Introduction
신호 전달 경로의 포괄적 인 이해는 리간드 - 수용체 상호 작용에 대한 자세한 지식이 필요합니다. 그 특정 수용체와 특정 리간드의 상호 작용을 평가하기위한 대부분의 방법은 시간이 많이 걸리고, 노동 집약적, 비싼 특정 장비와 전문 지식 1을 필요로한다.
직접 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (LRA)와 경쟁 LRA :이 문서에서는 면역 분석법 (ELISA)을 연결하는 효소에 따라 리간드 - 수용체 상호 작용을 조사하기 위해 두 빠르고 신뢰할 수있는 포인트 별 프로토콜을 설명합니다. ELISA는 일상적으로 거의 모든 실험에서 사용 된 매우 민감한 특정 용이 가능한 기술이다. ELISA를 수행하고 다양한 패션에 적응 될 수있다. 제시된 프로토콜은 다른 인터페론 람다 (INFLs)와 그 수용체 간의 상호 작용 연구를 위해 최적화된다.
직접 LRA는 quantificati 수 있습니다리간드 - 수용체의 리간드 농도에 대해 결합함으로써 결합 곡선을 산출한다. 리간드 - 수용체 상호 작용에 대한 적절한 모델을 사용하여, 데이터가 상기 해리 상수 (K D)를 추정하기 위해 분석 될 수있다.
제시된 프로토콜, 일반적으로 사용되는 힐 방정식 리간드 결합 수용체를 모델링에 적용된다. 이러한 표면 플라즈몬 공명 기술 2,3- 다른 방법은 두 단백질 사이의 결합 친화도의 측정을 할 수 있지만,이 기술은 종종 노동 집약적 고가이고 특별한 실험 장비를 필요로한다.
LRA는 경쟁 저해 펩티드의 스크리닝을 가능 : 리간드 결합 수용체 펩티드가 농도에 대해 정량화된다. 이것은 펩티드의 억제 효과를 설명하는 용량 - 반응 곡선을 산출한다. 데이터는 상기 IC (50) (반 최대한 억제 농도를 추정하기 위해 분석 될 수있다
두 ELISA 프로토콜은 사용하기 쉽고 연구 질문의 넓은 범위로 적용 할 수있다. 어떤 종류의 재조합 단백질을 확실하고 빠르게 상호 작용 부분을 결정하기 위해 사용될 수있다. 또한, 경쟁 LRA는 리간드 또는 수용체를 모방하도록 설계 차단 펩티드를 사용하여 리간드 및 수용체의 중요한 상호 작용 위치를 결정하는데 사용될 수있다. 차단 펩타이드 효율적이고 특정 억제를 표시하는 경우, 펩타이드는 중요한 상호 작용 리간드의 사이트 (펩타이드 모방 경우 수용체) 또는 리간드 (펩타이드 모방 경우 리간드)를 차지한다.
제 1 프로토콜은 다른 INFLs의 K D 값 결정 및 리셉터의 알파 서브 유니트, 즉 설명 직접 LRA를 사용하여 인터루킨 28 수용체 (IL28RA). 다음에, 제 2 프로토콜에 20 아미노산 길이의 펩티드의 능력을 확인하는 방법을 도시INFL-IL28RA 상호 작용을 억제한다. 펩티드들은 수용체 결합 부위에서 IFNLs 경쟁하도록 설계함으로써 상호 작용 분자 이해할 수있다. 또한,이 펩타이드는 하류 시그널링 4 효과에 미치는 영향을 결정하기 위해 시험 관내 실험에서 IL28RA을 차단하는데 사용될 수있다.
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Protocol
1. 시약 준비
- 탄산염 코팅 완충액을 제조 0.36 g 나 2 CO 3 및도 3의 100 ml의 증류수에 0.84 g의 NaHCO3를 용해하는 단계; 멸균 필터를 사용까지 RT에서 0.22 ㎛의 폴리 에테르 설폰 (PES) 멤브레인 필터 저장 구동 진공을 이용하여 버퍼.
- 인산염에 0.05 % v / V를 트윈 20을 추가하여 세척 용액을 제조 식염수 (PBS)를 버퍼.
- 4 ℃에서 5g을 100㎖의 PBS에 BSA (≥98 %) 저장을 용해시켜 5 % 소 혈청 알부민 (BSA) PBS 용액 (블로킹 용액)을 준비한다.
- 재조합 수용체, 리간드 및 차단 펩티드
- Reconstitutethe 재조합 인간 인터루킨 수용체 알파 서브 유닛 (IL28RA) 및 -80 ° C에서 제조업체의 지침 및 저장에 따라 인간의 IFN (IFNL1-3)의 재조합 그의 - 태그 리간드. Synthetize은 펩티드를 차단 및 이전 (4) 기술로 사용된다. 리간드의 다양한 농도를 준비하는 PBS를 사용하여S 및 검정에 사용하기위한 펩타이드.
- 차 항체를 준비하려면 1에서 0.1 % BSA와 PBS의 6 배 그의 마우스 단일 클론 항체를 희석 : 1,000 희석. 희석 차 항체를 제조 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) (1)에서 0.1 % BSA와 함께 PBS에 공액 된 염소 항 - 마우스 IgG (H + L) : 10,000 희석.
- 제조자의 지시에 따른 시약을 혼합하여 B TMB 용액을 제조 하였다.
- 실온에서 증류수와 저장소에 5 N 황산 (H 2 SO 4)을 추가하여 스톱 솔루션을 준비합니다.
2. 면역 흡수 분석법 (ELISA를)을 효소 결합
주 : 직접적인 리간드 - 수용체 상호 작용을 ELISA (직접 LRA도 1) 수용체 - 리간드 결합 친화도의 척도로서, 일정한 수용체 리간드의 해리 (K D)를 측정하는데 사용될 수있다. 경쟁 리간드 - 수용체 상호 작용 ELISA (경쟁 LRA, 그림 2) 모든리간드와 수용체 사이의 상호 작용을 방해하는 작용 펩타이드 (및 기타 차단 화합물)의 심사 OWS. 이전에 5 게시 된 기본 프로토콜은 더욱 최적화되었다.
주 :이 방법의 각 단계에서 96 웰 플레이트에 대한 솔루션을 추가 멀티 채널 피펫을 사용하여 ELISA 양이다. 솔루션 캔트 또는 세척 단계에서, 싱크에 직접 솔루션을 밖으로 던져.
- 직접 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (직접 LRA)
참고 : 워크 플로의 그림은 (그림 1 참조).- 재조합 수용체와 코팅 플레이트
- 100 NG / μL 최종 농도 카보네이트 버퍼 재조합 수용체 희석. 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 100 μl를 피펫 팅에 의해 고정 된 수용체 농도 (100 NG / μL) 96 웰 마이크로 타이 플레이트의 코트 우물. 잘 가장자리 유물을 방지하기 위해 판의 외벽을 제외합니다. 뚜껑 접시를 덮고을 품어4 ° CO / N에서 판.
- 차단 및 리간드의 추가
- 다음 날, 싱크대에 대한 판을 기울여 코팅 용액을 제거하고 세척 용액 (PBS + 0.05 % v / V를 트윈 20)와 플레이트 3 번 씻는다.
- 물론 멀티 채널 피펫을 사용하여 각각 5 % BSA 용액 200 μl를 사용하여 도장 판의 자유 수용체 결합 부위를 차단하고 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 배양한다.
- 블로킹 용액을 폐기 (. 단계 2.1.2.1 참조) 세정액 판을 3 회 세척 하였다.
- 상이한 농도 (AT 재조합에게 그의 태그가 리간드를 준비 예 8 ㎍ / ㎖, 4 μg의 / ㎖, 2 ㎍ / ㎖, 1 ㎍ / ㎖, 0.5 ㎍ / ㎖, 0.25 ㎍ / ㎖, 0.125 ㎍ / ㎖, 0.063 μg의 / PBS에서 ㎖, 0.031 μg의 / ㎖, 0.0 μg의 / ㎖). 빈 우물 만 PBS를 추가합니다.
- 중복 우물에 각 리간드 농도의 100 μl를 추가하고 수용체 - 리간드를 허용 RT에서 2 시간 동안 접시를 품어상호 작용.
- 항체와 배양
- 리간드와 인큐베이션 후, 세척 용액으로 플레이트를 3 회 세척 하였다.
- 피펫 차 항 그 마우스 모노클로 날 항체 용액 (1 : 1000) 100 ㎕를 각 웰에 관한 것이다.
- 2 시간 동안 실온에서 접시를 품어; 배양 후, 항체 용액을 (단계 2.1.2.1 참조). 버리고 세정액으로 플레이트를 3 회 세척 하였다.
- 물론 각 : HRP 100 ㎕를 염소에게 항 - 마우스 IgG 이차 항체 용액 (10,000 1) 결합 추가합니다. 실온에서 45 분 동안 접시를 품어.
- 항체 용액을 폐기 (. 단계 2.1.2.1 참조) 세정액 판을 3 회 세척 하였다.
- 기판 및 개발의 추가
- 실온 TMB 기질 용액을 가져와 1 TMB 기질을 용액 A 및 B를 준비 : 1 비율. 갓 각 웰에 기판을 준비 100 μl를 추가하고 15 ~ 30 분 동안 실온에서 접시를 유지합니다. 충분한 COL 후 또는 개발은 50 μl의 중지 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- 접시와 데이터 분석 읽기
참고 설명 프로토콜 측정 신호가 특이 적 결합에서 상승한다는 가정에 기초한다. 이 신호에 비특이적 결합 기여도를 추정해야 할 수도 있지만, 이것은이 프로토콜의 범위를 벗어난다.- 직접 450 nm에서의 흡광도 (광학 밀도, OD)를 참조하십시오.
- 측정 된 OD 값에서 배경 신호를 빼고이를 정규화. (10를 기록,베이스 10) 로그 스케일로 리간드 농도의 모든 값을 변환.
- 정규화 배경 OD 값 보정 플롯 (10 로그 스케일, X 축)의 리간드 농도에 대해 대수 (Y 축 점유 수용체 결합 부위의 일부에 해당).
- K D 값을 추정하는, 힐 방정식은 다음 형태로 데이터를 적합 :
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참고 : 여기에 Y 점유 수용체 결합 부위와 Y 최대 바인딩을 최대의 분율을 의미한다; [L]은 무료로 리간드와 힐 계수의 농도를 나타낸다. 리간드에 대한 하나의 결합 부위가 존재하면, 힐 계수 N 이상의 리간드 결합 부위를 가진 시스템의 경우 = 1, 결합 전시 긍정적 협동성되면, N> 1 음극 협동성 경우 N <1 N 만약 아니오 협동성 = 1 현미경 해리 상수라고하고 반 최대 유효 농도 EC 50 (6)에 해당합니다. 겉보기 해리 상수는 K의 D = (K D) n은. 간단한 경우 N = 1에서, 결합 부위의 절반 수용체 점령의 K D = K D되어있는 리간드 농도 해리 상수에 대응한다. 이 모델은 단지 작은 분획이뿐만 아니라, 평형 상태에서 바인딩 질량 동작을 가정추가 된 리간드, 수용체에 결합되어 즉, [L] >> [RL].
- 재조합 수용체와 코팅 플레이트
그림 1. 직접 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (직접 LRA). 직접 LRA에 대한 단계별 프로토콜입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 경쟁 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (경쟁 LRA)
참고 :. 워크 플로우의 그림은 그림 2를 참조하십시오 경쟁 LRA 절차는 리간드에 중요한 변경 사항을 제외하고는 동일한 직접 LRA로 단계 (접시 코팅, 항체 배양, 플레이트 개발) 다음과 첨가 단계를 펩티드. 적절한 음성 대조군은이 분석을 위해 필수적이다. 이전 스크리닝 연구에서 <SUP> 4, 스크램블 차단 펩타이드 길항 효과를 보이지 않았다.- 차단 - 리간드 및 차단 펩타이드의 추가를
- 다음날, 도포 액을 제거하고 (2.1.2.1 참조) 플레이트를 세척한다.
- 각 웰을 5 % BSA 용액 200 μl를 첨가함으로써 도장 판을 차단하고 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 배양한다.
- PBS의 고정 된 농도 (2 × 20 NG / ㎖)에서 그의 재조합 태깅 리간드 (IFNL1-3)을 준비한다.
- 용량 - 반응 곡선을 보장하는 PBS 10 nM 내지 100 μM의 범위의 다양한 농도로 차단 펩티드 (참조 표 3)를 준비한다.
참고 :이 차단 펩타이드의 IC (50) 값의 후속 결정을 할 수 있습니다. 대조군 웰에서 최대 (100 %) 결합을 유도하는 펩티드없이 단지 고정 리간드의 농도를 추가한다. 빈에서 리간드 또는 펩티드없이 단지 PBS를 추가합니다. - 리간드의 50 μL (IFNL1-3) 및 각 PE의 50 μl를 추가중복의 우물에 ptide 농도.
- 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어.
- 플레이트 및 데이터 분석 읽기
참고 설명 프로토콜 측정 신호가 특이 적 결합에서 상승한다는 가정에 기초한다. 이 신호에 비특이적 결합 기여도를 추정해야 할 수도 있지만, 이것은이 프로토콜의 범위를 벗어난다.- 직접 450 nm에서의 흡광도 (광학 밀도, OD)를 참조하십시오.
- 측정 된 OD 값에서 배경 신호를 빼고이를 정규화. (10를 기록,베이스 10) 로그 스케일로 펩타이드 농도의 모든 값을 변환.
- 정규화 배경 OD 값 보정 플롯 (10 로그 스케일, X 축)의 리간드 농도에 대해 대수 (Y 축 점유 수용체 결합 부위의 일부에 해당).
- IC 50 값을 측정하기 위해, 다음 식에 맞게 데이터 :
참고 : 여기에 [P]는 펩타이드 농도와 힐 슬로프입니다. 힐 기울기는 용량 - 반응 곡선의 기울기에 대해 설명합니다. IC (50)는 수용체와 리간드 사이의 결합의 50 % 억제가 관찰되는 억제제의 농도에 상당한다.
- 차단 - 리간드 및 차단 펩타이드의 추가를
그림 2. 경쟁 리간드 - 수용체 상호 작용 분석 (경쟁 LRA). 경쟁 LRA에 대한 단계별 프로토콜입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
INFL1-3 및 수용체 알파 소단위 IL28RA 사이의 해리 상수는 직접 LRA를 사용하여 측정 하였다. 결과는도 3에 도시되어 차지하는 결합 부위의 비율은 각각의 IFN 농도의 로그에 대해 도시된다. 데이터의 스캐 챠드 플롯은 오른쪽 하단 모서리에 표시됩니다. 결과는 직접 LRA는 상기 K D 값을 추정하기 위해 분석 될 수있다 결합 곡선을 얻을 수 있음을 나타낸다. K D 값은 힐 방정식 데이터 (식 1)을 끼워 맞춤으로써 결정 하였다.
IFNL1는 IFNL2 및 IFNL3 다음에 높은 결합력을 가지고 있습니다. 힐 계수 N> 1은 초기 리간드 - 수용체 상호 작용 (토론 참조) 후 추가 리간드에 대한 친 화성을 증가 제안한다. 예상 해리 상수 및 힐 계수를 표에 정리 1.
경쟁 LRA는 IFNL1-3 및 IL28RA (도 4) 사이의 상호 작용 차단 펩티드의 영향을 정량화하는데 사용되었다. 10 NG / ml의 리간드 농도 차지하는 결합 부위의 펩티드 분획 농도의 로그에 대해 도시된다. IC 50 값을 추정하기 위해, 데이터는 수학 식 2에 설치된다.
차단 펩티드 큰 정도로 IFNL3 및 IL28RA (IC 50 = 0.26 μM) 사이의 상호 작용을 억제 하였다. IC (50)는 두 번 IFNL2-IL28RA 상호 작용 (IC 50 = 0.50 μM) 및 IFNL1-IL28RA 상호 작용을위한 더 높은 크기의 한 순서로 높고, 나타내는 펩타이드는 IFNL1-IL28RA 상호 작용을 방해 덜 효과적이었다. 결정 IC (50) 값과 힐 슬로프는 표 2에 요약되어있다.
_content "FO : 킵 together.within 페이지는 ="1 "> 적절한 데이터 분석 리간드 - 수용체 상호 작용을 이해하는 데 필수적인 나타낸 결과는 그래프 패드 프리즘과 같은 과학적 그래프 소프트웨어를 사용하여 생성 된 K D 값 결정 용.. 상기 데이터에 장착 된 '하나의 사이트 - 특정 힐 슬로프 바인딩'. (. 장에서 식 1에 해당 2.2.1) IC 50 값 결정을 위해, 데이터는 함수 '로그 (억제제) VS로 끼워 . 정규화 응답 -. 가변 슬로프 '(. 장 수학 식 2 참조 2.2.2) 그러나, 비 - 선형 회귀 분석을위한 소프트웨어를 사용할 수있다.
그림 직접 리간드 - 수용체 분석 (직접 LRA) 3. 결과. IFNL1 (녹색), IFNL2 (빨간색) 및 IL28RA에 IFNL3 (파란색)의 결합에 대한 바인딩 곡선. 오른쪽 하단에있는 각각의 스캐 챠드 플롯코너 결합의 긍정적 인 공동 조작성을 제안한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 경쟁 리간드 - 수용체 분석 (경쟁 LRA). 4. 결과 IFNL1 (10 NG / ㎖, 녹색) (10 ng를 / ㎖, 적색) IFNL2 및 IFNL3의 결합의 억제를 나타내는 투여 량 - 반응 곡선 (10 NG 20 AA 펩타이드에 의한 IL28RA에 / ㎖, 파랑). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 예상 해리 상수 (K D) 및 IL28RA에 결합 IFNL1-3의 언덕 계수. 표준 오차 (SE)는 데이터 포인트 당 네 개의 복제의 샘플 크기 주어진다.
표 2. 블로킹 펩티드 IL28RA에 IFNL1-3의 결합에 대한 용량 - 반응 곡선의 힐 슬로프의 추정 최대 절반 억제 농도 (IC 50) IFN 농도는 10 ng / ml이다. 복제의 수는 3이다.
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Discussion
ELISA는 많은 실험실에 대한 표준과 잘 확립 된 방법이다. 우리는 더 수정 이전에 게시 된 방법 5,7를 개선했다. 입증 단계별 프로토콜이 리간드 - 수용체 상호 작용의 K D 값을 결정하는 간단한 방법으로 사용할 수있는 방법을 도시한다. 또한, 리간드 - 수용체 상호 작용을 방해 차단 펩타이드 IC50이 측정 될 수있다.
대부분의 연구자들은 이전 ELISA 프로토콜을 사용하는 것처럼 주요 장점은 빠른 설치, 시약 및 익숙한 처리를 쉽게 준비합니다. 직접 LRA 프로토콜은 매우 유연하고 다양한 단백질 - 단백질 상호 작용을 측정하도록 구성 될 수있다. 된 His6 또는 대체 태그 재조합 단백질 고정화 파트너 바인딩 파트너로 사용되어야한다. 경쟁 LRA는 (ⅰ)에 대한 선별 도구로 악용 될 수있는 화합물을 (펩타이드, 항체, 또는 작은 몰을 차단하는 억제 가능성을 확인ecules) 및 (Ⅱ) 수용체 또는 리간드를 모방하도록 고안된 차단 펩티드를 이용하여 중요한 상호 작용 위치를 결정한다.
음성 대조군은 제시된 분석의 적절한 해석에 필수적이다. 이전 스크리닝 연구 (4)에서 사용되는 차단 펩타이드의 스크램블 순서는 길항 효과를 보이지 않았다. 그러나, 다른 펩티드는 정전으로 인한 비특이적 인 상호 작용도 스크램블링 후에 가능성 차단 능력을 나타내었다.
잠재적 인 제한이 분석은 시험 관내 상황을 반영하는 것입니다. 특히, 이종 수용체는 종종보다 복잡한 구조를 형성한다. 단지 리간드 수용체 또는 리간드가 또한 다시 세포 내 신호를 유도 형태 변화 또는 이량 화를 유발하여 수용체를 활성화 여부 결합 여부를 구별하는 것은 불가능하다. 제시된 분석에서, 우리는 immobili하는 재조합 수용체를 사용고상에 데이빗. 이 설정은 활성화를 테스트 또는 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)으로 막 환경이나 막 콜레스테롤을 필요로 수용체의 상호 작용을 조사하기 위해 작동하지 않습니다. 또한 재조합 단백질의 사용은주의를 발생시킵니다. 예를 들어, 재조합 단백질의 폴딩 및 삼차 구조는 생체 내 상황에 비해 상이 할 수있다. 리간드와 수용체의 결합은 일반적으로하지만 인간의 최적 온도는 37 ° C 것, RT에서 발생한다. 마지막으로, 상업적인 재조합 리간드와 수용체의 사용은 고가 증명할 수있다. 이러한 한계에도 불구하고,이 두 ELISA 프로토콜은 빠르게 리간드 - 수용체 상호 작용을 탐구하는 가능성을 보여줍니다.
제시된 결과는 IFNL1 IFNL2 비교 IL28RA 대한 약간 높은 친 화성을 갖고, IFNL3의 친화도가보다 낮은 IFNL2 세 배 인 것으로 나타났다. 이것은 IFNLs 간의 유사성을 고려하여 현저하다. IFNL1 및 IFNL2 DIF33 아미노산의 FER은 IFNL2 및 IFNL3은 단지 7 아미노산 8에서 차이가있다. IL28RA 및 IFNLs 간의 상호 작용 및 나선 IFNL 9 AB 루프를 포함한다. IFNL 서열 정렬 네 상당한 헬릭스의 차이 IFNL1 및 IFNL3 (도 5a) 사이 AB 루프를 보여준다. 하나는 소금 다리 Arg54-Glu119에 영향을 미칩니다. 이 섹션의 아미노산 잔기는 UniProt가 IFNL1-IL28R1 복잡한 (그림의 결정 구조에서 발견 된 Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) 및 Q8IU57 (IL28RA)를 엔트리에 따라 열거 5B). 구조 조정은 IFNL1에 Arg57도 Glu118 (그림 5C)과 염 다리를 형성 할 수있다 INFL3에 Lys57로 대체되는 것을 보여줍니다. IFNL3 및 IL28RA의 감소 친화력과 일치 연산 10, 11 및 돌연변이 (12)는리스 - 글루 소금 교량의 Arg-글루의 샐보다 안정적인 일반에 있는지, 쇼를 분석t 다리.
헬릭스의 아미노산 서열과 IFNL2 IFNL3 동일이기 때문에, 나선의 차이는 양호하게, IFNL3의 하부 친화력을 설명하지 않는다. 주요 차이점은 Arg74 및 IFNL2에서 His76이 IFNL3 8 Lys70 및 Arg72로 대체 AB 루프에서 돌연변이에서 발생하는 것으로 생각된다.
또한 IFNLs 사이 안정성 용해도의 차이는 분석의 결과에 영향을 미칠 수있다. LRA 직접 분석법은 M nm 정도의 농도를 사용하여 혈청 내 사이토 카인의 생리 학적 농도는 PM nM의 범위에 놓여 있기 때문에, IFNL의 응집을 배제 할 수 없다. 우리는 IFN의 관찰 긍정적 협동성은 특정 또는 불특정 리간드 결합 수용체의 증가, 예를 들면 용액 중 재조합 IL28RA 수용체 이량 체화 또는 제 리간드 또는 리간드 단편의 결합에 의한 바인딩 가정 할 높은 친화력. 호Wever에게는 더 연구가이를 확인해야합니다.
경쟁 LRA 모방에 IFNL3의 AB 루프를 사용 차단 펩타이드 (그림 6). 전술 한 바와 같이, AB 루프는 IFNLs 및 IL28RA 9 특히 IFNL2 및 IFNL3 간의 상호 작용에서 중요한 역할을한다. IL28RA / IFNL1 결정 구조 IFNL3의 상 동성 모델링 차단 펩티드에 상당하는 영역이 IL28RA과 상호 작용 인터페이스 (도 6)에 공간적으로 근접에있는 것을 나타낸다. 펩티드 블록 것으로 추측 IFNL 및 IL28RA의 AB 루프의 상호 작용. 이 대전 LRA 지원 결과 펩티드 모든 IFNLs의 결합에 대한 억제 효과를 갖는다 그러나 펩티드 IL28RA 및 하나 IFNL3 또는 IFNL1 및 IL28A의 상호 작용의보다 IFNL2 사이의 상호 작용의 더 효과적인 저해제이다. 예상 한 바와 같이, 펩티드 블록 그것 이후 가장 효과적으로 결합 IFNL3IFNL3의 AB-루프와 완전히 같은 바인딩 주머니를 차지한다.
표 3에 나타낸 바와 같이 차단 펩타이드가 다른에, IFNL1 및 IFNL2의 AB-루프 정렬됩니다. 두 아미노산과 펩티드 IFNL2간에 상이하고, 반면 IFNL1 / IL28RA 상호 작용의 저해 펩티드의 낮은 IC 50 값이 일관 열두 아미노산 IFNL1 펩티드 사이에 차이가있다. 이 IFNLs 및 IL28RA의 AB-루프 사이의 상호 작용에 대한 약간 다른 바인딩 모드가 있음을 나타내고 IFNL1을 모방 펩타이드가 IFNL3 및 IL28RA 사이의 상호 작용보다 IFNl1 및 IL28RA 사이의 상호 작용을 차단에 더 효과적 일 것이라고 예측한다.
또한, 상기 펩타이드는 전체 양 (네 개의 아르기닌 및 리신 잔기 만이 아스파라긴산 잔기) 충전 및 계산 분석은 펩티드가 더 정의 보조 모티프가 없음을 나타낸다. 그것의 코일, 유연한 일에ructure 펩타이드는 수용체의 다른 지역에 바인딩 할 수 있습니다. 이것은 잠재적 리간드 - 수용체 복합체 (도 5b 및도 5c)을 안정시키기 염다리 형성 D118, 글루타메이트 및 아스 파르 테이트 잔기를 차단할 수있다.
산소 원자는 적색으로 표시되어 IFNL1 (녹색) 및 IFNL3 (청색).도 5의 구조 비교는, 질소 원자 청색으로 도시되어있다. IL28RA 바인딩 IFNL1 및 IFNL3의 (A) 중첩 (IL28RA는 도시하지 않음). 0.672 Å이 루트는 모든 정렬 된 원자의 평방 편차 (RMSD)을 의미합니다. IFNL1 다를 IFNL3의 사이드 체인 빛 분홍색으로 강조 표시됩니다. Arg54와 D118 사이 (B) 소금 다리입니다. IL28RA 바인딩 IFNL1에 (C) IFNL3 정렬 (IL28RA은 회색으로 표시됩니다). 정렬 표시의 Arg-글루 소금 BRI 그DGE 아마 덜 안정리스 - 글루, Lys57 및 D118 사이의 염 다리로 대체됩니다. 파이 몰은 인물의 제조에 사용하고 정렬. 한 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
IFNL3 그림 6. 정렬 (미도 IFNL1) 복잡한 IFNL1-IL28RA. IFNL3은 파란색과 회색의 IL28RA에 표시됩니다. 차단 펩타이드에 대응하는 영역이 보라색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 3 :
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
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