Introduction
En omfattande förståelse av signalvägar kräver detaljerad kunskap om ligand-receptorinteraktionen. De flesta metoder för att bedöma samverkan av en viss ligand med dess specifika receptor är dyra, tidskrävande, arbetsintensiv och kräver särskild utrustning och kompetens en.
I artikeln beskrivs två snabba och pålitliga punkt-för-punkt-protokoll för att undersöka ligand-receptorinteraktion baserad på en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA): den direkta ligand-receptorinteraktion assay (LRA) och konkurrensen LRA. ELISA är en mycket känslig, specifik och lätt tillgänglig teknik, som rutinmässigt används i nästan varje laboratorium. ELISA kan utföras och anpassas på olika sätt. De presenterade protokoll är optimerade för undersökning av samspelet mellan olika lambda interferoner (INFLs) och deras receptor.
Den direkta LRA tillåter en quantificatipå ligand-receptorbindning i förhållande till ligandkoncentration och därmed ger en bindningskurva. Användning av en lämplig modell för ligand-receptor-interaktion, kan data analyseras ytterligare för att uppskatta dissociationskonstanten (K D).
I det presenterade protokollet är vanligt förekommande Hill ekvation gäller att modellera ligand-receptorbindning. Även om andra metoder såsom ytplasmonresonans teknik 2,3 tillåter bestämningen av bindningsaffiniteter mellan två proteiner, är denna teknik ofta arbetsintensiv, dyr och kräver speciell laboratorieutrustning.
Tävlingen LRA möjliggör screening av hämmande peptider: Ligand-receptorbindnings kvantifieras med avseende på peptidkoncentration. Detta ger en dos-responskurva som beskriver den inhiberande effekten av peptiden. Data kan analyseras ytterligare för att uppskatta halv maximal inhiberande koncentration (IC 50
Både ELISA-protokoll är lätta att använda och kan anpassas till ett brett spektrum av forskningsfrågor. Rekombinanta proteiner av alla slag kan användas för att på ett tillförlitligt och snabbt bestämma interaktions delar. Dessutom kan tävlingen LRA användas för att bestämma kritiska interaktionsställen på ligander och receptorer med hjälp av blockerande peptider, som är utformade för att efterlikna antingen liganden eller receptorn. Om blockerings peptiden visar effektiv och specifik hämning upptar peptiden en kritisk interaktion platsen för liganden (om peptiden härmar receptor) eller ligand (om peptid efterliknar liganden).
Det första protokollet beskriver K D-värde bestämning av olika INFLs och alfa-subenheten av sin receptor, dvs interleukin-28-receptorn (IL28RA) använda den direkta LRA. Därefter visar det andra protokollet hur man bestämmer förmågan hos en 20 aminosyror lång peptid tillinhibera INFLATIONS-IL28RA interaktioner. Peptiden är utformad för att konkurrera med IFNLs på deras receptorbindningsstället och möjliggör således en molekylär förståelse av interaktionen. Dessutom kan denna peptid användas för att blockera IL28RA i in vitro experiment för att bedöma effekten på nedströms signaleffekter 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagens
- För att framställa karbonatbeläggningsbuffert, upplösa 0,36 g Na 2 CO 3 och 0,84 g NaHCO 3 i 100 ml destillerat vatten; sterilt filter bufferten med hjälp av en vakuumdriven 0,22 um polyetersulfon (PES) membranfilter och förvara vid rumstemperatur tills användning.
- Framställ tvättlösning genom att tillsätta 0,05% volym / volym Tween 20 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Bered en 5% bovint serumalbumin (BSA) (blockeringslösning) i PBS-lösning genom att lösa 5 g BSA (≥98%) i 100 ml PBS och lagra vid 4 ° C.
- Rekombinant receptor, Ligander och Blockering peptider
- Reconstitutethe rekombinanta humana interleukin-receptor alfa-subenheten (IL28RA) och rekombinanta His-taggade ligander av humant IFN (IFNL1-3) enligt tillverkarens instruktioner och förvara vid -80 ° C. Syntetisera blockerande peptider och användes såsom tidigare beskrivits 4. Använd PBS för att förbereda olika koncentrationer av ligands och peptider för användning i analyserna.
- För att framställa den primära antikroppen, utspädd 6x His mus monoklonal antikropp i PBS med 0,1% BSA vid en: 1000 utspädning. För att framställa den sekundära antikroppen, utspädd pepparrotsperoxidas (HRP) konjugerat get-anti-mus-IgG (H + L) i PBS med 0,1% BSA vid en: 10.000 utspädning.
- Framställ TMB-lösning genom blandning av reagensen A och B i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Förbereda stopplösning genom att tillsätta 5 N svavelsyra (H 2 SO 4) i destillerat vatten och förvara vid RT.
2. Enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA)
OBS: Den direkta ligand-receptorinteraktion ELISA (direkt LRA, figur 1) kan användas för att mäta receptor-ligand-dissociationskonstant (Kd), som ett mått på receptor-ligand-bindningsaffinitet. Tävlingen ligand-receptor interaktion ELISA (tävling LRA, Figur 2) allaows screening av peptider (och andra blockerande föreningar), som verkar för att interferera med interaktionen mellan ligand och receptor. Den grundläggande protokoll som tidigare offentliggjordes fem ytterligare optimeras.
OBS: I både ELISA metoder använder multikanalpipett för adde lösningar till brunnarna i 96-brunnars platta i varje steg. I lösningen dekantera eller tvättningssteg, kasta ut lösningarna direkt i diskhon.
- Direkt ligand-receptor-interaktion analys (direkt LRA)
OBS: För en illustration av arbetsflödet (se figur 1).- Beläggning Plate med rekombinant receptor
- Späd den rekombinanta receptom i karbonatbuffert till en slutlig koncentration av 100 ng / | il. Coat brunnar i 96-brunnars mikrotiterplatta med fast receptor koncentration (100 ng / l) genom att pipettera 100 l till varje brunn med en flerkanalspipett. Uteslut ytterväggar plattan för att undvika väl kant artefakt. Täck plattan med ett lock och inkuberaplattan vid 4 ° CO / N.
- Blockering och Tillsats av ligander
- Nästa dag, ta bort beläggningslösningen genom att luta plattan mot diskbänken och tvätta plattan 3 gånger med tvättlösning (PBS + 0,05% vol / vol Tween 20).
- Blockera de fria receptorbindningsställen i den belagda plattan med användning av 200 | il 5% BSA-lösning till varje brunn med en flerkanalspipett och inkubera plattan under 2 h vid RT.
- Kassera blockerande lösningen (se steg 2.1.2.1.) Och tvätta plattan 3 gånger med tvättlösning.
- Förbereda det rekombinanta His-taggade ligander vid olika koncentrationer (t.ex., 8 | ig / ml, 4 | ig / ml, 2 | ig / ml, 1 ug / ml, 0,5 | ig / ml, 0,25 | ig / ml, 0,125 | ig / ml, 0,063 ^ g / ml, 0,031 | ig / ml, 0,0 | ig / ml) i PBS. Lägg bara PBS i blankbrunnarna.
- Tillsätt 100 | il av varje ligandkoncentrationen till brunnarna i duplikat och inkubera plattan under 2 h vid RT tillåter receptor-ligandinteraktion.
- Inkubation med Antikroppar
- Efter inkubation med liganderna, tvätta plattan 3 gånger med tvättlösning.
- Pipettera 100 | il av primär anti-His monoklonal musantikropp lösning (1: 1000) till varje brunn.
- Inkubera plattan vid rumstemperatur under 2 h; efter inkubation, kassera lösningen antikroppen (se steg 2.1.2.1.) och tvätta plattan 3 gånger med tvättlösning.
- Tillsätt 100 pl av HRP kopplat till get anti-mus IgG sekundär antikropp-lösning (1: 10000) till varje brunn. Inkubera plattan under 45 min vid RT.
- Kassera antikropplösning (se steg 2.1.2.1.) Och tvätta plattan 3 gånger med tvättlösning.
- Tillsats av substrat och utveckling
- Föra de TMB substratlösningarna till RT och förbereda TMB substratlösning A och B vid ett: 1-förhållande. Tillsätt 100 | il nyberedd substrat till varje brunn och hålla plattan vid RT under 15 till 30 min. Efter tillräcklig col eller utveckling tillsätt 50 pl stopplösning.
- Läsa Plate och dataanalys
OBS: Det beskrivna Protokollet är baserat på antagandet att den uppmätta signalen stiger från specifik bindning. Det kan vara nödvändigt att uppskatta bidrag ospecifik bindning till signal, men detta är utanför ramen för detta protokoll.- Läs av absorbansen (optisk densitet, OD) direkt vid 450 nm.
- Subtrahera bakgrundssignalen från de uppmätta OD-värden och normalisera dem. Omvandla alla värden av ligandkoncentrationen till logaritmisk skala (bas 10, log 10).
- Plotta den normaliserade och bakgrundskorrigerade OD-värden (y-axel, motsvarar den fraktion av ockuperade receptorbindningsställen) mot logaritmen av ligandkoncentrationen (X-axeln, log 10 skala).
- För att uppskatta Kd värde, passar data till följande form of the Hill-ekvationen:
tp_upload / 53.575 / 53575eq1.jpg "/>
OBS: Här Y betecknar den del av ockuperade receptorbindningsställen och Y max den maximala bindning; [L] betecknar koncentrationen av fri ligand och Hill koefficient. Om det endast finns ett bindningsställe för liganden, är Hill-koefficienten n = 1. För system med mer än en ligand bindningsställe, den bindande uppvisar positiva kooperativitet om n> 1, negativ kooperativitet om n <1 och ingen kooperativitet om n = 1. den mikroskopiska dissociationskonstanten kallas och motsvarar halva maximala effektiva koncentrationen EC50 6. Den skenbara dissociationskonstanten är Kd = (K D) n. I det enklaste fallet där n = 1, Dissociationskonstanten motsvarar liganden koncentration vid vilken hälften av receptorbindningsställen är upptagna och Kd = Kd. Denna modell förutsätter massaktioner bindning under jämviktsförhållanden, samt att endast en liten del avden tillsatta liganden är bunden till receptorn, dvs, [L] >> [RL].
- Beläggning Plate med rekombinant receptor
Figur 1. Direkt ligand-receptor-interaktion analys (direkt LRA). Steg-för-steg-protokoll för direkt LRA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Konkurrens ligand-receptor-interaktion analys (tävling LRA)
OBS:. För en illustration av arbetsflödet se figur 2 Tävlings LRA förfarandet följer samma steg som direkt LRA (beläggning plattan, antikropps inkubation, plåtframkallning) med undantag för viktiga förändringar i liganden och peptider Dessutom steg. Lämpliga negativa kontroller är väsentliga för denna analys. I en tidigare screeningstudie <sup> 4, oordning blockerar peptiden visade inte antagonistiska effekter.- Blockering - Tillsats av ligander och blockerings peptider
- Nästa dag, ta bort beläggningslösningen och tvätta plattan (se 2.1.2.1).
- Blockera den belagda plattan genom att tillsätta 200 ul av 5% BSA-lösning till varje brunn och inkubera plattan under 2 h vid RT.
- Förbereda de rekombinanta His-taggade ligander (IFNL1-3) vid en fast koncentration (2x-20 ng / ml) i PBS.
- Förbereda den blockerande peptid (jfr Tabell 3) med olika koncentrationer varierande från 10 nM till 100 ^ M i PBS för att garantera en dos-responskurva.
OBS: Detta möjliggör efterföljande bestämning av IC50-värde för blockering peptiden. I kontrollbrunnar, lägga ligandkoncentration endast fast utan peptid att härleda maximum (100%) bindning. I ämnet, bara lägga PBS utan ligand eller peptid. - Tillsätt 50 pl av de ligander (IFNL1-3) och 50 fil av varje peptide koncentration till brunnarna i duplikat.
- Inkubera plattan under 2 h vid RT.
- Läsa Plate och dataanalys
OBS: Det beskrivna Protokollet är baserat på antagandet att den uppmätta signalen stiger från specifik bindning. Det kan vara nödvändigt att uppskatta bidrag ospecifik bindning till signal, men detta är utanför ramen för detta protokoll.- Läs av absorbansen (optisk densitet, OD) direkt vid 450 nm.
- Subtrahera bakgrundssignalen från de uppmätta OD-värden och normalisera dem. Omvandla alla värden av peptidkoncentrationen till logaritmisk skala (bas 10, log 10).
- Plotta den normaliserade och bakgrundskorrigerade OD-värden (y-axel, motsvarar den fraktion av ockuperade receptorbindningsställen) mot logaritmen av ligandkoncentrationen (X-axeln, log 10 skala).
- För att uppskatta IC50-värde, passar data till följande ekvation:
OBS: Här [P] är den peptidkoncentration och Hill-lutningen. Hill-lutningen beskriver lutning av dos-responskurvan. IC 50 motsvarar den inhibitorkoncentration vid vilken 50% hämning av bindning mellan ligand och receptor observeras.
- Blockering - Tillsats av ligander och blockerings peptider
Figur 2. Konkurrens ligand-receptor-interaktion analys (tävling LRA). Steg-för-steg-protokoll för konkurrens LRA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissociationskonstanterna mellan INFL1-3 och deras receptor alfa subenhet IL28RA bestämdes med användning av den direkta LRA. Resultaten visas i Figur 3: Fraktionen av ockuperade bindningsställen är avsatt mot logaritmen för respektive IFN-koncentrationen. Scatchard plot av data visas i det nedre högra hörnet. Resultaten illustrerar att den direkta LRA ger en bindningskurva, som kan analyseras ytterligare för att uppskatta K D-värdet. K D-värdet bestämdes genom anpassning av data till Hill-ekvationen (ekvation 1).
IFNL1 har den högsta bindningsaffiniteten, följt av IFNL2 och IFNL3. Hill-koefficienten n> 1 föreslår ökad affinitet för ytterligare ligander efter den första ligand-receptorinteraktion (se diskussion). De beräknade dissociationskonstanter och Hill-koefficienter sammanfattas i tabell 1.
Konkurrenskraftig LRA användes för att kvantifiera effekten av en blockerande peptid på interaktionen mellan IFNL1-3 och IL28RA (Figur 4). Fraktionen av ockuperade bindningsställen för en ligand koncentration av 10 ng / ml är avsatt mot logaritmen av peptidkoncentrationen. Att uppskatta IC50-värden, är data monteras på ekvation 2.
Den blockerande peptid inhiberade interaktionen mellan IFNL3 och IL28RA (IC50 = 0,26 | iM) i störst utsträckning. IC 50 är dubbelt så hög för IFNL2-IL28RA interaktion (IC50 = 0,50 | iM) och en storleksordning högre för IFNL1-IL28RA interaktion, indikativ peptiden var mindre effektiv på att störa IFNL1-IL28RA interaktioner. De fastställda IC 50-värden och Hill backar sammanfattas i tabell 2.
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Korrekt dataanalys är väsentliga för förståelsen av ligand-receptorinteraktionen Resultaten visade genererades med hjälp av en vetenskaplig grafiska program såsom GraphPad PRISM För värdet bestämningen K D.. var data monterad på "En plats - specifik bindning med Hill lutning". (. motsvarar ekvation 1 i avsnitt 2.2.1) för IC 50 värde bestämningen är data monterad på funktionen "log (hämmare) vs . normaliserade svar -. variabel lutning "(. se ekvation 2 i avsnitt 2.2.2) Men någon programvara för icke-linjär regressionsanalys kan användas.
Figur 3. Resultat av direkta ligand-receptoranalys (direkt LRA). Bindningskurvor för bindningen av IFNL1 (grön), IFNL2 (röd) och IFNL3 (blå) till IL28RA. Respektive Scatchard plot i det nedre högrahörn föreslår positiv samverkan operativity av bindningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Resultat från kompetitiv ligand-receptoranalys (kompetitiv LRA). Dos-responskurvor som visar inhibition av bindningen av IFNL1 (10 ng / ml, grön), IFNL2 (10 ng / ml, rött) och IFNL3 (10 ng / ml, blå) till IL28RA vid 20 aa peptid. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Beräknad dissociationskonstanter (Kd) Och Hill-koefficienter i IFNL1-3 bindning till IL28RA. Medelfelet (SE) ges för en provstorlek av fyra replikat per datapunkt.
Tabell 2:. Uppskattad halva maximala hämmande koncentrationer (IC50) av de blockerande peptider och Hill-lutningen av dos-responskurvan för bindningen av IFNL1-3 till IL28RA IFN-koncentrationen är 10 ng / ml. Antalet replikat är tre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ELISA är en standard och väletablerad metod för många laboratorier. Vi har ytterligare modifierad och förbättrad en tidigare publicerad metod 5,7. Den demonstrerade steg-för-steg-protokoll visar hur den kan användas på ett enkelt sätt för att bestämma K-värden av ligand-receptorinteraktioner. Dessutom kan IC50 för en blockerande peptid som stör ligand-receptorinteraktionen bestämmas.
Stora fördelar är den snabba installationen enkel framställning av reagens och bekanta hantering, eftersom de flesta forskare har använt en ELISA-protokoll innan. Den direkta LRA protokollet är mycket flexibelt och kan anpassas för att mäta många protein-proteininteraktioner. Rekombinanta proteiner med His6- eller alternativa taggen ska användas som bindningspartner till en immobiliserad partner. Tävlingen LRA kan utnyttjas som ett screeningverktyg för att (i) bestämma den inhibitoriska potential att blockera föreningar (peptider, antikroppar, eller små molecules) och att (ii) bestämma de kritiska interaktionsställen med hjälp av blockerande peptider som utformats för att efterlikna receptorn eller liganden.
Negativa kontroller är nödvändiga för en korrekt tolkning av de presenterade analyser. I en tidigare screeningstudie 4, gjorde den kodade sekvensen av den använda blockerings peptiden inte visar antagonistiska effekter. Emellertid kan andra peptider uppvisade en blockeringskapaciteten även efter kodning, sannolikt på grund av ospecifika elektrostatiska interaktioner.
En potentiell begränsning är att denna analys avspeglar en in vitro situation. I synnerhet, heterodimera receptorer ofta bildar en mer komplex struktur. Det är inte möjligt att särskilja huruvida liganden bara binder till receptorn eller huruvida liganden aktiverar också receptom genom att utlösa en konformationsändring eller en dimerisering, vilket i sin tur leder till en intracellulär signal. I den presenterade analysen använde vi en rekombinant receptor, som är Immobilized till en fast fas. Denna inställning fungerar inte att testa aktivering eller för att undersöka interaktionen av receptorerna, som kräver membran miljön eller membran kolesterol såsom G-proteinkopplade receptorer (GPCR). Också användningen av rekombinant protein höjer varningar. Till exempel kan veckningen och tertiära strukturen av ett rekombinant protein vara annorlunda jämfört med en in vivo-situation. Bindningen av ligand och receptor sker vanligen vid RT, men hos människor den optimala temperaturen skulle vara 37 ° C. Slutligen kan användningen av kommersiellt tillgängligt rekombinant ligand och receptor bli dyrt. Trots dessa begränsningar, dessa två ELISA-protokoll visar potential att snabbt utforska ligand-receptorinteraktionen.
De presenterade resultaten visar att IFNL1 har en något högre affinitet för IL28RA jämfört med IFNL2 och affiniteten hos IFNL3 är tre gånger lägre än IFNL2. Detta är anmärkningsvärt med tanke på likheterna mellan IFNLs. IFNL1 och IFNL2 differ i 33 aminosyror medan IFNL2 och IFNL3 skiljer sig endast i sju aminosyror 8. Samspelet mellan IL28RA och IFNLs innebär Helix A och AB-loopen av IFNL 9. Inriktning av IFNL sekvenser avslöjar fyra signifikanta skillnader i Helix A, och AB-slingan mellan IFNL1 och IFNL3 (figur 5A). Man påverkar saltbryggan Arg54-Glu119. De aminosyrarester i detta avsnitt är uppräknade enligt UniProt poster Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) och Q8IU57 (IL28RA), som har påträffats i kristallstrukturen för den IFNL1-IL28R1 komplex (Figur 5B). Strukturell inriktning visar att Arg57 i IFNL1 ersätts av Lys57 i INFL3, som också är i stånd att bilda en saltbrygga med Glu118 (figur 5C). I överensstämmelse med den minskade affiniteten hos IFNL3 och IL28RA, beräknings 10,11 och mutations 12 analyser visar att Lys-Glu saltbryggor är i allmänhet mindre stabila än Arg-Glu salt broar.
Emellertid inte skillnaderna i Helix A inte på ett tillfredsställande sätt förklara den lägre affiniteten hos IFNL3, eftersom aminosyrasekvensen för Helix A är identisk för IFNL2 och IFNL3. Man tror att den största skillnaden uppstår från mutationer i AB-loopen, där arg74 och His76 i IFNL2 ersättas med Lys70 och Arg72 i IFNL3 8.
Dessutom kan skillnader i stabilitet och löslighet mellan IFNLs också påverka resultatet av analysen. Eftersom den direkta LRA analys använder koncentrationer från nM till M och den fysiologiska koncentrationen av cytokiner i serum ligger i PM till nM, inte kan uteslutas aggregering av IFNL. Vi kan anta att den observerade positiva kooperativitet av IFN-bindning orsakas av en specifik eller icke-specifik ökning av ligand-receptorbindning, t ex, en dimerisering av den rekombinanta IL28RA receptorn i lösning, eller en bindning av en andra ligand eller ligand-fragment med högre affinitet. hoWever, är ytterligare studier krävs för att verifiera detta.
Den blockerande peptid som användes i konkurrens LRA härmar den AB-loopen av IFNL3 (Figur 6). Såsom tidigare beskrivits, spelar AB-slingan en viktig roll i samspelet mellan IFNLs och IL28RA 9, särskilt IFNL2 och IFNL3. Homologimodellering av IFNL3 med IL28RA / IFNL1 kristallstrukturen visar att regionen, vilket motsvarar den blockerande peptiden ligger i nära rumslig närhet till interaktionen gränssnitt med IL28RA (figur 6). Tänkt att peptid blockerar interaktionen av AB-slingan hos IFNL och IL28RA. Resultaten av konkurrens LRA stöd detta: Peptiden har en hämmande effekt på bindningen av alla IFNLs emellertid peptiden är en mer effektiv inhibitor av interaktionen mellan IL28RA och antingen IFNL3 eller IFNL2 än av samverkan av IFNL1 och IL28A. Som väntat, peptid blockerar bindningen av IFNL3 mest effektivt eftersom detupptar exakt samma bindningsficka som AB-loopen av IFNL3.
Såsom visas i tabell 3, AB-slingor av IFNL1 och IFNL2 anpassas till de blockerande peptid skiljer sig åt. I överensstämmelse med det lägre IC50-värde av peptiden för hämning av IFNL1 / IL28RA interaktion, tolv aminosyror skiljer sig mellan IFNL1 och peptiden medan och endast två aminosyror skiljer sig mellan IFNL2 och peptiden. Detta tyder på att det är något olika bindningssätt för interaktion mellan AB-loopar av IFNLs och IL28RA och förutspår att peptider som efterliknar IFNL1 skulle vara mer effektiva på att blockera samspelet mellan IFNl1 och IL28RA än samspelet mellan IFNL3 och IL28RA.
Vidare är peptiden övergripande positivt laddade (fyra arginin och två lysinrester men bara två aspartat-rester) och beräknings analys visar att peptiden inte har några definierade sekundära motiv. Tack vare sin lindad, flexibel structure peptiden kan också binda till andra regioner i receptorn. Detta kan potentiellt blockera glutamat och aspartat-rester såsom D118, som bildar en saltbrygga för att stabilisera ligand-receptor-komplexet (figur 5B och 5C).
Figur 5. Strukturell jämförelse av IFNL1 (grön) och IFNL3 (blå). Syreatomer visas i rött, är kväveatomer visas i blått. (A) Överlagring av den IL28RA bundna IFNL1 och IFNL3 (IL28RA ej visad). Den kvadratiska medelvärdet avvikelse (RMSD) av alla inriktade atomer är 0,672 Å. Sidokedjor IFNL3 som skiljer sig från IFNL1 markeras med ljusrosa. (B) saltbrygga mellan Arg54 och D118. (C) IFNL3 anpassas till IL28RA bundna IFNL1 (IL28RA visas i grått). Inriktningen visar att Arg-Glu salt briDGE troligen ersätts av en mindre stabil Lys-Glu, en saltbrygga mellan Lys57 och D118. PyMOL användes för framställning av siffror och för anpassningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Inpassning av IFNL3 och IFNL1-IL28RA komplex (IFNL1 ej visad). IFNL3 visas i blått och den IL28RA i grått. De regioner som motsvarar de blockerande peptid markeras i lila. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 3:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
