Introduction
Uma compreensão abrangente de vias de sinalização requer conhecimento detalhado sobre a interação ligando-receptor. A maioria dos métodos para avaliar a interacção de um ligando particular com o seu receptor específico são caros, consomem tempo, trabalho intensivo e exige equipamentos e conhecimentos específicos 1.
Este artigo descreve dois protocolos rápidos e fiáveis ponto-a-ponto para investigar a interacção ligando-receptor baseado em um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA): o ensaio de interacção ligando-receptor directa (ERS) e o LRA competição. ELISA é uma técnica altamente sensível, específico e facilmente disponível, rotineiramente utilizados em quase todos os laboratórios. ELISA pode ser realizada e adaptada de diversas formas. Os protocolos apresentados são otimizados para a investigação da interação entre diferentes interferons lambda (INFLs) e seu receptor.
O LRA direta permite uma quantificatina de ligação ligando-receptor em relação à concentração do ligando e, portanto, produz uma curva de ligação. Usando um modelo apropriado para a interacção ligando-receptor, os dados podem ainda ser analisados para se avaliar a constante de dissociação (K D).
No protocolo apresentado, a equação de Hill vulgarmente utilizado é aplicada para modelar a ligação do ligando ao receptor. Embora outros métodos, tais como a tecnologia de ressonância de plasmon de superfície 2,3 permitir a determinação das afinidades de ligação entre as duas proteínas, esta tecnologia é muitas vezes um trabalho intensivo e caro, e requer equipamento laboratorial especial.
O LRA competição permite o rastreio de péptidos inibidores: A ligação ligando-receptor é quantificada em relação à concentração de péptido. Obteve-se uma curva de dose-resposta que descreve o efeito inibidor do péptido. Os dados podem ainda ser analisados para se estimar a concentração inibitória máxima metade (IC50
Ambos os protocolos de ELISA são fáceis de utilizar e podem ser adaptadas a uma ampla variedade de questões de pesquisa. As proteínas recombinantes, de qualquer tipo pode ser utilizada para determinar de forma fiável e rápida das peças de interacção. Além disso, o LRA competição pode ser usado para determinar sítios de interacção fundamentais de ligandos e receptores, utilizando os péptidos de bloqueio, que são concebidos para imitar ou o ligando ou o receptor. Se o péptido de bloqueio apresenta uma inibição eficiente e específico, o péptido ocupa um local crítico interacção do ligando (se o péptido imita o receptor) ou do ligando (se o péptido imita o ligando).
O primeiro protocolo descreve a determinação de K D valor de diferentes INFLs e a subunidade alfa do seu receptor, isto é, o receptor de interleucina-28 (IL28RA) usando o LRA directa. Em seguida, o segundo protocolo mostra como para determinar a capacidade de um péptido de comprimento de 20 aminoácidos deinibir as interacções INFL-IL28RA. O péptido é concebido para competir com IFNLs no seu local de ligação ao receptor e, portanto, permite uma compreensão molecular da interacção. Além disso, este péptido pode ser utilizado para bloquear IL28RA em experiências in vitro para determinar o impacto sobre os efeitos de sinalização a jusante 4.
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Protocol
1. Preparação de Reagentes
- Para preparar tampão de revestimento de carbonato, dissolve-se 0,36 g de Na 2 CO 3 e 0,84 g de NaHCO3 em 100 ml de água destilada; filtro estéril o buffer usando um vácuo impulsionado 0,22 polietersulfona (PES) filtro de membrana e armazenar a temperatura ambiente, até o uso.
- Preparar a solução de lavagem através da adição de 0,05% v / v de Tween 20 em tampão fosfato salino (PBS).
- Prepara-se uma 5% Albumina de Soro Bovino (BSA) (solução de bloqueio) em solução de PBS por dissolução de 5 g de BSA (≥98%) em 100 ml de PBS e armazenar a 4 ° C.
- Recombinante do receptor, os ligandos e os péptidos de bloqueio
- Reconstitutethe subunidade recombinante humana alfa do receptor da interleucina (IL28RA) e recombinantes ligantes His-tag de IFN humana (IFNL1-3) de acordo com instruções e armazenamento do fabricante a -80 ° C. Sintetizar péptidos de bloqueio e utilizados tal como previamente descrito 4. Use PBS para preparar a diferentes concentrações de ligandos e péptidos para utilização nos ensaios.
- Para preparar o anticorpo primário, diluir 6X His anticorpo monoclonal de ratinho em PBS com 0,1% de BSA a 1: 1000 de diluição. Para preparar o anticorpo secundário, dilui-se a peroxidase de rábano (HRP) conjugado bode anti-rato IgG (H + L) em PBS com 0,1% de BSA a diluição de 1: 10.000.
- Preparar a solução de TMB por mistura dos reagentes A e B de acordo com as instruções do fabricante.
- Preparar a solução de paragem através da adição de ácido sulfúrico 5 N (H 2 SO 4), em água destilada e armazenar a RT.
2. imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA Assays)
NOTA: A interacção directa ligando-receptor de ELISA (LRA directa, a Figura 1) pode ser utilizado para medir a dissociação do receptor-ligando constante (K D), como uma medida da afinidade de ligação ao receptor-ligando. A interacção ligando-receptor ELISA de competição (LRA competição, Figura 2) tudoOWS rastreio de péptidos (e outros compostos de bloqueio), que actuam de modo a interferir com a interacção entre ligando e receptor. O protocolo básico que foi publicado anteriormente 5 foi ainda mais aperfeiçoado.
NOTA: Em ambos os métodos ELISA usar pipeta multicanal para a adição de soluções para os poços da placa de 96 poços em cada passo. Em solução decantar ou etapas de lavagem, jogue fora as soluções diretamente na pia.
- Directo Ligando-Receptor Interaction Assay (LRA directa)
NOTA: Para obter uma ilustração do fluxo de trabalho (ver Figura 1).- Placa de revestimento com o receptor recombinante
- Dilui-se o receptor recombinante em tampão de carbonato a uma concentração final de 100 ng / ul. revestimento de poços de 96 poços de placas de microtitulação com uma concentração fixa de receptores (100 ng / ul) por pipetagem de 100 ul a cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Excluir paredes exteriores da placa para evitar bem artefato borda. Cobrir a placa com uma tampa e incubar aem placas a 4 ° CO / N.
- Bloqueio e adição de ligantes
- No dia seguinte, remover a solução de revestimento através da inclinação da placa contra a pia e lavar a placa 3 vezes com solução de lavagem (PBS + 0,05% v / v de Tween 20).
- Bloquear os sítios de ligação de receptores livres na placa revestida com 200 ul de solução de BSA a 5% a cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e incubar a placa durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Descartar a solução de bloqueio (ver passo 2.1.2.1.) E lavar a placa 3 vezes com solução de lavagem.
- Prepara-se o recombinante marcada com His ligandos em diferentes concentrações (por exemplo, 8 ug / mL, 4 jig / mL, 2 ug / mL, 1 ug / mL, 0,5 ug / mL, 0,25 ug / mL, 0,125 ug / mL, 0,063 ug / mL, 0,031 ug / mL, 0,0 ug / ml) em PBS. Adicione somente PBS nos poços branco.
- Adiciona-se 100 ul de cada concentração de ligando-se aos poços em duplicado e incubar a placa durante 2 horas à temperatura ambiente permitindo receptor-ligandointeração.
- A incubação com os anticorpos
- A seguir à incubação com os ligandos, lavar a placa 3 vezes com solução de lavagem.
- Pipetar 100 l de Seu anti-solução principal do rato anticorpo monoclonal (1: 1000) a cada poço.
- Incubar a placa a temperatura ambiente durante 2 horas; Após a incubação, rejeitar a solução de anticorpo (ver o passo 2.1.2.1.) e lavar a placa 3 vezes com solução de lavagem.
- Adicionar 100 ul de HRP de cabra acoplado solução de anticorpo secundário IgG anti-ratinho (1: 10000) a cada poço. Incubar a placa durante 45 minutos à TA.
- Descartar a solução do anticorpo (ver o passo 2.1.2.1.) E lavar a placa 3 vezes com solução de lavagem.
- Adição de substrato e Desenvolvimento
- Traga as soluções de substrato TMB para a TA e preparar a solução de substrato TMB A e B na proporção 1: 1. Adicionar 100 ul de substrato preparadas de fresco a cada poço e manter a placa à temperatura ambiente durante 15-30 min. Após col suficiente ou desenvolvimento adicionar solução de parada de 50 mL.
- Lendo a Análise Placa e Dados
NOTA: O protocolo descrito baseia-se no pressuposto de que o sinal medido sobe de ligação específica. Pode ser necessário para estimar a contribuição de ligação não especifica para o sinal, mas esta está fora do âmbito deste protocolo.- Leia a absorvância (densidade óptica, OD) a 450 nm directamente.
- Subtrair o sinal de fundo a partir dos valores medidos e OD normalizar-los. Transformar todos os valores da concentração do ligando a escala logarítmica (base 10, log 10).
- Traça-se a normalizada e de fundo corrigido valores de densidade óptica (Y-eixo, corresponde à fracção de locais de ligação do receptor ocupada) em função do logaritmo da concentração do ligando (eixo-X, escala log10).
- Para estimar o valor K D, ajustar os dados para a seguinte forma da equação Hill:
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NOTA: Aqui Y denota a fração de sítios receptores ocupados ligação e Y max a ligação máxima; [L] indica a concentração de ligando livre e o coeficiente de Hill. Se houver apenas um local de ligação para o ligando, o coeficiente de Hill é n = 1. Para sistemas com local de ligação mais do que um ligando, a exposições de ligação cooperatividade positiva se n> 1, cooperatividade negativa se n <1 e não se n cooperatividade = 1. a constante de dissociação é denominado microscópica e corresponde a metade do máximo de concentração eficaz CE50 6. A constante de dissociação aparente é K d = (K D) n. No caso mais simples, em que n = 1, a constante de dissociação corresponde à concentração do ligando na qual metade dos sítios de ligação do receptor são ocupados e K d = k D. Este modelo parte do princípio de acção de massa de ligação sob condições de equilíbrio, assim como a que apenas uma pequena fracção deo ligando é adicionado ligado ao receptor, isto é, [L] >> [RL].
- Placa de revestimento com o receptor recombinante
Figura 1. direto ensaio ligante receptor-interação (LRA direta). Protocolo passo-a-passo para a LRA direto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Competição Ligand-Receptor-Interaction Assay (competição LRA)
NOTA:. Para uma ilustração do fluxo de trabalho veja a Figura 2 O processo de concurso LRA segue os mesmos passos que o LRA direta (revestimento da placa, incubação do anticorpo, desenvolvimento placa), exceto para mudanças importantes no ligante e peptídeos passo além. controles negativos adequados são essenciais para este ensaio. Em um estudo de triagem anterior <sup> 4, o peptídeo bloqueando mexidos não mostraram efeitos antagónicos.- Bloqueio - A adição de ligantes e Peptídeos de bloqueio
- No dia seguinte, remover a solução de revestimento e lavar a placa (ver 2.1.2.1).
- Bloquear a placa revestida através da adição de 200 ul de solução de BSA a 5% a cada poço e incubar a placa durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Prepare os ligandos recombinantes His-tag (IFNL1-3) a uma concentração fixa (2x-20 ng / ml) em PBS.
- Prepara-se o péptido de bloqueio (cf. Tabela 3) com diferentes concentrações variando desde 10 nM a 100 pM em PBS, para garantir uma curva de dose-resposta.
NOTA: Este permite a determinação subsequente do valor de IC 50 para o péptido de bloqueio. Em cavidades de controlo, adicionar ligando única concentração fixa sem péptido para derivar o máximo (100%) de ligação. O espaço em branco, adicione apenas PBS sem ligando ou peptídeo. - Adicionar 50 ul de ligandos (IFNL1-3) e 50 ul de cada peconcentração ptide aos poços em duplicado.
- Incubar a placa durante 2 horas à TA.
- Lendo a Análise Placa e dados
NOTA: O protocolo descrito baseia-se no pressuposto de que o sinal medido sobe de ligação específica. Pode ser necessário para estimar a contribuição de ligação não especifica para o sinal, mas esta está fora do âmbito deste protocolo.- Leia a absorvância (densidade óptica, OD) a 450 nm directamente.
- Subtrair o sinal de fundo a partir dos valores medidos e OD normalizar-los. Transformar todos os valores da concentração de peptídeo a escala logarítmica (base 10, log 10).
- Traça-se a normalizada e de fundo corrigido valores de densidade óptica (Y-eixo, corresponde à fracção de locais de ligação do receptor ocupada) em função do logaritmo da concentração do ligando (eixo-X, escala log10).
- Para estimar o valor de IC 50, ajustar os dados com a equação seguinte:
NOTA: Aqui [P] é a concentração de péptido e o declive Hill. A encosta descreve o declive da curva de dose-resposta. O IC50 corresponde à concentração de inibidor a que se observa% de inibição da ligação entre o ligando e o receptor 50.
- Bloqueio - A adição de ligantes e Peptídeos de bloqueio
Figura 2. Concorrência ensaio ligante receptor-interação (LRA concorrência). Protocolo passo-a-passo para a LRA concorrência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
As constantes de dissociação entre INFL1-3 e sua subunidade alfa do receptor de IL28RA foram determinados utilizando o LRA directa. Os resultados são apresentados na Figura 3: A fracção de sítios de ligação ocupados é representada graficamente contra o logaritmo da concentração de IFN respectivo. O gráfico de Scatchard dos dados é mostrado no canto inferior direito. Os resultados mostram que o LRA directa produz uma curva de ligação, o qual pode ser ainda analisada para estimar o valor de K D. O valor de K D foi determinada por ajustamento dos dados à equação de Hill (equação 1).
IFNL1 tem a maior afinidade de ligação, seguido de IFNL2 e IFNL3. O coeficiente de Hill n> 1 sugere que o aumento de afinidade para ligandos adicionais após a interacção ligando-receptor inicial (ver discussão). As constantes de dissociação estimada e coeficientes de Hill estão resumidos na Tabela 1.
LRA competitiva foi utilizada para quantificar o impacto de um péptido de bloqueio sobre a interacção entre o IFNL1-3 e IL28RA (Figura 4). A fracção de sítios de ligação ocupados por uma concentração do ligando, de 10 ng / ml é representada graficamente contra o logaritmo da concentração de péptido. Para estimar os valores de IC 50, os dados são adaptados à Equação 2.
O péptido de bloqueio inibiu a interacção entre IL28RA e IFNL3 (IC50 = 0,26 uM) na maior extensão. O IC 50 é duas vezes mais elevada para a interacção IFNL2-IL28RA (IC50 = 0,50 uM) e uma ordem de magnitude mais elevada para a interacção IFNL1-IL28RA, indicativo do péptido foi menos eficaz na perturbar interacções IFNL1-IL28RA. Os valores de IC50 determinados e encostas encontram-se resumidos na Tabela 2.
_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "> análise de dados adequada é essencial para a compreensão da interação ligando-receptor Os resultados apresentados foram gerados usando um software de representação gráfica científica, como GraphPad PRISM Para a determinação do valor K D.. , os dados foram montados no 'One local - ligação específica com Colina inclinação'. (. corresponde à Equação 1 em Sec 2.2.1) para a determinação do valor IC 50, os dados são instalados em log a função '(inibidor) vs . resposta normalizada -. declive variável '(. ver Equação 2 em Sec 2.2.2) Contudo, qualquer software para análise de regressão não-linear pode ser usado.
Figura 3. Os resultados do ensaio ligando-receptor direto (LRA direta). Curvas de ligação para a ligação de IFNL1 (verde), IFNL2 (vermelho) e IFNL3 (azul) para IL28RA. O respectivo gráfico de Scatchard no canto inferior direitocanto sugere co-operatividade positiva da ligação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Resultados do ensaio de ligando-receptor competitivo (LRA competitiva). As curvas de dose-resposta que mostra a inibição da ligação de IFNL1 (10 ng / mL, verde), IFNL2 (10 ng / ml, vermelho) e IFNL3 (10 ng / ml, azul) para IL28RA pelo peptídeo 20 aa. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Estimativa constantes de dissociação (K D) E coeficientes de Hill de IFNL1-3 ligação para IL28RA. O erro padrão (SE) é dado para uma amostra de quatro repetições por ponto de dados.
Tabela 2:. Estimado a metade das concentrações máximas inibitórias (IC50) dos péptidos de bloqueio e a encosta da curva de dose-resposta para a ligação de IFNL1-3 para IL28RA A concentração de IFN é de 10 ng / ml. O número de repetições é três.
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Discussion
ELISA é um método padrão e bem estabelecido para muitos laboratórios. Temos ainda mais modificado e melhorado a 5,7 método previamente publicado. O protocolo passo-a-passo demonstrou mostra como ela pode ser usada de uma maneira simples para determinar os valores de KD de interacções ligando-receptor. Além disso, pode ser determinado o IC50 de um péptido de bloqueio que interfere com a interacção ligando-receptor.
As principais vantagens são a rápida instalação, uma fácil preparação de reagentes e manuseio familiar, como a maioria dos pesquisadores usaram um protocolo de ELISA antes. O protocolo de LRA directa é altamente flexível e pode ser adaptado para medir muitas interacções proteína-proteína. As proteínas recombinantes com His6- ou etiqueta alternativa deve ser utilizada como um parceiro de ligação a um parceiro imobilizado. O LRA concorrência pode ser explorado como uma ferramenta de triagem para (i) determinar o potencial inibitório de bloquear compostos (peptídeos, anticorpos, ou pequeno molecules) e (ii) determinar os locais de interacção fundamentais utilizando péptidos de bloqueio concebidos para imitar o receptor ou o ligando.
Os controlos negativos são essenciais para uma interpretação correcta dos ensaios apresentados. Em um estudo triagem prévia 4, a sequência mexidos do peptídeo bloqueando usado não mostraram efeitos antagônicos. No entanto, outros péptidos mostrou uma capacidade de bloqueio também depois lutando, provavelmente devido a interações eletrostáticas inespecíficos.
Uma limitação potencial é que este ensaio reflecte a situação in vitro. Em particular, os receptores heterodiméricos frequentemente formar uma estrutura mais complexa. Não é possível distinguir se o ligando apenas se liga ao receptor ou o ligando se também activa o receptor pelo desencadeamento de uma mudança conformacional ou uma dimerização, que por sua vez leva a um sinal intracelular. No ensaio apresentados, utilizou-se um receptor recombinante, que é Immobilized a uma fase sólida. Esta configuração não funciona para testar a activação ou para investigar a interacção de receptores, os quais requerem o ambiente de membrana ou membrana de colesterol, tais como os receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Também o uso de proteína recombinante levanta ressalvas. Por exemplo, a estrutura dobrável e terciária de uma proteína recombinante pode ser diferente em relação a uma situação in vivo. A ligação do ligando e o receptor ocorre geralmente à TA, no entanto, em seres humanos que a temperatura óptima poderia ser de 37 ° C. Finalmente, a utilização de um ligando do receptor recombinante comercial e pode revelar-se caros. Apesar destas limitações, estes dois protocolos ELISA mostraram potencial para explorar rapidamente a interacção ligando-receptor.
Os resultados apresentados mostram que IFNL1 tem uma afinidade ligeiramente maior para IL28RA comparação com IFNL2, e a afinidade de IFNL3 é três vezes mais baixa do que IFNL2. Isto é notável, considerando a semelhança entre IFNLs. dif IFNL1 e IFNL2fer em 33 aminoácidos, enquanto IFNL2 IFNL3 e diferem apenas em sete aminoácidos 8. A interação entre IL28RA e IFNLs envolve Helix A e AB-loop ininterrupto de IFNL 9. Alinhamento de sequências de IFNL revela quatro diferenças significativas na hélice A e AB-circuito entre IFNL1 e IFNL3 (Figura 5A). Uma afeta a ponte salina Arg54-Glu119. Os resíduos de aminoácidos nesta secção estão enumerados de acordo com a UniProt entradas Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) e Q8IU57 (IL28RA), que tem sido encontrado na estrutura cristalina do IFNL1-IL28R1 complexo (Figura 5B). Alinhamento estrutural mostra que Arg57 em IFNL1 é substituído por Lys57 em INFL3, que também é capaz de formar uma ponte salina com Glu118 (Figura 5C). Consistente com a diminuição da afinidade da IFNL3 e IL28RA, computacional 10,11 e mutacional 12 analisa show, que Lys-Glu pontes salinas são em geral menos estável do que Arg-Glu salt pontes.
No entanto, as diferenças na hélice A não explicam satisfatoriamente a baixa afinidade de IFNL3, uma vez que a sequência de aminoácidos da hélice A é idêntico para IFNL2 e IFNL3. Pensa-se que a principal diferença surge das mutações no AB-circuito, onde Arg74 e His76 em IFNL2 são substituídos por Lys70 e Arg72 no IFNL3 8.
Além disso, as diferenças na estabilidade e solubilidade entre IFNLs também pode afectar o resultado do ensaio. Uma vez que o ensaio de LRA directa utiliza concentrações de nM a M e a concentração fisiológica de citocinas no soro situa-se no intervalo de pM e nM, agregação de IFNL não pode ser excluída. Podemos assumir que a cooperatividade positiva observada do IFN- a ligação é provocada por um aumento específico ou não específico no complexo ligando-receptor de ligação, por exemplo, uma dimerização do receptor IL28RA recombinante em solução, ou uma ligação de um segundo ligando ou fragmento de ligando com maior afinidade. HoWever, mais estudos são necessários para verificar isso.
O péptido de bloqueio utilizada nas imita LRA concorrência AB-circuito de IFNL3 (Figura 6). Conforme descrito anteriormente, a AB-circuito desempenha um papel essencial na interação entre IFNLs e IL28RA 9, particularmente IFNL2 e IFNL3. Modelação de homologia de IFNL3 com a estrutura cristalina IL28RA / IFNL1 mostra que a região que corresponde ao péptido de bloqueio encontra-se em estreita proximidade espacial para a interface de interacção com IL28RA (Figura 6). Suposto que os blocos de péptidos a interação do laço de AB-IFNL e IL28RA. Os resultados da competição suporte LRA este: O péptido tem um efeito inibitório sobre a ligação de todos os IFNLs, no entanto, o péptido é um inibidor mais eficaz da interacção entre IL28RA e quer IFNL3 ou IFNL2 do que a da interacção de IFNL1 e IL28A. Como esperado, os blocos de péptidos de ligação a IFNL3 mais eficazmente uma vez queocupa exatamente o mesmo bolso de ligação como a AB-loop ininterrupto de IFNL3.
Como mostrado na Tabela 3, os AB-lacetes de IFNL1 e IFNL2 alinhado com o péptido de bloqueio diferem. Consistente com o menor valor de IC50 do péptido para a inibição da interacção IFNL1 / IL28RA, doze aminoácidos diferem entre IFNL1 e o péptido e Considerando que apenas dois aminoácidos diferem entre IFNL2 e o péptido. Isto indica que não são ligeiramente diferentes modos de ligação para a interacção entre o OR-loops dos IFNLs e IL28RA e prevê que os péptidos que mimetizam IFNL1 seria mais eficaz a bloquear a interacção entre IL28RA e IFNl1 do que a interacção entre IL28RA e IFNL3.
Além disso, o péptido é geral carregado positivamente (arginina quatro e dois resíduos de lisina, mas apenas dois resíduos de aspartato) e análise computacional mostra que o péptido não tem motivos secundários definidos. Devido à sua enrolada, st flexívelructure o péptido pode também ligar-se a outras regiões do receptor. Isto poderia potencialmente bloquear os resíduos de glutamato e aspartato, tais como D118, que forma uma ponte salina para estabilizar o complexo receptor-ligando (Figura 5B e 5C).
Figura 5. comparação estrutural de IFNL1 (verde) e IFNL3 (azul). Os átomos de oxigénio são mostrados em vermelho, átomos de nitrogênio são mostrados em azul. (A) A superposição do IFNL1 IL28RA-bound e IFNL3 (IL28RA não mostrados). O desvio quadrático médio (RMSD) de todos os átomos alinhados é 0,672 Å. cadeias laterais de IFNL3 que diferem IFNL1 são destacadas em light-rosa. Ponte (B) de sal entre Arg54 e D118. (C) IFNL3 Alinhado para IFNL1 IL28RA-bound (IL28RA é mostrado em cinza). O alinhamento mostra que a bri sal Arg-Gludge, provavelmente, é substituído por um menos estável Lys-Glu, uma ponte salina entre Lys57 e D118. PyMOL foi utilizado para a elaboração de figuras e para o alinhamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Alinhamento das IFNL3 e o IFNL1-IL28RA complexo (IFNL1 não mostrado). IFNL3 é mostrado em azul e o IL28RA em cinza. As regiões correspondentes aos péptidos de bloqueio são destaque na roxa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 3:
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
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