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Chemistry

Un ELISA basado Encuadernación y método Competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor

Published: March 14, 2016 doi: 10.3791/53575
Automatic Translation
1, 1,2,3, 4, 5, 4,6, 4, 7, 4, 4, 1,8
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, and Swiss Institute of Bioinformatics, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Li Ka Shing Institute for Virology, University of Alberta, 5Regional Infectious Diseases Unit, University of Edinburgh, 6Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Alberta, 7Infection Biology, Department of Biomedicine, University of Basel, 8Clinical Microbiology, University Hospital Basel

Introduction

Una comprensión completa de las vías de señalización requiere un conocimiento detallado acerca de la interacción ligando-receptor. La mayoría de los métodos para evaluar la interacción de un ligando particular con su receptor específico son caros, intensiva consume tiempo, trabajo y requieren equipo y la experiencia 1 específico.

Este artículo describe dos protocolos rápidos y fiables punto por punto para investigar la interacción ligando-receptor basado en una enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA): el ensayo de interacción ligando-receptor directo (LRA) y el LRA competencia. ELISA es una técnica altamente sensible, específica y fácilmente disponible, que se utiliza de forma rutinaria en casi todos los laboratorios. ELISA se puede realizar y adaptada de varias maneras. Los protocolos presentados están optimizados para la investigación de la interacción entre diferentes interferones lambda (infls) y su receptor.

El LRA directa permite una quantificatien de unión ligando-receptor con respecto a la concentración de ligando y por lo tanto produce una curva de unión. El uso de un modelo apropiado para la interacción ligando-receptor, los datos pueden ser analizados para estimar la constante de disociación (K D).

En el protocolo presentado, la ecuación de Hill de uso común se aplica al modelo de la unión de ligando-receptor. Aunque otros métodos tales como la tecnología de resonancia de plasmón de superficie 2,3 permiten la determinación de las afinidades de unión entre dos proteínas, esta tecnología es a menudo un trabajo intensivo, costoso y requiere un equipo especial de laboratorio.

El LRA competencia permite el cribado de péptidos inhibidores de: la unión ligando-receptor se cuantifica con respecto a la concentración de péptido. Esto produce una curva de dosis-respuesta que describe el efecto inhibitorio del péptido. Los datos pueden ser analizados para estimar la media máxima concentración inhibitoria (IC 50

Ambos protocolos de ELISA son fáciles de usar y pueden adaptarse a una amplia gama de temas de investigación. Las proteínas recombinantes de cualquier tipo se pueden utilizar para determinar de forma fiable y rápido de las partes de interacción. Además, el LRA competencia puede ser utilizado para determinar los sitios de interacción crítica de ligandos y receptores mediante el uso de péptidos de bloqueo, que están diseñados para imitar el ligando o el receptor. Si el péptido de bloqueo muestra la inhibición eficiente y específica, el péptido se encuentra en un sitio crítico interacción del ligando (si los compuestos peptídicos miméticos del receptor) o del ligando (si los compuestos peptídicos miméticos el ligando).

El primer protocolo describe la determinación K D valor de diferentes infls y la subunidad alfa de su receptor, es decir, el receptor de la interleucina-28 (IL28RA) utilizando el directo LRA. A continuación, el segundo protocolo se muestra cómo determinar la capacidad de un péptido largo de 20 amino ácido parainhibir las interacciones INFL-IL28RA. El péptido está diseñado para competir con IFNLs en su sitio de unión al receptor y por lo tanto permite una comprensión molecular de la interacción. Además, este péptido puede ser usado para bloquear IL28RA en experimentos in vitro para determinar el impacto sobre los efectos de señalización corriente abajo 4.

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Protocol

1. Preparación de los reactivos

  1. Para preparar tampón de recubrimiento de carbonato, se disuelven 0,36 g de Na 2 CO 3 y 0,84 g de NaHCO3 en 100 ml de agua destilada; filtro estéril de la memoria intermedia mediante el uso de un vacío impulsado 0,22 micras polietersulfona (PES) filtro de membrana y se almacena a temperatura ambiente hasta su uso.
  2. Preparar la solución de lavado mediante la adición de 0,05% v / v de Tween 20 en tampón fosfato salino (PBS).
  3. Preparar un 5% albúmina de suero bovino (BSA) (solución de bloqueo) en solución PBS disolviendo 5 g de BSA (≥98%) en 100 ml de PBS y se almacena a 4 ° C.
  4. Recombinante del receptor, los ligandos y los péptidos de bloqueo
    1. Reconstitutethe subunidad recombinante humana receptor de la interleucina alfa (IL28RA) y ligandos recombinantes con cola de histidina de IFN humano (IFNL1-3) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y almacenar a -80 ° C. Sintetizar el bloqueo de péptidos y se utiliza como se ha descrito previamente 4. Utilice PBS para preparar diferentes concentraciones de ligandos y péptidos para uso en los ensayos.
  5. Para preparar el anticuerpo primario, se diluye 6x Su anticuerpo monoclonal de ratón en PBS con 0,1% de BSA en dilución 1: 1000. Para preparar el anticuerpo secundario, se diluye con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado de cabra anti-IgG de ratón (H + L) en PBS con 0,1% de BSA en dilución 1: 10.000.
  6. Preparar la solución de TMB mediante la mezcla de los reactivos A y B de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  7. Preparar la solución de parada añadiendo 5 N de ácido sulfúrico (H 2 SO 4) en agua destilada y se almacena a temperatura ambiente.

2. inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA Ensayos)

NOTA: La interacción directa ligando-receptor ELISA (directa LRA, Figura 1) se puede utilizar para medir la constante de disociación del receptor-ligando (K D), como una medida de la afinidad de unión receptor-ligando. La interacción competencia ligando-receptor ELISA (LRA competencia, la Figura 2) todosOWS de detección de péptidos (y otros compuestos de bloqueo), que actúan para interferir con la interacción entre ligando y receptor. El protocolo básico que fue previamente publicada el 5 ha optimizado aún más.
NOTA: En ambos ELISA métodos utilizan pipeta multicanal para añadir soluciones a los pocillos de la placa de 96 pocillos en cada paso. En decantación solución o etapas de lavado, tirar las soluciones directamente en el fregadero.

  1. Ligando-receptor-Interacción directa de ensayo (directa LRA)
    NOTA: Para ver una ilustración del flujo de trabajo (ver Figura 1).
    1. Placa de recubrimiento con receptor recombinante
      1. Diluir el receptor recombinante en tampón de carbonato a una concentración final de 100 ng / l. recubrir los pocillos de placa de microtitulación de 96 pocillos con una concentración de receptor fija (100 ng / l) pipeteando 100 l a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Excluir paredes exteriores de la placa para evitar así artefacto borde. Cubrir la placa con una tapa e incubar laplaca a 4 ° CO / N.
    2. El bloqueo y la adición de ligandos
      1. Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento por la inclinación de la placa contra el fregadero y lavar la placa 3 veces con solución de lavado (PBS + 0,05% v v Tween / 20).
      2. Bloquear los sitios de unión al receptor libres en la placa recubierta con 200 l de solución de BSA 5% a cada pocillo usando una pipeta multicanal y se incuba la placa durante 2 horas a RT.
      3. Descartar la solución de bloqueo (vea el paso 2.1.2.1.) Y lavar la placa 3 veces con solución de lavado.
      4. Preparar el recombinante marcada con His ligandos a diferentes concentraciones (por ejemplo, 8 g / ml, 4 mg / ml, 2 mg / ml, 1 mg / ml, 0,5 g / ml, 0.25 g / ml, 0,125 g / ml, 0,063 g / ml, 0,031 mg / ml, 0,0 mg / ml) en PBS. Agregue sólo PBS en los pocillos de blanco.
      5. Añadir 100 l de cada concentración de ligando a los pocillos por duplicado y se incuba la placa durante 2 horas a RT permitiendo receptor-ligandoInteracción.
    3. La incubación con anticuerpos
      1. Después de la incubación con los ligandos, lavar la placa 3 veces con solución de lavado.
      2. Pipetear 100 l de su anti-solución primaria anticuerpo monoclonal de ratón (1: 1000) a cada pocillo.
      3. Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 2 h; Después de la incubación, desechar la solución de anticuerpos (véase el paso 2.1.2.1.) y lavar la placa 3 veces con solución de lavado.
      4. Añadir 100 l de HRP de cabra acoplados solución de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón (1: 10.000) a cada pocillo. Incubar la placa durante 45 min a TA.
      5. Descartar la solución de anticuerpo (véase el paso 2.1.2.1.) Y lavar la placa 3 veces con solución de lavado.
    4. La adición de sustrato y el Desarrollo
      1. Llevar las soluciones de sustrato TMB a TA y preparar la solución de sustrato TMB A y B en la proporción de 1: 1. Añadir 100 l de sustrato recién preparada a cada pocillo y mantener la placa a temperatura ambiente durante 15-30 min. Después de suficientes col o el desarrollo de añadir la solución de parada 50 l.
    5. La lectura de la placa y Análisis de Datos
      NOTA: El protocolo descrito se basa en la suposición de que la señal medida se eleva de unión específica. Puede ser que sea necesario para estimar la contribución de la unión no específica a la señal, pero esto está fuera del ámbito de aplicación de este protocolo.
      1. Leer la absorbancia (densidad óptica, OD) directamente a 450 nm.
      2. Restar la señal de fondo a partir de los valores de DO medidos y normalizarlos. Transformar todos los valores de la concentración de ligando a escala logarítmica (base 10, log 10).
      3. Representar gráficamente los normalizado y corrección de fondo a los valores de DO (eje Y, corresponde a la fracción de sitios de unión del receptor de ocupados) frente al logaritmo de la concentración de ligando (eje X, ingrese 10 escala).
      4. Para estimar el valor KD, ajustar los datos a la siguiente forma de la ecuación de Hill:
        tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
        NOTA: Aquí Y denota la fracción de sitios de unión de los receptores ocupados e Y max la unión máxima; [L] indica la concentración de ligando libre y el coeficiente de Hill. Si sólo hay un sitio de unión para el ligando, el coeficiente de Hill es n = 1. Para sistemas con sitio de unión a más de un ligando, la unión exposiciones cooperatividad positiva si n> 1, cooperatividad negativa si n <1 y no cooperatividad si n = 1. la constante de disociación microscópico se denomina y corresponde a la mitad de la máxima concentración efectiva CE 50 6. La constante de disociación aparente es Kd ​​= (KD) n. En el caso más simple, donde n = 1, la constante de disociación corresponde a la concentración de ligando a la que la mitad de los sitios de unión del receptor están ocupados y K d = K D. Este modelo supone la acción de masas de unión en condiciones de equilibrio, así como que sólo una pequeña fracción deel ligando añadido se une al receptor, es decir, [L] >> [RL].

Figura 1
Figura 1. Un ensayo directo ligando-receptor de la interacción (directa LRA). Protocolo paso a paso para LRA directa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Competencia ligando-receptor-Interacción de ensayo (la competencia LRA)
    NOTA:. Para una ilustración del flujo de trabajo ver Figura 2 El procedimiento de concurso LRA sigue los mismos pasos que el LRA directa (recubrimiento de la placa, de anticuerpos de incubación, el desarrollo de la placa) a excepción de los cambios importantes en el ligando y péptidos etapa de adición. controles negativos apropiados son esenciales para este ensayo. En un estudio de cribado anterior <sup> 4, el péptido bloqueo revueltos no mostró efectos antagónicos.
    1. El bloqueo - La adición de ligandos y Péptidos de bloqueo
      1. Al día siguiente, se retira la solución de recubrimiento y lavar la placa (véase 2.1.2.1).
      2. Bloquear la placa revestida por la adición de 200 l de solución de BSA 5% a cada pocillo y se incuba la placa durante 2 horas a RT.
      3. Preparar los ligandos recombinantes con cola de histidina (IFNL1-3) a una concentración fija (2x-20 ng / ml) en PBS.
      4. Preparar el péptido de bloqueo (véase la tabla 3) con diferentes concentraciones que variaban de 10 nM a 100 mM en PBS para garantizar una curva de dosis-respuesta.
        NOTA: Esto permite la posterior determinación del valor IC50 para el bloqueo péptido. En pocillos de control, añadir la concentración de ligando solamente fija sin péptido para obtener el máximo (100%) de unión. En el espacio en blanco, agregar sólo PBS sin ligando o péptido.
      5. Añadir 50 l de los ligandos (IFNL1-3) y 50 l de cada peconcentración ptide a los pocillos en los duplicados.
      6. Incubar la placa durante 2 horas a RT.
    2. La lectura de la placa de datos y análisis
      NOTA: El protocolo descrito se basa en la suposición de que la señal medida se eleva de unión específica. Puede ser que sea necesario para estimar la contribución de la unión no específica a la señal, pero esto está fuera del ámbito de aplicación de este protocolo.
      1. Leer la absorbancia (densidad óptica, OD) directamente a 450 nm.
      2. Restar la señal de fondo a partir de los valores de DO medidos y normalizarlos. Transformar todos los valores de la concentración de péptido a escala logarítmica (base 10, log 10).
      3. Representar gráficamente los normalizado y corrección de fondo a los valores de DO (eje Y, corresponde a la fracción de sitios de unión del receptor de ocupados) frente al logaritmo de la concentración de ligando (eje X, ingrese 10 escala).
      4. Para estimar el valor IC 50, ajustar los datos a la ecuación siguiente:
        Ecuación 2
        NOTA: Aquí [P] es la concentración de péptido y la pendiente de Hill. La pendiente de Hill describe la pendiente de la curva dosis-respuesta. El IC 50 corresponde a la concentración de inhibidor a la que se observó 50% de inhibición de la unión entre ligando y receptor.

Figura 2
Figura 2. Competencia ensayo ligando-receptor de la interacción (la competencia LRA). Protocolo paso a paso para la competencia LRA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Las constantes de disociación entre INFL1-3 y su subunidad alfa del receptor de IL28RA se determinaron utilizando el directo LRA. Los resultados se muestran en la Figura 3: La fracción de sitios de unión ocupados se representa frente al logaritmo de la respectiva concentración de IFN. La representación de Scatchard de los datos se muestra en la esquina inferior derecha. Los resultados ilustran que el LRA directa produce una curva de unión, que puede ser analizada más a estimar el valor K D. El valor K D se determinó ajustando los datos a la ecuación de Hill (ecuación 1).

IFNL1 tiene la mayor afinidad de unión, seguido de IFNL2 y IFNL3. El coeficiente de Hill n> 1 sugiere un aumento de afinidad por ligandos adicionales después de la interacción inicial de ligando-receptor (ver Discusión). Las constantes de disociación estimados y los coeficientes de Hill se resumen en la tabla 1.

Competitive LRA se utilizó para cuantificar el impacto de un péptido de bloqueo de la interacción entre IFNL1-3 y la IL28RA (Figura 4). La fracción de sitios de unión ocupados para una concentración de ligando de 10 ng / ml se representa en función del logaritmo de la concentración de péptido. Para estimar los valores de IC 50, los datos se ajusta a la ecuación 2.

El péptido inhibe el bloqueo de la interacción entre IFNL3 y IL28RA (IC 50 = 0,26 M) en la mayor medida. El IC 50 es dos veces más alta para la interacción IFNL2-IL28RA (IC 50 = 0,50 M) y un orden de magnitud mayor para la interacción IFNL1-IL28RA, indicativo del péptido fue menos eficaz en la interrupción de las interacciones IFNL1-IL28RA. Las determinados valores de IC50 y laderas de las colinas se resumen en la Tabla 2.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> El análisis adecuado de datos es esencial para la comprensión de la interacción ligando-receptor Los resultados mostrados se generaron usando un software de gráficos científica como GraphPad PRISM Para la determinación del valor de KD.. , los datos se ajustaron a la 'Uno de los sitios - unión específica con pendiente Hill'. (. corresponde a la ecuación 1 en la sección 2.2.1) para la determinación del valor IC50, los datos de registro se ajusta a la función '(inhibidor) vs . respuesta normalizada -. pendiente variable '(. véase la Ecuación 2 en la sección 2.2.2) sin embargo, cualquier software para análisis de regresión no lineal se puede utilizar.

figura 3
Figura 3. Los resultados del ensayo ligando-receptor directo (directa LRA). Curvas de unión para la unión de IFNL1 (verde), IFNL2 (rojo) y IFNL3 (azul) para IL28RA. La representación de Scatchard respectiva en la parte inferior derechaesquina sugiere positivo co-operatividad de la unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Los resultados del ensayo ligando-receptor competitivo (LRA competitivo). Las curvas de dosis-respuesta que muestra la inhibición de la unión de IFNL1 (10 ng / ml, verde), IFNL2 (10 ng / ml, rojo) y IFNL3 (10 ng / ml y azul) para IL28RA por el péptido de 20 aa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tabla 1
Tabla 1: Estimación de las constantes de disociación (KD) Y coeficientes de Hill de IFNL1-3 se unen a IL28RA. Se da el error estándar (SE) para un tamaño de muestra de cuatro repeticiones por punto de datos.

Tabla 2
Tabla 2:. Media estimada concentraciones inhibitorias máximas (CI 50) de los péptidos de bloqueo y la pendiente de Hill de la curva de dosis-respuesta para la unión de IFNL1-3 a IL28RA La concentración de IFN es de 10 ng / ml. El número de repeticiones es de tres.

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Discussion

ELISA es un estándar y un método bien establecido para muchos laboratorios. Hemos modificado y mejorado aún más un método publicado previamente 5,7. El protocolo demostrado paso a paso muestra cómo se puede utilizar de una manera sencilla para determinar los valores K D de interacciones ligando-receptor. Además, el IC50 de un péptido de bloqueo que interfiere con la interacción ligando-receptor puede ser determinada.

Las principales ventajas son la configuración rápida, fácil preparación de reactivos y la manipulación familiar, como la mayoría de los investigadores han utilizado un protocolo de ELISA antes. El protocolo LRA directa es muy flexible y se puede adaptar para medir muchas interacciones proteína-proteína. Las proteínas recombinantes con His6- o etiqueta alternativa deben utilizarse como la pareja de unión a un socio inmovilizado. El LRA competencia puede ser explotada como una herramienta de detección para (i) determinar el potencial inhibidor de los compuestos de bloqueo (péptidos, anticuerpos, o pequeño molecules) y (ii) determinar los sitios de interacción crítica mediante el uso de péptidos de bloqueo diseñados para imitar el receptor o el ligando.

Los controles negativos son esenciales para una correcta interpretación de los ensayos presentados. En un estudio de cribado anterior 4, la secuencia codificada del péptido bloqueo utilizado no mostró efectos antagónicos. Sin embargo, otros péptidos mostraron una capacidad de bloqueo también después de aleatorización, probablemente debido a interacciones electrostáticas no específicas.

Una limitación potencial es que este ensayo refleja una situación in vitro. En particular, los receptores heterodiméricos a menudo forman una estructura más compleja. No es posible distinguir si el ligando solo se une al receptor o si el ligando también activa el receptor mediante la activación de un cambio conformacional o una dimerización, que a su vez conduce a una señal intracelular. En el ensayo presentado, se utilizó un receptor recombinante, que es immobilizeta a una fase sólida. Esta configuración no funciona para probar la activación o para investigar la interacción de los receptores, que requieren el medio ambiente de membrana o colesterol de la membrana tales como receptores acoplados a proteínas G (GPCRs). También el uso de la proteína recombinante plantea advertencias. Por ejemplo, la estructura de plegado y terciaria de una proteína recombinante puede ser diferente en comparación con una situación in vivo. La unión de ligando y receptor por lo general se produce a temperatura ambiente, sin embargo, en los seres humanos la temperatura óptima sería 37 ° C. Finalmente, el uso del ligando recombinante comercial y receptor puede resultar caro. A pesar de estas limitaciones, estos dos protocolos de ELISA muestran potencial para explorar rápidamente la interacción ligando-receptor.

Los resultados presentados muestran que IFNL1 tiene un poco mayor afinidad por IL28RA en comparación con IFNL2, y la afinidad de IFNL3 es de tres veces menor que IFNL2. Esto es notable teniendo en cuenta la similitud entre IFNLs. DIF IFNL1 y IFNL2fer en 33 aminoácidos, mientras que IFNL2 y IFNL3 difieren sólo en siete aminoácidos 8. La interacción entre IL28RA y IFNLs implica la hélice A y AB-bucle de IFNL 9. Alineación de las secuencias IFNL revela cuatro diferencias significativas en la hélice A y el AB-bucle entre IFNL1 y IFNL3 (Figura 5A). Uno afecta al puente salino Arg54-Glu119. Los residuos de aminoácidos en esta sección se enumeran de acuerdo con la UniProt entradas Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) y Q8IU57 (IL28RA), que se ha encontrado en la estructura cristalina de la IFNL1-IL28R1 complejo (Figura 5B). Alineación estructural muestra que Arg57 en IFNL1 se sustituye por Lys57 en INFL3, que también es capaz de formar un puente salino con Glu118 (Figura 5C). En consonancia con la disminución de la afinidad de IFNL3 y IL28RA, computacional 10,11 y 12 muestran los análisis mutacional, que Lys-Glu puentes salinos son en general menos estables que Arg-Glu Salt puentes.

Sin embargo, las diferencias en la hélice A no explican satisfactoriamente la menor afinidad de IFNL3, ya que la secuencia de aminoácidos de la hélice A es idéntico para IFNL2 y IFNL3. Se cree que la principal diferencia surge de las mutaciones en el bucle AB-, donde arg74 y His76 en IFNL2 se sustituyen por Lys70 y Arg72 en IFNL3 8.

Por otra parte, las diferencias en la estabilidad y la solubilidad entre IFNLs también pueden afectar el resultado del ensayo. Dado que el ensayo LRA directa utiliza concentraciones de nM a M y la concentración fisiológica de citoquinas en el suero está en el intervalo pM a nM, la agregación de IFNL no se puede excluir. Podemos suponer que la cooperatividad positiva observada de la IFN unión es causada por un aumento específico o no específico en unión ligando-receptor, por ejemplo, una dimerización del receptor IL28RA recombinante en solución, o una unión de un segundo ligando o fragmento de ligando con mayor afinidad. HoWever, se necesitan más estudios para verificar esto.

El péptido utilizado en el bloqueo de los imitadores del LRA competencia AB-bucle de IFNL3 (Figura 6). Como se ha descrito anteriormente, el bucle AB-juega un papel esencial en la interacción entre IFNLs y IL28RA 9, en particular IFNL2 y IFNL3. Homología de modelado de IFNL3 con la estructura cristalina IL28RA / IFNL1 muestra que la región, que corresponde al péptido de bloqueo se encuentra en estrecha proximidad espacial a la interfaz de interacción con IL28RA (Figura 6). Se supone que los bloques de péptidos de la interacción de la AB-bucle de IFNL y IL28RA. Los resultados de la competencia apoyo LRA esto: El péptido tiene un efecto inhibidor sobre la unión de todos los IFNLs, sin embargo, el péptido es un inhibidor más eficaz de la interacción entre IL28RA y, o bien IFNL3 o IFNL2 que de la interacción de IFNL1 y IL28A. Como era de esperar, los bloques de péptidos la unión de IFNL3 más eficaz ya queocupa exactamente el mismo bolsillo de unión que el AB-bucle de IFNL3.

Como se muestra en la Tabla 3, los AB-bucles de IFNL1 y IFNL2 alineados con los péptidos de bloqueo difieren. En consonancia con el menor valor de la CI 50 del péptido para la inhibición de la interacción IFNL1 / IL28RA, doce aminoácidos difieren entre IFNL1 y el péptido mientras que y sólo dos aminoácidos difieren entre IFNL2 y el péptido. Esto indica que no son un poco diferentes modos de unión para la interacción entre los AB-bucles de los IFNLs y IL28RA y predice que los péptidos que imitan IFNL1 serían más eficaces en el bloqueo de la interacción entre IFNl1 y IL28RA de la interacción entre IFNL3 y IL28RA.

Además, el péptido se carga positivamente general (cuatro arginina y dos residuos de lisina pero sólo dos residuos de aspartato) y análisis computacional muestra que el péptido no tiene motivos secundaria definida. Debido a su espiral st, flexibleructure el péptido también puede unirse a otras regiones del receptor. Esto podría bloquear el glutamato y aspartato residuos tales como D118, que forma un puente de sal para estabilizar el complejo ligando-receptor (Figura 5B y 5C).

Figura 5
Figura 5. Comparación estructural de IFNL1 (verde) y IFNL3 (azul). Los átomos de oxígeno se muestran en rojo, los átomos de nitrógeno se muestran en azul. (A) Superposición de la IFNL1 unido a IL28RA y IFNL3 (IL28RA no se muestra). La raíz cuadrada media desviación (RMSD) de todos los átomos alineados es 0.672 Å. Las cadenas laterales de IFNL3 que difieren de IFNL1 se resaltan en color rosa claro. Puente (B) La sal entre Arg54 y D118. (C) IFNL3 alineados a IFNL1 con destino a IL28RA (IL28RA se muestra en gris). La alineación muestra que la sal bri Arg-GluDGE es probablemente reemplazado por un menos estable Lys-Glu, una sal-puente entre Lys57 y D118. PyMOL se utilizó para la preparación de las cifras ya la alineación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Alineación de IFNL3 y la IFNL1-IL28RA compleja (IFNL1 no se muestra). IFNL3 se muestran en azul y el IL28RA en gris. Las regiones correspondientes a los péptidos de bloqueo se resaltan en color púrpura. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 3
Tabla 3:

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) Thermo Scientific 442404 ELISA plate
Sodium carbonate (Na2CO3) Merck 497-19-8 For ELISA plate coating buffer
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) Merck 144-55-8 For ELISA plate coating buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030-100G 5% BSA in PBS for Blocking
rhIL-28Rα/IFNλR1 R&D systems 5260-MR Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha
rhIL-29/IFNλ1 R&D systems 1598-IL/CF Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag
rhIL-28A/IFNλ2 R&D systems 1587-IL/CF Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag
rhIL-28B/IFNλ3 R&D systems 5259-IL/CF Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag
6x His Monoclonal antibody (Mouse) Clontech 631212 Primary antiboy to capture His tagged Ligands
Goat anti-Mouse igG (H+L) Jackson Immuno Research 115-035-166 Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody
BDoptEIA TMB reagent set BD Biosciences 555214 ELISA - TMB substrate solution
Sulfuric acid (H2SO4) Fulka 84720 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution)
Synergy/H1 - Microplate reader BioTeK ELISA plate reader

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References

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Química No. 109 ELISA la detección la interacción ligando-receptor la disociación constante de afinidad unión bloqueo
Un ELISA basado Encuadernación y método Competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor
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Syedbasha, M., Linnik, J., Santer,… More

Syedbasha, M., Linnik, J., Santer, D., O'Shea, D., Barakat, K., Joyce, M., Khanna, N., Tyrrell, D. L., Houghton, M., Egli, A. An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions. J. Vis. Exp. (109), e53575, doi:10.3791/53575 (2016).

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