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Chemistry

Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore

Published: March 14, 2016 doi: 10.3791/53575

Introduction

Una comprensione completa delle vie di segnalazione richiede una conoscenza dettagliata circa l'interazione ligando-recettore. La maggior parte dei metodi per valutare l'interazione di un particolare ligando con il recettore specifico sono costosi, in termini di tempo, manodopera e richiedono attrezzature e competenze specifiche 1.

Questo articolo descrive due protocolli veloce e affidabile punto per punto per studiare l'interazione ligando-recettore sulla base di un enzima collegato immunosorbent assay (ELISA): il saggio di interazione ligando-recettore diretta (LRA) e l'LRA concorrenza. ELISA è una tecnica molto sensibile, specifico e facilmente disponibile, solitamente usata in quasi ogni laboratorio. ELISA può essere eseguito e adattato in varie mode. I protocolli presentati sono ottimizzati per la ricerca delle interazioni tra i diversi interferoni lambda (INFLs) e la loro recettore.

L'LRA diretta consente una quantificatisu ligando-recettore vincolante rispetto alla concentrazione del ligando e produce pertanto una curva vincolante. Usando un modello appropriato per l'interazione ligando-recettore, i dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare la costante di dissociazione (K D).

Nel protocollo presentato, l'equazione Hill comunemente usato è applicata per modellare il legame ligando-recettore. Sebbene altri metodi come la superficie plasmon risonanza a 2,3 consentono la determinazione delle affinità di legame tra due proteine, questa tecnologia è spesso laborioso, costoso e richiede attrezzature speciali di laboratorio.

L'LRA concorrenza consente la proiezione di peptidi inibitori: il legame ligando-recettore viene quantificata rispetto alla concentrazione di peptide. Questo produce una curva dose-risposta che descrive l'effetto inibitorio del peptide. I dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare la metà massima concentrazione inibitoria (IC 50

Entrambi protocolli ELISA sono facili da usare e possono essere adattati ad una vasta gamma di domande di ricerca. proteine ​​ricombinanti di qualsiasi tipo possono essere utilizzati per determinare in modo affidabile e veloce le parti di interazione. Inoltre, l'Lra concorrenza può essere utilizzato per determinare siti di interazione critici di ligandi e recettori utilizzando peptidi di blocco, che sono progettati per imitare sia il ligando o il recettore. Se il peptide bloccante mostra l'inibizione efficace e specifico, il peptide occupa un sito critico interazione del ligando (se imita peptidici del recettore) o del ligando (se imita peptide ligando).

Il primo protocollo descrive la determinazione K D valore delle diverse INFLs e la subunità alfa del loro recettore, cioè il recettore dell'interleuchina-28 (IL28RA) usando l'LRA diretta. Successivamente, il secondo protocollo mostra come determinare la capacità di un lungo peptide di 20 aminoacidi diinibire le interazioni INFL-IL28RA. Il peptide è stato progettato per competere con IFNLs al loro recettore sito di legame e consente così una comprensione molecolare dell'interazione. Inoltre, questo peptide può essere utilizzato per bloccare IL28RA in esperimenti in vitro per determinare l'impatto sugli effetti di segnalazione a valle 4.

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Protocol

1. Preparazione dei reagenti

  1. Per preparare un tampone di rivestimento carbonato, sciogliere 0,36 g di Na 2 CO 3 e 0,84 g NaHCO 3 in 100 ml di acqua distillata; filtro sterile il buffer utilizzando un vuoto spinto 0,22 micron polietersulfone (PES) filtro a membrana e conservare a temperatura ambiente fino a quando l'utilizzo.
  2. Preparare la soluzione di lavaggio con l'aggiunta di 0,05% v / v Tween 20 in tampone fosfato (PBS).
  3. Preparare un 5% di sieroalbumina bovina (BSA) (soluzione bloccante) in soluzione PBS sciogliendo 5 g BSA (≥98%) in 100 ml di PBS e conservare a 4 ° C.
  4. Ricombinante del recettore, leganti e peptidi di blocco
    1. Reconstitutethe ricombinante subunità umano recettore dell'interleuchina alfa (IL28RA) e ricombinanti ligandi His-tag di IFN umano (IFNL1-3) secondo le istruzioni del produttore e conservare a -80 ° C. Sintetizzare peptidi blocco e utilizzato come precedentemente descritto 4. Utilizzare PBS per preparare differenti concentrazioni di ligandos e peptidi per l'uso nei saggi.
  5. Per preparare l'anticorpo primario, diluire 6x suo mouse anticorpo monoclonale in PBS con 0,1% BSA a 1: 1000 diluizione. Per preparare l'anticorpo secondario, diluire perossidasi di rafano (HRP) capra coniugato anti-topo IgG (H + L) in PBS con 0,1% BSA a 1: 10.000 diluizione.
  6. Preparare la soluzione TMB miscelando il reagenti A e B secondo le istruzioni del produttore.
  7. Preparare la soluzione di arresto con l'aggiunta di 5 N acido solforico (H 2 SO 4) in acqua distillata e conservare a temperatura ambiente.

2. immunoenzimatico Assays (ELISA)

NOTA: Il diretta interazione ligando-recettore ELISA (Lra diretta, Figura 1) può essere utilizzato per misurare la dissociazione recettore-ligando costante (K D), come misura della affinità di legame del recettore-ligando. L'interazione concorrenza ligando-recettore ELISA (LRA concorrenza, figura 2) tuttoflussi di screening di peptidi (e altri composti di blocco), che agiscono di interferire con l'interazione tra ligando e recettore. Il protocollo di base che è stato precedentemente pubblicato 5 è stata ulteriormente ottimizzata.
NOTA: in entrambe ELISA metodi utilizzano pipetta multicanale per l'aggiunta di soluzioni ai pozzetti di 96 pozzetti in ogni passaggio. Nella soluzione decantare o fasi di lavaggio, buttare fuori le soluzioni direttamente nel lavandino.

  1. Diretto ligando-recettore-Interaction Assay (LRA continua)
    NOTA: Per una illustrazione del flusso di lavoro (vedere Figura 1).
    1. Piatto del rivestimento con il recettore ricombinante
      1. Diluire il recettore ricombinante in tampone carbonato a una concentrazione finale di 100 ng / ml. pozzi mano di 96 pozzetti micropiastra con la concentrazione dei recettori fisso (100 ng / ml) pipettando 100 ul per ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Escludere muri esterni della piastra per evitare così artefatto bordo. Coprire la piastra con un coperchio e incubare latarga a 4 ° CO / N.
    2. Blocco e aggiunta di leganti
      1. Il giorno seguente, togliere la soluzione di rivestimento inclinando il piatto contro il lavandino e lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio (PBS + 0,05% v / v Tween 20).
      2. Bloccare i siti recettoriali di legame liberi nella piastra rivestita con 200 ml di soluzione di BSA 5% in ogni pozzetto con una pipetta multicanale e incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente.
      3. Eliminare la soluzione di saturazione (vedi punto 2.1.2.1.) E lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio.
      4. Preparare il ricombinante His-tag ligandi a diverse concentrazioni (ad esempio, 8 mg / ml, 4 mg / ml, 2 mg / ml, 1 mg / ml, 0,5 mg / ml, 0,25 mg / ml, 0,125 mg / ml, 0,063 mcg / ml, 0,031 mg / ml, 0,0 mg / ml) in PBS. Aggiungere solo PBS nei pozzetti del bianco.
      5. Aggiungere 100 ml di ciascuna concentrazione ligando ai pozzetti in duplicato e incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente permettendo recettore-ligandointerazione.
    3. L'incubazione con anticorpi
      1. Dopo l'incubazione con i ligandi, lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio.
      2. Dispensare 100 l di suo anti-soluzione principale del mouse anticorpo monoclonale (1: 1.000) in ogni pozzetto.
      3. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore; Dopo l'incubazione, scartare la soluzione di anticorpi (vedi punto 2.1.2.1.) e lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio.
      4. Aggiungere 100 ml di HRP accoppiati capra soluzione di anticorpo secondario anti-topo IgG (1: 10.000) in ogni pozzetto. Incubare la piastra per 45 minuti a temperatura ambiente.
      5. Scartare la soluzione di anticorpi (vedi punto 2.1.2.1.) E lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio.
    4. L'aggiunta di substrato e lo Sviluppo
      1. Portare le soluzioni del substrato TMB a RT e preparare TMB soluzione di substrato A e B in rapporto 1: 1. Aggiungere 100 ml preparati al momento substrato di ogni bene e mantenere la piastra a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Dopo col sufficienti o sviluppo aggiungere la soluzione di arresto 50 ml.
    5. Leggere la piastra e analisi dei dati
      NOTA: Il protocollo descritto si basa sul presupposto che il segnale misurato sale dal legame specifico. Potrebbe essere necessario stimare il contributo di legame aspecifico al segnale ma questo è fuori della portata di questo protocollo.
      1. Leggere l'assorbanza (densità ottica, OD) direttamente a 450 nm.
      2. Sottrarre il segnale di fondo ai valori della DO misurati e li normalizza. Trasformare tutti i valori della concentrazione di ligando in scala logaritmica (base 10, log 10).
      3. Tracciare la normalizzata e di fondo corretta valori di OD (asse Y, corrisponde alla frazione di siti di legame del recettore occupati) contro il logaritmo della concentrazione di ligando (asse X, log scala 10).
      4. Per stimare il valore di K D, inserire i dati per il seguente modulo dell'equazione Hill:
        tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
        NOTA: Qui Y indica la frazione dei siti occupati del recettore di legame e Y max il legame massimo; [L] indica la concentrazione di legante libero e il coefficiente di Hill. Se vi è un solo sito di legame per il ligando, il coefficiente di Hill è n = 1. Per sistemi con più di un ligando sito di legame, l'esposizione vincolanti cooperatività positivo se n> 1, cooperatività negativa se n <1 e non cooperatività se n = 1. la costante di dissociazione microscopica è definito e corrisponde alla metà effettiva concentrazione massima EC 50 6. La costante di dissociazione apparente è K d = (K D) n. Nel caso più semplice in cui n = 1, la dissociazione corrisponde costanti a concentrazione ligando in cui la metà del recettore siti di legame sono occupati e K d = K D. Questo modello assume azione di massa vincolante in condizioni di equilibrio, e che soltanto una piccola frazione diil legante aggiunto è legato al recettore, cioè, [L] >> [RL].

Figura 1
Figura 1. saggio diretto ligando-recettore interazione (LRA diretta). Step-by-step di protocollo per LRA diretta. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Concorso ligando-recettore-Interaction Assay (competizione LRA)
    NOTA:. Per un'illustrazione del flusso di lavoro vedi Figura 2 La procedura di concorso LRA segue la stessa procedura come il LRA diretta (rivestimento della piastra, l'incubazione anticorpo, sviluppo targa) ad eccezione di importanti cambiamenti nel legante e peptidi passo oltre. Regolari controlli negativi sono essenziali per questo test. In uno studio di screening precedente <sup> 4, il peptide bloccando strapazzate non ha mostrato effetti antagonisti.
    1. Blocco - aggiunta di leganti e peptidi di blocco
      1. Il giorno seguente, togliere la soluzione di rivestimento e lavare la piastra (vedi 2.1.2.1).
      2. Bloccare la piastra rivestita con l'aggiunta di 200 ml di soluzione di BSA 5% in ogni pozzetto ed incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente.
      3. Preparare i ligandi His-tag ricombinanti (IFNL1-3) ad una concentrazione fissa (2x-20 ng / ml) in PBS.
      4. Preparare il peptide bloccante (vedi tabella 3) con differenti concentrazioni comprese tra 10 nM e 100 pM in PBS per garantire una curva dose-risposta.
        NOTA: Ciò consente successiva determinazione del valore IC50 per il peptide di blocco. In pozzetti di controllo, aggiungere concentrazione ligando solo fisso senza peptide di ricavare il massimo (100%) vincolante. Nel vuoto, solo aggiungere PBS senza legante o peptide.
      5. Aggiungere 50 ml di ligandi (IFNL1-3) e 50 ml di ogni peconcentrazione ptide ai pozzetti di duplicati.
      6. Incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente.
    2. Leggere la piastra e analisi dei dati
      NOTA: Il protocollo descritto si basa sul presupposto che il segnale misurato sale dal legame specifico. Potrebbe essere necessario stimare il contributo di legame aspecifico al segnale ma questo è fuori della portata di questo protocollo.
      1. Leggere l'assorbanza (densità ottica, OD) direttamente a 450 nm.
      2. Sottrarre il segnale di fondo ai valori della DO misurati e li normalizza. Trasformare tutti i valori della concentrazione di peptide in scala logaritmica (base 10, log 10).
      3. Tracciare la normalizzata e di fondo corretta valori di OD (asse Y, corrisponde alla frazione di siti di legame del recettore occupati) contro il logaritmo della concentrazione di ligando (asse X, log scala 10).
      4. Per stimare il valore di IC 50, inserire i dati alla seguente equazione:
        Equazione 2
        NOTA: Qui [P] è la concentrazione del peptide ed il pendio della collina. La pendenza Hill descrive la pendenza della curva dose-risposta. La IC 50 corrisponde alla concentrazione dell'inibitore alla quale si osserva il 50% di inibizione del legame tra il ligando e recettore.

figura 2
Figura 2. Concorrenza ligando-recettore interazione saggio (concorrenza LRA). Step-by-step di protocollo per LRA concorrenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

Le costanti di dissociazione tra INFL1-3 e loro recettore subunità alfa IL28RA sono stati determinati utilizzando il LRA diretta. I risultati sono mostrati in Figura 3: La frazione dei siti di legame occupati è tracciata contro il logaritmo della rispettiva concentrazione di IFN. La trama Scatchard dei dati è mostrata nell'angolo in basso a destra. I risultati illustrano che l'Lra diretta produce una curva di legame, che può essere ulteriormente analizzati per stimare il valore K D. Il valore di K D è stato determinato inserendo i dati dell'equazione Hill (equazione 1).

IFNL1 ha la più alta affinità di legame, seguito da IFNL2 e IFNL3. Il coefficiente di Hill n> 1 suggerisce aumentato affinità per i ligandi supplementari dopo l'interazione ligando-recettore iniziale (vedi la discussione). Le costanti di dissociazione stimati e coefficienti Hill vengono riassunti nella Tabella 1.

Competitive LRA stata usata per quantificare l'impatto di un peptide bloccante sull'interazione tra IFNL1-3 e IL28RA (Figura 4). La frazione di siti di legame occupati per una concentrazione ligando di 10 ng / ml è tracciata contro il logaritmo della concentrazione di peptide. Per stimare i valori di IC 50, il dato è montato equazione 2.

Il peptide bloccante inibito l'interazione tra IFNL3 e IL28RA (IC 50 = 0,26 pM) per quanto. L'IC 50 è due volte più elevato per l'interazione IFNL2-IL28RA (IC50 = 0.50 micron) e un ordine di grandezza superiore per l'interazione IFNL1-IL28RA, indicativa il peptide è stato meno efficace a interrompere le interazioni IFNL1-IL28RA. I determinati valori di IC 50 e Hill piste sono riassunti nella Tabella 2.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> l'analisi dei dati sono fondamentali per comprendere l'interazione ligando-recettore I risultati mostrati sono stati generati utilizzando un software di grafica scientifica come GraphPad Prism Per la determinazione del valore K D.. , i dati sono stati montato sul 'Un sito - di legame specifico con Hill pista'. (. corrisponde a Equazione 1 nel par 2.2.1) per la determinazione IC50 valore, il dato è montato registro la funzione '(inibitore) vs . normalizzata risposta -. pendenza variabile '(. vedi Equazione 2 in Sec 2.2.2) Tuttavia, qualsiasi software per l'analisi di regressione non lineare può essere utilizzato.

Figura 3
Figura 3. Risultati del test diretta ligando-recettore (LRA diretta). Curve vincolanti per la rilegatura di IFNL1 (verde), IFNL2 (rosso) e IFNL3 (blu) per IL28RA. La rispettiva plot Scatchard in basso a destraangolo suggerisce positivo co-operatività del legame. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Risultati del saggio ligando-recettore competitivo (LRA competitivo). Curve dose-risposta che mostra l'inibizione del legame di IFNL1 (10 ng / ml, verde), IFNL2 (10 ng / ml, rosso) e IFNL3 (10 ng / ml, blu) per IL28RA da parte del peptide di 20 aa. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1: Stima costanti di dissociazione (K D) E coefficienti Hill di IFNL1-3 vincolanti per IL28RA. L'errore standard (SE) è data per un campione di quattro repliche per punto dati.

Tabella 2
Tabella 2:. Stima mezzo massime concentrazioni inibitorie (IC 50) dei peptidi di blocco e il pendio della collina della curva dose-risposta per il legame di IFNL1-3 per IL28RA La concentrazione di IFN è di 10 ng / ml. Il numero di repliche è tre.

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Discussion

ELISA è uno standard e il metodo consolidato per molti laboratori. Abbiamo ulteriormente modificato e migliorato un metodo 5,7 precedentemente pubblicato. Il protocollo passo-passo dimostrato mostra come può essere utilizzato in modo semplice per determinare i valori K D di interazioni ligando-recettore. Inoltre, la IC50 di un peptide bloccante che interferisce con l'interazione ligando-recettore può essere determinato.

I principali vantaggi sono la rapida messa a punto, facile preparazione di reagenti e gestione familiare, come la maggior parte i ricercatori hanno utilizzato un protocollo ELISA prima. Il protocollo LRA diretta è molto flessibile e può essere adattato a misurare molte interazioni proteina-proteina. proteine ​​ricombinanti con His6- o tag alternativa devono essere usati come il partner di legame a un partner immobilizzato. L'LRA concorrenza può essere sfruttata come strumento di screening per (i) determinare il potenziale inibitorio di blocco composti (peptidi, anticorpi, o piccolo molecules) e (ii) determinare i siti critici di interazione utilizzando peptidi di blocco progettato per imitare il recettore o il ligando.

I controlli negativi sono essenziali per una corretta interpretazione dei saggi presentati. In un precedente studio di screening 4, la sequenza strapazzate del peptide bloccante utilizzato non ha mostrato effetti antagonistici. Tuttavia, altri peptidi hanno mostrato una capacità di bloccaggio anche dopo scrambling, probabilmente a causa di interazioni elettrostatiche aspecifici.

Un potenziale limitazione è che questo saggio riflette una situazione in vitro. In particolare, i recettori eterodimeriche spesso formano una struttura più complessa. Non è possibile distinguere se il ligando appena si lega al recettore o se il ligando attiva anche il recettore innescando un cambiamento conformazionale o dimerizzazione, che a sua volta porta ad un segnale intracellulare. Nel saggio presentato, abbiamo usato un recettore ricombinante, che è Immobilized ad una fase solida. Questa impostazione non funziona per testare l'attivazione o per indagare l'interazione dei recettori, che richiedono l'ambiente a membrana o colesterolo di membrana, come recettori accoppiati alle proteine ​​G (GPCR). Anche l'uso di proteine ​​ricombinanti solleva avvertimenti. Ad esempio, la struttura piegatura e terziaria di una proteina ricombinante può essere diverso rispetto a una situazione in vivo. Il legame del ligando e del recettore di solito avviene a temperatura ambiente, tuttavia nell'uomo la temperatura ottimale sarebbe 37 ° C. Infine, l'uso di legante ricombinante commerciale e recettore può rivelarsi costoso. Nonostante queste limitazioni, questi due protocolli ELISA mostrano il potenziale per esplorare rapidamente l'interazione ligando-recettore.

I risultati presentati dimostrano che IFNL1 ha un'affinità leggermente superiore per IL28RA rispetto a IFNL2, e l'affinità di IFNL3 è tre volte più basse IFNL2. Questo è notevole considerando la somiglianza tra IFNLs. DIF IFNL1 e IFNL2Fer a 33 aminoacidi, mentre IFNL2 e IFNL3 differiscono solo in sette aminoacidi 8. L'interazione tra IL28RA e IFNLs coinvolge Helix A e AB-loop di IFNL 9. L'allineamento di sequenze IFNL rivela quattro differenze significative nella Helix A e AB-loop tra IFNL1 e IFNL3 (Figura 5A). Uno colpisce il ponte salino Arg54-Glu119. I residui di aminoacidi in questa sezione sono elencati in base al UniProt voci Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) e Q8IU57 (IL28RA), che è stato trovato nella struttura cristallina del IFNL1-IL28R1 complesso (Figura 5B). Allineamento strutturale mostra che Arg57 in IFNL1 è sostituito da Lys57 in INFL3, che è anche in grado di formare un ponte salino con Glu118 (Figura 5C). In linea con la diminuzione affinità di IFNL3 e IL28RA, computazionale 10,11 e mutazionale 12 analisi dimostrano, che Lys-Glu ponti salini sono in generale meno stabili Arg-Glu salt ponti.

Tuttavia, le differenze di Helix A non soddisfacente spiegano l'affinità inferiore IFNL3, poiché la sequenza aminoacidica della Helix A è identico per IFNL2 e IFNL3. Si pensa che la differenza principale deriva dalle mutazioni nel AB-loop, dove Arg74 e His76 in IFNL2 sono sostituiti da Lys70 e Arg72 in IFNL3 8.

Inoltre, le differenze di stabilità e solubilità tra IFNLs possono anche influenzare l'esito del test. Dal momento che il test diretto LRA utilizza concentrazioni da NM a M e la concentrazione fisiologica di citochine nel siero risiede nel PM a Nm gamma, l'aggregazione di IFNL non può essere esclusa. Si può presumere che la cooperatività positiva osservata dell'IFN legame è causato da un aumento specifico o non specifico in ligando-recettore di legame, ad esempio, un dimerizzazione del recettore IL28RA ricombinante in soluzione, o un legame di un secondo legante o un frammento legante con una maggiore affinità. HoWever, ulteriori studi sono necessari per verificare questo.

Il peptide bloccante utilizzato nelle imita dell'LRA concorrenza AB-loop di IFNL3 (Figura 6). Come precedentemente descritto, l'AB-loop svolge un ruolo fondamentale nell'interazione tra IFNLs e IL28RA 9, particolarmente IFNL2 e IFNL3. Omologia modellazione IFNL3 con struttura cristallina IL28RA / IFNL1 mostra che la regione, corrispondente al peptide bloccaggio si trova in prossimità spaziale all'interfaccia interazione con IL28RA (Figura 6). Supposto che i blocchi peptide l'interazione della AB-loop di IFNL e IL28RA. I risultati del supporto concorso LRA questo: Il peptide ha un effetto inibitorio sul legame di tutti IFNLs, tuttavia il peptide è un inibitore più efficace dell'interazione tra IL28RA eo IFNL3 o IFNL2 rispetto dell'interazione di IFNL1 e IL28A. Come previsto, i blocchi peptidici il legame del IFNL3 più efficace poichéoccupa esattamente la stessa tasca vincolante l'AB-loop di IFNL3.

Come mostrato nella Tabella 3, le AB-anelli di IFNL1 e IFNL2 allineati ai peptide blocco differiscono. Coerentemente con il più basso valore di IC50 del peptide per l'inibizione dell'interazione IFNL1 / IL28RA, dodici aminoacidi differiscono tra IFNL1 e il peptide, mentre e solo due amminoacidi differiscono IFNL2 e il peptide. Questo indica che ci sono un po 'diverse modalità di legame per l'interazione tra le AB-loop dei IFNLs e IL28RA e prevede che i peptidi che imitano IFNL1 sarebbero più efficaci nel bloccare l'interazione tra IFNl1 e IL28RA che l'interazione tra IFNL3 e IL28RA.

Inoltre, il peptide viene complessiva carica positiva (quattro arginina e due residui di lisina ma solo due residui di aspartato) e analisi computazionale mostra che il peptide non ha motivi secondari definiti. Grazie alla sua spiralato, flessibile structure il peptide potrebbe anche legarsi ad altre regioni del recettore. Questo potrebbe bloccare glutammato e aspartato residui come D118, che forma un ponte salino di stabilizzare il complesso ligando-recettore (Figura 5B e 5C).

Figura 5
Figura 5. confronto strutturale di IFNL1 (verde) e IFNL3 (blu). Atomi di ossigeno sono mostrati in rosso, atomi di azoto sono mostrati in blu. (A) sovrapposizione delle IFNL1 IL28RA-bound e IFNL3 (IL28RA non mostrato). La radice scarto quadratico medio (RMSD) di tutti gli atomi allineati è 0,672 Å. catene laterali di IFNL3 che differiscono da IFNL1 sono evidenziate in luce-colore rosa. Ponte (B) sale tra Arg54 e D118. (C) IFNL3 Allineato per IFNL1 IL28RA-bound (IL28RA è mostrata in grigio). L'allineamento mostra che il sale bri Arg-GluDGE è probabilmente sostituito da un meno stabile Lys-Glu, un sale-ponte tra Lys57 e D118. PyMol è stato utilizzato per la preparazione di figure e per l'allineamento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Allineamento della IFNL3 e IFNL1-IL28RA complesso (IFNL1 non mostrato). IFNL3 è mostrato in blu e il IL28RA in grigio. Le regioni corrispondenti al peptide di blocco sono evidenziati in viola. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 3
Tabella 3:

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) Thermo Scientific 442404 ELISA plate
Sodium carbonate (Na2CO3) Merck 497-19-8 For ELISA plate coating buffer
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) Merck 144-55-8 For ELISA plate coating buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030-100G 5% BSA in PBS for Blocking
rhIL-28Rα/IFNλR1 R&D systems 5260-MR Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha
rhIL-29/IFNλ1 R&D systems 1598-IL/CF Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag
rhIL-28A/IFNλ2 R&D systems 1587-IL/CF Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag
rhIL-28B/IFNλ3 R&D systems 5259-IL/CF Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag
6x His Monoclonal antibody (Mouse) Clontech 631212 Primary antiboy to capture His tagged Ligands
Goat anti-Mouse igG (H+L) Jackson Immuno Research 115-035-166 Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody
BDoptEIA TMB reagent set BD Biosciences 555214 ELISA - TMB substrate solution
Sulfuric acid (H2SO4) Fulka 84720 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution)
Synergy/H1 - Microplate reader BioTeK ELISA plate reader

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References

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Chimica ELISA lo screening l'interazione ligando-recettore dissociazione costante affinità di legame il blocco
Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore
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Syedbasha, M., Linnik, J., Santer,More

Syedbasha, M., Linnik, J., Santer, D., O'Shea, D., Barakat, K., Joyce, M., Khanna, N., Tyrrell, D. L., Houghton, M., Egli, A. An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions. J. Vis. Exp. (109), e53575, doi:10.3791/53575 (2016).

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