Introduction
فهم شامل للمسارات إشارات يتطلب معرفة تفصيلية عن التفاعل يجند مستقبلات. معظم وسائل لتقييم تفاعل يجند خاص مع مستقبلات معينة لها مكلفة ومستهلكة للوقت والعمل مكثفة وتتطلب معدات وخبرات 1 محددة.
توضح هذه المقالة بروتوكولين سريعة وموثوق بها نقطة بنقطة للتحقيق التفاعل يجند مستقبلات بناء على انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA): ومباشر يجند مستقبلات التفاعل فحص (جيش الرب للمقاومة) وجيش الرب للمقاومة المنافسة. إليسا هي تقنية حساسة للغاية ومحددة ومتاحة بسهولة، وتستخدم بشكل روتيني في مختبر تقريبا. إليسا لا يمكن أن يؤديها وتكييفها في الموضات المختلفة. يتم تحسين البروتوكولات المعروضة للتحقيق التفاعل بين إنترفيرون مختلفة امدا (INFLs) ومستقبلات بهم.
جيش الرب للمقاومة المباشر يسمح لquantificatiعلى من يجند مستقبلات ملزمة فيما يتعلق تركيز يجند وبالتالي ينتج منحنى ملزم. باستخدام نموذج مناسب للتفاعل يجند مستقبلات، البيانات يمكن تحليلها لتقدير ثابت التفكك (K D).
في بروتوكول المعروضة، يتم تطبيق هيل المعادلة التي يشيع استخدامها في تصميم نموذج ليجند مستقبلات ملزمة. رغم أن هناك طرقا أخرى مثل تكنولوجيا الرنين مأكل سطح 2،3 تسمح تحديد الانتماءات الملزمة بين اثنين من البروتينات، وهذه التكنولوجيا هي في كثير من الأحيان كثيفة العمالة، ومكلفة، وتتطلب معدات المختبرات الخاصة.
جيش الرب للمقاومة المنافسة يمكن فحص الببتيد المثبطة: كميا ويجند مستقبلات ملزم فيما يتعلق تركيز الببتيد. هذا ينتج منحنى الاستجابة للجرعة واصفا تأثير كابح من الببتيد. البيانات يمكن تحليلها لتقدير نصف تركيز مثبط القصوى (IC 50
كلا البروتوكولين إليسا هي سهلة الاستخدام، ويمكن أن تتكيف مع مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية. البروتينات المؤتلف من أي نوع يمكن استخدامها لتحديد موثوق وسريع الأجزاء التفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، جيش الرب للمقاومة المنافسة يمكن استخدامها لتحديد مواقع التفاعل تنتقد بروابط ومستقبلات باستخدام منع الببتيدات، والتي صممت لتحاكي إما يجند أو مستقبلات. إذا أظهر الببتيد عرقلة وتثبيط فعالية ومحددة، الببتيد يحتل موقعا حاسما تفاعل يجند (إذا كان يقلد الببتيد مستقبلات) أو من يجند (إذا كان يقلد الببتيد يجند).
يصف البروتوكول الأول تحديد K D قيمة INFLs مختلفة والوحيدات ألفا من المستقبلات الخاصة بهم، أي مستقبلات انترلوكين 28 (IL28RA) باستخدام جيش الرب للمقاومة المباشر. بعد ذلك، يوضح البروتوكول الثاني كيفية تحديد قدرة الببتيد 20 الأحماض الأمينية طويلا لتمنع التفاعلات INFL-IL28RA. تم تصميم الببتيد للتنافس مع IFNLs في موقع مستقبلات تجليدها وبالتالي يمكن فهم الجزيئي للتفاعل. وعلاوة على ذلك، وهذا الببتيد يمكن استخدامها لمنع IL28RA في تجارب في المختبر لتحديد تأثير ذلك على آثار يشير المصب 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكاشف
- لإعداد عازلة طلاء كربونات، ويحل 0.36 ز نا 2 CO 3 و 0.84 غرام NaHCO 3 في 100 مل من الماء المقطر. تصفية العقيمة المخزن المؤقت باستخدام فراغ مدفوعة 0.22 ميكرون polyethersulfone (PES) غشاء تصفية وتخزينها في RT حتى الاستخدام.
- إعداد الحل غسل بإضافة 0.05٪ ت / ت توين 20 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- إعداد 5٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) (حل حجب) في حل برنامج تلفزيوني عن طريق إذابة 5 ز BSA (≥98٪) في 100 مل برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- المؤتلف مستقبلات، الليجندات والببتيدات حجب
- Reconstitutethe المؤتلف الإنسان فرعية انترلوكين مستقبلات ألفا (IL28RA) والمؤتلف بروابط صاحب الموسومة من الإنترفيرون البشري (IFNL1-3) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ومخزن في -80 درجة مئوية. Synthetize منع الببتيدات واستخدامها كما هو موضح سابقا (4). استخدام برنامج تلفزيوني لإعداد تركيزات مختلفة من يجندالصورة والببتيدات لاستخدامها في المقايسات.
- لإعداد الأجسام المضادة الأولية، وتمييع 6X صاحب ماوس الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ BSA في 1: 1000 تخفيف. لإعداد الأجسام المضادة الثانوية، وتمييع الفجل البيروكسيديز (HRP) مترافق الماعز المضادة للماوس مفتش (H + L) في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ BSA في 1: 10000 التخفيف.
- يعد حل جهاز الرصد عن طريق خلط الكواشف ألف وباء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إعداد توقف الحل بإضافة 5 N حامض الكبريتيك (H 2 SO 4) في الماء المقطر وتخزينها في RT.
2. انزيم مرتبط المناعي فحوصات (ELISAs)
ملاحظة: مباشر التفاعل يجند مستقبلات ELISA (جيش الرب للمقاومة المباشر، الشكل 1) يمكن استخدامها لقياس التفكك مستقبلات يجند ثابت (K D)، كمقياس للتقارب مستقبلات يجند ملزمة. التفاعل المنافسة يجند مستقبلات ELISA (جيش الرب للمقاومة المنافسة، الشكل 2) كلالدودة الحلزونية فحص من الببتيدات (وغيرها من المركبات تسد)، والتي تعمل على التدخل في التفاعل بين يجند والمستقبلة. البروتوكول الأساسي الذي تم نشره سابقا 5 تم تحسين أبعد من ذلك.
ملاحظة: في كلا ELISA استخدام أساليب متعددة ماصة لإضافة حلول للآبار لوحة 96-جيدا في كل خطوة. في حل صب أو غسل الخطوات، التخلص من الحلول مباشرة في الحوض.
- مباشر يجند مستقبلات-التفاعل الفحص (مباشر جيش الرب للمقاومة)
ملاحظة: للحصول على توضيح سير العمل (انظر الشكل 1).- لوحة طلاء مع مستقبلات المؤتلف
- تمييع مستقبلات المؤتلف في المخزن كربونات إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر. آبار معطف من 96-جيدا لوحة التلازن مع تركيز مستقبلات ثابت (100 نانوغرام / ميكرولتر) من قبل pipetting 100 ميكرولتر من كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. استبعاد الجدران الخارجية للوحة لتجنب جيدا قطعة أثرية الحافة. تغطية لوحة مع غطاء واحتضانلوحة في 4 درجات CO / N.
- الحجب وإضافة الليجندات
- في اليوم التالي، وإزالة حل طلاء عن طريق إمالة لوحة ضد الحوض وغسل لوحة 3 مرات مع حل غسل (PBS + 0.05٪ ت / ت توين 20).
- منع المواقع ملزم مستقبلات الحرة في لوحة المغلفة باستخدام 200 ميكرولتر من 5٪ حل جيش صرب البوسنة إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية واحتضان لوحة لمدة 2 ساعة على RT.
- تجاهل عرقلة الحل (راجع الخطوة 2.1.2.1.) وغسل لوحة 3 مرات مع حل الغسيل.
- إعداد صاحب الموسومة بروابط المؤتلف بتركيزات مختلفة (على سبيل المثال، 8 ميكروغرام / مل، 4 ميكروغرام / مل، 2 ميكروغرام / مل، 1 ميكروغرام / مل، و 0.5 ميكروغرام / مل، 0.25 ميكروغرام / مل، 0.125 ميكروغرام / مل، 0.063 ميكروغرام / مل، 0.031 ميكروغرام / مل، 0.0 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني. إضافة الوحيد في برنامج تلفزيوني في الآبار فارغة.
- إضافة 100 ميكرولتر من كل تركيز يجند إلى الآبار في مكررة واحتضان لوحة لمدة 2 ساعة على RT السماح مستقبلات يجندالتفاعل.
- الحضانة مع الأجسام المضادة
- وبعد الحضانة مع بروابط، وغسل لوحة 3 مرات مع حل الغسيل.
- ماصة 100 ميكرولتر المضادة له، والحل الأساسي الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (1: 1000) إلى كل بئر.
- احتضان لوحة في RT لمدة 2 ساعة. بعد الحضانة، وتجاهل الحل الأجسام المضادة (راجع الخطوة 2.1.2.1.) وغسل لوحة 3 مرات مع حل الغسيل.
- إضافة 100 ميكرولتر من برنامج الصحة الإنجابية يقترن الماعز المضادة للماوس مفتش حل الضد الثانوية (1: 10000) إلى كل بئر. احتضان لوحة لمدة 45 دقيقة في RT.
- تجاهل حل الأجسام المضادة (راجع الخطوة 2.1.2.1.) وغسل لوحة 3 مرات مع حل الغسيل.
- إضافة الركيزة والتنمية
- تقديم حلول الركيزة TMB إلى RT، وإعداد تمب الركيزة حل A و B في نسبة 1: 1. إضافة 100 ميكرولتر الطازجة الركيزة على كل جانب والحفاظ على لوحة على RT لمدة 15-30 دقيقة. بعد العقيد كافية أو التطوير إضافة 50 ميكرولتر توقف الحل.
- قراءة اللوحة وتحليل البيانات
ملاحظة: يقوم بروتوكول الموصوفة على افتراض أن إشارة قياس ترتفع من ملزمة محددة. قد يكون من الضروري تقدير مساهمة غير محددة ملزمة للإشارة لكن هذا هو خارج نطاق هذا البروتوكول.- قراءة الامتصاصية (الكثافة الضوئية، OD) مباشرة في 450 نانومتر.
- طرح إشارة الخلفية من القيم OD قياس وتطبيع هذه العلاقات. تحويل جميع قيم تركيز يجند إلى مقياس لوغاريتمي (القاعدة 10، تسجيل 10).
- مؤامرة تطبيع والخلفية تصحيح القيم OD (العمودي، يتوافق مع جزء من مواقع مستقبلات ملزمة المحتلة) ضد لوغاريتم تركيز يجند (المحور السيني، وتسجيل 10 الحجم).
- لتقدير قيمة K D، وتناسب البيانات إلى النموذج التالي من المعادلة هيل:
tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
ملاحظة: هنا Y يدل على جزء من مواقع الربط مستقبلات المحتلة وY ماكس على الحد الأقصى ملزمة. [L] يدل على تركيز يجند مجانا ومعامل هيل. إذا كان هناك موقع واحد فقط ملزم ليجند، ومعامل هيل ن = 1. للحصول على أنظمة مع موقع يجند أكثر من واحد ملزم، المعارض ملزمة cooperativity إيجابية إذا كان n> 1، cooperativity السلبية إذا كان n <1 و لا cooperativity إذا كان n = 1. يسمى ثابت التفكك المجهري ويتوافق مع نصف التركيز الفعال الأقصى EC 50 6. التفكك ثابت واضح هو ك د = (K D) ن. في أبسط الحالات حيث n = 1، والتفكك يتوافق مستمرة للتركيز يجند التي تشغل نصف مستقبلات مواقع الربط وك د = ك د. يفترض هذا النموذج العمل الجماعي ملزما بموجب شروط التوازن، فضلا عن أنه ليس هناك سوى جزء صغير منلا بد من يجند إضافة إلى مستقبلات، أي [L] >> [RL].
- لوحة طلاء مع مستقبلات المؤتلف
الشكل 1. المباشر يجند مستقبلات التفاعل فحص (جيش الرب للمقاومة المباشر). بروتوكول خطوة بخطوة لجيش الرب للمقاومة المباشر. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- المنافسة يجند مستقبلات-التفاعل الفحص (المنافسة جيش الرب للمقاومة)
ملاحظة: للحصول على توضيح سير العمل انظر الشكل 2 ويأتي هذا الإجراء جيش الرب للمقاومة المنافسة نفس الخطوات جيش الرب للمقاومة المباشر (طلاء لوحة، والأجسام المضادة الحضانة، وتطوير لوحة) باستثناء تغييرات هامة في يجند والببتيدات خطوة بالإضافة. ضوابط السلبية السليمة ضرورية لهذا الاختبار. في دراسة فحص السابقة <سوب> 4، الببتيد منع سارعت لم تظهر آثار معادية.- الحظر - إضافة الليجندات والببتيدات حجب
- في اليوم التالي، وإزالة حل طلاء وغسل لوحة (انظر 2.1.2.1).
- منع المغلفة لوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 5٪ حل جيش صرب البوسنة إلى كل بئر واحتضان لوحة لمدة 2 ساعة على RT.
- إعداد المؤتلف بروابط صاحب الموسومة (IFNL1-3) بتركيز ثابت (2X 20 نانوغرام / مل) في برنامج تلفزيوني.
- إعداد الببتيد الحجب (راجع الجدول رقم 3) مع تركيزات مختلفة تتراوح ما بين 10 نانومتر إلى 100 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني لضمان منحنى الاستجابة للجرعة.
ملاحظة: وهذا يتيح قرار لاحق من قيمة IC 50 لالببتيد حظر. في آبار المراقبة، إضافة تركيز يجند فقط ثابت دون الببتيد لاستخلاص أقصى (100٪) ملزمة. في الفراغ، إضافة الوحيد PBS دون يجند أو الببتيد. - إضافة 50 ميكرولتر من بروابط (IFNL1-3) و 50 ميكرولتر من كل البولي ايثيلينتركيز ptide إلى الآبار في مكررة.
- احتضان لوحة لمدة 2 ساعة على RT.
- قراءة اللوحة وتحليل البيانات
ملاحظة: يقوم بروتوكول الموصوفة على افتراض أن إشارة قياس ترتفع من ملزمة محددة. قد يكون من الضروري تقدير مساهمة غير محددة ملزمة للإشارة لكن هذا هو خارج نطاق هذا البروتوكول.- قراءة الامتصاصية (الكثافة الضوئية، OD) مباشرة في 450 نانومتر.
- طرح إشارة الخلفية من القيم OD قياس وتطبيع هذه العلاقات. تحويل جميع قيم تركيز الببتيد إلى مقياس لوغاريتمي (القاعدة 10، تسجيل 10).
- مؤامرة تطبيع والخلفية تصحيح القيم OD (العمودي، يتوافق مع جزء من مواقع مستقبلات ملزمة المحتلة) ضد لوغاريتم تركيز يجند (المحور السيني، وتسجيل 10 الحجم).
- لتقدير قيمة IC 50، احتواء البيانات للمعادلة التالية:
ملاحظة: هنا [ف] هو تركيز الببتيد والمنحدر هيل. يصف المنحدر هيل شدة الانحدار في منحنى الاستجابة للجرعة. وIC 50 يتوافق مع تركيز مثبط الذي لوحظ 50٪ من تثبيط ملزمة بين يجند والمستقبلة.
- الحظر - إضافة الليجندات والببتيدات حجب
الشكل 2. المنافسة يجند مستقبلات التفاعل فحص (جيش الرب للمقاومة المنافسة). بروتوكول خطوة بخطوة لجيش الرب للمقاومة المنافسة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تحديد ثوابت التفكك بين INFL1-3 وعلى مستقبلات ألفا فرعية IL28RA باستخدام جيش الرب للمقاومة المباشر. وتظهر النتائج في الشكل (3): يتم رسم جزء من مواقع الربط المحتلة ضد لوغاريتم تركيز الإنترفيرون منها. ويظهر المؤامرة سكاتشارد البيانات في أسفل الزاوية اليمنى. وتوضح النتائج أن جيش الرب للمقاومة المباشر ينتج منحنى ملزم، والتي يمكن لمزيد من التحليل لتقدير قيمة K D. تم تحديد قيمة K D عن طريق تركيب البيانات إلى المعادلة هيل (المعادلة 1).
IFNL1 لديها أعلى النسب ملزمة، تليها IFNL2 وIFNL3. ن هيل معامل> 1 يقترح زيادة تقارب لبروابط إضافية بعد الأولي التفاعل يجند مستقبلات (انظر مناقشة). وتتلخص الثوابت تفارق المقدرة ومعاملات هيل في الجدول 1.
وقد استخدم جيش الرب للمقاومة تنافسية ل quantitate تأثير الببتيد الحجب على التفاعل بين IFNL1-3 وIL28RA (الشكل 4). يتم رسم جزء من مواقع الربط المحتلة لتركيز يجند من 10 نانوغرام / مل ضد لوغاريتم تركيز الببتيد. لتقدير القيم IC 50، تم تجهيز البيانات للمعادلة 2.
مستعمل الببتيد منع التفاعل بين IFNL3 وIL28RA (IC 50 = 0.26 ميكرومتر) إلى أقصى حد. وIC 50 هو مثلي ارتفاع للتفاعل IFNL2-IL28RA (IC 50 = 0.50 ميكرومتر) والنظام واحد من حجم أكبر للتفاعل IFNL1-IL28RA، إنما يدل على الببتيد أقل فعالية في تعطيل التفاعلات IFNL1-IL28RA. ولخص تحديد IC 50 قيم ومنحدرات التل في الجدول 2.
_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> تحليل البيانات السليم هو ضروري لفهم التفاعل يجند مستقبلات تم إنشاء أظهرت النتائج باستخدام برنامج الرسوم البيانية العلمية مثل GraphPad بريزم ولتحديد قيمة K D. ، تم تركيب البيانات إلى "موقع واحد - محددة ملزمة مع تل منحدر. (. يناظر المعادلة 1 في ثانية 2.2.1) لتحديد القيمة IC 50، تم تجهيز البيانات إلى سجل وظيفة" (المانع) مقابل . استجابة طبيعية - المنحدر المتغير '(انظر المعادلة 2 في ثانية 2.2.2) ومع ذلك، أي برنامج لتحليل الانحدار غير الخطي يمكن استخدامها.
الشكل 3. نتائج مباشرة لفحص يجند مستقبلات (جيش الرب للمقاومة المباشر). منحنيات ملزمة لربط IFNL1 (الأخضر)، IFNL2 (الحمراء)، وIFNL3 (الأزرق) لIL28RA. المؤامرة سكاتشارد منها في أسفل اليمينوتشير الزاوية الإيجابي المشارك operativity من الربط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. نتائج تنافسية يجند مستقبلات فحص (جيش الرب للمقاومة تنافسية). منحنيات الاستجابة للجرعة التي تبين تثبيط ملزمة من IFNL1 (10 نانوغرام / مل، والأخضر)، IFNL2 (10 نانوغرام / مل، أحمر) وIFNL3 (10 نانوغرام / مل، الزرقاء) لIL28RA من الببتيد 20 أأ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تقدير ثوابت التفكك (K D) ومعاملات هيل IFNL1-3 ملزمة لIL28RA. ويرد الخطأ المعياري (SE) لحجم عينة من أربعة تكرارات لكل نقطة بيانات.
الجدول 2: يقدر نصف تركيزات المثبطة القصوى (IC 50) من الببتيدات الحجب والمنحدر هيل منحنى الجرعة والاستجابة لربط IFNL1-3 إلى IL28RA تركيز الإنترفيرون هو 10 نانوغرام / مل. عدد مكررات ثلاثة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إليسا هو المعيار وطريقة راسخة للعديد من المختبرات. لقد مزيد من التعديل وتحسين طريقة 5،7 المنشورة سابقا. ويبين أثبتت بروتوكول خطوة بخطوة كيف يمكن استخدامها في طريقة بسيطة لتحديد القيم K D التفاعلات يجند مستقبلات. بالإضافة إلى ذلك، IC50 من الببتيد الحجب الذي يتداخل مع التفاعل يجند مستقبلات يمكن تحديدها.
المزايا الرئيسية هي الإعداد السريع، من السهل إعداد الكواشف ومعالجة مألوفة، حيث أن معظم الباحثين قد استخدمت بروتوكول ELISA قبل. بروتوكول جيش الرب للمقاومة المباشر هو درجة عالية من المرونة ويمكن أن تتكيف مع قياس العديد من تفاعلات البروتين البروتين. البروتينات المؤتلف مع His6- أو علامة بديلة يجب أن تستخدم الشريك ملزم لشريك يجمد. جيش الرب للمقاومة المنافسة يمكن استغلالها كأداة فحص ل(ط) تحديد إمكانية المثبطة للحجب المركبات (الببتيدات، والأجسام المضادة، أو مول صغيرالجزيئات) وإلى (ب) تحديد مواقع التفاعل الحرجة باستخدام منع الببتيدات مصممة لتحاكي المستقبل أو يجند.
ضوابط السلبية ضرورية لتفسير الصحيح للفحوصات المقدمة. في دراسة فحص السابقة 4، فإن تسلسل تدافعت من الببتيد منع استخدامها لا تظهر آثار معادية. ومع ذلك، أظهرت الببتيدات أخرى قدرة الحجب أيضا بعد الهرولة، ويرجح ذلك بسبب التفاعلات كهرباء غير محددة.
وجود قيود المحتمل هو أن هذا الاختبار يعكس الوضع في المختبر. على وجه الخصوص، مستقبلات heterodimeric غالبا ما تشكل بنية أكثر تعقيدا. وليس من الممكن التمييز بين ما إذا كان يجند يرتبط فقط لمستقبلات أو ما إذا كان يجند أيضا ينشط مستقبلات عن طريق إحداث تغيير متعلق بتكوين أو dimerization، والذي بدوره يؤدي إلى إشارة داخل الخلايا. في مقايسة المقدمة، استخدمنا مستقبلات المؤتلف، وهو immobiliزد إلى المرحلة الصلبة. هذا الإعداد لا تعمل على اختبار التنشيط أو لتحقيق التفاعل بين مستقبلات، والتي تتطلب بيئة غشاء أو الكوليسترول غشاء مثل G البروتين إلى جانب مستقبلات (GPCRs). أيضا استخدام البروتين المؤتلف يثير المحاذير. على سبيل المثال، بنية قابلة للطي والعالي من البروتين المؤتلف قد تكون مختلفة مقارنة مع الوضع في الجسم الحي. الربط يجند ومستقبلات يحدث عادة في RT، ولكن في البشر فإن درجة الحرارة المثلى أن تكون 37 درجة مئوية. وأخيرا، فإن استخدام يجند المؤتلف التجاري ومستقبلات يمكن أن تثبت مكلفة. وعلى الرغم من هذه القيود، تظهر هذه البروتوكولات ELISA اثنين القدرة على استكشاف بسرعة التفاعل يجند مستقبلات.
تظهر النتائج المقدمة أن IFNL1 لها قابلية أعلى قليلا لIL28RA مقارنة IFNL2، وتقارب من IFNL3 هو ثلاثة أضعاف أقل من IFNL2. هذا أمر رائع نظرا للتشابه بين IFNLs. IFNL1 وIFNL2 DIFفر في 33 الأحماض الأمينية في حين تختلف IFNL2 وIFNL3 فقط في سبع الأحماض الأمينية 8. التفاعل بين IL28RA وIFNLs ينطوي اللولب ألف وAB-حلقة من IFNL 9. محاذاة تسلسل IFNL تكشف أربعة فروق ذات دلالة إحصائية في اللولب ألف وAB-حلقة بين IFNL1 وIFNL3 (الشكل 5A). واحد يؤثر على جسر الملح Arg54-Glu119. يتم تعداد بقايا الأحماض الأمينية في هذا القسم وفقا ليونيبروت إدخالات Q8IU54 (IFNL1)، Q8IZI9 (IFNL3)، Q8IZJ0 (IFNL2) وQ8IU57 (IL28RA)، والتي تم العثور عليها في التركيب البلوري للIFNL1-IL28R1 معقد (الشكل 5B). معارض المواءمة الهيكلية التي Arg57 في IFNL1 يتم استبداله Lys57 في INFL3، التي هي أيضا قادرة على تشكيل جسر الملح مع Glu118 (الشكل 5C). وتمشيا مع تقارب انخفضت من IFNL3 وIL28RA، الحسابية 10،11 وتغيري 12 تظهر التحليلات، أن ليز-غلو الجسور الملح بشكل عام أقل استقرارا من الارجنتين-غلو ش.م.لر الجسور.
ومع ذلك، فإن الاختلافات في اللولب ولا تفسر مرض تقارب أقل من IFNL3، منذ تسلسل الأحماض الأمينية من اللولب ومطابق للIFNL2 وIFNL3. ويعتقد أن الفرق الرئيسي ينشأ من الطفرات في AB-حلقة، حيث يتم استبدال Arg74 وHis76 في IFNL2 التي كتبها Lys70 وArg72 في IFNL3 8.
وعلاوة على ذلك، فإن الاختلافات في الاستقرار والذوبان بين IFNLs قد تؤثر أيضا على نتائج الفحص. منذ جيش الرب للمقاومة الفحص المباشر يستخدم بتركيزات تتراوح بين نانومتر إلى M والتركيز الفسيولوجي من السيتوكينات في المصل يكمن في مساء إلى نانومتر المدى، تجميع IFNL لا يمكن استبعادها. يمكننا أن نفترض أن cooperativity الإيجابية التي من IFN ملزمة سببه الزيادة محددة أو غير محددة في يجند مستقبلات ملزم، على سبيل المثال، وهو dimerization من مستقبلات IL28RA المؤتلف في حل أو ربط ليجند الثاني أو جزء يجند مع ارتفاع تقارب. هوويفر، ويلزم إجراء مزيد من الدراسات للتحقق من ذلك.
الببتيد منع استخدامها في يقلد جيش الرب للمقاومة المنافسة AB-حلقة من IFNL3 (الشكل 6). كما هو موضح سابقا، يلعب AB-حلقة دورا أساسيا في التفاعل بين IFNLs وIL28RA 9، لا سيما IFNL2 وIFNL3. النمذجة تناظر من IFNL3 مع التركيب البلوري IL28RA / IFNL1 يدل على أن المنطقة، والتي تتطابق مع الببتيد حجب تكمن في قربها المكاني إلى واجهة التفاعل مع IL28RA (الشكل 6). من المفترض أن الكتل الببتيد تفاعل AB-حلقة من IFNL وIL28RA. نتائج دعم جيش الرب للمقاومة مسابقة هذا: الببتيد له تأثير كابح بشكل خاص على ربط جميع IFNLs، ولكن الببتيد هو المانع أكثر فعالية من التفاعل بين IL28RA وإما IFNL3 أو IFNL2 من تفاعل IFNL1 وIL28A. كما هو متوقع، لبنات الببتيد وملزمة من IFNL3 أكثر فعالية لأنهتحتل بالضبط نفس جيب ملزم مثل AB-حلقة من IFNL3.
كما هو مبين في الجدول رقم 3، وAB-حلقات IFNL1 وIFNL2 الانحياز إلى الببتيد منع تختلف. وتمشيا مع انخفاض قيمة IC 50 من الببتيد لتثبيط التفاعل IFNL1 / IL28RA، واثني عشر من الأحماض الأمينية تختلف بين IFNL1 والببتيد في حين وتختلف اثنين فقط من الأحماض الأمينية بين IFNL2 والببتيد. هذا يشير إلى أن هناك وسائط ملزمة مختلفة قليلا عن التفاعل بين AB-الحلقات من IFNLs وIL28RA ويتوقع أن الببتيدات التي تحاكي IFNL1 ستكون أكثر فعالية في منع التفاعل بين IFNl1 وIL28RA من التفاعل بين IFNL3 وIL28RA.
وعلاوة على ذلك، وعموما اتهم الببتيد إيجابيا (أربعة أرجينين واثنين من مخلفات يسين ولكن اثنين فقط من مخلفات اسبارتاتي) ويظهر التحليل الحسابي أن الببتيد لا يوجد لديه الدوافع الثانوية التي تم تعريفها. بسبب ملفوف ومرنة الحادية وructure الببتيد قد ربط أيضا إلى مناطق أخرى من مستقبلات. هذا يمكن أن منع الغلوتامات واسبارتاتي المخلفات مثل D118، الذي يشكل جسرا الملح لتحقيق الاستقرار في مجمع يجند مستقبلات (الشكل 5B و5C).
الرقم 5. مقارنة الهيكلية من IFNL1 (الخضراء) وIFNL3 (الأزرق). وتظهر ذرات الأكسجين باللون الأحمر، وتظهر ذرات النيتروجين في الزرقاء. (A) تراكب من IFNL1 متجهة الى IL28RA وIFNL3 (IL28RA لا تظهر). جذر متوسط الانحراف مربع (RMSD) من جميع ذرات الانحياز هو 0.672 Å. ويسلط الضوء على الجانب سلاسل من IFNL3 التي تختلف من IFNL1 في ضوء وردي. جسر (ب) سولت بين Arg54 وD118. (C) IFNL3 الانحياز إلى IFNL1 متجهة الى IL28RA (يظهر IL28RA باللون الرمادي). معارض محاذاة أن الملح بري الارجنتين-حمض الغلوتاميكوربما استبدال DGE قبل أقل استقرارا ليز-غلو، على جسر الملح بين Lys57 وD118. وقد استخدم PyMol لإعداد الأرقام والمحاذاة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويظهر الشكل 6. محاذاة IFNL3 وIFNL1-IL28RA مجمع (IFNL1 لا تظهر). IFNL3 باللون الأزرق وIL28RA في الرمادي. وسلط الضوء على المناطق المقابلة لالببتيد منع باللون الأرجواني. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 3:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
