Introduction
信号通路的全面了解需要有关配体 - 受体相互作用的详细知识。评估其特异性受体的特定配体的相互作用的大多数方法是昂贵的，耗时的，劳动密集型的，并且需要特定的设备和专门知识1。
本文介绍了两个快速和可靠的逐点的协议来调查的基础上的一种酶的配体 - 受体相互作用酶联免疫吸附测定（ELISA）：直接配体 - 受体相互作用测定（LRA）和竞争LRA。 ELISA是一个高度敏感的，具体的和随时可用的技术，几乎在每一个实验室常规使用。 ELISA可以执行并适于各种方式。所提出的协议对不同的λ干扰素（INFLs）和它们的受体之间的相互作用的调查进行了优化。
直接LRA允许一个quantificati关于配体 - 受体的相对于配体浓度结合和由此产生的结合曲线。使用适当的型号为配体-受体相互作用，可以将数据进一步分析以估计的解离常数（K D）。
在所提出的协议，通常使用希尔方程被施加到该配体 - 受体结合建模。尽管其它方法，例如表面等离子共振技术2,3-允许两个蛋白之间的结合亲和力的测定，这种技术常常是劳动密集型的，昂贵的，并且需要特殊的实验室设备。
竞争LRA能够抑制肽的筛选：在配体 - 受体结合相对于肽浓度定量。这产生描述的肽的抑制作用的剂量 - 反应曲线。数据可以被进一步分析以估计半数最大抑制浓度（IC 50
两者的ELISA协议是易于使用，并且可以适合于广泛的研究问题。任何形式的重组蛋白可以用于可靠地并快速确定相互作用的部件。此外，竞争LRA可用于通过使用阻断肽，其目的是为了模仿或配体或受体，以确定配体和受体的关键相互作用位点。如果封闭肽显示有效和特异性抑制，肽占据配体的关键相互作用位点（如肽模拟物的受体）或配体（如肽模拟物的配位体）。
第一个协议描述不同INFLs的在K D值的决心和其受体α亚基， 即使用直接LRA白细胞介素28受体（IL28RA）。接着，第二协议显示如何确定一个20个氨基酸长的肽的能力抑制INFL-IL28RA相互作用。肽被设计成在其受体结合位点与IFNLs竞争，从而使相互作用的分子的理解。此外，该肽可以用于阻止在体外实验IL28RA以确定对下游信号效应4的影响。
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Protocol
1.试剂准备
- 以制备碳酸包被缓冲液，溶解0.36克Na 2 CO 3和0.84克的NaHCO 3在100毫升蒸馏水;无菌过滤器通过使用真空从动0.22μm的聚醚砜（PES）膜过滤器，并存储在RT之前使用的缓冲区。
- 通过在磷酸盐中加入0.05％体积/体积的吐温20制备洗涤溶液缓冲盐水（PBS）。
- 通过在100毫升PBS中5克BSA（≥98％），并存储溶解在4℃下制备的5％牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液（封闭溶液）。
- 重组受体，配体和阻止肽
- Reconstitutethe重组人白介素受体α亚基（IL28RA），并根据制造商的说明，并储存于-80℃的重组人干扰素（IFNL1-3）的His标记的配体。 Synthetize阻断肽和如先前所述4中使用。使用PBS中制备不同浓度的配体的秒和在测定中使用的肽。
- 为了制备第一抗体，稀释在PBS中的0.1％BSA的6倍他小鼠单克隆抗体以1：1000稀释。为了制备第二抗体，稀释辣根过氧化物酶（HRP）的PBS缀合的山羊抗小鼠IgG（H + L）含有1 0.1％BSA的1:10,000稀释。
- 通过根据制造商的说明混合试剂A和B制备TMB溶液。
- 通过在RT加入在蒸馏水和商店5 N硫酸（H 2 SO 4）准备终止溶液。
2.酶联免疫测定（ELISA）
注：直接配体-受体相互作用的ELISA（直接LRA， 图1）可以被用于测量受体-配体的解离常数（K D），作为受体-配体结合亲和力的量度。竞争配体-受体相互作用的ELISA（竞争LRA， 图2）的所有流入的肽（和其他阻断化合物），其作用与配体和受体之间的相互作用来干扰的筛选。先前公布5的基本协议进一步优化。
注意：在这两种ELISA方法使用多道移液器用于添加解决方案，以在每一个步骤96孔板的孔中。在溶液澄清或洗涤步骤，直接扔出去的解决方案整合到水槽。
- 直接配体 - 受体相互作用测定（直接LRA）
注意：对于该工作流的示图（ 见图1）。- 涂层板的重组受体
- 稀释在碳酸盐缓冲液的重组受体至100毫微克/微升的最终浓度。通过使用多道移液器以及移液100微升到每个具有固定的受体浓度（100毫微克/微升）96孔微量滴定板的涂层的孔中。排除板外墙面，以免以及边缘神器。覆盖有盖板，孵育的板在4°CO / N。
- 阻塞和配体的加入
- 第二天，通过倾斜靠在水槽板除去涂层溶液和3次洗涤液（PBS + 0.05％体积/体积的吐温20）洗涤该板。
- 用200微升的5％BSA溶液到每个用多道移液器井框在涂板的游离受体结合位点和孵育所述板在室温2小时。
- 弃去封闭溶液（见步骤2.1.2.1）和3次洗涤液洗涤该板。
- 制备重组His-标记的配体在不同浓度（ 例如，8微克/毫升，4微克/毫升，2微克/毫升，1微克/毫升，0.5微克/毫升，0.25微克/毫升，0.125微克/毫升，0.063微克/毫升，0.031微克/毫升，0.0微克/毫升）的PBS。仅添加PBS的空白孔。
- 加入100微升每配体浓度向孔中一式两份，并在室温孵育2小时的板允许受体 - 配体相互作用。
- 孵化与抗体
- 与配体孵育后，3次洗涤平板用洗涤溶液。
- 吸取100μl的初级抗His小鼠单克隆抗体溶液（1：1,000）的每个孔中。
- 孵育在室温下2小时的板;温育后，弃去抗体溶液（见步骤2.1.2.1）和3次洗涤液洗涤该板。
- 添加100微升HRP偶联的山羊抗小鼠IgG二抗溶液（1：10,000）到每个孔中。将培养板在室温下45分钟。
- 弃去抗体溶液（见步骤2.1.2.1）和3次洗涤液洗涤该板。
- 基材与发展加成
- 使TMB底物溶液到室温，并在1制备TMB底物溶液A和B：1的比例。添加新鲜制备的衬底以每孔100μl，并保持在室温的板15-30分钟。经过充分的山坳或开发加入50微升一站式解决方案。
- 读板和数据分析
注意：所述的协议是基于所测量的信号从特异性结合升起的假定。它可能是估算非特异性结合到该信号的贡献必要的，但是这是出于这个协议的范围。- 直接读取450nm处的吸光度（光密度，OD值）。
- 减去从测量OD值的背景信号和正常化它们。变换的所有值的配位体浓度为对数标度的（基座10，日志10）。
- 积归一化和背景校正OD值（Y轴，对应于被占领受体结合位点的分数）抗配体浓度的对数（X轴，对数10的范围）。
- 为了估计在K D值，拟合数据到Hill方程的形式如下：
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注意：这里Y代表占据受体结合位点和Y 最大最大结合的部分; [L]表示游离配位体和希尔系数的浓度。如果只有一个用于配体结合位点，希尔系数为n = 1，对于具有多于一个的配位体结合位点的系统中，结合展品正协同如果n> 1，负协同如果n <1和没有协同如果n = 1，微观解离常数被称为并对应于半数最大有效浓度EC 50 6。表观解离常数为K D =（K D）ñ。在最简单的，其中n = 1的情况下，解离常数对应于该受体结合位点的一半被占用和KÐ= K D中的配体浓度。这个模型假定质量作用在平衡条件下的结合，以及，只有一小部分加入的配位体与受体结合， 即，[L] >> [RL]。
- 涂层板的重组受体
图1. 直接配体-受体相互作用测定（直接LRA）。直接LRA一步一步的协议。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 竞争配体 - 受体相互作用测定（竞争LRA）
注意：对于该工作流的示意图参见图2中的竞争LRA程序遵循作为直接LRA除了在配体的重要变化相同的步骤（涂布板，抗体孵育，板发展）和肽加成步骤。合适的阴性对照是用于该测定是必不可少的。在以前的筛选研究<SUP>如图4所示，加扰的封闭肽没有表现出拮抗作用。- 阻塞 - 配体和阻止肽加成
- 第二天，除去涂层溶液和洗涤所述板（见2.1.2.1）。
- 通过加入200微升的5％BSA溶液，以每孔阻挡涂板，孵育该板在RT 2小时。
- 在固定的浓度（2×20毫微克/毫升）的PBS制备重组His-标记的配体（IFNL1-3）。
- 制备具有不同浓度范围从10nM至100μM的在PBS中，以保证一个剂量-反应曲线的阻塞肽（参照表3）。
注：此启用阻断肽的IC 50值的连续测定。在对照孔，只加固定的配位体浓度没有肽获得最大（100％）的结合。在一片空白，只添加PBS没有配体或肽。 - 加的配位体的50微升（IFNL1-3）和50微升各PE的ptide集中在重复的井。
- 将培养板在室温2小时。
- 读板和数据分析
注意：所述的协议是基于所测量的信号从特异性结合升起的假定。它可能是估算非特异性结合到该信号的贡献必要的，但是这是出于这个协议的范围。- 直接读取450nm处的吸光度（光密度，OD值）。
- 减去从测量OD值的背景信号和正常化它们。变换的所有值的肽浓度对数标度的（基座10，日志10）。
- 积归一化和背景校正OD值（Y轴，对应于被占领受体结合位点的分数）抗配体浓度的对数（X轴，对数10的范围）。
- 来估计IC 50值，与数据拟合到以下公式：
注：此处[P]为肽浓度和Hill斜率。 Hill斜率描述了剂量 - 反应曲线的陡度。将IC 50对应于被观察到的配体和受体之间的结合的50％抑制的抑制剂浓度。
- 阻塞 - 配体和阻止肽加成
图2.竞争配体-受体相互作用测定（竞争LRA）。竞争LRA一步一步的协议。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Representative Results
使用直接LRA确定INFL1-3及其受体α亚基IL28RA之间的解离常数。结果示于图3：所占据的结合位点的小数值靠着相应的IFN浓度的对数作图。数据的Scatchard作图示于右下角。的结果表明，直接LRA产生一个结合曲线，其可以被进一步分析，以估计在K D值。在K D值，通过拟合数据至希尔方程（方程1）测定。
IFNL1具有最高结合亲和性，随后IFNL2和IFNL3。希尔系数N> 1建议初期配体 - 受体相互作用（见讨论）后，增加了额外的配体的亲和力。所估计的解离常数和希尔系数归纳在表 1。
有竞争力的LRA被用于定量阻塞肽对IFNL1-3和IL28RA（ 图4）之间的相互作用的影响。占用的结合位点的10纳克/ ml的配体浓度的馏分作图肽浓度的对数。来估计IC 50值，将数据拟合到等式2。
阻挡肽抑制IFNL3和IL28RA（IC 50 = 0.26μM）之间的相互作用，以最大程度。在IC 50为两倍高的IFNL2-IL28RA相互作用（IC 50 = 0.50微米）和幅度为IFNL1-IL28RA相互作用高一个数量级，这表明该肽是扰乱IFNL1-IL28RA相互作用不太有效。所确定的IC 50值和希尔斜率总结于表2中 。
_content“FO：保together.within页=”1“>正确的数据分析是理解配体-受体相互作用必需使用科学绘图软件如PRISM的GraphPad生成所显示的结果在K D值确定。中，数据拟合到“一个站点-希尔斜率特异性结合”。（对应于二段等式1 2.2.1）为了进行IC 50值确定，该数据被装配到功能“日志（抑制剂）与。归一化响应。 - 可变斜率'（见等式2在二段2.2.2）但是，可以使用非线性回归分析的任何软件。
图3的直接配体-受体测定（直接LRA）的结果。对于IFNL1（绿），IFNL2（红色）和IFNL3（蓝色）到IL28RA的结合结合曲线。相应Scatchard图右下角角落暗示结合的正协同性。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4的竞争配体-受体测定（竞争LRA）。结果表示IFNL1（10毫微克/毫升，绿色），IFNL2（10毫微克/毫升，红色）和IFNL3的结合的抑制的剂量-响应曲线（10毫微克/毫升，蓝）到IL28RA由20个氨基酸肽。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1： 估计解离常数（Kð），并结合IL28RA IFNL1-3山系数，标准误差（SE），给出了每个数据点四次重复样本大小。
表2： 阻断肽和用于IFNL1-3到IL28RA的结合的剂量-响应曲线的Hill斜率估算 半数最大抑制浓度（IC 50）的干扰素浓度为10纳克/毫升。重复次数为三。
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Discussion
ELISA是许多实验室标准和行之有效的方法。我们进一步修改和完善了先前公布的方法5,7。所表现出的一步一步的协议说明了如何能够以简单的方式被用于确定配体-受体相互作用的K个D取值。此外，阻挡肽，与配体 - 受体相互作用干扰的IC 50可被确定。
主要优点是快速安装，易于制备的试剂和熟悉的操作，因为大多数研究人员以前使用的ELISA协议。直接LRA协议是高度灵活的，并且可以适于测量许多蛋白质 - 蛋白质相互作用。与His6-或替代标签的重组蛋白应作为一个固定的伴侣的结合伴侣。竞争LRA可以被利用作为筛选工具来（ⅰ）确定阻断化合物（肽，抗体，或小摩尔的抑制潜力ecules）和（ⅱ）确定，通过使用经设计用以模仿受体或配体阻断肽临界相互作用位点。
阴性对照是用于呈现测定的正确的解释是必不可少的。在先前的筛选研究4中 ，所使用的阻断肽的加扰序列没有显示出拮抗作用。但是，其他的肽表现出阻挡能力也加扰后，可能是由于非特异性静电相互作用。
一个潜在的限制是，该测定反映在体外的情况。特别是，异二聚体受体常常形成更复杂的结构。它是不可能区分配体是否只与受体结合，还是该配体还通过触发的构象变化或二聚化，从而导致细胞内信号激活该受体。在所提出的测定中，我们使用了重组受体，这是immobili捷思到固相。这种设置不工作以测试激活或调查的受体，这需要所述膜的环境或膜胆固醇诸如G蛋白偶联受体（GPCR）的相互作用。还利用重组蛋白提出警告。例如，重组蛋白的折叠和三级结构可以相比， 在体内的情况是不同的。配体和受体的结合通常发生在RT，但是在人类中的最佳温度是37℃。最后，使用商业重组配体和受体的能证明昂贵。尽管有这些限制，这两种ELISA协议表明潜在迅速探索配体 - 受体相互作用。
所呈现的结果表明，IFNL1相比具有IFNL2为IL28RA稍高亲和力和IFNL3的亲和性比IFNL2三倍低。这是显着的考虑IFNLs之间的相似性。 IFNL1和IFNL2 DIFFER在33个氨基酸而IFNL2和IFNL3仅在七个氨基酸8不同。 IL28RA和IFNLs之间的相互作用涉及螺旋A和IFNL 9的AB循环。 IFNL序列的比对发现四螺旋A和显著差异IFNL1和IFNL3（ 图5A）之间的AB循环。其中影响盐桥Arg54-Glu119。本节中的氨基酸残基根据的UniProt条目Q8IU54（IFNL1），Q8IZI9（IFNL3），Q8IZJ0（IFNL2）和Q8IU57（IL28RA），这已在IFNL1-IL28R1复合物（ 图 1的晶体结构被发现列举5B）。结构比对显示，Arg57在IFNL1由Lys57在INFL3，这也能形成盐桥Glu118（ 图5C）所取代。与IFNL3和IL28RA，的亲和力下降一致计算10,11和突变12分析显示，该赖氨酸谷氨酸盐桥一般比精氨酸-谷氨酸SAL不太稳定的Ť桥梁。
然而，在螺旋A中的差异并不令人满意地解释IFNL3的较低亲和力，因为螺旋A的氨基酸序列为IFNL2和IFNL3相同。它被认为是主要的不同点是在AB环中的突变，其中，Arg74和His76在IFNL2由Lys70和Arg72中IFNL3 8取代。
此外，IFNLs之间在稳定性和溶解度的差异也可能影响测定的结果。由于直接LRA测定使用从纳米浓度M和血清细胞因子的生理浓度在于1pM至nM范围，IFNL的聚集不能排除。我们可以假设，干扰素的观察正协同结合是通过在配体-受体的特异性或非特异性增加结合， 例如，重组IL28RA受体溶液中的二聚化，或第二配体或配体片段的结合引起的具有更高的亲和力。何wever，还需要进一步的研究来验证这一点。
在竞争LRA模拟使用IFNL3的AB环的阻断肽（ 图6）。如先前所描述的，AB环起着IFNLs和IL28RA 9，特别IFNL2和IFNL3之间的相互作用中起重要作用。 IFNL3与IL28RA / IFNL1晶体结构的同源建模表明该区域，它对应于分块的肽在于紧密的空间接近度与IL28RA交互界面（ 图6）。假设该肽块IFNL和IL28RA的AB环的相互作用。竞争LRA支持此的结果：所述肽具有对所有IFNLs的结合，具有抑制效果但是肽是IL28RA，要么IFNL3或IFNL2比IFNL1和IL28A的相互作用的相互作用的更有效的抑制剂。正如预期的那样，所述肽块IFNL3的最有效的，因为它结合占据完全相同的结合口袋的IFNL3的AB循环。
如表3所示，IFNL1和IFNL2的AB-回路对准到封闭肽不同。为抑制IFNL1 / IL28RA相互作用的肽的较低的IC 50值一致，十二氨基酸IFNL1和肽之间不同，而和仅两个氨基酸IFNL2和肽之间不同。这表明，有在IFNLs和IL28RA的AB-环路之间的交互稍有不同的结合模式和预测，其模拟IFNL1肽会在阻断IFNl1和IL28RA之间的相互作用比IFNL3和IL28RA之间的相互作用更有效。
此外，该肽总体正电荷的（4精氨酸和两个赖氨酸残基，但只有两个天冬氨酸残基），并计算分析表明，该肽具有没有限定二次图案。由于其卷绕的柔性圣ructure肽也可能结合到受体的其它区域。这可能会阻止谷氨酸和天冬氨酸残基例如D118，形成盐桥，以稳定配体-受体复合物（ 图5B和5C）。
氧原子被显示为红色IFNL1（绿色）和IFNL3（蓝色）。 图 5. 结构比较 ，氮原子被以蓝色显示。 （ 一 ）IL28RA结合IFNL1和IFNL3的叠加（IL28RA未显示）。根指所有排列原子的方差（RMSD）为0.672埃。从IFNL1不同IFNL3的侧链强调浅粉红色。 Arg54和D118之间（B）盐桥。 （C）的IFNL3对齐IL28RA结合IFNL1（IL28RA以灰色示出）。对准表明精氨酸 - 谷氨酸盐BRIDGE可能是由较不稳定赖氨酸谷氨酸，Lys57和D118之间的盐桥取代。 PYMOL用于数字的准备和比对。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6. IFNL3对准和IFNL1-IL28RA络合物（IFNL1未示出）。IFNL3示于蓝色和IL28RA为灰色。相应的封闭肽的地区，在紫色突出显示。 请点击此处查看该图的放大版本。
表3：
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
