Introduction
En omfattende forståelse af signalveje kræver detaljeret viden om ligand-receptor interaktion. De fleste metoder til vurdering af samspillet af en bestemt ligand med dens specifikke receptor er dyre, tidskrævende, arbejdskrævende og kræver særligt udstyr og ekspertise en.
I denne artikel beskrives to hurtige og pålidelige punkt-for-punkt-protokoller til at undersøge ligand-receptor interaktion baseret på en enzymbundet immunosorbentassay (ELISA): Den direkte ligandreceptorinteraktion assay (LRA) og konkurrencen LRA. ELISA er et yderst følsomt, specifik og let tilgængelige teknik, som rutinemæssigt anvendes i næsten alle laboratorier. ELISA kan udføres og tilpasses på forskellige måder. De præsenterede protokoller er optimeret til undersøgelse af samspillet mellem forskellige lambda interferoner (INFLs) og deres receptor.
Den direkte LRA giver mulighed for en quantificatipå af ligand-receptor binding med hensyn til ligandkoncentration og giver således en bindende kurve. Anvendelse af en passende model for ligand-receptor-interaktion, kan dataene analyseres yderligere at estimere dissociationskonstanten (KD).
I præsenterede protokol, er det almindeligt anvendte Hill-ligningen anvendes til at modellere ligand-receptor binding. Selv om andre metoder såsom overfladeplasmonresonans teknologi 2,3 muliggøre bestemmelsen af bindingsaffiniteterne mellem to proteiner, denne teknologi er ofte arbejdskrævende, kostbare og kræver særlig laboratorieudstyr.
Konkurrencen LRA muliggør screening af inhibitoriske peptider: ligand-receptor binding kvantificeres i forhold til peptid koncentration. Dette giver en dosis-respons-kurve, der beskriver den inhibitoriske virkning af peptidet. Dataene kan yderligere analyseres for at estimere halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50
Både ELISA-protokoller er nemme at bruge, og kan tilpasses til en bred vifte af forskningsspørgsmål. Rekombinante proteiner af enhver art kan anvendes til pålideligt og hurtigt bestemme interaktion dele. Derudover kan konkurrencen LRA anvendes til at bestemme kritiske interageringssteder på ligander og receptorer ved hjælp blokerende peptider, som er designet til at efterligne enten liganden eller receptoren. Hvis blokerende peptid viser effektiv og specifik inhibering, peptidet indtager en kritisk interaktion site af ligand (hvis peptidet efterligner receptor) eller af liganden (Hvis peptidet efterligner liganden).
Den første protokol beskriver KD værdi bestemmelse af forskellige INFLs og alfa-underenheden af deres receptor, dvs. interleukin-28 receptor (IL28RA) ved hjælp af direkte LRA. Dernæst den anden protokol viser, hvordan til at bestemme evnen af en 20 aminosyrer lang peptid tilhæmme INFL-IL28RA interaktioner. Peptidet er designet til at konkurrere med IFNLs på deres receptorbindingssted og dermed muliggør en molekylær forståelse af interaktionen. Endvidere kan dette peptid bruges til at blokere IL28RA i in vitro-forsøg for at fastslå virkningen på downstream signalering effekter 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargøring af reagens
- Til fremstilling karbonatcoatingbuffer, opløses 0,36 g Na 2 CO 3 og 0,84 g NaHCO3 i 100 ml destilleret vand; steril filter bufferen ved hjælp af et vakuum drevet 0,22 um polyethersulfon (PES) membranfilter og opbevares ved stuetemperatur indtil brug.
- Forbered vaskeopløsning ved at tilsætte 0,05% vol / vol Tween 20 i phosphatbufret saltvand (PBS).
- Der fremstilles en 5% bovint serumalbumin (BSA) (blokeringsopløsning) i PBS-opløsning ved at opløse 5 g BSA (≥98%) i 100 ml PBS og opbevares ved 4 ° C.
- Rekombinante receptor, ligander og Blokering Peptider
- Reconstitutethe rekombinant human interleukin-receptor alpha-underenhed (IL28RA) og rekombinante His-mærkede ligander af humant IFN (IFNL1-3) i henhold til producentens anvisninger og opbevares ved -80 ° C. Syntetisere blokerende peptider og anvendt som beskrevet tidligere 4. Brug PBS at forberede forskellige koncentrationer af ligands og peptider til anvendelse i assayene.
- Til fremstilling af primære antistof, fortyndet 6x His Mus monoklonale antistof i PBS med 0,1% BSA ved 1: 1.000 fortynding. Til fremstilling af sekundære antistof, fortyndet peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret gede anti-mus IgG (H + L) i PBS med 0,1% BSA ved 1: 10.000 fortynding.
- Forbered TMB-opløsning ved at blande reagenserne A og B i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Forbered stop løsning ved tilsætning af 5 N svovlsyre (H 2 SO 4) i destilleret vand og opbevares ved stuetemperatur.
2. enzymmaerket assays (ELISA)
BEMÆRK: direkte ligandreceptorinteraktion ELISA (direkte LRA, figur 1) kan anvendes til at måle receptor-ligand dissociationskonstant (KD), som et mål for den receptor-ligandbindende affinitet. Konkurrencen ligand-receptor interaktion ELISA (konkurrence LRA, figur 2) alleOWS screening af peptider (og andre blokerende forbindelser), som virker til at interferere med interaktionen mellem ligand og receptor. Den grundlæggende protokol, der tidligere blev publiceret 5. blev yderligere optimeret.
BEMÆRK: I begge ELISA metoder bruger multikanalpipette til tilføjelse løsninger til brøndene i 96-brønds plade i hvert trin. I løsning dekanteres eller vasketrin, smide de løsninger direkte i vasken.
- Direkte ligand-receptor-interaktion assay (direkte LRA)
BEMÆRK: For en illustration af workflowet (se figur 1).- Belægning Plade med rekombinante receptor
- Fortynd rekombinante receptor i carbonatbuffer til en slutkoncentration på 100 ng / pl. Coat brønde af 96-brønds mikrotiterplade med fast receptor fusion (100 ng / pl) ved pipettering af 100 pi til hver brønd med en multikanalpipette. Udelukke ydre vægge af pladen for at undgå såvel kant artefakt. Dæk pladen med låg og inkuberesplade ved 4 ° CO / N.
- Blokering og Tilsætning af ligander
- Den næste dag fjernes overtræksopløsningen ved at vippe plade mod vasken og vask pladen 3 gange med vaskeopløsning (PBS + 0,05% v / v Tween 20).
- Blokere frie receptor-bindingssteder i den coatede plade anvendelse af 200 pi 5% BSA-opløsning til hver brønd med en multikanalpipette og inkuber pladen i 2 timer ved stuetemperatur.
- Kassér blokerende opløsning (se trin 2.1.2.1.) Og vaskes pladen 3 gange med vaskeopløsningen.
- Forbered rekombinante His-mærket ligander ved forskellige koncentrationer (f.eks 8 pg / ml, 4 pg / ml, 2 pg / ml, 1 ug / ml, 0,5 ug / ml, 0,25 ug / ml, 0,125 ug / ml, 0,063 ug / ml, 0,031 ug / ml, 0,0 ug / ml) i PBS. Tilføj kun PBS i de tomme brønde.
- Tilsæt 100 pi af hver ligandkoncentration til brøndene in duplo og inkuberes pladen i 2 timer ved stuetemperatur tillade receptor-ligandvekselvirkning.
- Inkubation med antistoffer
- Efter inkubation med liganderne, vask pladen 3 gange med vaskeopløsningen.
- Afpipetteres 100 pi primære anti-His monoklonalt muse-antistof (1: 1.000) til hver brønd.
- Inkubér pladen ved stuetemperatur i 2 timer; efter inkubation, kasseres antistof opløsning (se trin 2.1.2.1.) og vask pladen 3 gange med vask løsning.
- Tilsæt 100 pi HRP-koblet gede-anti-muse-IgG sekundært antistof (1: 10.000) til hver brønd. Inkubér pladen i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Kassér antistofopløsningen (se trin 2.1.2.1.) Og vaskes pladen 3 gange med vaskeopløsningen.
- Tilsætning af substrat og Udvikling
- Bring TMB-substrat løsninger til RT og forberede TMB-substratopløsning A og B ved 1: 1-forhold. Tilsæt 100 pi frisk fremstillede substrat til hver brønd og holde pladen ved stuetemperatur i 15-30 min. Efter tilstrækkelig col eller udvikling tilsættes 50 ul stop-løsning.
- Læsning af Plate og Data Analysis
BEMÆRK: Den beskrevne protokol er baseret på den antagelse, at det målte signal stiger fra specifik binding. Det kan være nødvendigt at estimere bidrag uspecifik binding til signalet, men dette er ikke omfattet af denne protokol.- Læs absorbans (optisk densitet, OD) direkte ved 450 nm.
- Fratræk baggrundssignalet fra de målte absorbansværdier og normalisere dem. Omdan alle værdier af ligand-koncentration til logaritmisk skala (base 10, log 10).
- Plot normaliserede og baggrund korrigeret OD-værdier (y-akse, svarer til den del af besatte receptor bindingssteder) mod logaritmen af liganden fusion (X-akse, log 10-skala).
- For at estimere KD-værdi, passer til dataene til den følgende form af Hill-ligningen:
tp_upload / 53.575 / 53575eq1.jpg "/>
BEMÆRK: Her Y betegner den del af besatte receptor bindingssteder og Y max den maksimale binding; [L] angiver koncentrationen af fri ligand og Hill-koefficient. Hvis der kun er et bindingssted for liganden, Hill-koefficienten er n = 1. For systemer med mere end én ligand bindingssted, den bindende udviser positiv kooperativitet hvis n> 1, negativ kooperativitet hvis n <1, og ingen kooperativitet hvis n = 1. den mikroskopiske dissociationskonstant betegnes og svarer til den halvmaksimal effektive koncentration EC50 6. Den tilsyneladende dissociationskonstant er Kd = (KD) n. I det enkleste tilfælde, hvor n = 1, dissociationskonstanten svarer til liganden koncentration, ved hvilken halvdelen af receptoren bindingssteder er optaget og Kd = KD. Denne model forudsætter masseaktioner binding under ligevægtsbetingelser, samt at kun en lille brøkdel afden tilsatte ligand bundet til receptoren, dvs., [L] >> [RL].
- Belægning Plade med rekombinante receptor
Figur 1. Direkte ligand-receptor-interaktion assay (direkte LRA). Trin-for-trin-protokol til direkte LRA. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Konkurrence ligand-receptor-interaktion Assay (konkurrence LRA)
BEMÆRK:. For en illustration af arbejdsgangen se figur 2 procedure Konkurrencen LRA følger de samme trin som den direkte LRA (belægning pladen, antistof inkubation, plade udvikling) med undtagelse af vigtige ændringer i liganden og peptider tilføjelse trin. Korrekt negative kontroller er afgørende for dette assay. I en tidligere screeningsundersøgelse <sup> 4, krypterede blokerende peptid viste ikke antagonistiske virkninger.- Blokering - Tilsætning af ligander og Blokering peptider
- Den næste dag fjernes overtræksopløsningen og vask pladen (se 2.1.2.1).
- Blokere overtrukne plade ved tilsætning af 200 pi 5% BSA-opløsning til hver brønd og inkuberes pladen i 2 timer ved stuetemperatur.
- Forbered de rekombinante His-mærkede ligander (IFNL1-3) ved en fast koncentration (2x-20 ng / ml) i PBS.
- Forbered blokerende peptid (tabel 3) med forskellige koncentrationer i området fra 10 nM til 100 uM i PBS til at garantere en dosisresponskurve.
BEMÆRK: Dette muliggør efterfølgende bestemmelse af IC50-værdien for den blokerende peptid. I kontrolbrønde, tilsæt kun fast ligand-koncentration uden peptid at udlede maksimum (100%) binding. I den tomme, kun tilføje PBS uden ligand eller peptid. - Der tilsættes 50 ul af liganderne (IFNL1-3) og 50 pi af hver peptide koncentration til brøndene i dubletter.
- Inkubér pladen i 2 timer ved stuetemperatur.
- Læsning af Plate og dataanalyse
BEMÆRK: Den beskrevne protokol er baseret på den antagelse, at det målte signal stiger fra specifik binding. Det kan være nødvendigt at estimere bidrag uspecifik binding til signalet, men dette er ikke omfattet af denne protokol.- Læs absorbans (optisk densitet, OD) direkte ved 450 nm.
- Fratræk baggrundssignalet fra de målte absorbansværdier og normalisere dem. Omdan alle værdier af peptidet koncentration til logaritmisk skala (base 10, log 10).
- Plot normaliserede og baggrund korrigeret OD-værdier (y-akse, svarer til den del af besatte receptor bindingssteder) mod logaritmen af liganden fusion (X-akse, log 10-skala).
- For at estimere IC50-værdien, passer dataene til den følgende ligning:
BEMÆRK: Her [P] er den peptidkoncentration og Hill hældning. The Hill hældning beskriver stejlheden af dosisresponskurven. IC 50 svarer til inhibitorkoncentrationen hvor der er observeret 50% inhibering af binding mellem ligand og receptor.
- Blokering - Tilsætning af ligander og Blokering peptider
Figur 2. Konkurrence ligand-receptor-interaktion assay (konkurrence LRA). Trin-for-trin-protokollen for konkurrence LRA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissociationskonstanterne mellem INFL1-3 og deres receptor alpha subunit IL28RA blev bestemt under anvendelse af direkte LRA. Resultaterne er vist i figur 3: Fraktionen af besatte bindingssteder er afbildet mod logaritmen af den respektive IFN-koncentration. Den Scatchard plot af data vises i nederste højre hjørne. Resultaterne illustrerer, at den direkte LRA giver en bindende kurve, som yderligere kan analyseres for at estimere KD-værdi. KD-værdien blev bestemt ved at tilpasse dataene til Hill ligningen (ligning 1).
IFNL1 har den højeste bindingsaffinitet, efterfulgt af IFNL2 og IFNL3. Hill-koefficienten n> 1 foreslår forøget affinitet for yderligere ligander efter den indledende ligand-receptor interaktion (se Diskussion). De estimerede dissociationskonstanter og Hill-koefficienter er sammenfattet i tabel 1.
Competitive LRA blev anvendt til at kvantificere virkningen af et blokerende peptid på samspillet mellem IFNL1-3 og IL28RA (figur 4). Fraktionen af besatte bindingssteder for en ligand koncentration på 10 ng / ml afbildes mod logaritmen af peptidkoncentrationen. For at estimere de IC50-værdierne, er dataene monteret ligning 2.
Den blokerende peptid hæmmede interaktionen mellem IFNL3 og IL28RA (IC50 = 0,26 uM) i størst omfang. IC 50 er dobbelt så høj for IFNL2-IL28RA interaktion (IC50 = 0,50 uM) og en størrelsesorden højere for IFNL1-IL28RA interaktion, vejledende peptid var mindre effektiv til at afbryde IFNL1-IL28RA interaktioner. De fastlagte IC50-værdier og Hill skråninger er sammenfattet i tabel 2.
_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Korrekt dataanalyse er afgørende for forståelsen af ligand-receptor interaktion De viste resultater blev genereret ved hjælp af en videnskabelig graftegning software som GraphPad PRISM For værdi bestemmelse K D.. , data blev monteret på "One site - specifik binding med Hill hældning '. (. svarer til ligning 1 i Sec 2.2.1) til bestemmelse af IC50-værdi, er de data, monteret på funktionen' log (inhibitor) vs . normaliseret svar -. variabel hældning '(. se ligning 2 i Sec 2.2.2) dog kan bruges noget software til ikke-lineær regressionsanalyse.
Figur 3. Resultater af direkte ligand-receptor assay (direkte LRA). Bindingskurverne for bindingen af IFNL1 (grøn), IFNL2 (rød) og IFNL3 (blå) til IL28RA. De respektive Scatchard plot i nederste højrehjørne tyder positivt samarbejde brugelighed af bindingen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Resultaterne fra den konkurrencemæssige ligand-receptor assay (kompetitiv LRA). Dosis-respons kurver, som viser inhibering af bindingen af IFNL1 (10 ng / ml, grøn), IFNL2 (10 ng / ml, rød) og IFNL3 (10 ng / ml, blå) til IL28RA ved 20 aa peptid. klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Anslået dissociationskonstanter (K D) Og Hill-koefficienter af IFNL1-3 binding til IL28RA. Er givet Den standardafvigelse (SE) for en stikprøve på fire replikater pr datapunkt.
Tabel 2:. Skønnet halvmaksimal inhiberende koncentrationer (IC50) af de blokerende peptider og bakken hældningen på dosis-respons-kurven for binding af IFNL1-3 til IL28RA IFN-koncentrationen er 10 ng / ml. Antallet af gentagelser er tre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ELISA er en standard og veletableret metode til mange laboratorier. Vi har yderligere modificeret og forbedret en tidligere publiceret metode 5,7. Den påvist trin-for-trin procedure viser, hvordan den kan anvendes på en enkel måde at bestemme Kd-værdier af ligand-receptor-interaktioner. Desuden kan bestemmes IC50 for et blokerende peptid, der interfererer med ligand-receptor interaktion.
Store fordele er den hurtige opsætning, nem fremstilling af reagenser og velkendte håndtering, da de fleste forskere har anvendt en ELISA-protokol før. Den direkte LRA protokol er meget fleksibel og kan tilpasses til at måle mange protein-protein interaktioner. Rekombinante proteiner med His6- eller alternativt tag skal anvendes som bindingspartner til en immobiliseret partner. Konkurrencen LRA kan udnyttes som et screeningsværktøj til (i) fastsætte den hæmmende potentiale for at blokere forbindelser (peptider, antistoffer eller små mollekyler) og (ii) bestemme de kritiske interaktion sites ved hjælp af blokerende peptider designet til at efterligne receptor eller liganden.
Negative kontroller er afgørende for en korrekt fortolkning af de præsenterede analyser. I en tidligere screeningsundersøgelse 4, har krypterede sekvens af det anvendte blokerende peptid ikke vise antagonistiske virkninger. Imidlertid viste andre peptider en blokerende kapacitet også efter scrambling, sandsynligvis på grund af uspecifikke elektrostatiske interaktioner.
En potentiel begrænsning er, at dette assay afspejler en in vitro situation. Navnlig heterodimere receptorer ofte danner en mere kompleks struktur. Det er ikke muligt at skelne, om liganden blot binder til receptoren eller om liganden aktiverer også receptoren ved at udløse en konformationel ændring eller en dimerisering, hvilket igen fører til et intracellulært signal. I det præsenterede assay, anvendte vi en rekombinant receptor, der er Immobilized til en fast fase. Denne opsætning virker ikke at teste aktivering eller at undersøge interaktionen af receptorer, som kræver membranen miljø eller membran cholesterol, såsom G-protein-koblede receptorer (GPCR'er). Også anvendelsen af rekombinant protein rejser advarsler. For eksempel kan foldningen og tertiære struktur af et rekombinant protein variere i forhold til en in vivo situation. Bindingen af ligand og receptor forekommer normalt ved stuetemperatur, men i mennesker den optimale temperatur vil være 37 ° C. Endelig kan brugen af kommerciel rekombinant ligand og receptor blive dyrt. Trods disse begrænsninger, disse to ELISA protokoller viser potentiale til hurtigt undersøge ligand-receptor interaktion.
De præsenterede resultater viser, at IFNL1 har en lidt højere affinitet for IL28RA forhold til IFNL2, og affinitet IFNL3 er tre gange lavere end IFNL2. Dette er bemærkelsesværdigt i betragtning af ligheden mellem IFNLs. IFNL1 og IFNL2 differ i 33 aminosyrer, mens IFNL2 og IFNL3 adskiller sig kun i syv aminosyrer 8. Samspillet mellem IL28RA og IFNLs involverer Helix A og AB-løkke IFNL 9. Tilpasning af IFNL sekvenser afslører fire betydelige forskelle i Helix A og AB-sløjfen mellem IFNL1 og IFNL3 (figur 5A). Man påvirker salt bridge Arg54-Glu119. Aminosyreresterne i dette afsnit er opregnet i henhold til UniProt poster Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) og Q8IU57 (IL28RA), som er blevet fundet i krystalstrukturen af IFNL1-IL28R1 kompleks (figur 5B). Strukturelle tilpasning viser, at Arg57 i IFNL1 erstattes af Lys57 i INFL3, som også er i stand til at danne en saltbro med Glu118 (figur 5C). I overensstemmelse med nedsat affinitet IFNL3 og IL28RA, beregningsmæssige 10,11 og mutations 12 analyser viser, at Lys-Glu salt broer er generelt mindre stabile end Arg-Glu salt broer.
Men forskellene i Helix A ikke tilfredsstillende forklare lavere affinitet for IFNL3, da aminosyresekvens Helix A er identisk for IFNL2 og IFNL3. Det menes, at den væsentligste forskel skyldes mutationerne i AB-loop, hvor Arg74 og His76 i IFNL2 erstattes af LYS70 og Arg72 i IFNL3 8.
Endvidere kan forskelle i stabilitet og opløselighed mellem IFNLs også påvirke resultatet af assayet. Da den direkte LRA-assayet benytter koncentrationer fra nM til M og den fysiologiske koncentration af cytokiner i serum ligger i pM til nM-området, kan aggregering af IFNL ikke udelukkes. Vi kan antage, at den observerede positive kooperativitet af IFN-binding er forårsaget af en specifik eller ikke-specifik stigning i ligand-receptor-binding, fx en dimerisering af den rekombinante IL28RA receptor i opløsning, eller en binding af en anden ligand eller ligand fragment med højere affinitet. HoWever, er yderligere undersøgelser nødvendige for at bekræfte dette.
Den blokerende peptid anvendes i de konkurrencemæssige LRA efterligner AB-løkke IFNL3 (figur 6). Som tidligere beskrevet, at AB-sløjfen spiller en væsentlig rolle i samspillet mellem IFNLs og IL28RA 9, især IFNL2 og IFNL3. Homologi modellering af IFNL3 med IL28RA / IFNL1 krystalstruktur viser, at regionen, der svarer til den blokerende peptid ligger i umiddelbar rumlig nærhed af interaktionen grænseflade med IL28RA (figur 6). Meningen, at peptidet blokerer interaktionen af AB-sløjfen af IFNL og IL28RA. Resultaterne af konkurrencen LRA understøtter dette: Peptidet har en hæmmende virkning på bindingen af alle IFNLs imidlertid peptidet er en mere effektiv inhibitor af interaktionen mellem IL28RA og enten IFNL3 eller IFNL2 end af interaktionen af IFNL1 og IL28A. Som forventet peptid blokerer bindingen af IFNL3 mest effektivt, da detindtager nøjagtig den samme bindende lomme som AB-løkke IFNL3.
Som vist i tabel 3, AB-loops af IFNL1 og IFNL2 tilpasset til de blokerende peptid forskellige. Overensstemmelse med den nedre IC50 værdi af peptidet til inhibering af IFNL1 / IL28RA interaktion, adskiller tolv aminosyrer mellem IFNL1 og peptidet henviser og kun to aminosyrer er forskellige IFNL2 og peptidet. Dette indikerer, at der er lidt forskellige bindende tilstande for samspillet mellem AB-løkker af IFNLs og IL28RA og forudser, at peptider, der efterligner IFNL1 ville være mere effektiv til at blokere interaktionen mellem IFNl1 og IL28RA end samspillet mellem IFNL3 og IL28RA.
Endvidere er peptidet samlede positivt ladet (fire arginin og to lysinrester men kun to aspartatrester) og beregningsmæssige analyse viser, at peptidet har ingen definerede sekundære motiver. På grund af sin oprullede, fleksibel structure peptidet kan også binde til andre regioner af receptoren. Dette kan potentielt blokere glutamat og aspartat rester, såsom D118, som danner en saltbro at stabilisere ligand-receptor-komplekset (figur 5B og 5C).
Figur 5. Strukturel sammenligning af IFNL1 (grøn) og IFNL3 (blå). Oxygen atomer er vist i rødt, er nitrogenatomer vist i blåt. (A) Overlejring af IL28RA-bundne IFNL1 og IFNL3 (IL28RA ikke vist). Den geometriske middelværdi afvigelse (RMSD) af alle justeret atomer er 0,672 Å. Sidekæder af IFNL3 der afviger fra IFNL1 er fremhævet med lyse pink. (B) Salt bro mellem Arg54 og D118. (C) IFNL3 tilpasset IL28RA-bundet IFNL1 (IL28RA vises i gråt). Tilpasningen viser, at Arg-Glu-salt briDGE sandsynligvis erstattet af en mindre stabil Lys-Glu, en salt-bro mellem Lys57 og D118. PyMOL blev anvendt til fremstilling af tal og for justeringen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Tilpasning af IFNL3 og IFNL1-IL28RA kompleks (IFNL1 ikke vist). IFNL3 vises i blåt og IL28RA i grå. De områder, der svarer til de blokerende peptid er fremhævet i lilla. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 3:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
