Introduction
संकेत दे रास्ते की एक व्यापक समझ ligand रिसेप्टर बातचीत के बारे में विस्तृत ज्ञान की आवश्यकता है। अपनी विशिष्ट रिसेप्टर के साथ एक विशेष ligand की बातचीत का आकलन करने के लिए सबसे तरीकों महंगे हैं, समय लेने वाली है, श्रम गहन और विशिष्ट उपकरण और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है 1।
यह लेख दो तेज और विश्वसनीय बिंदु से बिंदु प्रोटोकॉल का वर्णन ligand रिसेप्टर एक एंजाइम के आधार पर जांच करने के लिए बातचीत immunosorbent परख (एलिसा) से जुड़ा हुआ: प्रत्यक्ष ligand रिसेप्टर बातचीत परख (एलआरए) और प्रतियोगिता एलआरए। एलिसा एक बेहद संवेदनशील, विशिष्ट और आसानी से उपलब्ध तकनीक, नियमित तौर पर लगभग हर प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है। एलिसा प्रदर्शन किया और विभिन्न फैशन में रूपांतरित किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल अलग लैम्ब्डा इंटरफेरॉन (INFLs) और उनके रिसेप्टर के बीच बातचीत की जांच के लिए अनुकूलित कर रहे हैं।
प्रत्यक्ष एलआरए एक quantificati के लिए अनुमति देता हैligand रिसेप्टर की एकाग्रता पर ligand के संबंध में बाध्यकारी है और इस तरह एक बाध्यकारी वक्र पैदावार। Ligand रिसेप्टर बातचीत के लिए एक उपयुक्त मॉडल का उपयोग करना, डेटा आगे हदबंदी निरंतर (कश्मीर डी) अनुमान लगाने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, आमतौर पर इस्तेमाल हिल समीकरण ligand-रिसेप्टर बंधन मॉडल करने के लिए लागू किया जाता है। हालांकि इस तरह की सतह plasmon अनुनाद प्रौद्योगिकी 2,3 के रूप में अन्य तरीकों दो प्रोटीन के बीच बाध्यकारी समानताएं के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं, इस तकनीक अक्सर श्रम गहन, महंगा है, और विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है।
प्रतियोगिता एलआरए निरोधात्मक पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग के लिए सक्षम बनाता है: ligand रिसेप्टर बाध्यकारी पेप्टाइड एकाग्रता के संबंध में मात्रा निर्धारित है। यह एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र पेप्टाइड की निरोधात्मक प्रभाव का वर्णन अर्जित करता है। डेटा आगे (आईसी 50 आधा अधिक से अधिक निरोधात्मक एकाग्रता अनुमान लगाने के लिए विश्लेषण किया जा सकता उप> अवरुद्ध पेप्टाइड)।
दोनों एलिसा प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं और अनुसंधान के सवालों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता। किसी भी प्रकार की पुनः संयोजक प्रोटीन मज़बूती से और तेजी से बातचीत भागों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रतियोगिता एलआरए अवरुद्ध पेप्टाइड, जो या तो ligand या रिसेप्टर नकल करने के लिए तैयार कर रहे हैं का उपयोग करके ligands और रिसेप्टर्स की महत्वपूर्ण बातचीत साइटों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अवरुद्ध पेप्टाइड कुशल और विशिष्ट निषेध पता चलता है, पेप्टाइड ligand के एक महत्वपूर्ण बातचीत साइट (यदि पेप्टाइड mimics रिसेप्टर) या ligand के (यदि पेप्टाइड mimics ligand) रह रहे हैं।
पहले प्रोटोकॉल अलग INFLs की कश्मीर घ मूल्य निर्धारण और उनकी रिसेप्टर के अल्फा सबयूनिट, यानी वर्णन है, इंटरल्यूकिन 28 रिसेप्टर (IL28RA) डायरेक्ट एलआरए का उपयोग कर। इसके बाद, दूसरे प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे करने के लिए एक 20 एमिनो एसिड लंबे पेप्टाइड की क्षमता निर्धारित करने के लिएInfl-IL28RA बातचीत को रोकती हैं। पेप्टाइड उनकी रिसेप्टर बाध्यकारी साइट पर IFNLs के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए बनाया गया है और इस तरह की बातचीत का एक आणविक समझ में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इस पेप्टाइड इन विट्रो प्रयोगों में IL28RA ब्लॉक करने के लिए नीचे की ओर संकेत प्रभाव 4 पर प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Protocol
1. अभिकर्मक तैयार
- कार्बोनेट कोटिंग बफर तैयार करने के लिए, 0.36 छ ना 2 सीओ 3 और 100 में 3 मिलीलीटर आसुत जल 0.84 छ NaHCO भंग; बाँझ फिल्टर एक वैक्यूम उपयोग जब तक आरटी पर संचालित 0.22 माइक्रोन polyethersulfone (पी इ एस) झिल्ली फिल्टर और दुकान का उपयोग करके बफर।
- फॉस्फेट में 0.05% वी / वी बीच 20 जोड़कर धोने के समाधान तैयार खारा (पीबीएस) बफर।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिलीलीटर पीबीएस में 5 ग्राम बीएसए (≥98%) और दुकान भंग द्वारा एक 5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) पीबीएस समाधान में (अवरुद्ध समाधान) तैयार करें।
- संयोजक रिसेप्टर, ligands और अवरुद्ध पेप्टाइड्स
- Reconstitutethe पुनः संयोजक मानव इंटरल्यूकिन रिसेप्टर अल्फा सबयूनिट (IL28RA) और मानव IFN (IFNL1-3) की पुनः संयोजक उनकी टैग ligands -80 डिग्री सेल्सियस पर निर्माता के निर्देशों और दुकान के अनुसार। Synthetize पेप्टाइड्स अवरुद्ध और के रूप में पहले 4 में वर्णित किया करते थे। ligand के विभिन्न सांद्रता तैयार करने के लिए पीबीएस का प्रयोग करेंऔर assays में उपयोग के लिए पेप्टाइड्स।
- प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करने के लिए, 1 से 0.1% BSA के साथ पीबीएस में 6x उनका माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पतला: 1,000 कमजोर पड़ने। माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार करने के लिए, पतला हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) 1 में 0.1% BSA के साथ पीबीएस में संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + L): 10,000 कमजोर पड़ने।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मकों एक मिश्रण और बी द्वारा TMB समाधान तैयार है।
- आरटी पर आसुत जल और दुकान में 5 एन सल्फ्यूरिक एसिड (एच 2 अतः 4) जोड़ने से रोकने के समाधान तैयार है।
2. एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays (ELISAs)
नोट: प्रत्यक्ष ligand रिसेप्टर बातचीत एलिसा (प्रत्यक्ष एलआरए, चित्रा 1) रिसेप्टर ligand बंधन आत्मीयता का एक उपाय के रूप में, रिसेप्टर ligand हदबंदी निरंतर (कश्मीर डी) को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रतियोगिता ligand रिसेप्टर बातचीत एलिसा (एलआरए प्रतियोगिता, चित्रा 2) सभीपेप्टाइड्स (और अन्य यौगिकों अवरुद्ध), जो ligand और रिसेप्टर के बीच बातचीत के साथ हस्तक्षेप करने के लिए अधिनियम की स्क्रीनिंग OWS। बुनियादी प्रोटोकॉल है कि पहले 5 प्रकाशित किया गया था आगे अनुकूलित किया गया था।
नोट: दोनों में एलिसा तरीकों प्रत्येक चरण में 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के समाधान जोड़ने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। समाधान छानना या वाशिंग चरणों में, बाहर समाधान सीधे सिंक में फेंक देते हैं।
- प्रत्यक्ष ligand- रिसेप्टर-परख इंटरेक्शन (प्रत्यक्ष एलआरए)
नोट: कार्यप्रवाह का एक उदाहरण के लिए (चित्रा 1 देखें)।- संयोजक रिसेप्टर के साथ कोटिंग थाली
- 100 एनजी / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए कार्बोनेट बफर में पुनः संयोजक रिसेप्टर पतला। प्रत्येक के लिए 100 μl pipetting अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके निश्चित रिसेप्टर एकाग्रता (100 एनजी / μl) के साथ 96 अच्छी तरह से थाली के microtitre कोट कुओं। अच्छी तरह से किनारे विरूपण साक्ष्य से बचने के लिए प्लेट की बाहरी दीवारों को बाहर निकालें। एक ढक्कन के साथ कवर प्लेट और सेते4 डिग्री सीओ / एन पर थाली।
- अवरुद्ध और ligands के अलावा
- अगले दिन, सिंक के खिलाफ प्लेट झुकने से कोटिंग समाधान निकालने और प्लेट धोने के समाधान (पीबीएस + 0.05% वी / वी बीच 20) के साथ 3 बार धोएं।
- प्रत्येक के लिए 5% बीएसए समाधान के 200 μl का उपयोग कर अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग लेपित थाली में मुफ्त रिसेप्टर बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक और आरटी पर 2 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
- अवरुद्ध समाधान त्यागें (कदम 2.1.2.1 देखें।) और प्लेट समाधान धोने के साथ 3 बार धोएं।
- विभिन्न सांद्रता (कम से पुनः संयोजक उनकी टैग ligands तैयार करें जैसे, 8 माइक्रोग्राम / एमएल, 4 माइक्रोग्राम / एमएल, 2 माइक्रोग्राम / एमएल, 1 माइक्रोग्राम / एमएल, 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल, 0.25 माइक्रोग्राम / एमएल, 0.125 माइक्रोग्राम / एमएल, 0.063 माइक्रोग्राम / एमएल, 0.031 माइक्रोग्राम / एमएल, 0.0 माइक्रोग्राम / एमएल) पीबीएस में। खाली कुओं में केवल पीबीएस जोड़ें।
- दो प्रतियों में कुओं के लिए प्रत्येक ligand एकाग्रता के 100 μl जोड़ें और इजाजत दी रिसेप्टर ligand आरटी पर 2 घंटे के लिए थाली सेतेबातचीत।
- एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन
- ligands के साथ ऊष्मायन के बाद, समाधान धोने के साथ थाली 3 बार धोएं।
- पिपेट प्राथमिक विरोधी अपने माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी समाधान (1: 1,000) के 100 μl प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए।
- 2 घंटे के लिए आरटी पर थाली सेते हैं; ऊष्मायन के बाद, एंटीबॉडी समाधान (कदम 2.1.2.1 देखें।) त्यागने और प्लेट समाधान धोने के साथ 3 बार धोएं।
- प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से: एचआरपी के 100 μl बकरी विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (10,000 1) मिलकर जोड़ें। आरटी पर 45 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
- एंटीबॉडी समाधान त्यागें (कदम 2.1.2.1 देखें।) और प्लेट समाधान धोने के साथ 3 बार धोएं।
- सब्सट्रेट और विकास के अलावा
- आरटी के लिए TMB सब्सट्रेट समाधान लाने और 1 पर TMB सब्सट्रेट समाधान ए और बी को तैयार: 1 अनुपात। हौसले से प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए तैयार सब्सट्रेट 100 μl जोड़ें और 15-30 मिनट के लिए आरटी पर थाली रखने के लिए। पर्याप्त कर्नल के बाद या विकास 50 μl स्थान पर समाधान जोड़ें।
- प्लेट और डेटा विश्लेषण पढ़ना
नोट: वर्णित प्रोटोकॉल धारणा है कि मापा संकेत विशिष्ट बंधन से बढ़ जाता है पर आधारित है। यह संकेत करने के लिए unspecific बंधन का योगदान अनुमान लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है लेकिन यह इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है।- 450 एनएम पर सीधे absorbance (ऑप्टिकल घनत्व, ओवर ड्राफ्ट) पढ़ें।
- मापा आयुध डिपो मूल्यों से पृष्ठभूमि संकेत घटाना और उन्हें मानक के अनुसार। लघुगणक पैमाने पर करने के ligand एकाग्रता के सभी मूल्यों को बदलने (आधार 10, लॉग इन 10)।
- प्लॉट सामान्यीकृत और पृष्ठभूमि आयुध डिपो मूल्यों को सही ligand एकाग्रता के लघुगणक के खिलाफ (शाफ़्ट, पर कब्जा कर लिया रिसेप्टर बाध्यकारी साइटों के अंश से मेल खाती है) (एक्स अक्ष, लॉग इन 10 पैमाने पर)।
- कश्मीर घ मूल्य का अनुमान है, हिल समीकरण के निम्नलिखित फार्म के लिए डेटा फिट:
tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
नोट: यहाँ Y पर कब्जा कर लिया रिसेप्टर बाध्यकारी साइटों और वाई मैक्स अधिक से अधिक बाध्यकारी के अंश का अर्थ; [एल] मुक्त ligand और हिल गुणांक की एकाग्रता को दर्शाता है। अगर वहाँ केवल एक ligand के लिए बाध्यकारी साइट है, हिल गुणांक एन = 1. एक से अधिक ligand बाध्यकारी साइट के साथ सिस्टम के लिए, बाध्यकारी दर्शाती सकारात्मक सहकारिता है अगर n> 1, नकारात्मक सहकारिता यदि n <1 और यदि n कोई सहकारिता = 1. सूक्ष्म हदबंदी निरंतर करार दिया और आधा अधिक से अधिक प्रभावी एकाग्रता चुनाव आयोग 50 6 से मेल खाती है। स्पष्ट हदबंदी निरंतर कश्मीर डी = (कश्मीर डी) n है। सरलतम मामले में जहां एन = 1 में, ligand एकाग्रता, जिस पर रिसेप्टर बाध्यकारी साइटों में से आधे से कब्जा कर रहे हैं और कश्मीर घ = कश्मीर डी के लिए हदबंदी निरंतर मेल खाती है। यह मॉडल संतुलन की स्थिति के तहत बाध्यकारी, कि केवल एक छोटा सा अंश के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बड़े पैमाने पर कार्रवाई हो जाती हैजोड़ा ligand, रिसेप्टर के लिए बाध्य किया जाता है यानी, [एल] >> [आर एल]।
- संयोजक रिसेप्टर के साथ कोटिंग थाली
चित्रा 1. प्रत्यक्ष ligand-रिसेप्टर बातचीत परख (प्रत्यक्ष एलआरए)। प्रत्यक्ष एलआरए के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
- प्रतियोगिता ligand- रिसेप्टर-इंटरेक्शन परख (प्रतियोगिता एलआरए)
नोट:। कार्यप्रवाह का एक उदाहरण देखें चित्र 2 के लिए प्रतियोगिता एलआरए प्रक्रिया ligand में महत्वपूर्ण परिवर्तन के अलावा प्रत्यक्ष एलआरए के रूप में एक ही कदम (कोटिंग थाली, एंटीबॉडी ऊष्मायन, थाली विकास) इस प्रकार है और इसके अलावा कदम पेप्टाइड्स। उचित नकारात्मक नियंत्रण इस परख के लिए आवश्यक हैं। पिछले एक स्क्रीनिंग अध्ययन में <sup> 4, तले हुए अवरुद्ध पेप्टाइड विरोधी प्रभाव नहीं दिखा था।- अवरुद्ध - ligands और अवरुद्ध पेप्टाइड्स के अलावा
- अगले दिन, कोटिंग समाधान निकालने और (2.1.2.1 देखें) प्लेट धो लें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 5% BSA समाधान के 200 μl जोड़कर लेपित थाली ब्लॉक और आरटी पर 2 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
- एक निश्चित एकाग्रता (2x-20 एनजी / एमएल) पीबीएस में कम से पुनः संयोजक उनकी टैग ligands (IFNL1-3) तैयार करें।
- अलग एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र गारंटी करने के लिए 10 एनएम से पीबीएस में 100 सुक्ष्ममापी को लेकर सांद्रता के साथ अवरुद्ध पेप्टाइड (सीएफ 3 टेबल) तैयार करें।
नोट: यह अवरुद्ध पेप्टाइड के लिए आईसी 50 मूल्य के बाद के दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता है। नियंत्रण कुओं में, अधिकतम (100%) प्राप्त करने के लिए बाध्यकारी पेप्टाइड के बिना ही तय ligand एकाग्रता जोड़ें। रिक्त में, ligand या पेप्टाइड के बिना ही पीबीएस जोड़ें। - (IFNL1-3) ligands के 50 μl और प्रत्येक पे के 50 μl जोड़ेडुप्लिकेट में वेल्स को ptide एकाग्रता।
- आरटी पर 2 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
- प्लेट और डेटा विश्लेषण पढ़ना
नोट: वर्णित प्रोटोकॉल धारणा है कि मापा संकेत विशिष्ट बंधन से बढ़ जाता है पर आधारित है। यह संकेत करने के लिए unspecific बंधन का योगदान अनुमान लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है लेकिन यह इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है।- 450 एनएम पर सीधे absorbance (ऑप्टिकल घनत्व, ओवर ड्राफ्ट) पढ़ें।
- मापा आयुध डिपो मूल्यों से पृष्ठभूमि संकेत घटाना और उन्हें मानक के अनुसार। लघुगणक पैमाने पर करने के पेप्टाइड एकाग्रता के सभी मूल्यों को बदलने (आधार 10, लॉग इन 10)।
- प्लॉट सामान्यीकृत और पृष्ठभूमि आयुध डिपो मूल्यों को सही ligand एकाग्रता के लघुगणक के खिलाफ (शाफ़्ट, पर कब्जा कर लिया रिसेप्टर बाध्यकारी साइटों के अंश से मेल खाती है) (एक्स अक्ष, लॉग इन 10 पैमाने पर)।
- आईसी 50 मूल्य का अनुमान करने के लिए निम्न समीकरण के लिए डेटा फिट:
नोट: यहाँ [पी] पेप्टाइड एकाग्रता और पहाड़ी ढलान है। पहाड़ी ढलान खुराक प्रतिक्रिया वक्र के steepness वर्णन करता है। आईसी 50 अवरोध एकाग्रता, जिस पर ligand और रिसेप्टर के बीच बंधन के 50% निषेध मनाया जाता है से मेल खाती है।
- अवरुद्ध - ligands और अवरुद्ध पेप्टाइड्स के अलावा
चित्रा 2. प्रतियोगिता ligand-रिसेप्टर बातचीत परख (प्रतियोगिता एलआरए)। एलआरए प्रतियोगिता के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Representative Results
INFL1-3 और उनके रिसेप्टर अल्फा सबयूनिट IL28RA के बीच हदबंदी स्थिरांक प्रत्यक्ष एलआरए का उपयोग कर निर्धारित किया गया है। परिणाम 3 चित्र में दिखाए गए हैं: कब्जा कर लिया बाध्यकारी साइटों के अंश संबंधित IFN एकाग्रता के लघुगणक के खिलाफ साजिश रची है। डेटा के Scatchard साजिश सही नीचे कोने में दिखाया गया है। परिणाम यह दर्शाते हैं कि प्रत्यक्ष एलआरए एक बाध्यकारी वक्र है, जो आगे कश्मीर घ मूल्य का अनुमान विश्लेषण किया जा सकता अर्जित करता है। कश्मीर घ मूल्य हिल समीकरण के लिए डेटा (समीकरण 1) फिटिंग द्वारा निर्धारित किया गया था।
IFNL1 उच्चतम बंधन आत्मीयता, IFNL2 और IFNL3 द्वारा पीछा किया है। हिल गुणांक n> 1 प्रारंभिक ligand रिसेप्टर बातचीत (चर्चा देखने के लिए) के बाद अतिरिक्त ligands के लिए आकर्षण में वृद्धि हुई चलता है। अनुमान हदबंदी स्थिरांक और हिल गुणांक तालिका में संक्षेप हैं 1।
प्रतियोगी एलआरए IFNL1-3 और IL28RA (चित्रा 4) के बीच बातचीत पर एक अवरुद्ध पेप्टाइड के प्रभाव quantitate करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। 10 एनजी / एमएल के एक ligand एकाग्रता के लिए कब्जे में बाध्यकारी साइटों के अंश पेप्टाइड एकाग्रता के लघुगणक के खिलाफ साजिश रची है। आईसी 50 मूल्यों का अनुमान करने के लिए, डेटा 2 समीकरण के लिए फिट है।
अवरुद्ध पेप्टाइड सबसे बड़ी हद तक IFNL3 और IL28RA (आईसी 50 = 0.26 माइक्रोन) के बीच बातचीत हिचकते हैं। आईसी 50 में दो बार IFNL2-IL28RA बातचीत (आईसी 50 = 0.50 सुक्ष्ममापी) और परिमाण IFNL1-IL28RA बातचीत के लिए उच्च के एक आदेश के लिए के रूप में अधिक है, संकेत पेप्टाइड IFNL1-IL28RA बातचीत में खलल न डालें पर कम प्रभावी था। चुना गया आईसी 50 मूल्यों और पहाड़ी ढलानों तालिका 2 में संक्षेप हैं।
_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> उचित डेटा विश्लेषण ligand रिसेप्टर बातचीत को समझने के लिए आवश्यक है दिखाया परिणाम ऐसे GraphPad चश्मे के रूप में एक वैज्ञानिक रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न किया गया कश्मीर घ मूल्य निर्धारण के लिए।। आंकड़ों के लिए लगाया गया था 'एक साइट - विशिष्ट पहाड़ी ढलान के साथ बंधन'। (। Sec में 1 समीकरण से मेल खाती है 2.2.1) आईसी 50 मूल्य निर्धारण के लिए, डेटा समारोह 'लॉग (अवरोध) बनाम के लिए फिट है । सामान्यीकृत प्रतिक्रिया -। चर ढलान '(। Sec में 2 समीकरण देखते 2.2.2) हालांकि, गैर रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण के लिए किसी भी सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जा सकता है।
चित्रा 3. प्रत्यक्ष ligand रिसेप्टर परख (प्रत्यक्ष एलआरए) के परिणामों। IFNL1 (हरा), IFNL2 (लाल) और IFNL3 (नीला) IL28RA करने की बाइंडिंग के लिए बाध्यकारी घटता। नीचे सही में संबंधित Scatchard साजिशकोने का सुझाव बाध्यकारी का सकारात्मक सह-operativity। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. प्रतिस्पर्धी ligand रिसेप्टर परख (प्रतिस्पर्धी एलआरए)। के परिणाम IFNL1 (10 एनजी / एमएल, हरा), IFNL2 (10 एनजी / एमएल, लाल) और IFNL3 के बंधन का निषेध दिखा खुराक प्रतिक्रिया घटता (10 एनजी / 20 हूँ पेप्टाइड द्वारा IL28RA मिलीलीटर, नीला)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: अनुमानित हदबंदी स्थिरांक (कश्मीर डी) और IFNL1-3 हिल गुणांक IL28RA के लिए बाध्य। मानक त्रुटि (एसई) के आंकड़ों के अनुसार चार बिंदु प्रतिकृति का एक नमूना आकार के लिए दिया जाता है।
तालिका 2:। अवरुद्ध पेप्टाइड्स और IL28RA को IFNL1-3 की बाइंडिंग के लिए खुराक प्रतिक्रिया वक्र के पहाड़ी ढलान की अनुमानित आधा अधिक से अधिक निरोधात्मक सांद्रता (आईसी 50) IFN एकाग्रता 10 एनजी / एमएल है। प्रतिकृति की संख्या तीन है।
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Discussion
एलिसा एक मानक और कई प्रयोगशालाओं के लिए अच्छी तरह से स्थापित विधि है। हम आगे संशोधित और एक पहले प्रकाशित विधि 5.7 सुधार हुआ है। प्रदर्शन कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल से पता चलता है कि यह कैसे ligand रिसेप्टर बातचीत की कश्मीर डी मूल्यों को निर्धारित करने के लिए एक सरल तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, एक अवरुद्ध पेप्टाइड का IC50 कि ligand रिसेप्टर बातचीत के साथ हस्तक्षेप निर्धारित किया जा सकता है।
शोधकर्ताओं के रूप में सबसे पहले एक एलिसा प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है प्रमुख लाभ, तेजी से स्थापना, अभिकर्मकों और परिचित से निपटने की तैयारी के लिए आसान कर रहे हैं। प्रत्यक्ष एलआरए प्रोटोकॉल अत्यधिक लचीला है और कई प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। His6- या वैकल्पिक टैग के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन एक स्थिर साथी के लिए बाध्यकारी साथी के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। प्रतियोगिता एलआरए (i) एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता यौगिकों (पेप्टाइड्स, एंटीबॉडी, या छोटे मोल अवरुद्ध की निरोधात्मक क्षमता का निर्धारणecules) और (ii) रिसेप्टर या ligand की नकल तैयार अवरुद्ध पेप्टाइड्स का उपयोग करके महत्वपूर्ण बातचीत साइटों का निर्धारण।
नकारात्मक नियंत्रण प्रस्तुत assays के लिए एक उचित व्याख्या के लिए आवश्यक हैं। पिछले एक स्क्रीनिंग अध्ययन 4 में, इस्तेमाल किया अवरुद्ध पेप्टाइड के तले अनुक्रम विरोधी प्रभाव नहीं दिखा था। हालांकि, अन्य पेप्टाइड्स एक अवरुद्ध क्षमता भी पांव मार के बाद, unspecific इलेक्ट्रोस्टैटिक संबंधों के कारण होने की संभावना से पता चला है।
एक संभावित सीमा यह है कि इस परख इन विट्रो स्थिति को दर्शाता है। विशेष रूप से, heterodimeric रिसेप्टर्स अक्सर एक अधिक जटिल संरचना के रूप में। यह भेद करने के लिए है कि क्या सिर्फ ligand रिसेप्टर के लिए या कि क्या ligand भी एक गठनात्मक परिवर्तन या एक dimerization, जो बारी में एक intracellular संकेत की ओर जाता है ट्रिगर द्वारा रिसेप्टर को सक्रिय करता है बांधता संभव नहीं है। प्रस्तुत परख में, हम एक पुनः संयोजक रिसेप्टर, जो immobili प्रयोग किया जाता हैएक ठोस चरण के लिए जेड। इस सेटअप सक्रियण परीक्षण करने के लिए या रिसेप्टर्स, जो इस तरह जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के रूप में झिल्ली पर्यावरण या झिल्ली कोलेस्ट्रॉल की आवश्यकता होती है की बातचीत की जांच के लिए काम नहीं करता। इसके अलावा पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग निरंतर उठाती है। उदाहरण के लिए, एक पुनः संयोजक प्रोटीन की तह और तृतीयक संरचना एक विवो स्थिति की तुलना में अलग हो सकता है। ligand और रिसेप्टर के बंधन आमतौर पर आरटी पर होता है, हालांकि मानव में अधिकतम तापमान 37 डिग्री सेल्सियस होगा। अंत में, वाणिज्यिक पुनः संयोजक ligand और रिसेप्टर के उपयोग महंगा साबित हो सकता है। इन सीमाओं के बावजूद, इन दो एलिसा प्रोटोकॉल क्षमता दिखाने के लिए तेजी से ligand रिसेप्टर बातचीत का पता लगाने के लिए।
परिणाम प्रस्तुत IFNL1 IFNL2 की तुलना में IL28RA के लिए एक से थोड़ा अधिक समानता है, और IFNL3 की आत्मीयता IFNL2 से कम तीन गुना है कि दिखा। इस IFNLs के बीच समानता पर विचार उल्लेखनीय है। IFNL1 और IFNL2 अलग33 अमीनो एसिड में फेर IFNL2 और IFNL3 केवल सात अमीनो एसिड 8 में मतभेद है। IL28RA और IFNLs के बीच बातचीत कुण्डल ए और IFNL 9 के एबी लूप शामिल है। IFNL दृश्यों के संरेखण और कुण्डल ए में चार महत्वपूर्ण मतभेद IFNL1 और IFNL3 (चित्रा 5 ए) के बीच एबी लूप का पता चलता है। एक नमक पुल Arg54-Glu119 प्रभावित करता है। इस खंड में अमीनो एसिड के अवशेष को UniProt प्रविष्टियों Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) और Q8IU57 (IL28RA), IFNL1-IL28R1 जटिल (चित्रा के क्रिस्टल संरचना में पाया गया है जो अनुसार गिनाए जाते हैं 5 ब)। स्ट्रक्चरल संरेखण से पता चलता है कि IFNL1 में Arg57 INFL3 है, जो भी Glu118 (चित्रा 5C) के साथ एक नमक पुल बनाने में सक्षम है में Lys57 की जगह है। IFNL3 और IL28RA, की कमी आई है आत्मीयता के साथ लगातार कम्प्यूटेशनल 10,11 और 12 mutational शो का विश्लेषण करती है, कि लिस-ग्लू नमक पुलों Arg-ग्लू साल से कम स्थिर सामान्य में हैंटी पुलों।
हालांकि, कुण्डल ए में मतभेद संतोषजनक ढंग से, IFNL3 के निचले समानता की व्याख्या नहीं है के बाद से एक हेलिक्स के अमीनो एसिड अनुक्रम IFNL2 और IFNL3 के लिए समान है। यह सोचा है कि मुख्य अंतर AB-पाश में म्यूटेशन, जहां Arg74 और IFNL2 में His76 IFNL3 8 में Lys70 और Arg72 द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं से उठता है।
इसके अलावा, IFNLs के बीच स्थिरता और घुलनशीलता में मतभेद भी परख के परिणाम को प्रभावित कर सकता है। चूंकि प्रत्यक्ष एलआरए परख एम एनएम से सांद्रता का उपयोग करता है और सीरम में साइटोकिन्स के शारीरिक एकाग्रता बजे एनएम रेंज में निहित है, IFNL के एकत्रीकरण बाहर नहीं किया जा सकता है। हम मान सकते हैं कि IFN का मनाया सकारात्मक सहकारिता बंधन बाध्यकारी ligand रिसेप्टर में एक विशिष्ट या गैर विशिष्ट वृद्धि हुई है, जैसे, समाधान में पुनः संयोजक IL28RA रिसेप्टर के एक dimerization, या एक दूसरे ligand या ligand टुकड़ा की एक बाध्यकारी कारण होता है उच्च आत्मीयता के साथ। होwever, आगे की पढ़ाई यह सत्यापित करने के लिए आवश्यक हैं।
अवरुद्ध पेप्टाइड प्रतियोगिता एलआरए mimics में इस्तेमाल IFNL3 की अटल बिहारी-पाश (चित्रा 6)। पहले से वर्णित के रूप में, एबी लूप IFNLs और IL28RA 9, विशेष रूप से IFNL2 और IFNL3 के बीच बातचीत में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। IL28RA / IFNL1 क्रिस्टल संरचना के साथ IFNL3 की अनुरूपता मॉडलिंग से पता चलता क्षेत्र है, जो अवरुद्ध पेप्टाइड से मेल खाती है IL28RA के साथ बातचीत के इंटरफेस (चित्रा 6) के करीब स्थानिक निकटता में निहित है कि। माना जाता है कि पेप्टाइड ब्लॉकों IFNL और IL28RA की अटल बिहारी-पाश की बातचीत। प्रतियोगिता एलआरए का समर्थन इस के परिणाम: पेप्टाइड सभी IFNLs के बंधन, पर निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है हालांकि पेप्टाइड IL28RA और या तो IFNL3 या IFNL1 और IL28A की बातचीत की तुलना में IFNL2 के बीच बातचीत का एक अधिक प्रभावी अवरोध करनेवाला है। जैसी कि उम्मीद थी, पेप्टाइड ब्लॉकों IFNL3 के सबसे प्रभावी ढंग से यह बाद से बाध्यकारीIFNL3 की अटल बिहारी-पाश के रूप में बिल्कुल वैसा ही बाध्यकारी जेब रह रहे हैं।
जैसा कि तालिका 3 में दिखाया गया है, IFNL1 और IFNL2 के एबी छोरों गठबंधन को अवरुद्ध पेप्टाइड भिन्न होते हैं। IFNL1 / IL28RA बातचीत के निषेध के लिए पेप्टाइड के निचले आईसी 50 मूल्य के अनुरूप, बारह अमीनो एसिड IFNL1 और पेप्टाइड के बीच मतभेद है, जबकि और केवल दो एमिनो एसिड IFNL2 और पेप्टाइड के बीच मतभेद है। यह इंगित करता है IFNLs और IL28RA के एबी छोरों के बीच बातचीत के लिए थोड़ा अलग बाध्यकारी मोड रहे हैं कि और भविष्यवाणी की है कि पेप्टाइड्स जो IFNL1 नकल IFNL3 और IL28RA के बीच बातचीत से IFNl1 और IL28RA के बीच बातचीत को अवरुद्ध करने में अधिक प्रभावी हो जाएगा।
इसके अलावा, पेप्टाइड समग्र सकारात्मक आरोप लगाया जाता है (चार arginine और दो लाइसिन अवशेषों लेकिन केवल दो aspartate अवशेषों) और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण से पता चलता है कि पेप्टाइड कोई परिभाषित माध्यमिक रूपांकनों है। इसकी कुंडलित, लचीला सेंट के कारणructure पेप्टाइड भी रिसेप्टर के अन्य क्षेत्रों के लिए बाध्य हो सकता है। यह संभवतः ऐसे D118 है, जो एक नमक पुल ligand रिसेप्टर जटिल (चित्रा 5 ब और 5C) को स्थिर करने के रूपों के रूप में ग्लूटामेट और aspartate अवशेषों को ब्लॉक कर सकता है।
चित्रा 5. IFNL1 (हरा) और IFNL3 (नीला)। स्ट्रक्चरल तुलना ऑक्सीजन परमाणुओं लाल रंग में दिखाया जाता है, नाइट्रोजन परमाणुओं नीले रंग में दिखाया गया है। (ए) IL28RA बाध्य IFNL1 और IFNL3 के superposition (IL28RA नहीं दिखाया गया है)। जड़ सभी गठबंधन परमाणुओं के वर्ग विचलन (RMSD) मतलब .672 एक है। IFNL3 के पक्ष श्रृंखला है कि IFNL1 से अलग प्रकाश गुलाबी रंग में डाला जाता है। Arg54 और D118 के बीच (बी) नमक पुल। (सी) IFNL3 IL28RA बाध्य IFNL1 के लिए गठबंधन (IL28RA ग्रे में दिखाया गया है)। संरेखण से पता चलता है कि Arg-ग्लू नमक Briडीजीई शायद एक कम स्थिर लिस-ग्लू, Lys57 और D118 के बीच एक नमक पुल की जगह है। PyMol आंकड़े की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया था और संरेखण के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6 IFNL3 के संरेखण और IFNL1-IL28RA परिसर (IFNL1 दिखाया गया है)। IFNL3 नीले और ग्रे में IL28RA में दिखाया गया है। अवरुद्ध पेप्टाइड को इसी क्षेत्रों बैंगनी रंग में डाला जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
टेबल तीन:
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
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