Introduction
sinyal yollarının kapsamlı bir anlayış ligand-reseptör etkileşimi hakkında detaylı bilgi gerektirir. Spesifik reseptör ile belirli bir ligandın etkileşiminin değerlendirmek için en yöntemleri zaman alıcı, emek yoğun, pahalı ve özel ekipman ve uzmanlık 1 gerektirir.
doğrudan ligand-reseptör etkileşimi deneyi (LRA) ve rekabet LRA: Bu makale immünosorbent deneyi (ELISA) ile bağlantılı bir enzimin göre ligand-reseptör etkileşimi araştırmak için iki hızlı ve güvenilir bir nokta-nokta protokollerini tasvir eder. ELISA rutin hemen hemen her laboratuvarda kullanılan yüksek, duyarlı özel ve hazır bir tekniktir. ELISA yapıldı ve çeşitli usullerde uyarlanabilir. sunulan protokoller farklı lambda interferonlar (INFLs) ve reseptörü arasındaki etkileşimin araştırılması için optimize edilmiştir.
Doğrudan LRA bir quantificati sağlarLigand-reseptör ligand konsantrasyonuna göre bağlanma ve böylece bağlanma eğrisini verir. Ligand-reseptör etkileşimi için uygun bir model kullanılarak veriler ayrıca ayrılma sabiti (KD) tahmin etmek için analiz edilebilir.
Sunulan protokol olarak, yaygın olarak kullanılan, Hill denklemi ligand-reseptör modeli uygulanır. Bu tür yüzey plazmon rezonans tekniği 2,3 gibi diğer yöntemler, iki protein arasındaki bağlanma afiniteleri tespitine imkan da, bu teknoloji, emek-yoğun, pahalı ve özel laboratuar donanımına ihtiyaç duymaktadır.
Yarışma LRA önleyici peptidlerin taranmasını sağlar: bağlayıcı ligand-reseptör peptit konsantrasyonuna göre ölçülür. Bu peptid inhibitör etkisini açıklayan bir doz-yanıt eğrisi elde edilir. Veriler bundan başka, 50 IC (yarım maksimal inhibisyon konsantrasyonunu tahmin etmek için analiz edilebilir
Hem ELISA protokolleri kullanımı kolay ve araştırma soruları geniş bir şekilde adapte edilebilir. herhangi bir rekombinant proteinler, güvenilir ve hızlı iletişim düzenlemelerini belirlemek için kullanılır. Buna ek olarak, rekabet LRA ligand veya reseptör, ya taklit edecek şekilde tasarlanmıştır bloke peptidler kullanılarak ligand ve reseptör kritik etkileşim bölgelerine belirlemek için kullanılabilir. bloke peptid etkin ve spesifik inhibisyonunu gösteriyorsa, peptid kritik bir etkileşim ligandın sitesi (peptid taklit halinde reseptör) veya ligand (peptit taklit halinde ligandı) kaplar.
İlk protokol farklı INFLs K D değeri belirlenmesi ve bunların reseptörünün alfa alt birimini, yani açıklar, direkt LRA kullanarak interlökin-28 reseptör (IL28RA). Daha sonra, ikinci protokol bir 20 amino asit uzunluğunda bir peptid kapasitesini belirlemek için gösterilmiştirINFL-IL28RA etkileşimi inhibe eder. peptid reseptör bağlanma yerinde IFNLs ile rekabet etmek için tasarlanmış olup bir etkileşimin moleküler bir anlayış mümkün kılar. Bundan başka, bu peptidin aşağı akış sinyalleme etkileri 4 üzerindeki etkisini belirlemek için in vitro deneylerde IL28RA engellemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktif Hazırlama
- Karbonat kaplama tamponu hazırlamak 0.36 g Na 2 CO 3 ve 3 100 ml saf su 0.84 gr NaHCO çözmek için; steril filtre kullanımına kadar oda sıcaklığında 0.22 um polietersülfon (PES) zar filtresi ve mağaza tahrik edilen bir vakum kullanılarak tamponu.
- Fosfat% 0.05 h / h Tween 20 eklenerek yıkama çözeltisi hazırlayın tuz (PBS) tamponlu.
- 4 ° C 'de 5 g, 100 mi, PBS içinde BSA (≥98%) ve mağaza eritilmesi ile% 5 bovin serum albümini (BSA) PBS çözeltisi içinde (bloke çözelti) hazırlayın.
- Rekombinant bir reseptörü ligandları ve Bloklama peptitler
- Reconstitutethe rekombinant insan interlökin reseptörü alfa alt-birimi (IL28RA) ve -80 ° C 'de, üreticinin talimatlarına ve saklamak için uygun olarak insan IFN (IFNL1-3) rekombinant His-etiketli ligandlar. Sentezini peptidleri engelleme ve daha önce 4 tarif edildiği şekilde kullanıldı. ligandın farklı konsantrasyonlarda hazırlamak için PBS kullanarakS ve tahlillerde kullanılmak için peptidler.
- Primer antikor hazırlamak için, 1 ile% 0.1 BSA ile PBS içinde 6X His fare monoklonal antikoru seyreltilmiş: 1,000 seyreltme. seyreltik ikincil antikor hazırlamak için yaban turpu peroksidazı (HRP) 1% 0.1 BSA ile PBS içinde konjuge keçi anti-fare IgG (H + L): 10,000 seyreltme.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak belirteç, A, karıştırma ve B ile TMB çözeltisi hazırlayın.
- Oda sıcaklığında damıtılmış su ve mağaza 5N sülfürik asit (H 2 SO4) ekleyerek durdurma çözeltisi hazırlayın.
2. immünosorbent deneyleri (ELISA) Enzim bağlantılı
NOT: Doğrudan ligand-reseptör etkileşimi ELISA (doğrudan LRA, Şekil 1) reseptör-ligand bağlanma afınitesinin bir ölçüsü olarak, sabit bir reseptör-ligand ayrışma (KD) ölçülmesi için kullanılabilir. Yarışma ligand-reseptör etkileşimi ELISA (rekabet LRA, Şekil 2) Bütünligand ve reseptör arasındaki etkileşime müdahale etmek hareket peptidler (ve diğer bloke edici bileşiklerin), elenmesi akımları. Daha önce 5 yayımlandı temel protokol daha da optimize edildi.
Not: Yöntemler, her adımda 96-kuyulu plakanın kuyularına çözüm eklemek için çok kanallı pipet kullanın ELISA hem de. Çözelti tortusundan ayırma veya yıkama adımlarında, lavabo doğrudan çözüm dışarı atmak.
- Doğrudan ligand-reseptör-etkileşim deneyi (doğrudan LRA)
NOT: iş akışı bir örnek için (Şekil 1).- Rekombinan reseptör ile kaplama Plaka
- 100 ng / ul nihai konsantrasyona kadar karbonat tamponu içerisinde yeniden birleştirici alıcısını seyreltilir. de çok kanallı bir pipet kullanılarak her 100 ul pipetleme sabit reseptör konsantrasyonu (100 ng / ml) ile 96-çukurlu mikrotitre plakasının Coat kuyu. iyi kenar artifakı önlemek için plakanın dış duvarları hariç. Bir kapak ile plaka Kapak ve inkübe4 ° CO / N plaka.
- Engelleme ve Ligand eklenmesi
- Sonraki gün, lavaboya plaka eğerek Kaplama çözeltisini çıkarın ve yıkama çözeltisi (PBS +% 0.05 hac / hac Tween 20) ile plaka 3 kez yıkayın.
- de çok kanallı bir pipet kullanılarak her% 5 BSA çözeltisi 200 ul kullanılarak kaplanmış bir tabak üzerinde serbest reseptör bağlanma sitesi engelleme ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin.
- Engelleme çözüm atın (. adım 2.1.2.1) ve yıkama solüsyonu ile plaka 3 kez yıkayın.
- Farklı konsantrasyonlarda (rekombinant His-etiketli ligandları hazırlayın, örneğin, 8 ug / ml, 4 mg / ml, 2 ug / ml, 1 ug / ml, 0.5 ug / ml, 0.25 ug / ml, 0.125 ng / ml, 0.063 ng / ml'lik son yoğunluğa seyreltildi, 0.031 ug / ml, 0.0 ug / ml). boş kuyularda sadece PBS ekleyin.
- Kopya halinde kuyulara her bir ligand konsantrasyonu 100 ul ilave edin ve reseptör-ligand sağlayan oda sıcaklığında 2 saat süre ile inkübe levhasınıetkileşimi.
- Antikorları ile inkübasyon
- lejandlarla kuluçkaya yatırmayı takiben, yıkama çözeltisi plaka 3 kez yıkayın.
- Pipet birincil anti-His fare monoklonal antikoru çözeltisi (1: 1000), 100 ul her bir göze.
- 2 saat oda sıcaklığında inkübe levhasını; İnkübasyondan sonra antikor çözeltisi (adım 2.1.2.1 bkz.) iptal ve yıkama çözeltisi plaka 3 kez yıkayın.
- Her bir oyuğa: HRP 100 ul keçi anti-fare IgG ikincil antikor çözeltisi (10.000 1) bağlanmış ekleyin. Oda sıcaklığında, 45 dakika boyunca inkübasyona bırakılır.
- antikor çözüm atın (. adım 2.1.2.1) ve yıkama solüsyonu ile plaka 3 kez yıkayın.
- Substrat ve Kalkınma eklenmesi
- Oda sıcaklığına TMB substrat çözüm getirmek ve 1 TMB substrat çözeltisi A ve B hazırlanması: 1 oranında. Taze her çukuruna substrat hazırlanan 100 ul ilave edin ve 15-30 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka tutun. Yeterli col sonra veya geliştirme 50 ul durdurma çözüm ekleyin.
- Plaka ve Veri Analizi Okuma
Not: Açıklanan protokol ölçülen sinyal spesifik bağlanma yükselir varsayımına dayanır. Sinyale belirsiz bağlama katkısını tahmin etmek gerekli olabilir ama bu protokol kapsamı dışındadır.- şirketinden 450 nm'de absorbansı (optik yoğunluk, OD) okuyun.
- ölçülen OD değerleri arka plan sinyalini çıkarma ve bunları normalleştirmek. (10 günlük, tabanı 10) logaritmik ölçeğe ligand konsantrasyonunun tüm değerleri Transform.
- Normalize ve arka plan OD değerleri düzeltilmiş arsa (10 ölçek log, X ekseni) ligand konsantrasyonunun logaritmasının karşı (Y-ekseni, işgal reseptör bağlanma sitelerinin fraksiyonu karşılık gelir).
- K D değerini tahmin etmek Hill denkleminin aşağıdaki forma veri sığdırmak:
tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
NOT: Burada Y, işgal reseptör bağlanma siteleri ve Y max bağlayıcı maksimal bölümünü gösterir; [L] serbest ligand ve Hill katsayısı konsantrasyonunu ifade eder. ligand için tek bağlanma sahası varsa, Hill katsayısı n birden fazla ligand birleşme alanından sistemler için = 1, bağlayıcı sergileyen pozitif bir birliktelik olup eğer n> 1, negatif kooperativiteye eğer n <1 ve n Hayır kooperativiteye = 1 mikroskopik ayrışma sabiti olarak adlandırılır ve yarı maksimal etkili konsantrasyon EC50 6 karşılık gelir. Görünen ayrışma sabiti Kd = (KD) n. En basit durumda n = 1, bağlanma yerleri reseptör yarısı işgal ve Kd = Kd hangi ligand konsantrasyonu ayrışma sabiti tekabül. Bu model sadece küçük bir kısmını bu yanı sıra, denge koşulları altında bağlayıcı kitle eylemi varsayarilave ligand reseptöre bağlanır, yani [L] >> [rj].
- Rekombinan reseptör ile kaplama Plaka
Şekil 1. Doğrudan ligand-reseptör-etkileşim deneyi (doğrudan LRA). Direkt LRA için adım-adım protokolü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Rekabet Ligand-Reseptör-Etkileşim Analizi (rekabet LRA)
NOT:. Iş akışının bir illüstrasyon bakınız Şekil 2 için rekabet LRA prosedürü ligand önemli değişiklikler dışında aynı direkt LRA adımları (plaka kaplama, antikor inkübasyon, plaka geliştirme) izler ve ilave adımını peptidierinin. Uygun negatif kontroller Bu deney için gereklidir. Bir önceki tarama çalışmasında <sup> 4, şifreli engelleme peptid antagonistik etki göstermemiştir.- Engelleme - Ligand ve Engelleme Peptidlerin eklenmesi
- Ertesi gün, kaplama çözüm kaldırmak ve (2.1.2.1 bakınız) plakayı yıkayın.
- her çukuruna% 5 BSA çözeltisi 200 ul ekleyerek kaplanmış bir tabak üzerinde bloke edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin.
- PBS içinde sabit bir konsantrasyonu (2x-20 ng / ml) yeniden birleştirici His-etiketli ligandları (IFNL1-3) hazırlayın.
- Bir doz-tepki eğrisi garanti etmek için 10 nM ila 100, PBS içinde uM arasında değişen farklı konsantrasyonlarda bloke peptidi (bakınız Tablo 3) hazırlanır.
NOT: Bu bloklama peptidi için IC50 değeri daha sonra belirlenmesini mümkün kılar. Kontrol kuyuları, en fazla (% 100) bağlanma elde etmek için peptit olmayan tek sabit bir ligand konsantrasyonu ekleyin. Boş olarak, ligand veya peptid olmayan tek PBS ilave edin. - ligandlar, 50 ul (IFNL1-3) ve her bir PE 50 ul eklekopyalar halinde çukurlara ptide konsantrasyonu.
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin.
- Plaka ve veri analizi Okuma
Not: Açıklanan protokol ölçülen sinyal spesifik bağlanma yükselir varsayımına dayanır. Sinyale belirsiz bağlama katkısını tahmin etmek gerekli olabilir ama bu protokol kapsamı dışındadır.- şirketinden 450 nm'de absorbansı (optik yoğunluk, OD) okuyun.
- ölçülen OD değerleri arka plan sinyalini çıkarma ve bunları normalleştirmek. (10 günlük, tabanı 10) logaritmik ölçeğe peptid konsantrasyonu tüm değerlerini dönüştürmek.
- Normalize ve arka plan OD değerleri düzeltilmiş arsa (10 ölçek log, X ekseni) ligand konsantrasyonunun logaritmasının karşı (Y-ekseni, işgal reseptör bağlanma sitelerinin fraksiyonu karşılık gelir).
- IC50 değerini belirlemek için, aşağıdaki eşitliğe uygun verileri:
NOT: Burada [P] peptid konsantrasyonu ve Tepesi eğimi. Doruk eğim doz-yanıt eğrisinin dikliği açıklanmaktadır. IC50 ligand ve reseptör arasındaki bağlanmanın% 50 inhibisyonu gözlemlenirse edildiği inhibitör konsantrasyonuna tekabül etmektedir.
- Engelleme - Ligand ve Engelleme Peptidlerin eklenmesi
Şekil 2. Yarışma ligand-reseptör etkileşim deneyi (yarışma LRA). Rekabet LRA için adım-adım protokolü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
INFL1-3 ve reseptör alfa alt birimi IL28RA arasındaki ayrılma sabitleri doğrudan LRA kullanılarak belirlenmiştir. Sonuçlar Şekil 3'te gösterilmektedir: bağlantı konumları fraksiyonu ilgili IFN konsantrasyonu logaritmasına karşı grafiği çizilir. verilerinin Scatchard çizimi sağ alt köşesinde gösterilir. Sonuçlar doğrudan LRA daha KD değerini tahmin etmek için analiz edilebilir bir bağlama eğrisi, verir olduğunu göstermektedir. KD değeri Hill denklemine veri (Denklem 1) takılması ile belirlenmiştir.
IFNL1 IFNL2 ve IFNL3 ile en yüksek bağlanma afinitesine sahiptir. Hill katsayısı n> 1, ilk ligand-reseptör etkileşimi (tartışma) sonra ek ligand için afinite artışı önerir. Tahmini ayrılma sabitleri ve Hill katsayıları Tablo özetlenmiştir 1.
Rekabetçi LRA IFNL1-3 ve IL28RA (Şekil 4) arasındaki etkileşim ile ilgili bir bloke edici peptid etkisini ölçmek için kullanılmıştır. 10 ng / ml 'lik bir ligand konsantrasyonu için bağlantı konumları fraksiyonu peptid konsantrasyonunun logaritmasına karşı grafiği çizilir. IC50 değerlerini belirlemek için, veriler 2 denklem edilir.
Engelleme peptit olan en geniş ölçüde IFNL3 ve IL28RA (IC 50 = 0.26 uM) arasındaki etkileşimi inhibe. IC50 iki IFNL2-IL28RA etkileşimi (IC50 = 0.50 uM) ve IFNL1-IL28RA etkileşim için daha yüksek bir magnitüd düzeyinde olduğu gibi yüksek, gösterge peptit IFNL1-IL28RA etkileşimlerini bozan daha az etkili olmuştur. Belirlenen IC50 değerleri ve Hill bu eğimler Tablo 2'de özetlenmiştir.
_content "fo: keep-together.within sayfa =" 1 "> Uygun veri analizi ligand-reseptör etkileşimini anlamak için önemlidir gösterilen sonuçlar gibi GraphPad PRISM olarak bilimsel bir grafik yazılımı kullanılarak oluşturulan K D değeri belirlenmesi için.. veri takıldı 'Bir site - özgü Tepesi eğimle bağlayıcı'. (. Sec 1 Denklem karşılık 2.2.1) IC50 değeri belirlenmesi için, veri fonksiyon 'log (inhibitör) vs takılır . normalize cevap -. değişken eğim '(. Sec Denklem 2'ye bakınız 2.2.2) Ancak, doğrusal olmayan regresyon analizi için herhangi bir yazılım kullanılabilir.
Şekil doğrudan ligand-reseptör tahlilinde (doğrudan LRA) 3. Sonuçlar. IFNL1 (yeşil), IFNL2 (kırmızı) ve IL28RA için IFNL3 (mavi) bağlanması için bağlama eğrileri. sağ alt ilgili Scatchard çizimiköşe bağlama olumlu ko-operatif göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil rekabetçi ligand-reseptör tahlilinde (rekabetçi LRA). 4. Sonuçlar IFNL1 (10 ng / ml, yeşil), (10 ng / ml, kırmızı) IFNL2 ve IFNL3 bağlanmasının inhibisyonunu gösteren doz-tepki eğrileri (10 ng 20 aa peptid tarafından IL28RA / ml, mavi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Tahmini ayrılma sabitleri (K D) Ve IL28RA bağlanabilen IFNL1-3 Hill katsayıları. Standart hata (SE) veri noktası başına dört replika bir örnek boyutu için verilmiştir.
Tablo 2:. Engelleme peptidler ve IL28RA için IFNL1-3 bağlanması için doz-yanıt eğrisinin Hill eğimi tahmini yarım azami inhibe edici konsantrasyonlar (IC50), IFN konsantrasyonu 10 ng / ml'dir. kopya sayısı üçtür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ELISA birçok laboratuvar için standart ve köklü bir yöntemdir. Biz daha değiştirilebilir ve daha önce yayınlanan bir yöntem, 5,7 iyileştirilmiştir. Gösterilen adım adım protokolü ligand-reseptör etkileşimlerinin KD değerlerinin belirlenmesi için basit bir şekilde nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, ligand-reseptör etkileşimi engelleyen bir bloke edici peptidin IC50 belirlenebilir.
En araştırmacılar daha önce bir ELISA protokolü kullanılır gibi büyük avantajları, hızlı kurulum, reaktif ve tanıdık kullanım kolay hazırlanması bulunmaktadır. Doğrudan LRA protokolü son derece esnektir ve birçok protein-protein etkileşimlerini ölçmek için adapte edilebilir. His6- ya da seçenek etiketiyle Rekombinant proteinler, bir hareketsiz kılınmış ortak bağlanma ortağı olarak kullanılır. Yarışma LRA (i) bir tarama aracı olarak yararlanılabilir bileşikleri (peptitler, antikorlar ya da küçük mol bloke önleyici potansiyelini belirlemekecules) ve (ii) bir reseptör veya ligand taklit etmek üzere bloke peptidler kullanarak kritik etkileşim alanlarının belirlenmesi için.
Negatif kontroller, sunulan deneylerin uygun yorumlama için gereklidir. Bir önceki tarama çalışmasında 4, kullanılan engelleme peptit şifreli dizi antagonistik etki göstermemiştir. Ancak, diğer peptidler nedeniyle belirsiz elektrostatik etkileşimler, ayrıca çabalıyorlar sonra muhtemel bir engelleme kapasitesi göstermiştir.
Potansiyel sınırlama bu deney bir in vitro durumu yansıtır olmasıdır. Özellikle, heterodimerik reseptörlerin çoğu zaman daha karmaşık bir yapı oluşturmaktadır. Ligand yalnızca reseptörüne veya ligand da sırayla, bir hücre içi sinyal yol açan yapısal bir değişiklik ya da bir dimerizasyon, tetikleyerek reseptörünü aktive edip etmediğinin bağlanan olmadığını ayırt etmek mümkün değildir. sunulmuştur deneyde biz Immobili olan rekombinant bir reseptörü kullanılırbir katı faza zed. Bu kurulum aktivasyonunu test etmek için ya da G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) olarak zar ortamı ya da zar kolesterol gerektiren reseptörlerinin etkileşimini incelemek için çalışmaz. Ayrıca yeniden birleştirici proteinin kullanımı uyarılar yükseltir. Örneğin, bir rekombinant proteinin katlanması ve üçüncül yapı, bir in vivo duruma göre farklı olabilir. ligand ve reseptör bağlanmasını, genellikle, ancak insanlarda optimum sıcaklığı 37 ° C olacak, oda sıcaklığında meydana gelir. Son olarak, ticari rekombinant ligand ve reseptör kullanımı pahalı kanıtlayabilirim. Bu kısıtlamalara rağmen, bu iki ELISA protokolleri hızla ligand-reseptör etkileşimini keşfetmek için potansiyel gösteriyor.
Sunulan sonuçlar IFNL1 IFNL2 göre IL28RA için biraz daha yüksek bir afiniteye sahiptir ve IFNL3 afinitesi IFNL2 daha düşük üç misli olduğunu gösterir. Bu IFNLs arasındaki benzerliği göz önüne alındığında dikkate değer. IFNL1 ve IFNL2 dif33 amino asit fer IFNL2 ve IFNL3 sadece yedi amino asitler 8 farklılık ise. IL28RA ve IFNLs arasındaki etkileşim A sarmalı ve IFNL 9 AB-döngüsünü içermektedir. IFNL dizilerinin hizalanması, dört önemli sarmalı farklılıkları ve IFNL1 ve IFNL3 (Şekil 5A) arasındaki AB-döngü ortaya koymaktadır. Bir tuz köprüsü Arg54-Glu119 etkiler. Bu bölümdeki amino asit kalıntıları UniProt IFNL1-IL28R1 kompleksi (Şekil kristal yapısında bulunmuştur Q8IU54 (IFNL1) Q8IZI9 (IFNL3) Q8IZJ0 (IFNL2) ve Q8IU57 (IL28RA) girişlerine göre numaralandırılan 5B). Yapısal hizalama IFNL1 bölgesindeki Arg57 da Glu118 (Şekil 5C) ile oluşturulmuş bir tuz köprüsü oluşturmak için mümkün INFL3 bölgesi Lys57 ile ikame edildiğini gösterir. IFNL3 ve IL28RA, azalmış bir afinite ile uyumlu olarak hesaplama 10,11 ve mutasyonal 12, Lys-Glu tuz köprüleri Arg-Glu sal daha az kararlı, genel olarak olduğu, analizleri sonucundat köprüler.
A sarmalı ve amino asit sekansı IFNL2 ve IFNL3 için aynıdır Bununla birlikte, A sarmalı farklılıklar biçimde, IFNL3 alt afinitesi açıklamaz. Temel fark Arg74 ve IFNL2 bölgesindeki His76 IFNL3 8 Lys70 ve Arg72 değiştirilir AB-döngüsünde mutasyonlar, kaynaklandığı düşünülmektedir.
Ayrıca, IFNLs arasındaki kararlılık ve çözünürlük farklılıklar aynı zamanda tahlilin sonuçlarını etkileyebilir. Doğrudan LRA deney M nM konsantrasyonlarda kullanılır ve serum sitokin fizyolojik konsantrasyonunun pM nM aralığındadır için, IFNL agregasyon göz ardı edilemez. Bu IFN gözlemlenen pozitif bir birliktelik, bir spesifik veya spesifik olmayan bağlanma ligand reseptör artış, örneğin, çözelti içinde yeniden birleştirici IL28RA reseptör dimerizasyonu ya da bir ikinci ligand veya ligand fragmanının bağlanması kaynaklanır bağlanma varsayabiliriz daha yüksek afinite ile bağlar. HoWever, daha ileri çalışmalara Bunu doğrulamak için gereklidir.
Yarışma LRA taklit içinde IFNL3 ve AB-döngü kullanılan engelleme peptid (Şekil 6). Daha önce açıklandığı gibi, AB-köprüsü IFNLs ve IL28RA 9, özellikle de IFNL2 ve IFNL3 arasındaki etkileşim önemli bir rol oynar. IL28RA / IFNL1 kristal yapıya sahip IFNL3 Homoloji modeli bloke peptidine karşılık gelen bölge IL28RA etkileşim arayüzü (Şekil 6) civarındadır mekansal yakınlığı yatmaktadır göstermektedir. peptid blokları düşünülmektedir IFNL ve IL28RA ve AB-döngü etkileşimi. Bu rekabet LRA destek sonuçları: peptid, tüm IFNLs bağlanması üzerinde inhibe edici bir etkiye sahiptir, ancak peptid IL28RA ve ya IFNL3 ya IFNL1 ve IL28A etkileşiminin daha IFNL2 arasındaki etkileşimin daha etkili bir inhibitörüdür. Beklendiği gibi, peptid bloklarla yana en etkili IFNL3 bağlanmasıIFNL3 Ab-döngü tam olarak aynı bağlayıcı cep kaplar.
Tablo 3'te gösterildiği gibi, bloke peptit farklılık, IFNL1 ve IFNL2 Ab-döngüler hizalanır. Iki amino asit IFNL2 ve peptit arasında farklılık ise ve IFNL1 / IL28RA etkileşiminin engellenmesi için peptidin düşük IC50 değeri ile uyumlu olarak, on iki amino asit IFNL1 ve peptit arasında farklılık gösterir. Bu IFNLs ve IL28RA ve AB-döngüler arasındaki etkileşim için biraz farklı bağlama mod olduğunu gösterir ve IFNL1 taklit eden peptitler IFNL3 ve IL28RA arasındaki etkileşimin daha IFNl1 ve IL28RA arasındaki etkileşimi bloke daha etkili olacağını tahmin ediyor.
Bundan başka, peptit genel olarak pozitif (dört arginin ve iki lisin tortuları için, ancak sadece iki aspartat kalıntıları) şarj edilmiş ve hesaplama analizi peptit tanımlı bir orta motifleri sahip olduğunu göstermektedir. Nedeniyle kangal, esnek stkezlerinin Peptit aynı reseptörünün diğer bölgelere bağlanan olabilir. Bu potansiyel olarak ligand-reseptör kompleksi (Şekil 5B ve 5C) stabilize etmek için bir tuz köprüsünü oluşturan D118, glutamat ve aspartat kalıntıları bloke olabilir.
Oksijen atomu kırmızı ile gösterilmiştir IFNL1 (yeşil) ve IFNL3 (mavi). Şekil 5. yapısal karşılaştırması, nitrojen atomu mavi ile gösterilmiştir. IL28RA bağlı IFNL1 ve IFNL3 (A) 'den (IL28RA gösterilmemiştir). 0.672 Å kök tüm hizalanmış atomların kare sapması (RMSD) ortalamasıdır. IFNL1 farklı IFNL3 yan zincirleri ışık pembe vurgulanır. Arg54 ve D118 arasındaki (B) Tuz köprüsü. IL28RA bağlı IFNL1 için (C) IFNL3 hizalanmış (IL28RA gri gösterilir). hizalamasını gösterir Arg-Glu tuzu bri buDGE muhtemelen daha az stabil Lys-Glu, Lys57 ve D118 arasında bir tuz köprüsü ile değiştirilir. Pirol rakamlar hazırlanmasında kullanılan ve uyum için. Edildi , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
IFNL3 Şekil 6. hizalanması ve (gösterilmemiş olan IFNL1) kompleksi IFNL1-IL28RA. IFNL3 mavi ve gri IL28RA gösterilmiştir. Engelleme peptid tekabül eden bölgelerde mor vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 3:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
