Introduction
Пигментный эпителий сетчатки глаза (ПЭС) поддерживает функцию сенсорной сетчатки через многочисленные процессы 1. Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является наиболее важной причиной слепоты неизлечимой в промышленно развитых странах и характеризуется изменениями в ПЭС, включая потерю пигмента, потеря функции и атрофия. В AMD и при нормальном старении, ПЭС накапливает флуоресцентные, лизосом полученные органеллы, содержащие фрагменты фагоцитированы фоторецепторов, именуемых липофусциновых гранул. Накопление ПЭС липофусцина, как считалось, указывают на окислительные дисфункции 1, но недавние исследования показали , что морфология РПЭ остается нормальным в возрасте от глаз с высокими уровнями липофусциновых 2. Тем не менее, аномальные закономерности распределения липофусцина, в частности , потери липофусцина, являются документированные маркеры для AMD и AMD прогрессии, как гистологически и клинически 3,4
Дефектные процеспеть РПЭ липофусцина также было показано, происходит в некоторых наследственных дегенерации сетчатки. Пациенты , страдающие от болезни Stargardt (STGD) накапливаются липофусцина в ПЭС в молодом возрасте, в конце концов развивается потеря зрения подобное тому , которое наблюдалось в 5 драмов. Эти результаты свидетельствуют о том , что накопление липофусцина само по себе может быть токсичным и привод RPE дисфункции 6,7. Однако детальное изучение изображений предметов с STGD с течением времени не подтвердили , что накопление липофусцина фокусного привело к последующей потерей РПЭ 8. Следовательно, хотя липофусциновых аномалии являются маркерами дегенерации сетчатки, роль для прямой токсичности липофусцина остается недоказанной.
ПЭС является наиболее задний слой клеток сетчатки, но генерирует большинство флуоресцентного сигнала от глазного дна. Генерация и обнаружение автофлуоресцентной (AF), полученный из ПЭС может быть выполнена с использованием сканирующей конфокальной лазерной офтальмоскопии (cSLO), что позволяет VIsualization пространственного распределения фундус AF. Некоторые дегенерации сетчатки глаза демонстрируют отличительные закономерности фундус автофокусировки и вспомогательные средства визуализации AF в диагностике и мониторинге этих условий. Хотя стандарт визуализации AF является клинически важным, количественная АФ (Каф) стала важным средством оценки состояния здоровья ППД. Мы и другие разработали стандартизированный подход , который может достоверно определить уровни Каф в определенных местах сетчатки глаза 9. Каф имеет потенциальное применение в диагностике и мониторинг состояния сетчатки глаза, а также может иметь применение в прогнозе и риска стратификации. Кроме того, диагностические возможности Каф также были описаны для некоторых заболеваний сетчатки 10-12. Здесь мы предлагаем пошаговый детали для выполнения нашей техники сопровождается наглядной демонстрацией его применения в оценке здоровых и больных глаз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Все пациенты, зарегистрированные в этих исследованиях было сделано в соответствии с утвержденным институциональным экспертным советом надзора на Нью-Йоркской школы медицины университета.
1. Отбор пациентов и начальной подготовки для работы с изображениями
Примечание: Следующие материалы необходимы: 0,5% офтальмологический раствор тропикамид, 2,5% офтальмологический раствор фенилэфрина, cSLO оснащен спектральной области оптической когерентной томографии (ОКТ-SD), и внутренним источником опорного напряжения флуоресценции.
- До обработки изображений, надлежащим образом настроить cSLO для сбора данных в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Установите внутренний флуоресцентный ссылку в cSLO. Примечание: внутренний флуоресцентный ссылка, поскольку приобретенный у изготовителя, расположен в металлическом кольце и помещается непосредственно за объективом камеры. Если cSLO от другого производителя используется, может быть другая конфигурация, чем тот, который описан вэтот протокол.
- Для того, чтобы вставить ссылку в cSLO, крутить объектив, чтобы удалить его, открутить металлическое кольцо машины, и заменить его новым металлическим кольцом, содержащим ссылку.
Примечание: внутренний флуоресцентный ссылка имеет важное значение для техники Каф, так как она позволяет коррекции для изменения мощности лазера и детектора чувствительности / усиления.
- Для того, чтобы вставить ссылку в cSLO, крутить объектив, чтобы удалить его, открутить металлическое кольцо машины, и заменить его новым металлическим кольцом, содержащим ссылку.
- У пациентов, набранные для работы с изображениями пройти рутинную дилатационная обследование глаз и получить справочную информацию о прошлых глазном истории и основных медицинских условий, которые могут проявляться с глазными выводами.
- Разбавить учеников с 0,5% тропикамид и 2,5% фенилэфрина. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Разбавить учеников не менее 6 мм. Примечание: Это очень важно для непрерывного прохождения света, и, таким образом, для оптимальной визуализации и измерения глазного дна.
- До обработки изображений, установите пациента должным образом на cSLO, с подбородка на Chinrest, лоб помещается против forehead отдых, и боковые углах глаз правильно выровнен с индикаторами.
2. Базовый уровень визуализации глазного дна
- Во-первых, изображение на глазном дне с ближней инфракрасной области спектра отражения (ИК) света (длина волны 820 нм), для того, чтобы централизовать камеру над макулы и получить грубый фокус.
- При правильном расположении пациента, включить настройку аппаратного обеспечения на панели управления в режиме ИК-изображения, положение камеры вручную до тех пор, пока фундус в полном фокусе, и сделайте снимок
- Отрегулируйте настройку на панели управления в положение "IR-ОСТ", которая использует спектрально-домен оптической когерентной томографии (SD-OCT) в сочетании с ИК-изображений для оценки макулы для основного заболевания.
- Используйте направляющие, присутствующие в окне изображения, чтобы правильно ориентировать ОКТ на ИК-изображении глазного дна. Для достижения оптимального SD-OCT качества, установите камеру таким образом, что Октябре изображение находится в верхней трети своего окна изображения. Приобретать по меньшей мере, одну горизонтальную линию СБНчерез ямки и охватывает все поле изображения.
3. Настройка Каф обработки изображений
- Используйте "Высокая скорость" захвата изображения. Примечание: Этот параметр позволяет ускорить получения изображения, что снижает риск потери сигнала из-за движения пациента и в результате закупорки света радужной оболочки глаза или веки.
- Используйте "Среднее" 9 кадров. Примечание: Эта настройка позволяет быстро, последовательного захвата 9 кадров изображения, которые могут быть впоследствии "усредненного" для снижения уровня шума и артефактов (см ниже).
- Используйте поле "30 х 30 градусов". Примечание: Это относится к степени области сетчатки глаза захваченного во время захвата изображения.
- До начала обработки изображений, предупредить пациента о голубом свете, так как это может вызвать тревогу в первую очередь.
- Включите режим автофокусировки и выровнять ось камеры таким образом, что экран максимально "заполнен" фундус AF (минимальное потемнение сторон и углов изображения).
- Если пациенты чпр трудности терпимо относиться к ярко-синий свет, начать визуализацию с камерой подальше от глаз, а затем приблизить камеру медленно к пациенту, пока глазного дна не в полном виде.
ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Если свет, входящий в или выходящий из глаза затруднен, снижение сигнала приведет. Локализованные уменьшение видна как асимметричная потемнение в сторону изображения или угла. Обобщенная потеря сигнала наблюдается, когда движения глаз в одиночку препятствовать прохождению света.
- Если пациенты чпр трудности терпимо относиться к ярко-синий свет, начать визуализацию с камерой подальше от глаз, а затем приблизить камеру медленно к пациенту, пока глазного дна не в полном виде.
- Align камеру таким образом, что сигнал АФ находится на самом высоком уровне по всему полю. Цель для максимального сигнала, а не четкое изображение, однако они примерно соотносятся. Отрегулируйте фокусировку камеры, перемещая cSLO, чтобы изменить положение камеры либо вручную, либо с помощью офтальмоскопом джойстика.
- Регулировка чувствительности / усиления таким образом, что фундус AF хорошо видна, но избежать чрезмерного насыщения. Во время захвата изображения, цветные пиксели, видимые в каждой внутренней ссылки (расположенный в верхней частиизображение) или на глазном дне указывают на перенасыщенность и, таким образом, потери сигнала.
4. Получение изображения
Примечание: Важнейший шаг: Цель в приобретении изображения должно быть, чтобы получить 2 высокого качества 9-кадров стеки изображений за один сеанс, чтобы контролировать изменчивость между изображениями в сеансе. После репозиции пациента и камеры, получить вторую сессию двух изображений для оценки и контроля за изменчивости. Все изображения, в конечном счете, калибруется по внутренним источником опорного напряжения (описано ниже).
- Получение изображений только после того, как по меньшей мере 20 сек от "отбеливания" (полной экспозиции сетчатки к свету AF) , чтобы свести к минимуму поглощение света родопсина в сенсорной сетчатки 9.
- Используйте этот период для оптимизации выравнивания камеры, фокус и чувствительность.
- Есть предметы мигать перед каждым захвата изображения, как свежий слезной пленки улучшает качество сигнала.
- Избегайте веки в плоскости приобретения.
Примечание: Это может быть полезно, чтобы вручную открыть веки для более сложных пациентов. Авторы рекомендуют помощник выполняет эту задачу. - Оптимизация выравнивания перед каждым захвата изображения, чтобы гарантировать, что свет не перекрывается радужной оболочки приводит к снижению сигнала.
Примечание: По крайней мере, незначительное движение является очень распространенным явлением, авторы рекомендуют тонкую перестройку по мере необходимости перед каждым получения изображения. Руководящий и поощрение пациента в то время как визуализация помогает уменьшить движение. Авторы также рекомендуют использовать ножной педали машины в качестве "кнопки приобретения" таким образом, чтобы свести к минимуму оператора отвлечение. - Выполнять обработку после изображения, вычислив "среднее" из стека 9-кадра, чтобы увеличить отношение сигнал-шум. Подсчитать среднее значение стека с использованием программного обеспечения cSLO, выбрав опцию для вычисления среднего значения.
Примечание: Там может быть стеки , где некоторые кадры не оптимального качества (то есть, локализовали или обобщенными уменьшились сигнал относительно оптимальных кадров), поэтому внимательно осмотрите каждую стопку и снимите флажок неоптимальные кадров перед тем вычисления среднего значения.
Примечание: Средние изображения с приемлемым соотношением сигнал-шум может быть обработан по крайней мере, 3-х кадров. Это нормально для сторон и углов каждого изображения, чтобы иметь более низкий сигнал, чем центральные 20 градусов из-за ограничений внутри самого cSLO.- Если программа спросит , будет ли оператор хотел бы нормализовать уровни серого (то есть растянуть гистограмму) от 0 до 255, выберите "Нет". При этом сохраняется в неизменном виде серых уровней для анализа.
Анализ 5. Изображение
- Анализ изображений AF , как описано ранее с использованием программного обеспечения для анализа изображений , разработанный для техники Каф (IGOR; 9). Краткое описание типичного анализа изображений с помощью этого программного обеспечения приведена ниже.
- Загрузите программу Каф в IGOR и импортировать изображения (в формате .bmp), вывозимых сПрограммное обеспечение cSLO с соотношением сторон пикселей 768 х 768 (выходной параметр по умолчанию).
- Выберите изображение в раскрывающемся меню и начать анализ.
- Переставьте индикаторы калибровки на изображение таким образом, чтобы "перекрестье" залегают ямки и "кронштейн" граничащую оптический диск (эти показатели используются для масштабирования и расположите трансформирования). При правильной установке, использование программного обеспечения подсказок затем заполнить изображение с окружными трансформирования окружающих ямку (см рис 1, 2).
- Выберите опцию в IGOR для калибровки общих уровней серого каждого изображения на этих уровнях, присутствующих во внутренней флуоресцентной ссылки. Примечание: Этот шаг позволяет выполнять калибровку машинных факторов, связанных, в том числе электронного нулевого уровня каждого изображения и внутренний фактор опорного калибровки каждой машины, а также факторов, связанных с пациентом, включая возраст, рефракции и кривизны роговицы.
Примечание: Программное обеспечение для анализа затем отображает фиксированный гegions на полученном изображении, и значение Каф демонстрируется в каждом регионе. Значения Каф также автоматически вводятся в формате электронной таблицы в отдельном окне ". - Генерация Каф "тепловых карт", выбрав опцию в рамках командной строкой. Все изображения и данные могут быть экспортированы из программы ИГОРЯ в таблице первенствовать, выбрав соответствующие параметры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод был использован для изучения Каф как у здоровых 13 и болезненных состояний 10-12. У здоровых глаз (рисунок 1), AF , излучаемый от ПЭС распределяется относительно равномерно по всему фундус (рис 1А). Снижение интенсивности наблюдается в центральной области макулы вследствие блокирования света макулярного пигмента, а по бокам и в углах изображения благодаря оптике глаза и камеры. Сосуды появляются темные и должны быть в четкой ориентации в хорошо полученных изображений. Рисунок 1B демонстрирует соответствующую Теплокарта представление уровней Каф из рис 1А. Cooler цвета соответствуют областям более низкой интенсивности в то время как более теплые цвета соответствуют областям более высокой интенсивности. Максимальная интенсивность обычно рассматривается во втором концентрического кольца 8-сегмента (показано на рисунке 1В). Этот регион является также менее подвержены variabil изображений, связанных сности, чем регионы, ближе к краю изображения, и находится за пределами центральной области, где макулы пигмент имеет большое влияние на уровень Каф. Таким образом, средние интенсивности этого кольца используются для большинства анализа данных 13. Рисунок 2 представляет собой репрезентативный анализ в глазу с AMD демонстрирует географическая атрофия (ГА), продвинутую форму AMD. Эта форма результатов AMD в локализованных областях потери РПЭ, о чем свидетельствует значительное снижение или отсутствие автофокуса, и вызывает прогрессирующее центральную потерю зрения.
Рисунок 1. автофлюоресценции в здоровом глазу. (А) автофлюоресценции (AF) , изображение правого глаза нормального пациента. OD: диск зрительного нерва, Fo: ямка, Ма: макулы, Ref: внутренний источник опорного напряжения. (Б) заключительная обработка Каф карту AF изображения от (A). Более теплые цвета коррелируют с более высокой интенсивностью автофокусировки. Фиксированный регИоны показаны и значения Каф каждого региона указаны. Кольцо 8-сегментный perifoveal используется при анализе данных обозначается пунктирной линией. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. автофлюоресценции в глаза показывая географическая атрофия из - за AMD. (A) автофлюоресценции (AF) изображение левого глаза пациента с ВМД показывая географическая атрофия (ГА) ПЭС (репрезентативной области очерченной пунктирной линией). OD: диск зрительного нерва, Fo: ямка, Ма: макулы, Ref: внутренний источник опорного напряжения. Обратите внимание, заметно снижается и отсутствует АФ в областях, соответствующих GA в пятне. (Б) заключительная обработка Каф карту AF изображения от (A). Фиксированные районы показаны и значения Каф каждой области аповторно указал. Кольцо 8-сегментный perifoveal используется при анализе данных обозначается пунктирной линией. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Аномальные РПЭ распределение липофусцина, является ли увеличиваться или уменьшаться, является чувствительным маркером заболевания сетчатки и, как правило, связана с потерей сенсорной функции сетчатки глаза. Здесь мы опишем применение Каф для оценки ПЭС липофусцина. Включение внутреннего флуоресцентного ссылкой для коррекции переменной мощности лазера и детектора чувствительности 9 наряду с нашей стандартизированной метод визуализации позволяет для надежной количественной оценки уровней AF. Это наша цель, что этот метод поможет в диагностике и мониторинге заболеваний сетчатки глаза, и в конечном итоге при оценке эффективности терапевтических вмешательств, таких как наркотиков или генной терапии. Каф может также помочь в стратификации индивидуумов группы риска для условий, таких как AMD.
Мы сформировали большую нормативную базу данных Каф , которые будут использоваться в качестве справочного инструмента для интерпретации патологии 13 сетчатки глаза, а также описали Каф в нескольких ГНА заболеванийTES, включая болезнь Stargardt 10 быка глаз макулопатии 12 и Лучшего заболевания 11. В здоровой сетчатки, существуют различные уровни Каф между этническими группами, со значительно более высоким Каф у белых, чем чернокожих и азиатов, и показали, что женщины имеют более высокий уровень Каф, чем у мужчин. Пожалуй , наиболее ярко, Каф возрастает , как пациенты возраста, что соответствует уровням РПЭ липофусциновых, как ранее измерено спектрофлюориметре 14. Хотя текущая нормативная данные только продлить до 60 лет, кажется , что пациенты имеют измеренное снижение ПЭС липофусцина после 70 лет 14. Интересно, что он не появляется , что изменения в количестве РПЭ клеток происходят как пациентов в возрасте 2 , и поэтому наблюдается снижение AF может быть связано с перераспределением или уменьшением ПЭС липофусцина 3. Это будет интересно, чтобы определить эти снижение ФП в старости коррелируют ли с нарушенной функцией РПЭ и повышенным риском развития ВМД.
15. Другим ограничением является то, что этот метод является сложным для выполнения и сильно зависит от оператора. Крайне важно, чтобы последовательно получать изображения высокого качества для обеспечения точных измерений уровней AF. Для того, чтобы добиться этого, авторы рекомендуют строгое соблюдение протокола формирования изображения, а также адекватную практику. Хотя некоторые пациенты плохо переносят яркие вспышки света , необходимого для получения изображения AF, уверяя пациентов , что уровни воздействия хорошо в пределах безопасных пределов полезно 1. Для обеспечения оптимальной визуализации, очень важно, чтобы расширить зрачки не менее 6 мм и получить несколько изображений с беспрепятственным светопропускания (смотри выше). Достижение оптимального фокуса и избежать перенасыщения пикселей также имеют важное значение. Полезные методы включают общение с пациентом во время формирования изображения, использование помощника, если необходимо поднимать и использовать педаль для запуска камеры, как описано выше веко.
Таким образом, ООНderstanding патофизиологии ПЭС в дегенерации сетчатки остается областью активных исследований, а также потенциально важного терапевтического воздействия. Как Каф позволяет прямое сравнение уровней AF в изображениях, полученных в продольном направлении, между пациентами и между центрами, она является ценным инструментом, который может внести свой вклад в это понимание, а также предоставить полезную клиническую информацию. Подробный протокол изложенные здесь будет помогать другим в приобретении надежных данных Каф, и что важные клинические применения Каф будет стимулировать научно-исследовательских центров и клинических специалистов сетчатки глаза использовать технику Каф.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить наших соавторов, Франсуа Delori, Томас Берк, и Tobias Дункер.
Поддержка Исследования: NIH / NEI R01 EY015520 (РТС, JPG), и свободные средства от исследований, чтобы предотвратить слепоту (RTB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectralis HRA + OCT | Heidelberg Engineering | ||
| 0.5% tropicamide ophthalmic solution | Any brand can be used | ||
| 2.5% phenylephrine ophthalmic solution | Any brand can be used | ||
| Internal fluorescent reference | Heidelberg Engineering | ||
| IGOR Pro software | WaveMetrics |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological reviews. 85, 845-881 (2005).
- Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 4832-4841 (2014).
- Ach, T., et al. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 56, 3242-3252 (2015).
- Schmitz-Valckenberg, S., Jorzik, J., Unnebrink, K., Holz, F. G., Group, F. A. M. S. Analysis of digital scanning laser ophthalmoscopy fundus autofluorescence images of geographic atrophy in advanced age-related macular degeneration. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 240, 73-78 (2002).
- Weng, J., et al. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell. 98, 13-23 (1999).
- Holz, F. G., et al. Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin. Investigative ophthalmology & visual science. 40, 737-743 (1999).
- Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1981-1989 (2000).
- Smith, R. T., et al. Lipofuscin and autofluorescence metrics in progressive STGD. Investigative ophthalmology & visual science. 50, 3907-3914 (2009).
- Delori, F., et al. Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 9379-9390 (2011).
- Burke, T. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 2841-2852 (2014).
- Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in best vitelliform macular dystrophy. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 1471-1482 (2014).
- Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence distinguishes ABCA4-associated and non-ABCA4-associated bull's-eye maculopathy. Ophthalmology. 122, 345-355 (2015).
- Greenberg, J. P., et al. Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 5684-5693 (2013).
- Delori, F. C., Goger, D. G., Dorey, C. K. Age-related accumulation and spatial distribution of lipofuscin in RPE of normal subjects. Investigative ophthalmology & visual science. 42, 1855-1866 (2001).
- Sparrow, J. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2812-2820 (2013).
- Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. American National Standards Institute. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).
