Introduction
El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es compatible con la función de la retina sensorial a través de numerosos procesos 1. La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es la causa más importante de ceguera intratable en los países industrializados y se caracteriza por los cambios en el EPR, incluyendo la pérdida de pigmento, pérdida de la función y la atrofia. En AMD y en el envejecimiento normal, el RPE se acumula orgánulos fluorescentes, lisosomas derivados que contienen fragmentos fotorreceptoras fagocitados, se hace referencia como gránulos de lipofuscina. La acumulación de lipofuscina RPE ha sido pensado para indicar la disfunción oxidativa 1, pero estudios recientes han demostrado que la morfología del EPR se mantiene normal en los ojos de edad con altos niveles de lipofuscina 2. Marcadores Sin embargo, los patrones anormales de distribución de lipofuscina, en particular, la pérdida de la lipofuscina, se documentan para AMD y progresión de la DMAE, tanto histológicamente y clínicamente 3,4
proces defectuososcante de la lipofuscina RPE también se ha demostrado que se producen en ciertas degeneraciones retinianas hereditarias. Los pacientes que sufren de la enfermedad de Stargardt (STGD) acumulan lipofuscina en el EPR a una edad temprana, con el tiempo el desarrollo de la pérdida de visión similar a la observada en la DMAE 5. Estos resultados sugirieron que la acumulación de lipofuscina puede ser en sí mismo tóxico y conducir RPE disfunción 6,7. Sin embargo, un estudio de imagen detallada de los sujetos con STGD con el tiempo no confirmó que la acumulación de lipofuscina focal condujo a la pérdida de RPE posterior 8. Por lo tanto, aunque las anomalías de lipofuscina son marcadores de degeneraciones de la retina, un papel para la toxicidad directa de lipofuscina no ha sido demostrado.
El RPE es la capa más posterior de la célula de retina, pero genera la mayor parte de la señal fluorescente desde el fondo de ojo. Generación y detección de la autofluorescencia (AF) derivado de la RPE se pueden realizar usando la oftalmoscopia láser confocal de barrido (CSLO), que permite la visualization de la distribución espacial de AF fondo de ojo. Ciertas degeneraciones retinianas demuestran patrones distintivos de fondo de ojo AF, AF y ayudas de formación de imágenes en el diagnóstico y seguimiento de estas condiciones. Aunque las imágenes estándar de la FA es clínicamente importante, AF cuantitativa (QAF) se ha convertido en un medio importante para evaluar la salud del EPR. Nosotros y otros han desarrollado un método estándar que se pueden determinar de forma fiable los niveles qaf en lugares específicos de la retina 9. qaf tiene aplicaciones potenciales en el diagnóstico y seguimiento de las condiciones de la retina, y también puede tener utilidad en el pronóstico y estratificación del riesgo. Además, las capacidades de diagnóstico de qaf También se han descrito para ciertos trastornos de la retina 10-12. Aquí, proporcionamos datos por etapas para llevar a cabo nuestra técnica acompañada de una demostración visual de su aplicación en la evaluación de los ojos sanos y enfermos.
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Protocol
Ética Declaración: Todos los pacientes incluidos en estos estudios fueron realizados de acuerdo con lo que de revisión institucional aprobado supervisión de la junta de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York.
1. Selección de pacientes y preparación inicial de la Imagen
Nota: Se requieren los siguientes materiales: 0,5% solución oftálmica de tropicamida, 2,5% solución oftálmica fenilefrina, CSLO equipado con dominio espectral tomografía óptica de coherencia (SD-OCT) y la fluorescencia de referencia interna.
- Antes de la proyección de imagen, configurado de forma adecuada CSLO para la adquisición de datos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Montar una referencia fluorescente interna en el CSLO. Nota: La referencia fluorescente interna, tal como se adquirió desde el fabricante, se encuentra en un anillo de metal y se coloca directamente detrás de la lente de la cámara. Si se utiliza un CSLO de otro fabricante, puede haber una configuración diferente que la que se describe eneste protocolo.
- Con el fin de insertar la referencia en el CSLO, girar la lente para eliminarlo, desenroscar el anillo del metal de la máquina, y sustituirlo por el nuevo anillo de metal que contiene la referencia.
Nota: la referencia fluorescente interna es esencial para la técnica qaf, ya que permite la corrección de la variación en la potencia del láser y el detector de sensibilidad / ganancia.
- Con el fin de insertar la referencia en el CSLO, girar la lente para eliminarlo, desenroscar el anillo del metal de la máquina, y sustituirlo por el nuevo anillo de metal que contiene la referencia.
- Tienen los pacientes reclutados para la imagen se someten a un examen del ojo con dilatación de rutina y obtener información básica relativa a la historia ocular pasado y condiciones médicas subyacentes que pueden manifestarse con los hallazgos oculares.
- Dilatar los alumnos con 0,5% de tropicamida y fenilefrina al 2,5%. Paso crítico: Dilatar alumnos de al menos 6 mm. Nota: Esto es esencial para el paso ininterrumpido de la luz, y por lo tanto para la visualización óptima y la medición del fondo de ojo.
- Antes de las imágenes, la posición del paciente correctamente en el CSLO, con la barbilla apoyada en el soporte de la barbilla, la frente coloca contra la forehead resto, y cantos lateral correctamente alineados con los indicadores.
2. El nivel básico de imágenes de fondo de ojo
- En primer lugar, la imagen del fondo de ojo con la luz de reflectancia en el infrarrojo (IR) próximo (longitud de onda de 820 nm) con el fin de centralizar la cámara sobre la mácula y obtener el enfoque áspera.
- Con el paciente en la posición correcta, cambiar el ajuste de hardware en el panel de control para el modo de formación de imágenes de infrarrojos, cámara de posición manualmente hasta que el fondo está en el foco completo, y saque una foto
- Ajustar las configuraciones en el panel de control en "IR-OCT", que utiliza el dominio espectral tomografía de coherencia óptica (SD-OCT), en relación con las imágenes de infrarrojos para evaluar la mácula de la enfermedad subyacente.
- Utilice las guías presentes en la ventana de imagen para orientar correctamente la OCT para la imagen IR del fondo de ojo. Para lograr una óptima calidad SD-OCT, coloque la cámara de tal manera que la imagen de OCT se encuentra en el tercio superior de la ventana de imagen. Adquirir por lo menos una línea horizontal scuna a través de la fóvea y que abarca todo el campo de la imagen.
3. La creación de QAF Imaging
- Utilice la adquisición de imágenes "alta velocidad". Nota: Esta configuración permite la adquisición de imágenes más rápido, lo que disminuye el riesgo de pérdida de señal debido al movimiento del paciente y la consiguiente obstrucción de la luz por el iris o los párpados.
- Use "La media de 9" marcos. Nota: Esta configuración permite la captura rápida y secuencial de 9 cuadros de imagen, que pueden ser posteriormente "promedio" para reducir el ruido y los artefactos (véase más adelante).
- Utilizar el campo "30 x 30 grados". Nota: Esto se refiere a los grados de área de la retina capturado en la adquisición de imágenes.
- Antes de las imágenes, que advertir al paciente acerca de la luz azul, ya que esto puede ser alarmante al principio.
- Activar el modo AF y alinear eje de la cámara de tal manera que la pantalla es como máximo de "lleno" con FA fondo de ojo (oscurecimiento mínima de los lados y las esquinas de la imagen).
- Si los pacientes hAve dificultad para tolerar la luz azul brillante, comienzo de imágenes con la cámara más lejos del ojo y luego llevar la cámara lentamente hacia el paciente hasta que el fondo está a la vista.
Paso crítico: si la luz que entra y sale del ojo está obstruido, disminución de la señal dará como resultado. disminución localizada es visible como el oscurecimiento asimétrica de un lado de la imagen o de la esquina. pérdida generalizada de la señal se ve cuando los movimientos oculares solo obstruyen el paso de la luz.
- Si los pacientes hAve dificultad para tolerar la luz azul brillante, comienzo de imágenes con la cámara más lejos del ojo y luego llevar la cámara lentamente hacia el paciente hasta que el fondo está a la vista.
- Alinear la cámara de tal manera que la señal de AF está en su nivel más alto en todo el campo. Objetivo de señal máxima en vez de imagen más nítida, sin embargo, que más o menos se correlacionan. Ajuste el enfoque de la cámara moviendo el CSLO para volver a colocar la cámara de forma manual o con la palanca de mando oftalmoscopio.
- Ajustar la sensibilidad / ganancia de tal manera que la FA fondo de ojo es fácilmente visible, pero evitar la sobre-saturación. Durante la adquisición de imágenes, los píxeles de colores visibles tanto en la referencia interna (situado en la parte superior de laimagen) o el fondo de ojo indican sobre-saturación y por lo tanto la pérdida de señal.
4. Adquisición de imágenes
Nota: Paso crítico: El objetivo de la adquisición de imágenes debe ser de calidad para obtener 2 pilas de imágenes altas de 9 fotogramas por sesión para controlar la variabilidad entre las imágenes dentro de una sesión. Después de cambiar la posición del paciente y la cámara, obtener una segunda sesión de dos imágenes para la evaluación y el control de la variabilidad. Todas las imágenes en última instancia ser calibradas para la referencia interna (descrito a continuación).
- Adquirir imágenes sólo después de al menos 20 segundos de "blanqueo" (exposición total de la retina a la luz AF) para minimizar la absorción de la luz por la rodopsina en la retina sensorial 9.
- Usar este período para optimizar la alineación de la cámara, el enfoque y la sensibilidad.
- Tienen los sujetos parpadear antes de cada adquisición de imágenes como una película lagrimal fresca mejora la calidad de la señal.
- Evitar los párpados en el plano de la adquisición.
Nota: Puede ser útil manualmente los párpados abiertos para los pacientes más difíciles. Los autores recomiendan que un ayudante realiza esta tarea. - Optimizar la alineación antes de cada adquisición de imágenes para asegurarse de que la luz no es obstruida por el iris que resulta en una disminución de la señal.
Nota: Como mínimo menor movimiento es muy común, los autores recomiendan fina reajuste según sea necesario antes de cada adquisición de imágenes. Orientar y animar al paciente mientras que las imágenes ayuda a movimiento de descenso. Los autores también recomiendan el uso de un pedal de la máquina como el botón "adquisición" con el fin de minimizar la distracción del operador. - Realizar el procesamiento posterior de las imágenes mediante el cálculo de la "media" de la pila 9-marco para aumentar la relación señal-ruido. Calcular la media de una pila utilizando el software CSLO mediante la selección de la opción para calcular la media.
Nota: es posible que las pilas donde algunos cuadros no son de calidad óptima (es decir, han localizada o generalizada disminución de la ISgnal en relación con los marcos óptimas), por lo tanto, inspeccionar cuidadosamente cada pila y anular la selección de marcos subóptimas antes de cálculo de la media.
Nota: Las imágenes de medias con proporciones aceptables de señal a ruido se pueden procesar de al menos 3 cuadros. Es normal que los lados y las esquinas de cada imagen tenga la señal más baja que los 20 grados centrales debido a las limitaciones dentro de la propia CSLO.- Si el software pregunta si el operador quiere normalizar los niveles de gris (es decir, estirar el histograma) entre 0 y 255, seleccione "No". Esto mantiene los niveles de gris inalterados para el análisis.
Análisis 5. Imagen
- Analizar las imágenes AF como se describió anteriormente usando el software de análisis de imagen desarrollado para la técnica de QAF (IGOR; 9). Una breve descripción de un análisis de imagen típico que utiliza este software se incluye a continuación.
- Cargar el programa en QAF IGOR e importar imágenes (en formato .bmp) exportados de lasoftware CSLO con relación de aspecto de píxeles de 768 x 768 (parámetro de salida por defecto).
- Seleccione la imagen en el menú desplegable e iniciar el análisis.
- Cambiar la posición de los indicadores de calibración en la imagen de tal manera que las "punto de mira" se superponen a la fóvea y el "soporte" se apoya en el disco óptico (estos indicadores se utilizan para escalar y posicionar las ROI). Cuando se coloca correctamente, el software utilizan peticiones a continuación, rellenar la imagen con regiones de interés circunferenciales en torno a la fóvea (véanse las figuras 1, 2).
- Seleccionar la opción de IGOR para calibrar los niveles de gris globales de cada imagen para esos niveles presentes en la referencia fluorescente interna. Nota: Este paso permite la calibración de los factores relacionados con la máquina, incluyendo el nivel cero electrónico de cada imagen y el factor de calibración de referencia interna de cada máquina, así como los factores relacionados con el paciente, incluyendo la edad, la refracción y la curvatura corneal.
Nota: El software de análisis a continuación, muestra el r fijoEGIONES en la imagen resultante y un valor qaf se demuestra dentro de cada región. qaf valores también se introducen automáticamente en un formato de hoja de cálculo en una ventana separada ". - Generar qaf "mapas de calor" seleccionando la opción dentro de los símbolos del sistema. Todas las imágenes y los datos se pueden exportar desde el software IGOR en una hoja de cálculo de Excel mediante la selección de las opciones apropiadas.
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Representative Results
Esta técnica se utilizó para estudiar qaf en ambos sanos 13 y estados de enfermedad 10-12. En ojos sanos (Figura 1), AF emitida desde el RPE se distribuye de forma relativamente uniforme a lo largo del fondo de ojo (Figura 1A). intensidad reducida se ve en la región macular central debido al bloqueo de la luz por el pigmento macular, y en los lados y las esquinas de la imagen debido a la óptica del ojo y la cámara. Los vasos se ven oscuras y deben estar en foco claro en las imágenes así adquiridos. La Figura 1B muestra una representación correspondiente mapa de calor de los niveles qaf de la figura 1A. los colores más fríos corresponden a áreas de menor intensidad mientras que los colores más cálidos corresponden a las áreas de mayor intensidad. Intensidad máxima se ve generalmente en el segundo anillo de 8 segmentos concéntricos (indicado en la Figura 1B). Esta región también está menos sujeto a variabil relacionados con imágenesdad que las regiones más cercanas a los bordes de la imagen, y se encuentra fuera de la región central donde el pigmento mácula tiene un gran impacto en los niveles QAF. Por lo tanto, las intensidades medias de este anillo se utilizan para la mayoría de los análisis de datos 13. La Figura 2 presenta un análisis representativo en un ojo con AMD demuestra atrofia geográfica (GA), una forma avanzada de AMD. Esta forma de AMD en áreas localizadas de pérdida de RPE, evidenciado por marcadamente reducida o ausente AF, y provoca la pérdida progresiva de la visión central.
Figura 1. autofluorescencia en el ojo sano. Imagen (A) autofluorescencia (AF) del ojo derecho de un paciente normal. OD: disco óptico, Fo: fóvea, Ma: mácula, Ref: referencia interna. (B) El post-procesado mapa qaf imagen de AF a partir de (A). colores más cálidos corresponden a la intensidad de AF superior. reg fijoLos iones se muestran, y los valores qaf de cada región se indican. Perifoveal anillo de 8 segmentos utilizados en el análisis de datos se indica mediante la línea discontinua. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. autofluorescencia en el ojo se presentan atrofia geográfica debido a la AMD. (A) autofluorescencia (AF) imagen del ojo izquierdo de un paciente con degeneración macular avanzada que muestra atrofia geográfica (GA) del RPE (región representativa circunscrita por línea de trazos). OD: disco óptico, Fo: fóvea, Ma: mácula, Ref: referencia interna. Nota marcadamente reducida y ausente de AF en las regiones correspondientes a GA en la mácula. (B) El post-procesado mapa qaf imagen de AF a partir de (A). regiones fijas se muestran, y los valores de cada región qaf unare indicado. Perifoveal anillo de 8 segmentos utilizados en el análisis de datos se indica mediante la línea discontinua. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
distribución lipofuscina RPE anormal, si aumenta o disminuye, es un marcador sensible de la enfermedad de la retina y, en general se asocia con la pérdida de función de la retina sensorial. A continuación, describimos la aplicación de qaf para la evaluación de la lipofuscina RPE. La incorporación de una referencia interna fluorescente para corregir la sensibilidad variable la potencia del láser y el detector 9 junto con nuestra técnica de imagen estandarizada permite la cuantificación fiable de los niveles de AF. Nuestro objetivo es que este método ayuda en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades de la retina, y, finalmente, en la evaluación de la eficacia de las intervenciones terapéuticas, como la terapia de drogas o gen. qaf también puede ayudar en la estratificación de las personas en situación de riesgo de enfermedades tales como AMD.
Hemos generado una gran base de datos normativa de los datos QAF para ser utilizado como una herramienta de referencia para la interpretación de la patología de la retina 13, y también hemos descrito qaf en varios sta enfermedadtes, incluyendo la enfermedad de Stargardt 10, maculopatía en ojo de buey 12 y 11 La enfermedad de Best. En retina sana, hay diferentes niveles qaf entre los grupos étnicos, con significativamente mayor en QAF blancos que negros y los asiáticos, y ha demostrado que las mujeres tienen mayores niveles qaf que los hombres. Tal vez lo más sorprendente es que qaf aumenta a medida que la edad del paciente, que se corresponde con los niveles de lipofuscina RPE, medido previamente por espectrofluorometría 14. Aunque los datos normativa actual sólo se extiende hasta los 60 años, parece que los pacientes tienen una disminución medida en lipofuscina RPE después de los 70 los 14 años. Curiosamente, no parece que los cambios en el número de células RPE producen como pacientes de 2 años y por lo que las disminuciones observadas en AF puede ser debido a una redistribución o reducción de lipofuscina RPE 3. Será interesante determinar si estas disminuciones en la AF en la vejez se correlacionan con deterioro de la función RPE y mayor riesgo de AMD.
1 en ratones5. Otra limitación es que la técnica es difícil de realizar y es altamente dependiente del operador. Es esencial para obtener imágenes de alta calidad consistentemente para asegurar mediciones precisas de los niveles de AF. Para lograr esto, los autores recomiendan estricta adherencia al protocolo de imagen, así como la práctica adecuada. Aunque algunos pacientes toleran mal los brillantes destellos de luz requerida para obtener imágenes de la FA pacientes, asegurando que los niveles de exposición son bien dentro de los límites de seguridad es útil 1. Para permitir la proyección de imagen óptima, es fundamental para dilatar los alumnos de al menos 6 mm y obtener múltiples imágenes con la transmisión de luz sin obstrucciones (véase más arriba). El logro de un enfoque óptimo y evitar la sobresaturación de los píxeles son también esenciales. prácticas útiles incluyen comunicación con el paciente mientras que las imágenes, el uso de un asistente si el párpado tiene que ser levantado y utilizar el pedal de pie para la activación de la cámara, como se describió anteriormente.
En resumen, la ONUcomprensión de la fisiopatología de la RPE en degeneraciones de la retina sigue siendo un área de investigación activa, y del impacto terapéutico potencialmente importante. Como qaf permite la comparación directa de los niveles de AF en las imágenes obtenidas en sentido longitudinal, entre pacientes y entre los centros, es una herramienta valiosa que puede contribuir a esta comprensión, así como proporcionar información clínica útil. El protocolo detallado se describe aquí ayudará a otros en la adquisición de datos qaf fiables, y que las aplicaciones clínicas importantes de QAF animará a los centros de investigación y especialistas en retina clínicos para hacer uso de la técnica de QAF.
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Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a nuestros colaboradores, Francois Delori, Tomas Burke, y Tobias Duncker.
Apoyo a la Investigación: NIH / NEI R01 EY015520 (RTS, JPG), y los fondos de libre disposición de Investigación para prevenir la ceguera (RTB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectralis HRA + OCT | Heidelberg Engineering | ||
| 0.5% tropicamide ophthalmic solution | Any brand can be used | ||
| 2.5% phenylephrine ophthalmic solution | Any brand can be used | ||
| Internal fluorescent reference | Heidelberg Engineering | ||
| IGOR Pro software | WaveMetrics |
References
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