Quantitative Fundus-Autofluoreszenz für die Beurteilung von Netzhauterkrankungen

Introduction

Das retinale Pigmentepithel (RPE) unterstützt die Funktion der sensorischen Netzhaut durch eine Vielzahl von Prozessen ^1. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die wichtigste Ursache für unheilbar Blindheit in den Industrieländern und wird durch Veränderungen im RPE gekennzeichnet, einschließlich dem Verlust von Pigment, Funktionsverlust und Atrophie. In AMD und in normalen Alterungs akkumuliert der RPE fluoreszierend, Lysosom abgeleiteten Organellen phagozytierten Photorezeptorfragmente, die als lipofuscin Granulat enthält. Die Anhäufung von RPE Lipofuscin ist gedacht worden oxidative Dysfunktion ¹ , um anzuzeigen, aber neuere Studien haben gezeigt , dass die Morphologie RPE ² in gealterten Augen mit hoher lipofuscin Spiegel normal bleibt. Allerdings abnormale Muster von Lipofuszin Verteilung, insbesondere Verlust von Lipofuszin, werden dokumentiert Marker für AMD und AMD Progression sowohl histologisch und klinisch ^3,4

Defekte Vorarbsingen von RPE Lipofuszin hat auch in bestimmten erbliche Netzhautdegenerationen auftreten gezeigt worden. Patienten , die an Morbus Stargardt leiden (STGD) akkumulieren Lipofuszin im RPE in einem jungen Alter, schließlich Sehverlust ähnlich , dass die Entwicklung bis ⁵ in AMD gesehen. Diese Befunde legen nahe , dass Lipofuszin Akkumulation selbst toxisch sein können und fahren RPE Dysfunktion ^6,7. Allerdings bestätigen eine detaillierte Bildgebung Studie an Probanden mit STGD im Laufe der Zeit nicht , dass fokale Lipofuszin Akkumulation nachfolgenden RPE Verlust führte ^8. Obwohl also Lipofuszin Anomalien Marker für die Netzhautdegenerationen sind, bleibt eine Rolle für die direkte Toxizität von Lipofuszin unbewiesen.

Die RPE ist die posterior Zellschicht der Retina, sondern erzeugt den Großteil der Fluoreszenzsignal von dem Augenhintergrund. Erzeugung und Detektion von Autofluoreszenz (AF) aus dem RPE abgeleitet kann mit konfokalen Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (cSLO) durchgeführt werden, die für vi ermöglichtalisierung der räumlichen Verteilung des Fundus AF. Bestimmte Netzhautdegenerationen zeigen charakteristische Muster von Fundus AF und AF-Bildgebung hilft bei der Diagnose und Überwachung dieser Bedingungen. Obwohl Standard-AF-Bildgebung klinisch wichtig ist, hat quantitative AF (qAF) ein wichtiges Mittel zur Beurteilung der RPE Gesundheit. Wir und andere haben einen standardisierten Ansatz entwickelt, der zuverlässig qAF Verhältnisse in bestimmten Netzhautstellen ⁹ bestimmen kann. qAF hat mögliche Anwendungen in der Diagnose und Überwachung von Netzhautbedingungen und auch Verwendung in Prognose und Risikoschichtung aufweisen. Darüber hinaus haben die diagnostischen Fähigkeiten des qAF auch für bestimmte Netzhauterkrankungen ^10-12 beschrieben. Hier stellen wir schrittweise Details für unsere Technik durch eine visuelle Demonstration ihrer Anwendung bei der Bewertung von gesunden und erkrankten Augen begleitet durchführt.

Protocol

Ethikerklärung: Alle in diesen Studien teilnehmenden Patienten wurden durchgeführt, so in Übereinstimmung mit genehmigten Institutional Review Board Aufsicht an der New York University School of Medicine.

1. Patientenauswahl und Erste Vorbereitung für Imaging

Hinweis: Die folgenden Materialien werden benötigt: 0,5% Tropicamid ophthalmische Lösung, 2,5% Phenylephrin ophthalmische Lösung, ausgestattet mit cSLO Spektralbereich der optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) und interne Fluoreszenz Referenz.

1. Vor der Bildgebung, entsprechend gesetzt bis cSLO zur Datenerfassung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Montieren Sie einen internen Fluoreszenz Referenz in der cSLO. Hinweis: Der interne fluoreszierenden Referenz, wie vom Hersteller bezogen, ist in einem Metallring untergebracht und befindet sich direkt hinter der Kameralinse platziert. Wenn ein cSLO von einem anderen Hersteller verwendet wird, kann es eine andere Konfiguration als diejenige sein, die in beschriebendieses Protokoll.
   1. Um die Referenz in das cSLO, ist die Linse einzusetzen, sie zu entfernen, schrauben Sie den Metallring der Maschine, und ersetzen Sie es mit dem neuen Metallring mit dem Referenz.
      Hinweis: Die interne Fluoreszenz Bezug auf die qAF Technik wesentlich ist, wie es Korrektur zur Variation der Laserleistung ermöglicht und Detektorempfindlichkeit / Verstärkung.
3. Haben Patienten zur Bildgebung rekrutiert eine Routine geweitete Augenuntersuchung unterziehen und Hintergrundinformationen in Bezug auf Vergangenheit Augen Geschichte und Vorerkrankungen erhalten, die mit Augensymptome manifestieren kann.
4. Dilate Schüler mit 0,5% Tropicamid und 2,5% Phenylephrin. KRITISCH STEP: Dilate Schüler mindestens 6 mm. Anmerkung: Diese zur ununterbrochenen Durchgang von Licht erforderlich ist, und somit für eine optimale Visualisierung und Messung des Fundus.
5. Vor der Bildgebung, die die Position des Patienten richtig auf dem cSLO, mit dem Kinn auf der Kinnstütze ruht, legte die Stirn gegen die forehead Ruhe und seitliche canthi richtig mit den Indikatoren ausgerichtet sind.

2. Baseline Imaging des Augenhintergrunds

1. Als erstes Bild der Fundus mit Nah-Infrarot-Reflexion (IR) Licht (Wellenlänge von 820 nm), um die Kamera über der Makula und erhalten grobe Fokus zu zentralisieren.
   1. Bei Patienten richtig positioniert ist, schalten Sie die Hardware-Einstellung auf dem Bedienfeld, um IR-Imaging-Modus Position Kamera manuell, bis der Fundus in voller Fokus ist, und ein Bild nehmen
   2. Passen Sie die Einstellung auf dem Bedienfeld auf "IR-OCT", die Spectral-Domain die optische Kohärenztomographie verwendet (SD-OCT) in Verbindung mit IR-Bildgebung die Makula für zugrundeliegende Krankheit zu bewerten.
   3. Verwenden Sie die Führungen in der Imaging-Fenster, um die korrekte Oktober zu dem Infrarotbild des Fundus orientieren. Für eine optimale SD-OCT Qualität, positionieren Sie die Kamera so, dass das OCT-Bild im oberen Drittel seines Abbildungsfenster ist. Erwerben mindestens eine horizontale Linie sceine durch die Fovea und die den gesamten Bildfeld.

3. Definieren von qAF Imaging

1. Verwenden Sie "High-Speed" Bildaufnahme. Hinweis: Diese Einstellung für eine schnellere Bildaufnahme ermöglicht es, das Risiko von Signalverlust verringert sich aufgrund der Bewegung des Patienten und die daraus resultierende Blockade von Licht durch die Iris oder Augenlider.
2. Verwenden Sie "Mittelwert von 9" Frames. Hinweis: Diese Einstellung ermöglicht die schnelle, sequentielle Erfassung von 9 Bildrahmen, der anschließend sein kann "gemittelt" Rauschen und Artefakten zu reduzieren (siehe unten).
3. Verwenden Sie "30 x 30 Grad" ein. Hinweis: Dies bezieht sich auf den Grad der Netzhautbereich bei der Bildaufnahme erfasst.
4. Vor der Bebilderung warnen Patienten über die blaues Licht, wie dies auf den ersten alarmierend sein kann.
5. Schalten Sie den AF-Modus und richten Kameraachse, so dass der Bildschirm maximal ist "gefüllt" mit Fundus AF (minimale Verdunkelung der Seiten und Ecken des Bildes).
   1. Wenn Patienten have Schwierigkeit, die helles blaues Licht, starten Bildgebung mit der Kamera weiter weg vom Auge und dann bringen Sie die Kamera langsam in Richtung des Patienten zu tolerieren, bis der Fundus in voller Größe zu sehen ist.
      Kritischste Schritt: Wenn Licht in der Eingabe oder aus dem Auge austritt, wird behindert, verringerte Signal führt. Lokalisierte Rückgang ist sichtbar als asymmetrische Verdunkelung eines Bildes Seite oder Ecke. Generalized Signalverlust ist zu sehen, wenn die Augenbewegungen allein Lichtdurchgang versperren.
6. Ausrichten der Kamera, so daß das NF-Signal auf seinem höchsten Niveau im gesamten Feld ist. Ziel ist es für maximale Signal eher als schärfste Bild, aber sie grob korrelieren. Stellen Sie die Kamera Fokus durch die cSLO Bewegen der Kamera entweder manuell oder mit dem Augenspiegel Joystick neu zu positionieren.
7. Stellen Sie die Empfindlichkeit / Verstärkung, so dass Fundus AF leicht sichtbar ist, aber vermeiden Sie eine Übersättigung. Während der Bildaufnahme, farbige Pixel sichtbar entweder in der internen Referenz (am oberen Ende der sichBild) oder der Fundus zeigen Übersättigung und damit Verlust des Signals.

4. Image Acquisition

Hinweis: kritischste Schritt: Das Ziel bei der Bildaufnahme sollte 2 hochwertige 9-Frame-Bildstapel pro Sitzung zu erhalten, werden für Variabilität zu steuern zwischen den Bildern innerhalb einer Sitzung. eine zweite Sitzung von zwei Bildern nach Neupositionierung des Patienten und der Kamera erhalten und für Variabilität Kontrolle zu beurteilen. Alle Bilder werden schließlich auf die interne Referenz (unten beschrieben) kalibriert werden.

1. Erwerben Sie Bilder erst nach mindestens 20 Sekunden von "Bleichen" (volle Belichtung der Netzhaut zu AF - Licht) Absorption von Licht zu minimieren , indem ⁹ in der sensorischen Netzhaut Rhodopsin.
   1. Verwenden Sie diese Zeit, um die Ausrichtung der Kamera, Fokus und Empfindlichkeit zu optimieren.
2. Haben die blinzeln Probanden vor jeder Bildaufnahme als ein frischer Tränenfilm Signalqualität verbessert.
3. Vermeiden Sie Augenlider in der Ebene des Erwerbs.
   Hinweis: Es kann manuell geöffneten Lidern anspruchsvoller Patienten hilfreich sein. Die Autoren empfehlen, dass ein Assistent diese Aufgabe ausführt.
4. Optimieren Sie die Ausrichtung vor jeder Bildaufnahme, um sicherzustellen, dass das Licht nicht durch die Iris was zu einer verminderten Signal behindert wird.
   Hinweis: Da zumindest geringfügige Bewegung sehr häufig ist, empfehlen die Autoren Fein Neuausrichtung als notwendig vor jeder Bildaufnahme. Führung und Förderung der Patient während Bildgebung Abnahme Bewegung hilft. Die Autoren empfehlen, auch die Maschinen Fußpedal als "Erwerb Taste" können, um Bediener Ablenkung zu minimieren.
5. Führen Sie nach der Bildverarbeitung durch die Berechnung des "mittleren" des 9-Frame-Stack Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Berechnen Sie den Mittelwert eines Stapels die cSLO Software durch Wahl der Option den Mittelwert zu berechnen.
   Hinweis: Es kann Stapel, in dem einige Frames nicht von optimaler Qualität (dh haben lokalisierte oder generali verringerte signal relativ zu den optimalen Rahmen), daher sorgfältig jeden Stapel inspizieren und suboptimal Frames deaktivieren vor der Berechnung des Mittelwerts.
   Anmerkung: Die mittlere Bilder mit annehmbarer Signal-Rausch-Verhältnisse können von mindestens 3 Rahmen verarbeitet werden. Es ist normal, dass die Seiten und Ecken jedes Bildes zu niedrigeren Signal haben als die zentralen 20 Grad aufgrund von Einschränkungen im cSLO selbst.
   1. Wenn die Software fragt , ob der Bediener die Graustufen zu normalisieren möchten (dh dehnen das Histogramm) zwischen 0 und 255, wählen Sie "Nein". Dadurch bleibt unverändert Graustufen für die Analyse.

5. Bildanalyse

1. Analysieren AF Bilder wie zuvor beschrieben , die Bildanalyse - Software für die qAF Technik entwickelt , unter Verwendung von (IGOR; ^9). Eine kurze Beschreibung eines typischen Bildanalyse mit Hilfe dieser Software ist unten enthalten.
   1. Laden Sie das Programm qAF in IGOR und Importieren von Bildern (im .bmp Format) aus der exportiertencSLO Software mit Pixel-Seitenverhältnis 768 x 768 (Standard-Ausgabeparameter).
   2. Wählen Sie das Bild in der Drop-Down-Menü und die Analyse starten.
   3. Repositionieren Kalibrierung Indikatoren auf das Bild, so dass die "Fadenkreuz", um die Fovea liegen über und die "Klammer" liegt an der Papille (diese Indikatoren verwendet werden, zu skalieren und die ROIs positionieren). Wenn sie richtig positioniert, Aufforderungen füllen Verwendung Software dann das Bild mit Umfangs ROIs die Fovea umgibt (siehe Abbildungen 1, 2).
   4. Wählen Sie die Option in IGOR die Gesamtgraustufen jedes Bild auf diesen Ebenen in der internen Fluoreszenz Bezug zu kalibrieren. Anmerkung: Dieser Schritt ermöglicht die Kalibrierung von maschinenbezogenen Faktoren, einschließlich der elektronischen Nullpegel jedes Bild und dem internen Referenzkalibrierungsfaktor jeder Maschine sowie patientenbezogene Faktoren, einschließlich Alter, Brechung und Hornhautkrümmung.
      Anmerkung: Die Analysesoftware zeigt dann die feste rEGIONEN auf dem resultierenden Bild und einem qAF Wert wird in jeder Region unter Beweis gestellt. qAF Werte werden ebenfalls automatisch in ein Tabellenkalkulationsformat in einem separaten Fenster eingegeben. "
   5. Generieren Sie qAF "Heatmaps" durch die Möglichkeit, innerhalb der Eingabeaufforderungen auswählen. Alle Bilder und Daten können durch Auswahl der entsprechenden Optionen aus der IGOR-Software in einer Excel-Tabelle exportiert werden.

Representative Results

Diese Technik wurde verwendet , qAF sowohl bei gesunden ¹³ und Krankheitszuständen ^10-12 zu studieren. In gesunden Augen (Abbildung 1), AF von dem RPE emittiert wird , relativ gleichförmig durch den Fundus (1A) verteilt. Verringerter Intensität im zentralen Makularegion gesehen aufgrund von Makulapigment von lichtblockierenden und an den Seiten und Ecken des Bildes durch die Optik des Auges und der Kamera. Die Schiffe erscheinen dunkel und sollte in gut aufgenommenen Bilder in klaren Fokus sein. 1B zeigt eine entsprechende Heatmap Darstellung der qAF Ebenen aus 1A. Cooler Farben entsprechen Bereichen mit geringerer Intensität, während wärmere Farben auf Bereiche höherer Intensität entsprechen. Maximale Intensität in der zweiten konzentrischen 8-Segment - Ring (angegeben in Abbildung 1B) allgemein gesehen. Diese Region ist auch weniger anfällig für Abbildungsbezogene variabilkeit als Bereiche an den Bildgrenzen näher und ist außerhalb des zentralen Bereichs, wo Macula Pigment einen großen Einfluss auf qAF Ebenen. Somit werden die mittleren Intensitäten dieser Ring für die meisten Datenanalysen verwendet ^13. Abbildung 2 stellt eine repräsentative Analyse in einem Auge mit AMD geographischer Atrophie (GA) demonstriert, eine fortgeschrittene Form der AMD. Diese Form der AMD Ergebnisse in lokalisierten Bereichen von RPE Verlust, belegt durch deutlich verminderte oder fehlende AF und verursacht progressive zentralen Sehverlust.

Abbildung 1. Autofluorescence in gesunden Auge. (A) Autofluorescence (AF) Bild des rechten Auges eines normalen Patienten. OD: Papille, Fo: Fovea, Ma: Makula, Ref: interne Referenz. (B) Postprocessing qAF Karte von AF Bild von (A). Warmer Farben korrelieren höhere AF Intensität. Feste regIonen werden gezeigt, und qAF Werte jeder Region sind angegeben. 8-Segment perifovealen Ring in der Datenanalyse verwendet wird , die durch die gestrichelte Linie angezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Autofluorescence in Auge Anzeige geographischer Atrophie aufgrund AMD. (A) Autofluorescence (AF) Bild des linken Auges eines Patienten mit fortgeschrittenen AMD zeigt geographische Atrophie (GA) des RPE (repräsentative Region durch die gestrichelte Linie umschrieben). OD: Papille, Fo: Fovea, Ma: Makula, Ref: interne Referenz. Hinweis deutlich reduziert und abwesend AF in Regionen GA in der Makula entspricht. (B) Postprocessing qAF Karte von AF Bild von (A). Feste Regionen angezeigt, und qAF Werte der jeweiligen Region einerneut angezeigt. 8-Segment perifovealen Ring in der Datenanalyse verwendet wird , die durch die gestrichelte Linie angezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Abnormal RPE Lipofuszin Verteilung, ob erhöht oder verringert wird, ist ein empfindlicher Marker der Netzhauterkrankung und wird in der Regel mit dem Verlust der sensorischen Retina-Funktion verbunden. Hier beschreiben wir Anwendung qAF zur Bewertung von RPE Lipofuscin. Der Einbau eines internen Fluoreszenz Referenz für variable Laserleistung und Empfindlichkeit des Detektors ⁹ neben unserer standardisierten Bildgebungstechnik zur Korrektur ermöglicht eine zuverlässige Quantifizierung von NF - Pegel. Unser Ziel ist es, dass dieses Verfahren bei der Diagnose und Überwachung von Netzhauterkrankungen helfen werden, und schließlich in der Wirksamkeit von therapeutischen Maßnahmen, wie beispielsweise Arzneimittel oder Gentherapie. qAF kann auch wie AMD at-Risk für die Bedingungen in Schichtung von Einzelpersonen unterstützen.

Wir haben eine große normative Datenbank von qAF Daten als Referenzinstrument ¹³ für die Interpretation der retinalen Pathologie verwendet werden und sind beschrieben auch qAF in mehreren Krankheits states, einschließlich Morbus Stargardt ^10, Bullauge Makulopathie ¹² und Morbus Best ^11. Bei gesunden Netzhaut gibt es unterschiedliche qAF Ebenen zwischen den ethnischen Gruppen, mit deutlich höheren qAF bei Weißen als Schwarze und Asiaten, und zeigte, dass Frauen höhere qAF Spiegel als Männer haben. Vielleicht am deutlichsten erhöht qAF als Patienten im Alter, die mit RPE Lipofuszin Ebenen entspricht, wie zuvor von Spektrofluorometrie gemessen ^14. Obwohl Strom nur normative Daten zu Alter erstrecken sich bis 60, scheint es , dass die Patienten nach Alter 70 ¹⁴ eine gemessene Abnahme der RPE Lipofuszin haben. Interessanterweise scheint es nicht , dass Änderungen in der Zahl RPE - Zelle als Patienten im Alter von ² auftreten und so die beobachteten Rückgänge AF kann zu einer Umverteilung oder eine Verringerung der RPE Lipofuszin ³ fällig. Es wird interessant sein, zu bestimmen, ob diese Abnahme der AF im Alter korrelieren mit eingeschränkter RPE-Funktion und einem erhöhten Risiko von AMD.

15. Eine weitere Einschränkung ist , dass die Technik ist eine Herausforderung zu erfüllen und ist in hohem Maße abhängig vom Netzbetreiber. Es ist wichtig, um eine gleichbleibend hohe Bildqualität zu erhalten, um genaue Messungen von AF Ebenen zu gewährleisten. Um dies zu erreichen, empfehlen die Autoren die strikte Einhaltung des Bildgebungsprotokoll sowie eine angemessene Praxis. Obwohl einige Patienten schlecht die helle Lichtblitze für AF - Bildgebung erforderlich tolerieren, versicherte Patienten , dass Expositionsniveaus gut innerhalb der sicheren Grenzen sind ¹ hilfreich. Um eine optimale Abbildung zu ermöglichen, ist es wichtig, die Schüler mindestens 6 mm aufzuweiten und mehrere Bilder mit freiem Lichttransmission (siehe oben) zu erhalten. optimalen Fokus zu erreichen, und eine Übersättigung von Pixeln zu vermeiden sind ebenfalls unerlässlich. Hilfreiche Praktiken gehören die Kommunikation mit dem Patienten während Bildgebung Verwendung eines Assistenten, wenn das Augenlid angehoben werden muss, und das Fußpedal zum Auslösen der Kamera, wie oben beschrieben.

Zusammengefasst unständnis der Pathophysiologie des RPE in Netzhautdegenerationen wie vor ein Bereich der aktiven Forschung und potenziell wichtige therapeutische Wirkung. Als qAF zum direkten Vergleich von AF Werte in den Bildern in Längsrichtung erhalten ermöglicht, zwischen Patienten und zwischen den Zentren ist es ein wertvolles Instrument, die nützliche klinische Informationen bereitstellt, als auch zu diesem Verständnis beitragen kann. Die ausführliche Protokoll hier skizziert werden andere in den Erwerb von zuverlässigen qAF Daten unterstützen, und dass die wichtigen klinischen Anwendungen von qAF werden Forschungszentren und klinische Retina-Spezialisten empfehlen die Verwendung des qAF Technik zu machen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0.5% tropicamide ophthalmic solution			Any brand can be used
2.5% phenylephrine ophthalmic solution			Any brand can be used
Internal fluorescent reference	Heidelberg Engineering
IGOR Pro software	WaveMetrics