כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

Introduction

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תומך בפונקציה של הרשתית החושית באמצעות תהליכים רבים ^1. גיל ניוון מקולרי הקשור (AMD) היא הסיבה החשובה ביותר של עיוורון חשוכת במדינות המתועשות ומאופיין שינויים הרשתית, כולל הפסד של פיגמנט, אובדן תפקוד וניוון. ב AMD וב הזדקנות נורמלית, הרשתית מצטברת פלורסנט, אברונים הנגזרים ליזוזום המכיל שברי קולטי אור phagocytosed, המכונים גרגרי lipofuscin. הצטברות של lipofuscin הרשתית כבר חשבתי להצביע חמצוני בתפקוד ^1, אך מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המורפולוגיה הרשתית נותר תקין בעיני בני עם רמות lipofuscin גבוהה ^2. עם זאת, דפוסים חריגים של הפצת lipofuscin, לאובדן מסוים של lipofuscin, הם סמנים מתועדים להתקדמות AMD ו- AMD, הוא היסטולוגית וקליני ^3,4

למחזור פגוםלשיר של lipofuscin הרשתית גם הוכח להתרחש מחלות רשתית תורשתיות מסוימות. חולים שסובלים ממחלות Stargardt (STGD) לצבור lipofuscin ב הרשתית בגיל צעיר, בסופו של דבר לפתח אובדן חזון דומה לזה לראות AMD ^5. ממצאים אלה הציעו הצטברות lipofuscin עצמו עשוי להיות רעיל ולנסוע רשתית תפקוד ^6,7. עם זאת, מחקר הדמיה מפורט של נושאים עם STGD לאורך זמן לא לאשר מוקדים כי הצטברות lipofuscin הובילה לאובדן רשתית לאחר ^8. לפיכך, למרות חריגות lipofuscin הם סמנים עבור מחלות רשתית, תפקיד לרעילות ישירה של lipofuscin לא הוכח.

הרשתית היא השכבה אחורית התא ביותר של הרשתית, אבל מייצרת את רוב אות ניאון מן הפונדוס העיני. הדור וזיהוי של autofluorescence (AF) נגזר הרשתית יכול להתבצע באמצעות אופטלמוסקופיה לייזר סריקה confocal (cSLO), המאפשר visualization של הפריסה המרחבית של AF הפונדוס. מחלות רשתית מסוימים להפגין דפוסים ייחודיים של הפונדוס AF, ועזרי הדמיה AF באבחון וניטור של תנאים אלה. למרות הדמית AF הסטנדרטית היא חשיבות קלינית, AF כמותית (qAF) הפך אמצעי חשוב בהערכת בריאות רשתית. אנחנו ואחרים פתחנו גישה סטנדרטית שיכול לקבוע qAF רמות מהימנות במקומות ספציפיים ברשתית ^9. יש qAF יישומים פוטנציאליים באבחנה ובמעקב של תנאי רשתית, וייתכן שיש גם שירות ריבוד הפרוגנוזה והסיכון. בנוסף, יכול האבחון של qAF גם תואר הפרעות ברשתית מסוימות ^10-12. כאן, אנו מספקים פרטים מבחינת צעד לביצוע הטכניקה שלנו מלווה בהדגמה ויזואלית של היישום שלה בהערכת עיני בריאות וחולות.

Protocol

משפט ואתיקה: כל החולים שהשתתפו במחקרים אלה נעשו זאת בהתאם פיקוח ועדת הבדיקה מוסדיים מאושרים בבית הספר לרפואה באוניברסיטת ניו יורק לרפואה.

1. בחירת חולים והכנה ראשונית הדמיה

הערה: החומרים הבאים נדרשים: 0.5% פתרון עיניים tropicamide, 2.5% פתרון עיניים phenylephrine, cSLO מצויד טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית תחום ספקטרלי (SD-OCT), והתייחסות הקרינה הפנימית.

1. לפני הדמיה, להגדיר cSLO כראוי לרכישת נתונים על פי הוראות היצרן.
2. הר התייחסות ניאון פנימי cSLO. הערה: התייחסות הניאון הפנימית, כפי שנרכשה מהיצרן, שוכן טבעת מתכת ממוקמת ישירות מאחורי עדשת המצלמה. אם cSLO מיצרן אחר משמש, ייתכנו תצורה שונה מזו שבה מתוארתבפרוטוקול זה.
   1. על מנת להכניס את הפניה אל cSLO, לסובב את העדשה כדי להסיר אותו, להתיר את טבעת המתכת של המכונה, ולהחליף אותו עם טבעת מתכת חדשה המכילה את ההפניה.
      הערה: ההתייחסות ניאון פנימי חיוני הטכניקה qAF, שכן היא מאפשרת תיקון עבור וריאציה כוח לייזר ורווח / רגישות הגלאי.
3. יש חולים שגויסו הדמיה לעבור בדיקת עיניים שיגרתית מורחבת ולקבל מידע רקע לגבי ההיסטוריה העינית בעבר ומצבים רפואיים בסיסיים שעשויות להתבטא עם ממצאים עיניים.
4. מתרחבים תלמידים עם 0.5% tropicamide ו phenylephrine 2.5%. שלב קריטי: מתרחב תלמידי 6 מ"מ לפחות. הערה: זה חיוני למעבר רצוף של אור, ובכך להדמיה ומדידה אופטימליות של הפונדוס.
5. הסנטר לפני הדמיה, למקם את המטופל כראוי על cSLO, עם נח על chinrest, המצח העומדים כנגד foreheaשאר ד, ו canthi לרוחב מיושר כהלכה עם המדדים.

2. הדמיה Baseline של הפונדוס Ocular

1. ראשית, תמונה הפונדוס עם החזרה האינפרה אדומה קרוב (IR) אור (אורך גל של 820 ננומטר) על מנת לרכז את המצלמה מעל המקולה ולקבל מוקד מחוספס.
   1. עם חולה ממוקם כראוי, לשנות את הגדרת החומרה בלוח הבקרה למצב הדמית IR, מצלמת מיקום באופן ידני עד הפונדוס הוא בפוקוס מלא, ולקחת תמונה
   2. התאם את ההגדרה בלוח הבקרה כדי "IR-Oct", אשר משתמש טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית רפאים-דומיין (SD-OCT) בשילוב עם הדמית IR להעריך את המקולה עבור מחלה בסיסית.
   3. השתמש במדריכים הנוכחיים בחלון ההדמיה כדי כראוי להתמצא ב- OCT לדימוי IR של הפונדוס. כדי להשיג איכות SD-Oct אופטימלי, למקם את המצלמה כך את תמונת אוקטובר היא בשליש העליון של חלון ההדמיה שלה. רוכש לפחות sc קו אופקי אחדדרך הגומה ו פורש בתחום ההדמיה כולה.

3. הגדרת הדמיה qAF

1. השתמש רכישת תמונה "מהירה". הערה: הגדרה זו מאפשרת לרכישת תמונה מהר, אשר מקטינה את הסיכון של אובדן אות בשל תנועת מטופל וסתימה וכתוצאה מכך אור על ידי הקשתית או עפעפיים.
2. השתמש "Mean של 9" מסגרות. הערה: הגדרה זו מאפשרת צילום מהיר, רצוף של 9 מסגרות תמונה, אשר יכול להיות מאוחר "ממוצעים" כדי להפחית את הרעש חפץ (ראה להלן).
3. השתמש "30 x 30 מעלות" שדה. הערה: זה מתייחס המעלות של האזור ברשתית שנתפס במהלך רכישת תמונה.
4. לפני ההדמיה, להזהיר המטופל על האור הכחול, כמו זה יכול להיות מדאיג בהתחלה.
5. הפעל את מצב AF וליישר ציר מצלמה כך המסך הוא מקסימאלי "מלא" עם AF הפונדוס (מחשיך מינימאלי של הצדדים ופינות של התמונה).
   1. אם h החולהקושי ave לסבול את האור הכחול הבהיר, להתחיל הדמיה עם המצלמה רחוקה מהעין ולאחר מכן להביא את המצלמה באיטיות כלפי המטופל עד הפונדוס הוא לעיני.
      שלב קריטי: אם אור הנכנס לתוך או לצאת מן העין חסומה, ירד האות תגרום. ירידה מרוכזת גלויה כמו המחשיך סימטרי של צד תמונה או בפינה. הפסד של האות כללית אפשר לראות כאשר תנועות עיניים לבד לחסום מעבר האור.
6. יישר את המצלמה כך את אות AF היא ברמה הגבוהה ביותר לאורך כל השדה. כוון אות מקסימלי ולא תמונה חדה, אולם הם פחות או לתאם. התאם את מיקוד המצלמה על ידי הזזת cSLO כדי לשנות את מיקום המצלמה באופן ידני או עם ג'ויסטיק האופתלמוסקופ.
7. התאם את הרגישות / רווח כך AF הפונדוס גלוי בקלות, אך להימנע הצפת יתר. במהלך רכישת התמונה, בצבע הפיקסלים הנראים בשני ההתייחסות הפנימית (הממוקם בחלק העליון שלתמונה) או הפונדוס מצביע הצפת יתר ובכך פסד של אות.

4. Image Acquisition

הערה: שלב קריטי: המטרה ברכישת תמונה צריכה להיות כדי להשיג 2 ערימות תמונה 9 מסגרת באיכות גבוהה בכל הפעלה לשלוט על השתנות בין תמונות בתוך מושב. לאחר למקם מחדש את החולה ואת המצלמה, לקבל מושב שני של שתי תמונות להעריך ובקרת השתנות. כל התמונות בסופו של דבר להיות מכוילות על ההתייחסות הפנימית (כמתואר להלן).

1. לרכוש תמונות רק אחרי לפחות 20 שניות של "הלבנה" (חשיפה מלאה של רשתית לאור AF) כדי למזער קליטת האור על ידי rhodopsin ברשתית החושית ^9.
   1. השתמש את התקופה הזו כדי לייעל מצלמת יישור, מוקד ורגישות.
2. יש הנושאים למצמץ לפני כל רכישת התמונה כסרט מדמיע טרי משפר את איכות האות.
3. הימנע עפעפיים במישור של רכישה.
   הערה: זה עשוי להיות מועיל כדי עפעפיים לפתוח באופן ידני לחולים מאתגרים יותר. החוקרים ממליצים כעוזר מבצע משימה זו.
4. מטב יישור לפני כל רכישת תמונה על מנת להבטיח כי האור אינו חסום על ידי איריס וכתוצאה מכך אות ירד.
   הערה: כפי התנועה לפחות קטין נפוצה מאוד, ממליצי מחברי התכנסות קנסה לפי צורך לפני כל רכישת תמונה. מנחים ועידוד המטופל תוך הדמית עזר תנועת ירידה. המחברים ממליצים גם להשתמש ברגל-הדוושה של המכונית כמו "כפתור הרכישה" על מנת להקטין הסחת דעת מפעיל.
5. בצע בעיבוד תמונות פוסט על ידי חישוב "שביל" ערימת 9 המסגרת להגדיל את יחס אות לרעש. לחשב את הממוצע של ערימה באמצעות תוכנת cSLO ידי בחירת האפשרות לחשב את הממוצע.
   הערה: ייתכנו ערימות שבו מסגרות וחלקם לא באיכות אופטימלית (כלומר, לוקליזציה או להכליל ירד סיביחס gnal אל המסגרות האופטימלית), ולכן בזהירות לבדוק כל ערימה ולבטל את בחירת מסגרות לא טובות לפני החישוב של הממוצע.
   הערה: תמונות Mean עם יחס אות לרעש מקובל יכולות להיות מעובד מן 3 מסגרות לפחות. זה נורמלי הצדדים והפינות של כל תמונה יש אות נמוכה 20 מעלות המרכזיות בשל מגבלות בתוך cSLO עצם.
   1. אם התוכנה שואלת אם המפעיל רוצה לנרמל את הרמות האפורות (כלומר, למתוח את ההיסטוגרמה) בין 0 ל -255, בחר "לא". זה שומר על רמות אפורות ללא שינוי לניתוח.

ניתוח תמונה 5.

1. ניתוח תמונות AF כפי שתואר לעיל באמצעות תוכנת ניתוח תמונה שפותחה עבור טכניקת qAF (איגור; ^9). להלן תיאור קצר של ניתוח תמונה אופייני באמצעות תוכנה זו כלול להלן.
   1. טען את התוכנית qAF ב איגור לייבא תמונות (בפורמט bmp) מיוצא מןcSLO תוכנה עם יחס ממדים פיקסל 768 x 768 (פרמטר פלט ברירת מחדל).
   2. בחר את התמונה בתפריט הנפתח וליזום ניתוח.
   3. מיקום מחדש אינדיקטורים כיול על תמונה כזו כי "הכוונת" לשכב הגומה ואת "סוגר" הסמוכה לאתר בדיסק האופטי (אינדיקטורים אלה משמשים סולם ומקם את ROIs). כשהוא מוצב כראוי, להשתמש בתוכנת הנחיות אז לאכלס את התמונה עם ROIs ההיקפי סביב הגומה (ראה איורים 1, 2).
   4. בחר באפשרות ב איגור לכייל את הרמות האפורות הכוללות של כל תמונה לרמות נוכחים בהפנית הניאון הפנימית. הערה: שלב זה מאפשר כיול של גורמים הקשורים המכונה, כוללים רמת האפס האלקטרונית של כל תמונה וסרטון הגורם כיול התייחסות הפנימי של כל מכונה, כמו גם גורמים הקשורים לחולה, כולל גיל, רפרקציה עקמומיות קרנית.
      הערה: תוכנת הניתוח ולאחר מכן מציגה את r הקבועegions על התמונה תוצאתי וסך ערך qAF מודגם בכל אזור. ערכי qAF גם מוזנים באופן אוטומטי לפורמט גיליון אלקטרוני בחלון נפרד. "
   5. צור qAF "מפות חום" על ידי בחירה באפשרות בתוך ההנחיות הפקודות. כל תמונות הנתונים ניתן לייצא מתוכנת איגור בגיליון אלקטרוני של Excel על ידי בחירת האפשרויות המתאימות.

Representative Results

טכניקה זו שמשה ללמוד qAF בשני ¹³ ומחלות בריאות מדינות ^10-12. בעיני בריא (איור 1), AF נפלט הרשתית מופץ יחסית אחיד לאורך כל (איור 1 א) הפונדוס. עוצמת מופחתת נתפסת באזור המקולה המרכזית בשל חסימת האור על ידי פיגמנט מקולרי, ועל הצדדים ואת הפינות של התמונה בשל אופטיקה של העין ואת המצלמה. כלי להופיע כהה וצריך להיות בפוקוס ברור בתמונות-רכשה גם. איור 1B מדגים ייצוג מפת חום המקביל רמות qAF מן איור 1 א. Cooler צבעים מתאימים תחומי פעילות נמוכה בלבד ואילו צבעים חמים יותר מתאימים תחומיים בעצמה גבוהה יותר. עצמה המקסימלית נתפסת בדרך כלל טבעת 8-קטע קונצנטריים השנייה (מצוינת איור 1B). אזור זה הוא גם פחות בכפוף הדמיה הקשורים variability מאשר אזורים קרוב לגבולות התמונה, והוא מחוץ לאזור המרכזי שבו פיגמנט המקולה יש השפעה גדולה על רמות qAF. לפיכך, העוצמות הממוצעות של טבעת זו משמשות רוב הנתונים מנתחים ^13. איור 2 מציג ניתוח נציג עין עם AMD הוכחת אטרופיה גיאוגרפית (GA), צורה מתקדמת של AMD. צורה זו של תוצאות AMD באזורי נקודות של אובדן רשתית, שמעידה באופן ניכר מופחתת או נעדר AF, וגורמת לאובדן ראייה המרכזי פרוגרסיבי.

איור 1. autofluorescence בעין הבריאה. (א) autofluorescence (AF) תמונה של עין ימין של חולה רגיל. OD: דיסק אופטי, Fo: הגומה, מא: המקולה, Ref: התייחסות פנימית. (ב) לאחר עיבוד מפת qAF של תמונת AF מ- (A). חמים צבעים כדי לתאם עוצמת AF גבוהה. reg קבועיונים נראים לעין, וערכי qAF של כל אזור מסומנים. טבעת perifoveal 8-קטע המשמשת בניתוח נתונים מצוין על ידי הקו המקווקו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. autofluorescence בעין מוצג אטרופיה גיאוגרפית בשל AMD. (א) autofluorescence (AF) תמונה של עינו השמאלית של מטופל עם AMD המתקדם מראה אטרופיה גיאוגרפית (GA) של הרשתית (אזור הנציג נתחם על ידי קו מקווקו). OD: דיסק אופטי, Fo: הגומה, מא: המקולה, Ref: התייחסות פנימית. הערה מופחתת באופן בולט נעדר AF באזורים המתאימים GA המקולה. (ב) לאחר עיבוד מפת qAF של תמונת AF מ- (A). אזורים קבועים מוצגים, וערכי qAF של כל אזורמחדש מצוין. טבעת perifoveal 8-קטע המשמשת בניתוח נתונים מצוין על ידי הקו המקווקו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הפצת lipofuscin רשתית חריגה, אם רמות גבוהות או נמוך, הוא סמן רגיש של מחלת רשתית והיא קשורה בדרך כלל עם אובדן תפקוד רשתית חושי. כאן אנו מתארים יישום של qAF להערכת lipofuscin רשתית. התאגדות של התייחסות ניאון פנימית לתקן רגישות כוח גלאי ליזר משתנית ⁹ לצד טכניקת דימות הסטנדרטית שלנו מאפשר אלקטרוני כדי לכמת אמין של רמות AF. המטרה שלנו היא כי שיטה זו תסייע באבחון וניטור של מחלת רשתית, ובסופו של דבר בהערכת היעילות של התערבויות טיפוליות, כגון טיפול תרופתי או הגן. qAF עשוי גם לסייע ריבוד של אנשים בסיכון למצבים כמו AMD.

יש לנו שנוצר מסד נתונים נורמטיביים גדולות של נתונים qAF לשמש ככלי עזר לפרשנות פתולוגיה ברשתית ^13, וגם תיארו qAF ב STA המחלה מספר tes, כולל Stargardt המחלה ^10, Maculopathy ועין השור ¹² ובסט המחלה ^11. ב רשתית בריאה, יש רמות שונות qAF בין קבוצות אתניות, עם גבוה משמעותי qAF אצל לבנים מאשר שחורים אסיאתים, והוכיחו כי יש נשים רמות qAF גבוהות יותר מגברים. אולי הכי בולט, qAF מגביר גיל מטופלים, אשר עולה בקנה אחד עם רמות lipofuscin הרשתית, כמו בעבר נמדד spectrofluorometry ^14. למרות נתונים נורמטיביים נוכחיים בלבד להאריך עד גיל 60, נראה כי יש חולים ירידה שנמדדה lipofuscin רשתית לאחר גיל 70 ^14. מעניין, זה לא נראה כי שינויים בתא מס רשתית להתרחש בחולים בגיל ² וכן הלאה שהירידה שנחזתה ב AF עשויה לנבוע חלוקה מחדש או הפחתה הרשתית lipofuscin ^3. זה יהיה מעניין לקבוע אם ירידות אלה AF בגיל מבוגר לתאם עם פונקצית רשתית לקויה וסיכון מוגבר AMD.

s = "jove_content"> פרוטוקול זה מאפשר תוצאות כמותיות אמינות כי ניתן להשוות longitudinally, בין מטופלים, ובין מכונות cSLO. מגבלה אחת היא כי qAF לא יכול למדוד AF במדויק בחולים מבוגרים עם ועכירות עדשה, אשר מגבילה את טכניקת משנה של אוכלוסייה בסיכון גבוה זה. אחד הפתרונות האפשריים הוא להשתמש בשיטה reflectometry בנפרד להעריך הפסדים אור בתקשורת. למרבה המזל, מבוגרים חולים שקבלו pseudophakic עם קפסולות אחורי ברור ומאפייני שידור עדשות תוך עיניות ידועים הם מועמדים טובים qAF. עם זאת, התלמידים של חולים קשישים ואנשים עם ניתוח קטרקט לפני לעתים קרובות אינם מתרחבים ליותר מ -6 מ"מ, אשר מגביל מעבר האור ומונע אוסף נתונים מדויקים. על מנת חולים כאלה תמונה, צמצם עשויים להיות מוכנס לתוך cSLO ידי היצרן על מנת להקטין את הקוטר של הלייזר. שינוי זה נוצל בהצלחה לבצע הדמיה qAF בעכברים ¹5. מגבלה נוספת היא כי הטכניקה היא מאתגר לבצע והוא מאוד תלוי במפעיל. זה חיוני כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה באופן עקבי על מנת להבטיח מדידות מדויקות של רמות AF. כדי להשיג זאת, החוקרים ממליצים הקפדה על פרוטוקול ההדמיה כמו גם תרגול נאות. למרות שחלק מחולים גרועים לסבול הבזקי אור בהירה נדרשת הדמית AF, והבטיח חולים שרמות החשיפה גם בתוך הגבולות הבטוחים מועיל ^1. כדי לאפשר הדמיה אופטימלית, הוא קריטי כדי להתרחב תלמידי מ"מ לפחות 6 וכדי להשיג מספר רב של תמונות עם העברת אור בלא ההפרעה (ראה לעיל). השגת מיקוד אופטימלי והימנעות oversaturation הפיקסלים הם גם חיוניים. שיטות שימושיות כוללות את תקשורת עם המטופל תוך הדמיה, שימוש עוזר אם העפעף צריכה להיות הרים ולהשתמש דוושת הרגל מפעילה את המצלמה, כפי שתואר לעיל.

לסיכום, האו"םderstanding בפתופיזיולוגיה של הרשתית ב מחלות רשתית נשאר שטח של מחקר פעיל, ושל השפעה טיפולית פוטנציאלי חשובה. כפי qAF מאפשר השוואה ישירה של רמות AF בתמונות שהתקבלו longitudinally, בין חולים ובין מרכזי, זה הוא כלי רב ערך שיכול לתרום להבנה זו, כמו גם לספק מידע קליני יעיל. הפרוטוקול המפורט המתוארות כאן יסייע לאחרים ברכישת נתוני qAF אמינים, וכי היישומים הקליניים החשובים של qAF יעודדו מרכזי מחקר ומומחי רשתית קליניים לעשות שימוש בטכניקת qAF.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0.5% tropicamide ophthalmic solution			Any brand can be used
2.5% phenylephrine ophthalmic solution			Any brand can be used
Internal fluorescent reference	Heidelberg Engineering
IGOR Pro software	WaveMetrics