網膜疾患の評価のための定量的眼底自己蛍光

Introduction

網膜色素上皮（RPE）は、多数のプロセス¹を通して感覚網膜の機能をサポートしています。加齢性黄斑変性症（AMD）は、先進国における治療不可能な失​​明の最も重要な原因であり、顔料の喪失、機能及び萎縮の損失を含むRPEの変化によって特徴づけられます。 AMDでは、通常の老化、RPEは、貪食感光体の断片を含む蛍光、リソソーム由来の細胞小器官を蓄積リポフスチン顆粒と呼ばれます。 RPEのリポフスチンの蓄積は、酸化障害^1を示し^ていると考えられてきたが、最近の研究では、RPEの形態は、高リポフスチンのレベル²と高齢目で正常のままであることを示しています。しかし、リポフスチン分布の異常パターンは、リポフスチンの特定の損失で、両方の組織学的および臨床的に^3,4、AMDおよびAMDの進行のためのマーカーを文書化されています

不良プロセスへRPEリポフスチンの歌うは、特定の遺伝性網膜変性症で起こることが示されています。シュタルガルト病（STGD）に罹患している患者は、最終的にはAMD ⁵に見られるものと同様の視力喪失を開発し、若い年齢でRPEにおけるリポフスチンを蓄積します。これらの知見は、リポフスチンの蓄積は、それ自体が毒性であるとRPEの機能障害^6,7を駆動^すること^ができることを示唆しました。しかし、時間をかけてSTGDを有する被験者の詳細なイメージング研究では、焦点リポフスチンの蓄積は⁸以降のRPEの損失につながった確認しませんでした。リポフスチン異常は網膜変性のマーカーであるが故に、リポフスチンの直接毒性の役割が証明されていないままです。

RPEは、網膜の最も後方の細胞層であるが、眼底からの蛍光信号の大部分を生成します。 RPE由来する自家蛍光の発生と検出（AF）は、VIを可能にする共焦点走査型レーザー検眼鏡（cSLO）を用いて行うことができます眼底AFの空間分布のsualization。特定の網膜変性は、これらの状態の診断およびモニタリングにおける独特の眼底AFのパターン、AF用撮像補助を示します。標準的なAF撮影が臨床的に重要であるが、定量的なAF（QAF）は、RPEの健康を評価する重要な手段となっています。我々と他の人が確実に特定の網膜の位置⁹でQAFレベルを決定することができる標準的手法を開発しました。 QAFは、網膜の状態の診断およびモニタリングにおける潜在的な用途を有し、また、予後、リスク層別化に有用性を有することができます。また、QAFの診断機能はまた、特定の網膜疾患^10-12について記載されています。ここでは、健康と病気の目の評価では、そのアプリケーションの視覚的なデモンストレーションを伴う私たちの技術を実行するための段階的な詳細を提供します。

Protocol

倫理文：これらの研究に登録したすべての患者は、医学のニューヨーク大学ロースクールで承認された施設内倫理委員会の監督に基づいて行ってました。

1.患者の選択およびイメージングのための初期の準備

スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（SD-OCT）を搭載した0.5％トロピカミド点眼液、2.5％フェニレフリン点眼液、cSLO、および内部蛍光基準：以下の材料が必要とされています注意してください。

1. 撮影の前には、適切に製造元の指示に従って、データ取得のためcSLOを設定します。
2. cSLO内部蛍光基準をマウントします。注：内部蛍光基準、製造業者から購入し、金属リング内に収容されており、カメラのレンズの後方に直接配置されます。他の製造業者からcSLOが使用される場合、に記載されているものとは異なる構成が存在してもよいですこのプロトコル。
   1. cSLOへの参照を挿入するためには、それを削除し、マシンの金属リングを外し、および参照を含む新しい金属リングでそれを置き換えるために、レンズをねじります。
      注：それはレーザーパワーの変動や検出器の感度/ゲインを補正することができるように内部蛍光基準は、QAF技術に不可欠です。
3. イメージングのために募集の患者は、日常拡張目の検査を受け、過去の眼の歴史や眼の所見と現れ得る基礎疾患に関する背景情報を取得しています。
4. 0.5％のトロピカミド及び2.5％フェニレフリンと瞳孔を拡張します。重要なステップ：少なくとも6ミリメートルに生徒を膨らませます。注：これは、光の中断のない通過のため、ひいては眼底の最適な可視化および測定のために不可欠です。
5. 撮影の前に、あごがchinrestで休んで、cSLO上で適切に患者を配置し、額はforeheaに対して配置しましたdは残り、かつ適切な指標と整合横眼角。

眼底の2ベースラインイメージング

1. まず、黄斑の上にカメラを一元化し、ラフなフォーカスを得るために、近赤外線の反射率（IR）光（820nmの波長）で画像眼底を。
   1. 患者が適切に配置して、眼底がフルフォーカスになるまで手で、赤外線撮像モードにコントロールパネル上の位置にカメラをハードウェアの設定を切り替えると、画像を撮ります
   2. 「IR-OCT」、基礎疾患のための黄斑を評価するために、IRイメージングと併せて、スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（SD-OCT）を使用するには、コントロールパネルの設定を調整します。
   3. 正しく眼底のIR画像に10月を配向する撮像窓に存在するガイドを使用してください。最適なSD-OCT品質を達成するために、OCT画像が​​撮像窓の上部三分の一になるようにカメラを配置。少なくとも1水平ラインSCを取得中心窩を通る全体イメージング分野にまたがります。

3. QAFイメージングを設定します

1. 「高速」の画像取得を使用してください。注意：この設定が原因患者の動きに信号損失のリスクを減少させ、虹彩や眼瞼による光の遮断を結果としてより高速な画像取得を可能にします。
2. フレーム「9の平均」を使用します。注：この設定は、続いて（下記参照）、ノイズやアーチファクトを低減するために、「平均化」することができます9画像フレームの急速な、シーケンシャル取り込みを可能にします。
3. 「30×30度」フィールドを使用します。注：これは、画像取得中に取り込まれた網膜領域の程度を指します。
4. これが最初で警報することができるように、撮像に先立って、青色光について患者に警告します。
5. AFモードをオンにすると、画面が最大限眼底AF（画像の辺や角の最小限の黒ずみ）で「満たされる」ようなカメラ軸を揃えます。
   1. 患者Hの場合明るい青色光を許容aveの難しさは、さらに眼から離れたカメラで撮影を開始し、眼底が丸見えになるまで、患者に向かってゆっくりとカメラを持参します。
      重要なステップ：光が遮られているに入るか、目から出た場合は、信号が発生します減少しました。ローカライズされた減少は、像側または角の非対称の黒ずみとして表示されます。目の動きだけでは、光の通路を妨げたときに、信号の一般損失が見られます。
6. AF信号がフィールド全体にその最高レベルになるように、カメラの位置を合わせます。しかし、彼らはおおよそ相関し、最大シグナルよりもむしろ最も鮮明な画像を目指します。手動または検眼鏡のジョイスティックでカメラを再配置するcSLOを移動させることで、カメラのフォーカスを調整します。
7. 眼底AFが簡単に見えるように感度/ゲインを調整しますが、過飽和を避けます。画像取得時には、内部基準のいずれかで目に見える色の画素は、（の上部にあります画像）や眼底は、信号の飽和オーバー、したがって損失を示しています。

4.画像取得

注意：重​​要なステップを：画像取得における目標は、セッション内の画像間の変動を制御するために、セッションごとに2、高品質の9フレームの画像スタックを取得するためにすべきです。患者とカメラを再配置した後、評価し、変動を制御するために、2つの画像の第二セッションを取得。全ての画像は、最終的には内部基準（後述）に較正されます。

1. 感覚網膜⁹にロドプシンによる光の吸収を最小限にするためにのみ「漂白」（AF光に対する網膜の完全露出）の少なくとも20秒後に画像を取得します。
   1. カメラのアライメント、フォーカスと感度を最適化するために、この期間を使用します。
2. 新鮮な涙液膜は、信号品質を向上させるように、各画像取得の前に点滅科目を持っています。
3. 買収の面でまぶたを避けてください。
   注：これは、より困難な患者のために手動で開くまぶたに役立つかもしれません。著者らは、アシスタントは、このタスクを実行することをお勧めします。
4. その光が減少した信号が得られる虹彩によって妨害されていないことを確認するために、各画像取得の前にアライメントを最適化します。
   注：として、少なくともマイナーな動きが非常に一般的であり、著者は各画像取得の前に、必要に応じて細かな再調整をお勧めします。イメージングは​​減少の動きを助けるながら患者を案内し、奨励。オペレータの気晴らしを最小にするように著者はまた、「取得ボタン」として、マシンのフットペダルを使用することをお勧めします。
5. 信号対雑音比を増加させるために9フレームスタックの「平均値」を計算することによって、後の画像処理を行います。平均値を計算するためのオプションを選択してcSLOソフトウェアを使用して、スタックの平均を計算します。
   注：いくつかのフレームは、最適な品質のものではないスタックがあるかもしれない（ すなわち 、ローカライズや一般SIが低下しています最適なフレームにgnal相対的）、したがって、慎重に各スタックを検査し、平均値の計算の前に、次善のフレームの選択を解除します。
   注：許容可能な信号対雑音比の平均画像は、少なくとも3つのフレームから処理することができます。各画像の辺と角がcSLO自体の内部制限のために、中央の20度よりも低い信号を有することは正常です。
   1. ソフトウェアは、オペレータがグレーレベルを正常化したいかどうかを尋ねられた場合は、「いいえ」を選択し、0〜255の間（ すなわち 、ヒストグラムを伸ばします）。これは、分析のための不変のグレーレベルを維持しています。

5.画像解析

1. 以前QAF技術のために開発された画像解析ソフトウェアを用いて説明したようにAFの画像を分析（IGORを; ^9）。このソフトウェアを使用する典型的な画像解析の簡単な説明は以下に含まれています。
   1. IGORとインポート画像でQAFプログラムをロードします（.bmpの形式で）からエクスポートピクセル縦横比768×768（デフォルトの出力パラメータ）とcSLOソフトウェア。
   2. ドロップダウンメニューで画像を選択し、分析を開始します。
   3. 「十字線」は、中心窩と「ブラケット」視神経乳頭を（これらの指標は、関心領域を拡張し、配置するために使用されている）に当接し上に重なるように、画像上の校正指標を再配置します。適切に配置すると、利用ソフトウェアは、（ 図1、図2を参照）中心窩の周囲の円周のROIで画像を取り込むように求められます。
   4. 内部蛍光基準に存在するもののレベルに各画像の全体的なグレーレベルを較正するためにIGORでオプションを選択します。注：このステップは、各画像の電子ゼロレベルと各マシンの内部基準校正係数、ならびに年齢、屈折と角膜曲率を含む患者関連因子、を含む機械関連因子のキャリブレーションを可能にします。
      注：解析ソフトウェアは、次に固定Rが表示され結果画像とQAF値にegionsは、各領域内で実証されています。 QAF値も自動的に別のウィンドウでスプレッドシート形式に入力されます。」
   5. コマンドプロンプト内でオプションを選択することにより、QAF「ヒートマップ」を生成します。すべての画像およびデータは、適切なオプションを選択することにより、ExcelスプレッドシートにIGORソフトからエクスポートすることができます。

Representative Results

この技術は、両方の健康¹³および疾患状態^10-12でQAFを研究するために使用しました。健康な目（ 図1）においては、RPEから放出されたAFは、眼底（ 図1A）の全体にわたって比較的均一に分布しています。減少し強度が原因で目とカメラの光学系に黄斑色素による光の遮断、および画像の側面やコーナーでのために中央黄斑部に見られます。船舶は暗く見え、よく取得された画像に明確な焦点であるべきである。 図1B は 、 図1AからQAFレベルの対応するヒートマップ表現を示しています。暖かい色はより高い強度の領域に対応しながら、クーラーの色は低い強度の領域に対応します。最大強度は、一般に、（ 図1Bに示される）第二の同心8セグメントリングに見られます。この領域はまた、イメージング関連variabilを受けにくいです近い画像境界に領域よりも性、及び黄斑色素は、QAFレベルに大きな影響を与え、中央領域の外側です。したがって、このリングの平均強度が^13を分析^し 、ほとんどのデータのために使用されている。 図2は、AMDが地図状萎縮（GA）、AMDの先進的な形を実証するとともに、眼内の代表分析を提示します。この著しく減少または不在AFによって証明RPE損失の局所領域におけるAMDの結果の形、およびプログレッシブ中央視力低下の原因となります。

正常な患者の右眼の健康な目で図1.自家蛍光。（A）自家蛍光（AF）の画像。 OD：光学ディスク、Foは：窩、馬：黄斑、参考：内部リファレンス。 （B）（A）からのAF用画像の後処理QAFマップ。ウォーマー色は、より高いAFの強度に相関します。固定REGイオンが示されており、各領域のQAF値が示されています。データ分析に使用される8セグメントperifovealリングが破線で示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

AMDへの地図状萎縮を表示目図2.自家蛍光。（A）自家蛍光（AF）の高度なAMDはRPE（破線により囲ま代表領域）の地理的萎縮（GA）を示す患者の左目の画像。 OD：光学ディスク、Foは：窩、馬：黄斑、参考：内部リファレンス。黄斑にGAに対応する領域に顕著に減少し、不在のAFに注意してください。 （B）（A）からのAF用画像の後処理QAFマップ。固定領域は示されており、各領域aのQAF値再示されました。データ分析に使用される8セグメントperifovealリングが破線で示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

異常のRPEリポフスチン分布は、増加または減少するかどうか、網膜疾患の感受性マーカーであり、一般に感覚網膜の機能の喪失と関連しています。ここで、我々は、RPEリポフスチンの評価のためQAFのアプリケーションを記述します。我々の標準化されたイメージング技術と一緒に可変レーザパワーと検出器感度⁹を補正する内部蛍光基準の取り込みは、AFレベルの信頼できる定量を可能にします。この方法は網膜疾患の診断およびモニタリングに役立つ、そして最終的にはそのような薬剤または遺伝子療法などの治療的介入の有効性を評価するになることを私たちの目標です。 QAFはまた、AMDなどの状態のためにリスクの個体の層別化を助けることができます。

我々は、網膜の病変¹³を解釈するための参照ツールとして使用されるQAFデータの大規模な規範データベースを生成し、また、いくつかの疾患STAにQAFを記載していますシュタルガルト病^10、ブルズアイ黄斑症¹²とベスト病^11を含むTES、。健康的な網膜では、そこに民族グループ間で異なるQAFレベルが黒人やアジア人よりも白人の方が有意に高かっQAFで、で、女性が男性よりも高いQAFレベルを有することを実証しました。おそらく最も著しく、QAFは、以前分光分析¹⁴によって測定されるように、RPEリポフスチンのレベルに対応する患者の年齢、として増加します。現在の規範的なデータのみを60歳まで延長するが、患者が70歳¹⁴後のRPEリポフスチンで測定された減少を持っていることが表示されます。興味深いことに、RPE細胞数の変化は、患者の年齢²などで観察された減少として発生することは表示されません。 AFは、RPEリポフスチン³で再配布または減少に起因する可能性があります。古い時代のAFにおけるこれらの減少は、減損RPE機能とAMDのリスクの増加と相関するかどうかを判断するために興味深いものになります。

15。別の制限は、技術が実行するために挑戦されていることであり、非常にオペレータに依存します。一貫してAFレベルの正確な測定を保証するために、高品質の画像を得ることが不可欠です。これを達成するために、著者らは、撮影プロトコルを厳守だけでなく、十分な練習をお勧めします。一部の患者は不十分曝露レベルが安全な範囲内にあることを患者を保証するAF用撮像に必要な光の明るいフラッシュを、容認するが^、1人^が役に立っ^たとあります。最適な撮像を可能にするために、（上記参照）は、少なくとも6ミリメートルに瞳孔を拡張すると遮るもののない光伝送に複数の画像を得ることが重要です。最適なフォーカスを実現し、ピクセルの過飽和を回避することも不可欠です。イメージングは​​、アシスタントの使用は、瞼は、上述したように、持ち上げられ、カメラをトリガするためのフットペダルを使用する必要がある場合、一方役立つ慣行は、患者との通信を含みます。

要約すると、未網膜変性におけるRPEの病態生理をderstandingすることは活発な研究の領域のままであり、潜在的に重要な治療上の影響。 QAFは、患者間とセンター間で、縦方向に得られた画像のAFレベルの直接的な比較を可能にするように、それはこのような理解に貢献するだけでなく、有用な臨床情報を提供することができる貴重なツールです。ここで説明する詳細なプロトコルは、信頼性の高いQAFデータの取得に他の人を支援する、とQAFの重要な臨床応用は、QAF技術を利用するための研究センターや臨床網膜の専門家を奨励すること。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0.5% tropicamide ophthalmic solution			Any brand can be used
2.5% phenylephrine ophthalmic solution			Any brand can be used
Internal fluorescent reference	Heidelberg Engineering
IGOR Pro software	WaveMetrics