Abstract
פיגומי רקמות לשחק תפקיד מכריע בתהליך התחדשות רקמות. הפיגום האידיאלי חייב למלא מספר דרישות כמו רכב ראוי שיש, מודולוס ממוקד, מאפיינים אדריכליים מוגדרים היטב. Biomaterials כי לשחזר את הארכיטקטורה הפנימית של רקמת in vivo הם חיוניים לחקר מחלות כמו גם כדי להקל על התחדשות של רקמות רכות איבד פגום. טכניקה biofabrication פותחה רומן המשלב מצב הדמיה אמנות, תלת ממדי (3D) הדפסה, ופעילות אנזימטית סלקטיבית כדי ליצור דור חדש של חומרים ביולוגיים למחקר ויישום קליני. החומר שפותח, גומי שור סרום אלבומין, הוא תגובה מוזרקת לתוך תבנית המקיימת תכונות גיאומטריות ספציפיות. חומר הקרבה זה מאפשר ההעברה הנאותה מאפיינים אדריכליים לחומר פיגום טבעי. אב הטיפוס כולל פיגום קולגן 3D עם ערוצי מ"מ 4 ו -3 כי represent ארכיטקטורה מסועפת. מאמר זה מדגיש את השימוש בטכניקת biofabrication זה ההדור של מבנים טבעיים. פרוטוקול זה מנצל תוכנה בעזרת מחשב (CAD) לייצר תבנית מוצקה אשר תהיה תגובה הזריק גומי BSA ואחריו העיכול אנזימטי של הגומי, עוזב המאפיינים האדריכליים שלה בתוך חומר הפיגום.
Introduction
בתחום הנדסת רקמות היכולת לפברק פיגומי רקמות היא חיונית. פיגום רקמות מתאים יש מבנה 3D, מורכב מחומרים ביולוגיים, ומחקתי באדריכלות רקמות vivo כדי להקל צמיחת תאים ורקמות שיפוץ. פיגום זה חייב לאפשר הובלה של חומרים מזינים ו הרחקת פסולת 1-4. אחד מכשולים העיקרי בייצור של פיגומים אלה הם היכולת לשחזר תכונות גיאומטריות ספציפיות לחומר ביולוגי. כמה טכניקות biofabrication דווחו לשלוט בתכונות הגיאומטריות של פיגומים אלו, דוגמאות הם electrospinning 5-8, ממס ליהוק 9, stereolithography 10, ו 3D-הדפסת 11, בין יתר. טכניקות אלו נופלים במתן העברה קל יחסית של מאפיינים אדריכליים פנימיים וחיצוניים לשליטה, הם יקרים, מוגבלים על ידי רזולוצית printability שלהם (
במערכות ייצור מסחריות רבות, יצירת חללים פנימיות, ערוצים, ותכונות מושגות באמצעות חול או חומרים נשלפים או הקרבה מתאימים אחרים. חלק המתכת או הפלסטיק נוצר סביב עובש החול, והפעם הוא הקרושה, בחול מוסר. ב הרבה באותו אופן, את הדור הבא של חומרים ביולוגיים צריך המקבילה biosand. לכן, גומי BSA פותח כתחליף biosand. גומי BSA הוא חומר שעוצבה זה מקרוב שמורכב אלבומין בסרום שור crosslinked עם glutaraldehyde. המטרה סופית הוא ליצור מחדש מאפיינים אדריכליים מסוימים לתוך פיגום קולגן מתכלה. המאפיינים של biorubber ההקרבה מקיימת נאמנות ממדים עם העובש של רקמה המקורית מתוארים.
התחת = "jove_content"> שילובים כמה ריכוזי BSA ו glutaraldehyde נבדקו באמצעות מגוון של ממיסים. חומר זה נוצר על ידי תגובה בין BSA ו glutaraldehyde. גומי BSA יכול להיות תגובה מוזרקת הגיאומטריות הסבוכות של תבניות רקמות. BSA Crosslinked הוא טריפסין יציב ולעכל בקלות על ידי האנזים בתנאי pH וטמפרטורה קל. לעומת זאת, סוג שלמים שאני קולגן הוא עמיד מאוד לעיכול טריפסין. תכונות אלו מהוונות להסיר את גומי BSA סלקטיבי עוזב את הקולגן מאחור. העבודה נוכחית כללה קביעת הפרמטרים האידיאליים צריכים להשיג עובש יציב שיכול לספק מאפיינים אדריכליים ספציפיים פיגום ביולוגי. התכונות הספציפיות אשר הוערכו כלל mixability, עיכול אנזים, נושאים עומס, ויכולת להיות תגובה מוזרקת לתוך תבנית שלילית. השילוב של BSA 30% ו -3% glutaraldehyde מילוי דרישות אלה. פרוטוקול זה מספק את necessהנחיות האר"י ליצור פיגומים תלת ממדי אלה. אב הטיפוס כולל פיגום קולגן המייצג ארכיטקטורת קנים עם יבוא אחד ושני ערוצי זרימה בקטרים של 4 ו 3 מ"מ, בהתאמה. טכניקה זו יש פוטנציאל לחקות סביבות מיקרו מקרו של הרקמה של עניין. טכנולוגיה זו מספקת טכניקה מעשית לספק מאלפת גיאומטריות ספציפיות חומר מתכלה בתוך קל ומהיר יחסית עם איכות גבוהה, אשר יכול להיות מכוון לחקות את גמישות רקמות vivo ב ומאפיינים אחרים של הרקמה של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לקבוע את אחוז המוצקים יצווה קולגן
- חלץ את הקולגן בעקבות הליך שפורסם בעבר 13. להפשיר מינימום של 20 מ"ל של קולגן. לקבוע את האחוז הראשוני של מוצקי הקולגן יצווה כדי לתפעל את ריכוז הקולגן הידרוג נוצר.
- חותכים שלוש חתיכות של נייר אלומיניום (כ- 6 x 6 ס"מ) ולעצב כל אחד כפי במחבת באמצעות בתחתית מבחנה 25 מ"ל. רשום את המשקל של כל מחבת.
- הוספת כמות קטנה של קולגן לכל מחבת ולהקליט את המשקל הכולל של סיר האלומיניום וקולגן. הוסף 0.5 - 0.8 גרם של קולגן על כל סיר אלומיניום.
הערה: לאחר שלב זה, יש שלוש מחבתות רדיד אלומיניום וכל אחד צריך כמות קטנה של קולגן. הקפד לרשום את המשקל של כל מחבת אלומיניום ריקה (סה"כ 3) והמשקל של המחבת לאחר תוספת של קולגן. - חשבתי את המשקל של קולגן בכל מחבת באמצעות following הנוסחה:
קולגן משקל = פאן ומשקל קולגן - במשקל פאן - מניחים שלוש מחבתות אלומיניום אשר מחזיקים את הקולגן בתנור ב 100 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, להקליט את המשקל של כל מחבת אלומיניום קולגן מיובש.
- חשב את המשקל של קולגן מיובש באמצעות המשוואה הבאה:
משקל קולגן מיובש = פאן ומשקל קולגן מיובש - במשקל פאן - חישוב אחוזי מוצק במשך שלוש דגימות לקביעת ריכוז מוצק קולגן השתמשה בנוסחה הבאה:
- חשבתי את התוכן המוצק קולגן הממוצע של יצווה באמצעות האחוז המוצק קולגן לכל אחת משלוש הדגימות.
הערה: קולגן אשר ישמשו מה שנשאר של קולגן התייבשות. אף אחד קולגן המיובש ישמש. - לאחר קביעת אחוז קולגן המוצקה (iריכוז הקולגן nitial) של אצווה, להמשיך להשתמש קולגן hydrated הנותרים. השתמש מטר pH מכויל כדי להתאים את ה- pH של אצווה קולגן 3.
- הוספת כמויות קטנות (2-5 μl בכל פעם) של 12 N חומצה הידרוכלורית (HCl). שמור על קרח בכל עת. אל תוסיף את חומצה הידרוכלורית ישירות קולגן - להוסיף את החומצה על הצד של הצינור. לאחר הוספת חומצה, השתמש מרית לדחוף את החומצה על קולגן ובמהירות ומערבבים את התערובת.
- ברגע שהוא מגיע pH של 3, בואו הקולגן לשבת O / N ב 4 ° C.
2. הכנת גומי BSA
- הכן את אלבומין בסרום שור הפתרון (BSA) ביצוע הליך מפורט להלן.
- כן פתרון בופר פוספט 2x (PBS). הוסף שתי טבליות PBS ל -100 מ"ל של מים כדי להפוך 0.02 פתרון M PBS.
- שלב BSA עם 2x PBS ליצור פתרון BSA 30% באמצעות הליך מפורט להלן.
- לדוגמה, כדי לבצע BSA 30% עם 30 מ"ל של PBS 2x, השתמש 12.9 גרם של BSA. להוסיף 1/3 PBS 2x (למשל, 10 מ"ל) כדי בקבוקון עם בר ומערבבים. להוסיף 1/2 של BSA (למשל, 6.45 גרם BSA) אל הבקבוק בעזרת מרית, להרטיב את המומס יבש.
- חזור על תהליך זה של הוספת PBS ולאחר מכן BSA עד שכל המומס ואת ממס הוא בבקבוק. השתמש מרית להרטיב כל המומס. זה ייראה כמו תערובת של כמה נוזלי גושים. תן לזה לשבת במשך כ 30 דקות.
- ואז, להפוך את הבוחש על מחזור נמוך ולוודא שאין גושים סביב הבר ומערבב. זה צריך לקחת 90 דקות כדי לקבל את הכל בתמיסה או שזה יכול להיות שמאל ערבוב O / N ב 4 ° C. לאחר המומס הוא כל מומס, מניחים את הפתרון בתוך מזרק 20 מ"ל ו כתרים עם מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר. לחץ על הבוכנה לגרש נוזל דרך המסנן ולאסוף הפתרון המעוקר צינור חדש. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- כן soluti glutaraldehyde 3%על ידי דילול פתרון glutaraldehyde 25% עם PBS 2x מסונן סטרילי. לדוגמה, במשך 10 מ"ל של תמיסת 3% Glutaraldehyde, השתמש 2 מ"ל של 25% glutaraldehyde ו -8 מ"ל של 2x PBS. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. טיפול תבניות
הערה: אב הטיפוס המתואר במאמר זה משתמש חתיכת עובש Y נירוסטה בהתאמה אישית. העובש מכיל יבוא ושני ערוצי יצוא של 4 ו -3 מ"מ, בהתאמה. ראשית, תבניות נקיות, לרסס אותם עם שומן בלתי רווי, לעקר אותם. הכן את תבניות הנוהל מתוארות להלן.
- תבניות נירוסטה נקיות באמצעות sonicator בתדר של 35 קילוהרץ. מניחים את התבניות ב sonicator לצלול אותם עם מים וקרח. שמור את התבניות קרות בכל עת בעוד sonicator פועל. הפעל את sonicator עבור 2 תקופות של 90 דקות.
- לאחר כל התקופה, להשתמש במחט לוודא שאין המהותיות Luer לנעול נירוסטה או במחבר רז. השתמש במים וסבון כדי לנקות את כל פני השטח של שני הצדדים של התבניות. ודא שאין חסימה של הערוצים.
- מניחים את התבניות, ברגים, ומחבר מנעול Luer בתוך שקית החיטוי ו החיטוי זה.
- מלא את הבקבוק שמתחבר דרך חצי מרסס אוויר שבומן-חזיר זמין מסחרי (סוכן שחרור חומצת שומן מעורב). החזר את המכסה עם בקבוק כובע רגיל. מניח אותו בתוך שקית חיטוי ו חיטוי זה.
הערה: לארד משמש כדי להקל על השחרור של החומר יהיה תגובה המוזרקת בהמשך (גומי BSA). אין להניח את המכסה בקבוק מרסס ב autoclave- זה יכול לגרום נזק לאטם פנימי. - לחמם את השומן במשך 45 שניות או עד ברורה הנזילות שלה במיקרוגל. הבריגו את המכסה מרסס אוויר לבקבוק שומן. חבר את המכסה עם המרסס. צרף המרסס למקור האוויר על ספסל המעבדה. פתח את שסתום האוויר, ופתח את הפייה של המרסס עד שהוא מתחיל להרטיב את המשטחשל מגבת נייר.
- תרסיס שומן בניצב לפני השטח עובש עד פני השטח מכוסה במלואה. לאחר כל פיסת כבר מרוסס, למקם אותם בצלחת פטרי ולאטום אותו. מניחים את התבניות על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- המשך לעקר את התבניות ידי החשיפה פני לאור UV למשך 30 דקות. מניחים אותם בחזרה על 4 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים להיות מוזרק התגובה.
4. הזרקת התגובה של גומי BSA
הערה: כל החומרים הפתרון צריך להיות לשמור על קור עד מוכן לשימוש כדי למנוע הגדרה מוקדמת של גומי BSA בשלבים הבאים.
- הכן את המנפק עבור מסירת גומי BSA אל תבניות ביצוע השלבים הבאים.
- לעקר את כל הרכיבים ערבוב (שני O טבעות, כובע מזרק, מזרק כפול, לערבב קצה, ו -4: מנפק 1) על ידי חשיפת אותם לאור UV למשך 30 דקות ב תגובת שרשרת פולימראז ברדס (PCR).
הערה: מכסה מנוע PCR שמש בגלל tההליך שלו כרוך fixatives. כימיקלים אלה לא ניתן להשתמש ב למכסת מנוע תרבית תאים / רקמות בשל סיכון של חשיפה ורעילה לתאים. כל מכסה מנוע אחר המכיל אור UV יהיה מתאים. - מניחים את הכובע טיפ על בעל פתרון.
- בצע את הערבוב וההזרקה בכל 4: יחס 1 של BSA: Glutaraldehyde. מוסיפים את BSA 30% לתא מזרק כפול אשר יספקו את הכמות הגבוהה ביותר של פתרון (זה ייקח בערך 4 מ"ל למלא). הקפד להשאיר מספיק מקום כדי למקם את טבעת O כדי למנוע גדותיו וזיהום של החדר הסמוך.
- הוסף פתרון glutaraldehyde 3% אל החדר השני (זה ייקח בערך 1 מ"ל כדי למלא). הקפד להשאיר מספיק מקום כדי למקם את טבעת O כדי למנוע גדותיו וזיהום של החדר הסמוך.
- יש להכניס את המזרק הכפול על המנפק. הטה את ההרכבה אנכית כך כובע המזרק הוא על העליונה. החזר את המכסה עם קצה הערבוב.
- Sc REW חלקי שני עובש הנירוסטה יחד.
- הנח את המכלול בתוך שקית חיטוי.
- למען הסר האוויר מנפק, להחזיק אותו במצב זקוף ובמהירות ללחוץ על הידית פעם אחת כדי לשחרר כמות קטנה של BSA מעורבב עם glutaraldehyde. ואז במהירות לצרף את מחבר מנעול Luer של עובש נירוסטה Y אל קצה המזרק.
- להחזיק את התבנית נירוסטה Y ביד שמאל ואת מנפק תערובת BSA-Glutaraldehyde מימין. חלופי כיסוי כל פליטה של שמאל וימין של ערוצי היצוא ידי הלחיצה על הפליטה של מכונת צדי שקית החיטוי לוודא החללים בתוך מלאי פתרון. ואז, במקום התבניות אופקיות ולהזריק שוב.
- לנתק את התבניות מן המנפק ומניח בצלחת 25 מ"מ פטרי.
- מניחים Parafilm ברחבי צלחת פטרי כדי למנוע התייבשות של גומי.
- מניחים את התבנית בתוך O מקרר 4 ° C / N.
- לעקר את כל הרכיבים ערבוב (שני O טבעות, כובע מזרק, מזרק כפול, לערבב קצה, ו -4: מנפק 1) על ידי חשיפת אותם לאור UV למשך 30 דקות ב תגובת שרשרת פולימראז ברדס (PCR).
= "Jove_title"> 5. התאמת ריכוז קולגן
הערה: קולגן יש לשמור על הקרח בכל עת במהלך התהליך.
- שנה את ריכוז הקולגן באמצעות האחוז המוצק קולגן.
- הפוך 10 מ"ל של קולגן 1.75% על ידי התאמת ריכוז הקולגן הראשונית עם מים קרים.
- באמצעות מד pH מכויל, להתאים את ה- pH ל 3 באמצעות 12 N חומצה הידרוכלורית. אל תוסיף את חומצה הידרוכלורית ישירות collagen- להוסיף את החומצה על הצד של הצינור. לאחר הוספת חומצה, השתמש מרית לדחוף לתוכו את החומצה קולגן ובמהירות ומערבבים את התערובת.
- לשקול 4 גרם של קולגן צינור חרוטי נפרד.
- צנטריפוגה קולגן כדי להסיר אוויר ב 4 ° C ו- 9343 XG במשך 20-30 דקות.
- UV לעקר את מכסה המנוע תרבית תאים עבור 30 דקות, ולהוסיף 14 μl של laminin על קולגן 4 מ"ל. זה יגרום ריכוז laminin סופי של 10 מיקרוגרם / μl. הערה: Laminin מספק sשלמות tructural, הדבקה, ומקדם תגובות הסלולר השונות.
- סובבו את UV PCR להדליק במשך 20-30 דקות לפני השימוש ברדס לעיקור.
- מניחים את הכובע מנעול Luer, לצרף מזרק 20 מ"ל, באתנול במשך שעות 2. לאחר מכן, לאפשר לו להתייבש ומניחים אותו לאור UV.
- גמא מקרין את קולגן עבור 8.6 דקות כדי להגיע ל -1,200 cGy.
שים לב: בפעם יהיה תלוי הדעיכה של מקור צסיום. התאם את הזמן כדי להגיע לאותה המינון.
6.Casting קולגן על גומי BSA
- כדי לפלמר קולגן, השתמש 8: 1: 1 יחס (קולגן: HEPES: MEM). ההליך הבא מבוסס על גרם 4 ראשוניים של קולגן acidified (משלב 5.1.8).
- בצע פתרון 0.2 N HEPES במים, ולהתאים את ה- pH עד 9 על ידי הוספת כמויות קטנות (1-5 μl) של 1-5 M נתרן הידרוקסידי פתרון (NaOH). באמצעות מד pH מכויל, לפקח על ה- pH של התמיסה לאחר כל הוספה. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או keEP על הקרח.
- כבה את האור UV של מכסה המנוע בתרבית רקמה במשך 20-30 דקות כדי לעקר את מכסה המנוע.
- מלקחי חיטוי, מרית, אזמל עבור עיקור.
- מערבבים 1.5 מ"ל של 0.2 N HEPES (pH 9) ו -1.5 מ"ל של 10x MEM באמצעות מכסה המנוע בתרבית רקמה. הקפד לשמור את זה על הקרח מערבולת במשך 5 שניות לפני השימוש. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או ולשמור על הקרח.
- כדי לעקר את מכסה המנוע PCR, להדליק את האור UV במשך 30 דקות.
- מניחים צלחת 12 היטב מזרק 20 מ"ל ב -20 ° C למשך 10 דקות, או עד מוכן להמשיך. הערה: שמור את כל החומרי קר עד מוכנה לשימוש. הגידול בטמפרטורת גורם fibrillogenesis קולגן המוקדם.
- לרסס את כל הצינורות והצלחים היטב כי הם הולכים להיות בשכונה עם אתנול 70% ולתת להם להתייבש במשך עיקור. מניחים מזרק 20 מ"ל על קרח כדי לקרר לשימוש מאוחר יותר.
- ב למכסה המנוע PCR, לפתוח את תבניות נירוסטה לשחרר את הגומי BSA ו באמצעות אזמל, לחתוך את ערוצי הפליטה של r BSAעובש ubber.
- מתחת למכסה מנוע PCR, לפתוח את צינורות קולגן סטרילי ולהוסיף 1 מיליליטר של פתרון HEPES-MEM (לוודא כי לפני לחילוץ פתרון HEPES-MEM, שזה מתערבב היטב ואין פיקדונות מוצקים).
- באמצעות מרית סטרילי, ביסודיות לערבב את הפתרון קולגן חיץ.
- סגור מערבולת אותו במהירות כדי להבטיח הידרוג'ל מעורב היטב.
- מעבירים מזרק 20 מ"ל קר.
- ביד אחת, החזק את גומי BSA בתוך הבאר, באמצעות אחרים, לוותר מחצית הפתרון הידרוג'ל קולגן על החלק התחתון של הבאר.
- באמצעות פינצטה סטרילית, להבטיח כי הקצוות יבוא ו יצוא גומי נוגעים בצידי היטב.
- יוצקים פתרון קולגן על גבי גומי עד מכוסה לחלוטין.
- ודא גומי BSA מושעה בתוך קולגן כי אין בועות, במיוחד ליד הקצוות של הגומי.
- מניחים את המכסה ועוטפים Parafilm ברחביהיקף של הבאר.
- שים בחממה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. השאירו את האור PCR UV על.
- לאחר פילמור של קולגן, UV crosslink הידרוג באמצעות ההליך הבא.
הערה: crosslinking של קולגן ייעשה באמצעות מנגנון UV crosslinker שבו כמות האנרגיה יכול להיות נשלט.- הפעל את crosslinker UV ולהשתמש בהגדרה אנרגיה כדי להקרין את התוף הריק עם 630,000 μJ / 2 ס"מ.
- הסר את הג'לים מן החממה.
- תרסיס ידיים עם אתנול, ו, בתוך החדר, להסיר את המכסה מהר ככל האפשר.
- סגור את קאמרית UV crosslink הידרוג על ידי בחירת הגדרה אנרגיה irradiating 630,000 μJ / 2 ס"מ.
- לאחר מחזור crosslinking, לכבות את האור UV על מכסה המנוע PCR
- תרסיס ידות עם אתנול ופתח את התא, הציב את המכסה במהירות החזרה אל צלחת היטב. הזז את הצלחת היטבאל מכסה המנוע PCR.
- באמצעות מרית סטרילי, בעדינות לשחרר ולהסיר את הג'ל מהבאר. תהפכו את הג'לים מתחת למכסה המנוע כדי crosslink התחתון של הידרוג'ל. חזור על שלב 6.2.3 ו 6.2.4.
7. עיכול אנזים של גומי BSA
- על מנת לקבל פיגום קולגן חלול, להסיר גומי BSA בצורה שאינו משפיע על הממדים המוטבעים הידרוג'ל. ההליך המתואר להלן.
- כבה את האור UV במשך 20-30 דקות כדי לעקר את מכסה המנוע בתרבית רקמה.
- בצע פתרון טריפסין 0.25% pH 7.8. לדוגמה, במשך 15 מ"ל מים, להוסיף 0.0376 גרם של טריפסין צינור חרוטי 50 מ"ל. התאם את ה- pH 7.8 ידי הוספת כמויות קטנות (2-5 μl) של 1 M NaCl. מניחים את הפתרון בתוך מזרק 20 מ"ל ו כתרים עם מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר. לחץ על הבוכנה לגרש נוזל דרך המסנן ולאסוף הפתרון סטרילי בתוך שפופרת חדשה.
- הפעל באמבט מים ולהגדיר את הטמפרטורה ל 30מעלות צלזיוס.
- אחרי 30 דקות, לכבות את האור UV. תרסיס אתנול על כל צינורות וחומרים אשר ישמשו בשכונה.
- מעבירים את הידרוג'ל קולגן מתחת למכסה המנוע ומכניסים צינור חרוטי נפרד.
- להוסיף סביב 3-5 מ"ל (רק מספיק כדי לכסות את הג'לים) של פתרון טריפסין 0.25% עם pH של 7.8 על צינור אחד.
- חותם את הצינורות עם Parafilm ו מערבולת בקלילות כ 1 דקות.
- מקום באמבט מים C 30 מעלות במשך 15-24 שעות. בעוד באמבט מים, מערבולת הג'לים קל לעתים קרובות עד גומי BSA כבר מעוכל או יוסר הידרוג'ל.
הערה: על מנת לקבוע אם גומי BSA הוסר, או הגומי הוא צף הפתרון טריפסין או שיש חלקים שבורים. אסור שיהיו אזורים כהים חזותיים בתוך הידרוג'ל.
- כדי להבטיח שכל גומי טריפסין BSA הוסר מן הידרוג'ל, לשטוף אותו כמתואר להלן.
- הפעל את הו PCRד אור UV במשך 20-30 דקות.
- כן פתרון Mosconas. שלב אשלגן כלורי (KCl, 28.6 מ"מ), (3 NaHCO, 11.9 מ"מ), גלוקוז (9.4 מ"מ) ו- (4 לאא 2 PO, 0.08 מ"מ) במים. התאם ל- pH 7.4 עם 1 M NaOH או 12 פתרון M HCl. מניחים את הפתרון בתוך מזרק 20 מ"ל ולהשתמש במסנן מזרק של 0.20 מיקרומטר לעקר את הפתרון.
- תרסיס הכל עם אתנול לפני הצבת על מכסה המנוע ולאפשר אתנול להתייבש.
- פתח את צינור ולהעביר 5-10 מ"ל של תמיסת Mosconas סטרילי כדי צינור חרוטי 50 מ"ל חדש.
- מעבירים את הידרוג'ל קולגן אל צינור חרוטי המכיל את פתרון האנזים. ודא כי הידרוג'ל מכוסה כולו הפתרון. השאירו את הצינורית שייקר במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לשאוב את הפתרון Mosconas וחזור על שלב 7.2.5 פעמיים.
- חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות מראה כי טכניקת biofabrication זו יעילה ביצירת פיגומי 3D שיכולים לחקות את הסידור המרחבי לראות רקמות vivo. המאפיינים אדריכליים הם פרמטרים חיוניים עבור יישום הנדסת רקמות, החלו למלא תפקיד מרכזי ביחסי גומלין תא vivo ב והפונקציונלי של הרקמה.
העקביות mixability של גומי BSA היה פרמטר חשוב בייצור גומי BSA כי היא הומוגנית, והוא מסוגל לשמור על הצורה שלה נועדה. המסיסות של חלבונים נקבעה על ידי השפעות מולקולאריים, כגון אינטראקציה בין חלבונים, ועל אינטראקציה עם הממס, אשר גורם לשינויים בהתנהגות החלבון הכוללת. המוליכות של הפתרון BSA נמדדה, המהווה אינדיקציה ריכוז מלח של הפתרונות. טבלה 1 מפרטת את והשילובons של BSA, ממס, ו glutaraldehyde נבדק. כצפוי, הדגימות שהיו המוליכות גבוהות (ממס 2x PBS) הקלו המסיסות של BSA.
פרמטר נוסף המשמש לקביעת מצבו המתאים לפיתוח של חומר הקרבה זה היה שיעור התגובה. זמן התגובה של BSA ירד כמו ריכוז של glutaraldehyde עלה, כצפוי. מקבע מגיב עם קבוצות אמינו-α של חומצות אמינו, קבוצת אמינו N הטרמינל של פפטידים, וקבוצת sulfhydryl של ציסטאין. Glutaraldehyde מגיב בעיקר עם BSA דרך קבוצות אמינו של ליזין כדי ליצור את קשרים קוולנטיים מולקולאריים (איור 1 א) 14. לאחר תקופת דגירה, דגימות הראו שינוי צבע מצהוב בהיר עד כהה צהוב וחום, הגדלת עוצמת בריכוז glutaraldehyde מוגברת (איור 1B). 20%, 30%, גידולBSA ד 40% עם 2% glutaraldehyde במים לא יוצר גומי. פתרון 40% BSA, בשל הצמיגות הגבוהה שלה ואת מקבע מאוד תגובתי, הביא משתנה כוח לאורך הגומי. התנהגות זו יכולה להיגרם על ידי הקושי של glutaraldehyde לחדור שרשראות חלבון בצורה הומוגנית. הממס היה השפעה רבה על המסיסות של חלבון וגם את תגובתו שלו עם המקבע. פתרונות 2x PBS היו mixable בקלות. פתרון BSA עם מים היה קשה לערבב. מסיסות BSA מושפעת במידה רבה את המוליכות של הממס (טבלה 2), ולגרום לשינויים קונפורמציה בחלבון. הדגימות המבטיחות ביותר היו BSA 30% עם glutaraldehyde 3% ב 1x PBS ו 2x PBS.
כדי להבטיח כי הגומי הצליח כוחות טעינה מתמשכים, מבחן דחיסה בוצע. תכונות מכניות של ארבע דוגמאות של גומי BSA נמדדו: 30% BSA 3% glutaraldehyde ב2x PBS, 30% BSA 3% glutaraldehyde ב PBS 1x, 20% BSA 3% glutaraldehyde ב 2x PBS ו -20% BSA 2% glutaraldehyde ב 1x PBS. גלי סינוס הראו שינוי פאזה קטן מאוד בין עקומות העומס ותזוזה (מוסף איור 2) המועברים העקום לחץ ומתח (מוסף איור 3). בהתבסס על עקומות לחצו ומתח, את הראה היסטרזיס שלוש הדגימות הראשונות בין ההעמסה והפריקה (איור 2A-2C). דגימות אלה שלוש התנהגו כחומר viscoelastic המכיל תכונות אלסטיות וצמיג כשכוחות יושמו. Glutaraldehyde% 20% BSA 2 הראה סימנים של לעיוות בלתי הפיך (איור 2 ד). 30% BSA 3% glutaraldehyde ב 1x PBS ו 2x PBS הראו התנהגות דומה (איור 2E -One מחזור פריקה וטעינה). מודולוס האלסטיות נקבע מהחלק ליניארי של ארבע דגימות אלה (איור 2F). הריכוז של פוספטממס הגדיל את מודולוס האלסטיות משמעותי בטווח הנבדק (p = 0.03). 20% BSA 2% glutaraldehyde ב PBS 1x מעווה בקלות, מראה מודולוס אלסטיות נמוכה.
כדי להעריך את עיכול אנזימטי של גומי, קצב התגובה מחושב התבססה על היעלמותו של גומי BSA כאשר הניח במגע עם האנזים בנקודת זמן ספציפית. תהליך העיכול אנזימטי היה כאל כור יצווה. השוואה בין ריכוז גומי החל לפני הטיפול ואת גומי עזב לאחר lyophilized נעשתה להשיג קינטיקה של דרכי העיכול. איור 3 מציג את קצב התגובה עבור כל דגימה ביחס ריכוז glutaraldehyde ו BSA, ממס, ו בזמן מגוריו. מגמה ברורה נצפתה בין ריכוזי crosslinker ואת קצב התגובה של דיסוציאציה של הישות. ניתוח סטטיסטי בוצע בכל נקודת זמן. עבור הדואר 15 שעות זמן נקודה, ריכוז glutaraldehyde השפיע באופן משמעותי על קצב התגובה וכתוצאה מכך ערך ap של 0.02 (לוח מוסף 4). לאחר מכן נקודת זמן, הן glutaraldehyde וריכוז BSA השפיע באופן משמעותי על שיעור (לוח מוסף 5-7). הגורם המשפיע ביותר הכולל היה ריכוז glutaraldehyde, שמסומן על ידי ערך p משמעותי יותר. הגידול בריכוז glutaraldehyde ירד קצב תגובה של מערכת העיכול של ישות הגומי.
כמות החלבון מומסת על ידי טריפסין נקבעה באמצעות assay BCA (איור 4). מגמה נפוצה נצפתה: ככל הריכוז הנמוך יותר של המקבע, יותר חלבון היה מתעכל מן גומי BSA. טריפסין אינטראקציה עם המדגם גומי על ידי ביקוע הגישה המאזנית ובהתאם קשרים קוולנטיים החדש שנוצר שהוקמה על ידי glutaraldehyde, ובכך המסת המבנה הכללי מעלזְמַן. נראה כי עם 1x PBS יש חלבון solubilized יותר בנקודת זמן קודמת לעומת PBS 2x. במשך הזמן, יש עלייה של חלבונים בתמיסה ב 15 שעות, שהמשיכה להגדיל עד 48 שעות ולאחר מכן הוא ירד. זה יכול להיות בגלל טריפסין זמן ביקוע החלבונים, ולכן יצירת פפטידים קטנים וחומצות אמינו. כמו כן, ניתן לייחס את המגבלות של assay, אשר יכולים רק לקרוא פפטידים אשר מורכבים משלושה או יותר חומצות אמינו. ניתוח סטטיסטי הראה כי ריכוז BSA ו glutaraldehyde השפיע באופן משמעותי על שחרורו של חלבון מן גומי BSA (p <0.05). גידול בריכוז BSA גרם לעלייה של חלבון ב supernatant, כאשר עליית glutaraldehyde גרם לירידת חלבון מומס.
כדי למדוד את הניתוק של חומר ההקרבה הזה, גומי נשקל (בסיס רטוב) לפני להציבו contact עם טריפסין. המקבילה של משקל יבש של הגומי להציב פתרון עיכול האנזים נקבעה באמצעות הערכים המוצגים מוסף באיור 1. פתרון האנזים הגיב עם גומי BSA, ובכך, solubilized החלבון. הגומי הנותרת לאחר הטיפול lyophilized O / N ומשקלו. איור 5 מראה כי הממס השפיעו על דיסוציאציה של גומי. באותו הריכוז של BSA ו glutaraldehyde, קונדומי ממס 2x PBS שומרים יותר של החומר שלהם לעומת PBS 1x.
שלוש יצירות עובש מוצק היו מפוברקות: עובש Loop (מוסף איור 4 א), Piece יציבות (מוסף איור 4B), עובש Y (איור 6 א, משמאל). יצירת עובש הנירוסטה Y נוצרה באמצעות מכונת Microlution (איור 6 א, מימין). עובש זה תגובה הזריקה BSA 30% ו -3% glutaraldeהייד 2x PBS (6B איור, שמאל). הגומי הורש להגיב O / N ב 4 ° C. הגומי היה casted עם קולגן (איור 6, מרכז) ולאחר מכן האנזים מתעכל (איור 6, מימין). נתונים ראשונים הצביעו על כך ב- pH 7.8 ובטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות, גומי BSA ניתן לעכל עם השפעה מינימאלית על פיגום קולגן. לאחר 15 שעות, גומי הוא נחלש על ידי האנזים והמשוחרר מספיק כי הוא מותיר את הערוצים מבלי להשפיע על התכונות הגיאומטריות של קולגן. פיגום קולגן 3D נוצר כי יש תכונות גיאומטריות ספציפיות. 6B איור (מימין) מראה ערוץ בקוטר 4 מ"מ בתוך הידרוג'ל קולגן לאחר עיכול אנזים של גומי BSA. הערוץ נמדד עם קליפר להבטיח כי ממד המקורי נשמר. ואכן, הערוץ החדש של הידרוג'ל קולגן היה 4 מ"מ. תבניות גומי BSA יכולות להחזיק ממדים קטנים כמו 300 מיקרומטר, אשר נבדקה לנוing עובש יציבות (איור 7). פיגומים אלו נבדקו עבור glutaraldehyde שיורית לא מצאנו שאריות לאחר שטיפות Mosconas.
איור 1. BSA גומי. (א) BSA תגובת גומי. Glutaraldehyde Crosslinks ארגון ה- BSA על ידי יצירת קשרים קוולנטיים. (ב) גומי BSA. ריכוזים שונים של BSA, ריכוזים של glutaraldehyde, וסוג הממס היו casted על 24 גם צלחות והגיבו O / N ב 4 ° C. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. עקומות מתח זנים של קונדומי BSA. עקומות מתח זנים של BSA ru bbers. (א) 30% BSA 3% glutaraldehyde ב 2x PBS; (ב) 30% BSA 3% glutaraldehyde ב 1x PBS; (ג) 20% BSA 3% glutaraldehyde ב 2x PBS; ו (ד) 20% BSA 2% glutaraldehyde ב 1x PBS (3 מחזורים). עקומות גומי הצג AC, כי יש כמה hysteris, אבל לחזור לצורתו המקורית שלהם. D לדוגמא מראה גומי עם מודולוס נמוך מאוד אלסטי בקלות ומעוות לצמיתות במהלך תהליכי פריקה וטעינה. מדגם B הראו התנהגות דומה מאוד כפי שניתן לראות במחזור אחד פריקה וטעינה ב E גרף (נציג מחזור אחד של כל דגימה). הגמישות הושפעה הריכוז של מקבע ואת הממס בשימוש (F). הדגימות מוצגות עלייה משמעותית מודולוס עם גידול של המלחים (** p <0.05). ריכוז מקבע גבוה יותר הביא לעלייה משמעותית את האלסטיות של קונדומי BSA (* p <0.05).arget = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קצב התגובה איור 3. של התפוררות גומי BSA. ככל שעולה מקבע, קצב התגובה יורדת עבור כל דגימות 1x PBS (א), 2x PBS (B), ומים (C). 40% BSA 2% glutaraldehyde ב 2x PBS תערוכות אחד השיעורים הגבוהים ביותר של תגובה. זאת בשל הקושי נתקל בקבלת חלבון BSA הומוגנית. (כחול: 20% BSA, סגול: 30% BSA, ואדום: 40% BSA). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
חלבון איור 4. quantifi קטיון לאחר עיכול אנזים. ככל שעולים מקבע, חלבון מומס מן הגומי יורד עבור כל דגימות 1x PBS (א), 2x PBS (B), ומים (C). (כחול: 20% BSA, סגול: 30% BSA, ואדום: 40% BSA). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עיכול איור 5. גומי. אנחנו נקבע את כמות גומי מתעכל על ידי השוואת המוצא ולסיים מוצרי בסיס חומר יבש. השגנו כמות העיכול לפחות על המדגם 6% glutaraldehyde ואת glutaraldehyde% ביותר 30% BSA 2 ב 1x PBS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. מסועפות אבטיפוס. (א) ייצוג של כלי דם סניף. יוצג בפינה השמאלית הוא מוצק שנוצר MASTERCAM אשר הוסב G קוד מפוברק באמצעות Microlution 363-S כפי שניתן לראות בצד ימין. יצירת עובש הנירוסטה מייצגת ערוץ יבוא 4 מ"מ עם ערוצי יצוא דו 3mm. (ב) 3D פיגום קולגן. יוצג בפינה שמאלי הוא גומי BSA נעשה באמצעות העובש המוצג לעיל. המרכז מציג את גומי מוטבע הידרוג'ל קולגן. מוצג בפינה ימנית הם הערוצים עזבו בתוך פיגום קולגן לאחר הגומי היה מתעכל אנזים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ftp_upload / 53,578 / 53578fig7.jpg "/>
ערוץ איור 7. BSA. הוסר ערוץ 300 מיקרומטר BSA מתבנית חתיכת יציבות. יש שכבה דקה של סוכן לשחרר עובש סביב הערוץ. השטח הנוסף הוא להבחין בבירור תחת מיקרוסקופ וניתן להסירו בקלות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| BSA (%) | Glutaldehyde (%) |
| 20 | 2 |
| 20 | 3 |
| 20 | 6 |
| 30 | 2 |
| 30 | 3 |
| 30 | 6 |
| 40 | 2 |
| 40 | 3 |
| 6 |
. לוח 1. פרמטרים גומי BSA BSA ו מקבע היו מעורבים בכל 4: יחס 1 באמצעות שלושה ממיסים שונים.
| לִטעוֹם | מוליכות (MS / ס"מ) | pH | |
| BSA (%) | מֵמֵס | ||
| 30 | 2x PBS | 11.43 | 7.06 |
| 30 | 1x PBS | 6.35 | 7.05 |
| 30 | DI | 2.39 | 6.76 |
| 20 | 2x PBS | 13.00 | 6.92 |
| 20 | 1x PBS | 8.67 | 7.09 |
| 20 | DI | 2.08 | |
מוליכות ו- pH טבלה 2. דגימות BSA. המוליכות ו- pH של פתרונות BSA נמדדו בנוכחות ממסים שונים. גידול מוליך מוצג בין 2x ו 1x PBS.
| BSA (%) | Glutaraldehyde (%) | מֵמֵס | תצפיות | |||
| 20 | 2 | 1x PBS | רך, חומר ובר-עיוות קל | |||
| 20 | 3 | 1x PBS | רך אבל יותר יציב מאשר glutaraldehyde 2% | |||
| 20 | 6 | 1x PBS | נוקשה, פריך מעט | |||
| 30 | 2 | 1x PBS | עקביות טובה | |||
| 30 | 3 | 1x PBS | עקביות טובה | |||
| 30 | 6 | 1x PBS | שָׁבִיר | |||
| 40 | 2 | 1x PBS | מאוד לא עקבי ביצירת עקביות ג'ל / גומי | |||
| 40 | 3 | 1x PBS | העקביות להשתנות לאורך המדגם | |||
| 40 | 6 | 1x PBS | שָׁבִיר | |||
| 20 | 2 | 2x PBS | רך, חומר ובר-עיוות קל אבל יותר יציב מאשר במדגם 1x PBS | |||
| 20 | 3 | 2x PBS | רך אך נוקשה מאשר 2% | |||
| 20 | 6 | 2x PBS | עקביות טובה | |||
| 30 | 2 | 2x PBS | עקביות טובה, יותר studry מאשר עם PBS 1x | |||
| 30 | 3 | 2x PBS | עקביות טובה, יותר studry מאשר עם PBS 1x | |||
| 30 | 2x PBS | mixability אבל britle טוב | ||||
| 40 | 2 | 2x PBS | העקביות להשתנות לאורך המדגם | |||
| 40 | 3 | 2x PBS | העקביות להשתנות לאורך המדגם | |||
| 40 | 6 | 2x PBS | העקביות להשתנות לאורך מדגם וזה היה פריך | |||
| 20 | 2 | מַיִם | האם לא יוצר חומר ג'ל / גומי | |||
| 20 | 3 | מַיִם | נוצר ג'ל אבל נראה נוקשה יותר tהוא 1X PBS ו 2x PBS, עולה בקנה אחד | |||
| 20 | 6 | מַיִם | נוצר ג'ל אבל נראה נוקשה מאשר PBS 1x PBS ו 2x, עולה בקנה אחד | |||
| 30 | 2 | מַיִם | האם לא יוצר חומר ג'ל / גומי | |||
| 30 | 3 | מַיִם | נוצר ג'ל אבל נראה נוקשה מאשר PBS 1x PBS ו 2x, עולה בקנה אחד | |||
| 30 | 6 | מַיִם | נוצר ג'ל אבל נראה נוקשה מאשר PBS 1x PBS ו 2x, עולה בקנה אחד | |||
| 40 | 2 | מַיִם | האם לא יוצר materi ג'ל / גומיאל | |||
| 40 | 3 | מַיִם | העקביות להשתנות לאורך המדגם - נוקשה על גבי | |||
| 40 | 6 | מַיִם | העקביות להשתנות לאורך המדגם - נוקשה על גבי | |||
גומי טבלת 3. BSA. לאחר גומי BSA הגיב O / N, חור ביופסיה של 8 מ"מ של המדגם נלקח. טבלה זו מכילה כמה תצפיות חזותיות של העקביות והמראה של דגימות.
מוסף באיור 1. אחוז מוצק. האחוז המוצק מכל גומי נקבע (משקל יבש / משקל רטוב). הממס לא השפיע על percentaGE של מוצקים (p> 0.05). אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
מוסף איור 2. גל סינוס של 30% BSA 3% glutaraldehyde 2x PBS. העומס דחיסה ועקירה של המדגם מוצגים כפונקציות של הזמן שחלף. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
מוסף איור 3. גל סינוס של 30% BSA 3% glutaraldehyde 2x PBS. את הלחץ ואת המתח של המדגם חושבו זממו כפונקציה של הזמן שחלף. ישנו פאזה קטן, אינדיcative של התנהגות viscoelastic של גומי. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
מוסף איור 4. מוצקים MASTERCAM. (א) Loop ו- (ב) יציבות חתיכות. לאחר תכנון MASTERCAM באמצעות אלה, הקוד G יובאה וחתיכת פלדה או פליז נירוסטה השימוש במכונה Microlution או חתיכת PLA באמצעות Replicator 3D Makerbot. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| גבולות | Min | מקס | ||
| -17 | 3 | | ||
| עקירה (מ"מ) | -1.5 | 0.3 | ||
| גַל | שלב 1 | רמה 2 | תדר (הרץ) | מַחזוֹר |
| סינוס | -15 | -3 | 1 | 5,000 |
| קליטת נתונים | ||||
| זמן סריקה | 1.008 | |||
| נקודות סריקה | 360 | |||
| מספר סריקות </ Td> | 5 | |||
| סריקה לאחר | 1.008 שניות בין סריקה | |||
מוסף לוח 1. פרמטרי בדיקות דחיסה. שימוש גל סינוס, קשר בין העומס והתזוזה נקבע עבור ארבעה סוגים של גומי. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| תוצאות ANOVA | |||||
| df | SS | גברת | F | המשמעות F | |
| נְסִיגָה | 3 | 9.85E + 02 | 3.28E + 02 | 4.70E + 02 | 1.06E-18 |
| שְׂרִידִי | 20 | 1.40E + 01 | 6.99E-01 | ||
| סה"כ | 23 | 9.99E + 02 | |||
| ניתוח רגרסיה | |||||
| מקדמי | שגיאה סטנדרטית | t Stat | P-value | ||
| לְעַכֵּב | 1.74E + 00 | 8.23E-01 | 2.12E + 00 | 4.70E-02 | |
| BSA (%) | 7.82E-01 | 2.09E-02 | 3.74E + 01 | 5.49E-20 | |
| Glutaraldehyde (%) | 3.17E-01 </ Td> | 1.03E-01 | 3.09E + 00 | 5.71E-03 | |
| מֵמֵס | 2.61E + 01 | 2.22E + 01 | 1.18E + 00 | 2.53E-01 | |
לוח מוסף 2. ניתוח סטטיסטי של אחוז מוצקי גומי BSA. ארגון ה- BSA ו glutaraldehyde השפיעו באופן משמעותי על האחוז המוצק. הממס לא השפיע על אחוז מוצקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| תוצאות ANOVA | |||||
| df | SS | גברת | F | המשמעות F | |
| נְסִיגָה | 3 | 3.06E + 05 | 1.02E + 05 | 1.18E + 01 | 4.00E-03 |
| שְׂרִידִי | 7 | 6.07E + 04 | 8.67E + 03 | ||
| סה"כ | 10 | 3.67E + 05 | |||
| ניתוח רגרסיה | |||||
| מקדמי | שגיאה סטנדרטית | t Stat | P-value | ||
| לְעַכֵּב | 6.50E + 02 | 4.25E + 01 | 1.53E + 01 | 1.23E-06 | |
| BSA (%) | 4.67E + 00 | 3.80E + 01 | 1.23E-01 | 9.06E-01 | |
| מֵמֵס | 1.02E + 02 | 3.80E + 01 | 2.67E + 00 | 3.20E-02 | |
| Glutaraldehyde (%) | 1.16E + 02 | 5.70E + 01 | 2.03E + 00 | 8.21E-02 | |
לוח מוסף 3. ניתוח סטטיסטי של מודולוס האלסטיות הקשורים ריכוז PBS. ריכוז PBS השפיע באופן משמעותי על מודולוס האלסטיות. הגידול של מלחים הממס גרם לעליית מודולוס אלסטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| תוצאת ANOVA | |||||
| df | SS | גברת | F | המשמעות F | |
| נְסִיגָה | 3 | 6.15E-15 | 2.05E-15 | 3.68E + 00 | 1.67E-02 |
| שְׂרִידִי | 60 | 3.34E-14 | 5.57E-16 | ||
| סה"כ | 63 | 3.96E-14 | |||
| ניתוח רגרסיה | |||||
| מקדמי | שגיאה סטנדרטית | t Stat | P-value | ||
| לְעַכֵּב | 3.74E-08 | 1.37E-08 | 2.74E + 00 td> | 8.03E-03 | |
| BSA (%) | 3.89E-10 | 3.62E-10 | 1.07E + 00 | 2.88E-01 | |
| Glutaraldehyde (%) | -5.92E-09 | 1.83E-09 | -3.23E +00 | 2.02E-03 | |
| מֵמֵס | -6.78E-08 | 3.76E-07 | -1.80E-01 | 8.58E-01 | |
לוח מוסף 4. ניתוח סטטיסטי של הקצב התגובה לאחר 15 שעות של מערכת עיכול אנזים. ריכוז glutaraldehyde השפיעו באופן משמעותי על קצב התגובה של מערכת העיכול של הגומי על ידי הפחתה בריכוזי glutaraldehyde גבוהים. אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.
| תוצאות ANOVA | |||||
| df | SS | גברת | F | המשמעות F | |
| נְסִיגָה | 3 | 7.36E-15 | 2.45E-15 | 3.62E + 01 | 1.21E-13 |
| שְׂרִידִי | 62 | 4.20E-15 | 6.78E-17 | ||
| סה"כ | 65 | 1.16E-14 | |||
| ניתוח רגרסיה | |||||
| מקדמי | שגיאה סטנדרטית | t Stat | |||
| לְעַכֵּב | 2.98E-08 | 4.77E-09 | 6.25E + 00 | 4.22E-08 | |
| BSA (%) | 4.56E-10 | 1.26E-10 | 3.62E + 00 | 6.03E-04 | |
| Glutaraldehyde (%) | -6.04E-09 | 6.15E-10 | -9.82E +00 | 3.00E-14 | |
| מֵמֵס | -6.57E-08 | 1.31E-07 | -5.02E-01 | 6.17E-01 | |
לוח מוסף 5. ניתוח סטטיסטי של קצב התגובה לאחר 24 שעות של מערכת עיכול אנזים. ריכוז BSA ו glutaraldehyde השפיע באופן משמעותי על קצב התגובה של מערכת העיכול של הגומי. בריכוזי glutaraldehyde גבוהים, יש ירידה ב tהוא קצב תגובה. בריכוזי BSA גבוהים, יש עלייה בשיעור התגובה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| תוצאות ANOVA | |||||
| df | SS | גברת | F | המשמעות F | |
| נְסִיגָה | 3 | 3.10E-15 | 1.03E-15 | 2.74E + 01 | 1.64E-11 |
| שְׂרִידִי | 64 | 2.42E-15 | 3.78E-17 | ||
| סה"כ | 67 | 5.52E-15 | |||
| ניתוח רגרסיה | |||||
| מקדמי | שגיאה סטנדרטית | t Stat | P-value | ||
| לְעַכֵּב | 2.17E-08 | 3.50E-09 | 6.20E + 00 | 4.55E-08 | |
| BSA (%) | 2.13E-10 | 9.20E-11 | 2.31E + 00 | 2.39E-02 | |
| Glutaraldehyde (%) | -3.94E-09 | 4.53E-10 | -8.70E +00 | 1.90E-12 | |
| מֵמֵס | 3.04E-08 | 9.57E-08 | 3.18E-01 | 7.51E-01 | |
לוח מוסף6. ניתוח סטטיסטי של קצב התגובה לאחר 48 שעות של מערכת העיכול אנזים. הריכוז BSA ו glutaraldehyde השפיע באופן משמעותי על קצב התגובה של מערכת העיכול של גומי. בריכוזי glutaraldehyde גבוהים, יש ירידה בשיעור התגובה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| תוצאות ANOVA | |||||
| df | SS | גברת | F | המשמעות F | |
| נְסִיגָה | 3 | 2.19E-15 | 7.29E-16 | 3.05E + 01 | 3.56E-12 |
| שְׂרִידִי | 61 | 1.46E-15 2.39E-17 | |||
| סה"כ | 64 | 3.64E-15 | |||
| ניתוח רגרסיה | |||||
| מקדמי | שגיאה סטנדרטית | t Stat | P-value | ||
| לְעַכֵּב | 1.05E-08 | 2.84E-09 | 3.69E + 00 | 4.80E-04 | |
| BSA (%) | 3.61E-10 | 7.48E-11 | 4.83E + 00 | 9.48E-06 | |
| Glutaraldehyde (%) | -3.07E-09 | 3.69E-10 | -8.33E +00 | 1.21E-11 | |
| כךlvent | 3.97E-08 | 7.80E-08 | 5.09E-01 | 6.12E-01 | |
לוח מוסף 7. ניתוח סטטיסטי של קצב התגובה לאחר 72 שעות של מערכת עיכול אנזים. ריכוז BSA ו glutaraldehyde השפיע באופן משמעותי על קצב התגובה של מערכת העיכול של הגומי. בריכוזי glutaraldehyde גבוהים, יש ירידה בשיעור התגובה. בריכוזי BSA גבוהים, יש עלייה בשיעור התגובה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biofabrication הוא שדה רב תחומית ביותר שבו עקרונות הביולוגיה וההנדסה למזג ליצור בחומרים מורכבים המחקות רקמות הילידים. כדי להשיג זאת, יש צורך לפתח טכניקות להשתמש במידע שנאסף רקמות in vivo ולתרגמו פיגום חוץ גופית. בדרך זו, פלטפורמה יכולה להיות מהונדסת דומה המאפיינים האדריכליים, פונקציונליים, מכאניים של רקמת vivo. חומר הפיגומים האופטימלי צריך להחזיק מאפיינים מסוימים, כגון להיות ביולוגי, לחקות את התכונות המכאניות של הרקמות של עניין, להיות מסוגל שפלה נשלטה, מסוגל לתמוך כדאיויות תא, ומסוגל המאפשר רקמות שיפוץ 2,3.
שפע של טכניקות ייצור פותח כדי ליצור קיימא, בונה תלת ממדי. טכנולוגיות אלה מתחלקים לשתי קטגוריות עיקריות: קונבנציונליד מתקדם. הטכניקות הקונבנציונליות כוללות שימוש בחומרים מסורתי סינטטי וטבעי להכנת מבנים נקבובית. כמה דוגמאות הן ממס הליהוק, להקפיא ייבוש, וממיסים דפוס. חסרונות של טכניקות אלה כוללים בקרה לקויה של נקבובי בתוך מבנה (גודל נקבוביים גומלין נקבובי) וקושי ביצוע ערוצים פנימיים בתוך הפיגומים. טכניקות מתקדמות כוללות stereolithography, דפוס, הדפסה 3D, electrospinning, בין היתר 1. יש טכניקות אלו חסרונות כגון היעדר ערוצי ארכיטקטורה ארוך טווח, בחירת החומרים לספק חוזק מכאני אופטימלי בעת היותו מסוגל מחלק דרך חרירים בקוטר קטן, אופטימיזציה תלויה בחומר, דורש שלאחר העיבוד נרחב שעשוי להיות רעילות, הגבלה בעיצוב של ארכיטקטורות פנימיות בתוך מבנה במבחנה. חסרון העיקרי בהדפסת 3D הוא זמינות של חומרים ביולוגיים כי הם נישאים קליטים מספיק, בעוד גם בעל תכונות מכאניות נדרשות לשמור על ארגון אדריכלי מוגדר 12. הטכנולוגיה המוצגת כאן משלבת הוא טכניקות ייצור קונבנציונליות ומתקדמות. הטוב משני העולמים נגזר ההתכנסות של ייצור אוטומטי ליצור, או לייבא, ארכיטקטורה הרצויה עם ההתפתחות של גומי אנזים-יציב. תבניות הנירוסטה נוצרו באמצעות מכונת כרסום, אבל הייצור שלהם אינו מוגבל טכניקה זו. באמצעות מדפסת 3D (למשל, Makerbot), אותה התבניות היו מפוברק מחומצת polylactic (PLA). התבניות השליליות נטחנו באמצעות הנחיות אדריכליות שתוכננו על ידי התכנית CAD, המספקת תבניות מוצקות שיוצרות העברה נוחה והאמינה של תכונות לכל חומר. הטכנולוגיה זו היא משמעותית כי היא מאפשרת לא רק את השליטה על רכב הרקמות החיצוני, אלא גם של הארכיטקטורה הפנימית המורכבת ביותר. העבודה מוצגת כאןמתמקד בעיקר על האפיון של גומי BSA, אשר יכול להיות מעורבים בצורה הומוגנית, מתעכל בקלות כמות של זמן סביר, היה עמיד בפני שינויים במבנה שלה, והוא מסוגל לחקות תכונות דקות, כשהוא אוחז את יציבותו במהלך תהליך הליהוק . המגבלה של שיטה זו נוסתה ואת ברזולוציה של חומר ההקרבה יכולה לשמור ממדים קטנים כמו 300 מיקרומטר קוטר. עם זאת, איור 7 עולה כי הערוץ מוקף שכבה דקה של סוכן לשחרר עובש. באמצעות מיקרוסקופ, השטח הנוסף הזה הוא להבחין בבירור וניתן להסירו כדי שהמאפיין הרצוי. טכניקת biofabrication זו מאפשרת שכפול של מגוון רחב של מבנים פנימיים אשר נעו בין המקרו אל המיקרו.
אלבומין הוא החלבון הנפוץ ביותר של מערכת הדם. כיוון שהחלבונים הם polyelectrolytes, מסיסות נקבע על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות 15-17. הוכיח כי בריכוזי מלח נמוכים, קיים מלוח-שבתוקף חלבון הקלת מסיסותו 18. Glutaraldehyde הוא סוכן crosslinking הגורמת לשינויים המאפיינים של אלבומין. שינוי הצבע שניתן לראות באיור 1 מיוחס ההיווצרות של קשרי aldimine 19-21. Glutaraldehyde מגיב בעיקר עם BSA דרך קבוצות אמינו של ליזין כדי ליצור את קשרים קוולנטיים מולקולאריים 14. הנתונים מצביעים כי העלייה של מלחים שיפר את האלסטיות של הגומי (מ PBS 1x ל 2x PBS). ריכוז glutaraldehyde גבוה יותר מפיקת ג'לים נוקשה כי להגדיר קודם לכן לעומת אלה ריכוז נמוך. עם זאת, הם יותר קשה לוותר, לערבב homogenously, והם יוצרים ג'ל שביר. כדי לספק את הכמות המתאימה של גומי BSA לתוך תבניות, כל חלק של ההרכבה חייב להישמר בקירור בגלל טמפרטורות גבוהות להאיץ את glutaraldehyde ותגובת BSA.הגומי האידיאלי (30% BSA 3% glutaraldehyde ב 2x PBS או 1x PBS) מתנהג כחומר viscoelastic שיכולים לעמוד להיטען מבלי לעוות לצמיתות. זה הופך להיות חשוב מאוד בעת טיפול ליהוק חומר סביב מבנה גומי BSA.
טריפסין הוא פרוטאז סרין כי hydrolyzes חלבונים. טריפסין הוא אנזים בשימוש נרחב שיש לו ייחוד מחשוף גבוה. וחותך את שרשרות פפטיד בעיקר בצד carboxyl של ליזין חומצות אמינו ארגינין 22. BSA הוא מסיס בקלות בריכוזים נמוכים במים, ואת טריפסין בקלות מתעכל הגומי BSA עוזב את הקולגן שלם ללא פגע יחסית. החומר לא יהיה שום קשר עם תאים. הבונה נבדק לנוכחות של glutaraldehyde חינם ולא היו עקבות של מקבע זה. זה מדגים את היעילות של גומי BSA כחומר הקרבה עבור biofabrication. בפרוטוקול זה, קולגן שימש כחומר פיגום, אבל כל otהחומר שלה כי הוא עמיד בפני העיכול טריפסין יוכל לשמש.
עבודה עתידית תהיה ממוקדת על reconstituting מרכיבי כלי הדם בתוך הידרוג ידי זריעת הפיגום עם תאי אנדותל פיברובלסטים. אחד האתגרים הוא ליצור התפלגות אחידה של תאים ברחבי הפנימי של ערוצי המחקים חלוקת 3D הילידים. כדי לטפל בבעיה זו, אסטרטגיה מפותחת המאפשרת האטים או חיבור של הערוצים ואת הזריקה של השעית תא. החומר נבדק הוא F127 pluronic, אשר הוא ג'ל thermoreversible, נוזלים ב 4 ° C ו- מוצקים מעל 30 מעלות צלזיוס 23,24. ריכוז גבוה של pluronic הצליחה ליצור את החותם הזמני הכרחי. לאחר ההשעיה תא הוא בתוך ערוצי הפיגום, הישות מסובבת עבור סכום מסוים של זמן עד שהתאים לדבוק כל הצדדים של המבנה 3D. הערוץ בתוך יצטרך תקשורת נאותה לשמירההישרדות התא. Pluronic שומרת בצורת ג'ל שלה הוא מסיס בקלות בסביבה מימית. ברגע שתאים לדבוק, הידרוג יוצף תקשורת, והוא יכול להיות מתורבת בתנאים נייחים או זרימה, בהתאם למטרת המחקר. מתודולוגיה זו תיבחן נוסף ותיהפך מעקב לפרסום זה. טכניקת biofabrication המתוארת כאן כרגע נמצאת בשימוש לפתח העתק פיגום של עורק כליה אנושית. אותה הגישה יכול גם להתבצע עם סוגים אחרים של רקמות, כגון לב, להרחיב את התחולה של טכניקה זו למגוון רחב של יישומים קליניים.
טכניקת biofabrication שפותחה כאן הוא צעד קדימה בדור של פיגומים חוץ גופייה שיכולה לשחזר תכונות גיאומטריות מהותיות במהירות ובאופן אמין. חומר טבעי, כגון קולגן, נבחר משום שהיא מציעה כימי אופטימלי או פיסיקלי לתאים פני חומרים סינטטיים. אלה נהחומרים טוראל יכול לשמש לצורכי מחקר רפואי, כמו במבחנה מודלים של פיתוח, מום, ורקמות המחלה, כמו גם להחלפת רקמות פגועות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen type I | Collagen extracted from calf hide | ||
| Hydrocloric Acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) | MP Biomedical | U5378 | 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS |
| Albumium from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Glutaraldehyde | Sigma -Aldrich | G5882 | Toxic |
| Lard | Fields | 3090 | |
| Stainless Steel Molds | Milled using Microlution Machine | ||
| Air Brush Kit | Central Pneumatic | 47791 | |
| Mixing Tip for double syringe | Medmix | ML2.5-16-LLM | Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med |
| Small O ring for double syringe | Medmix | PPB-X05-04-02SM | Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural |
| Double Syringe cap | Medmix | VLX002-SM | Cap, 4:1/10:1, PE brown, med |
| Big O ring for double syringe | Medmix | PPA-X05-04-02SM | Piston A, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe | Medmix | SDL X05-04-50M | Double syringe, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe Dispenser | Medmix | DL05-0400M | Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain |
| Laminim | 3.6 mg/ml - extracted USC lab | ||
| 20 ml Syringe Luer Lock Tip | BD | 302830 | |
| Luer Lock Caps | Fisher | JGTCBLLX | |
| HEPES | Sigma -Aldrich | H4034 | |
| Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) | Life Technologies | 1143-030 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 | |
| UV Crosslinker | Spectroline UV | XLE1000 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Fisher | S271-10 | To prepare Mosconas |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma -Aldrich | P5405-250 | To prepare Mosconas |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328-500 | To prepare Mosconas |
| Glucose | Sigma -Aldrich | G-8270 | To prepare Mosconas |
| Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S-7907 | To prepare Mosconas |
| Sterile Filter for syringes | Corning | 431224 |
References
- Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
- Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
- Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
- Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
- Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
- Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
- Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
- Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
- Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
- Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
- Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
- Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
- Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
- Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
- Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
- Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723 (2012).
- Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).
