Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

तीन आयामी Biomimetic प्रौद्योगिकी: उपन्यास Biorubber कोलेजन hydrogels में निर्धारित सूक्ष्म और स्थूल पैमाने आर्किटेक्चर बनाता है

Published: February 12, 2016 doi: 10.3791/53578
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Surgery - Division of General Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Chemical Engineering, University of South Carolina

Abstract

ऊतक scaffolds ऊतक उत्थान की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आदर्श पाड़ ऐसे होने उचित संरचना, लक्षित मापांक, और अच्छी तरह से परिभाषित स्थापत्य सुविधाओं के रूप में कई आवश्यकताओं को पूरा करना चाहिए। Biomaterials कि इन विवो ऊतक के आंतरिक वास्तुकला पुनरावृत्ति बीमारियों के अध्ययन के साथ ही खो दिया है और विकृत नरम ऊतक के उत्थान की सुविधा के लिए के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक उपन्यास biofabrication तकनीक विकसित की गई है जो अनुसंधान और नैदानिक ​​आवेदन के लिए biomaterials की एक नई पीढ़ी तैयार करने के लिए कला इमेजिंग, तीन आयामी (3 डी) मुद्रण, और चयनात्मक enzymatic गतिविधि के राज्य को जोड़ती है। विकसित सामग्री, गोजातीय सीरम albumin रबर, एक साँचे में ढालना है कि विशिष्ट ज्यामितीय सुविधाओं में इंजेक्शन की पुष्टि की प्रतिक्रिया होती है। इस यज्ञ सामग्री एक प्राकृतिक पाड़ सामग्री के स्थापत्य सुविधाओं की पर्याप्त हस्तांतरण की अनुमति देता है। प्रोटोटाइप 4 और 3 मिमी चैनलों कि रेपर साथ एक 3 डी कोलेजन पाड़ के होते हैंएक branched वास्तुकला ESENT। इस पत्र प्राकृतिक निर्माणों की पीढ़ी के लिए इस biofabrication तकनीक के उपयोग पर जोर दिया। इस प्रोटोकॉल एक कंप्यूटर एडेड सॉफ्टवेयर (सीएडी) एक ठोस ढालना जो बीएसए रबर रबर के enzymatic पाचन के द्वारा पीछा के साथ इंजेक्शन प्रतिक्रिया होगी पाड़ सामग्री के भीतर इसकी स्थापत्य सुविधाओं के निर्माण के लिए छोड़ रहा है, का इस्तेमाल करता है।

Introduction

ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में ऊतक scaffolds के निर्माण की क्षमता महत्वपूर्ण है। एक उपयुक्त ऊतक पाड़ एक 3 डी संरचना है, biocompatible सामग्री से बना है, और इन विवो ऊतक वास्तुकला में mimics सेल और ऊतक विकास और remodeling की सुविधा के लिए। इस पाड़ पोषक तत्वों के परिवहन और कचरे को हटाने की 1-4 की अनुमति मिलनी चाहिए। इन scaffolds के उत्पादन में मुख्य बाधाओं में से एक एक biocompatible सामग्री में विशिष्ट ज्यामितीय सुविधाओं पुनरावृत्ति करने की क्षमता है। कई biofabrication तकनीक इन scaffolds के ज्यामितीय सुविधाओं को नियंत्रित करने के लिए सूचित किया गया है, उदाहरण 5-8 electrospinning कर रहे हैं, विलायक के कास्टिंग 9, स्टीरियोलिथोग्राफी 10, और 3 डी मुद्रण 11, दूसरों के बीच में। इन तकनीकों में चलाया आंतरिक और बाह्य स्थापत्य सुविधाओं की एक अपेक्षाकृत आसान हस्तांतरण प्रदान करने में कम होना, महंगा है, उनके संकल्प और printability (द्वारा सीमित कर रहे हैं 12 का उत्पादन करने की एक लंबी अवधि की मांग की आवश्यकता होती है।

कई वाणिज्यिक निर्माण प्रणालियों में, आंतरिक शून्यता, चैनल, और सुविधाओं के निर्माण के लिए रेत या अन्य उपयुक्त हटाने योग्य या बलि सामग्री का उपयोग कर हासिल की है। धातु या प्लास्टिक हिस्सा रेत मोल्ड के आसपास का गठन किया जाता है, और एक बार यह जम जाता है, रेत निकाल दिया जाता है। बहुत इसी तरह, biomaterials की अगली पीढ़ी biosand बराबर की जरूरत है। इसलिए, बीएसए रबर biosand के लिए एक विकल्प के रूप में विकसित किया गया था। बीएसए रबर एक नव तैयार की सामग्री है कि गोजातीय सीरम albumin glutaraldehyde साथ crosslinked के होते है। अंतिम लक्ष्य एक biodegradable कोलेजन पाड़ में विशिष्ट स्थापत्य सुविधाओं विश्राम करने के लिए है। बलि biorubber कि मूल ऊतक के आचारण के साथ आयामी निष्ठा का कहना है की विशेषताओं का वर्णन किया जाता है।

इन विवो ऊतक लोच और ब्याज के ऊतकों की अन्य विशेषताओं की नकल करने देखते जा सकता है के साथ एक अपेक्षाकृत आसान है और समय पर मामले में एक biodegradable सामग्री के लिए एक विशिष्ट ज्यामितीय शिक्षाप्रद देने के लिए प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. कोलेजन बैच में एसएनएफ का प्रतिशत निर्धारित

  1. एक पहले प्रकाशित प्रक्रिया 13 निम्नलिखित कोलेजन निकालें। कोलेजन के 20 मिलीलीटर की एक न्यूनतम गला लें। आदेश का गठन हाइड्रोजेल में कोलेजन एकाग्रता में हेरफेर करने में बैच में कोलेजन ठोस का प्रारंभिक प्रतिशत निर्धारित करते हैं।
    1. एल्यूमीनियम पन्नी (लगभग 6 x 6 सेमी) के तीन टुकड़े काटें और एक 25 मिलीलीटर बीकर के नीचे का उपयोग करके एक पैन के रूप में प्रत्येक एक आकृति। प्रत्येक पैन के वजन रिकॉर्ड।
    2. प्रत्येक पैन के लिए कोलेजन की एक छोटी राशि जोड़ सकते हैं और एल्यूमीनियम पैन और कोलेजन के कुल वजन का रिकॉर्ड है। प्रत्येक एल्यूमीनियम पैन पर कोलेजन की 0.8 ग्राम - 0.5 जोड़ें।
      नोट: इस कदम के बाद, वहाँ तीन एल्यूमीनियम पन्नी धूपदान हैं और हर एक कोलेजन की एक छोटी मात्रा में होना चाहिए। प्रत्येक (कुल 3) खाली एल्यूमीनियम पैन के वजन और कोलेजन के बाद इसके अलावा पैन के वजन को दर्ज करने के लिए सुनिश्चित करें।
    3. एफ का उपयोग कर प्रत्येक पैन में कोलेजन के वजन की गणनाollowing सूत्र:
      कोलेजन वजन = पान और कोलेजन वजन - पान वजन
    4. तीन एल्यूमीनियम धूपदान है कि 24 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में कोलेजन पकड़ रखें।
    5. 24 घंटे के बाद, प्रत्येक एल्यूमीनियम पैन के वजन और निर्जलित कोलेजन रिकॉर्ड है।
    6. निर्जलित कोलेजन निम्न समीकरण का उपयोग के वजन की गणना:
      निर्जलित कोलेजन वजन = पान और निर्जलित कोलेजन वजन - पान वजन
    7. ठोस के प्रतिशत की गणना तीन नमूने नीचे सूत्र का उपयोग कोलेजन ठोस एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए:
      2 समीकरण
    8. बैच तीन नमूने से प्रत्येक के लिए कोलेजन ठोस प्रतिशत का उपयोग कर की औसत कोलेजन ठोस सामग्री की गणना।
      नोट: कोलेजन कि इस्तेमाल किया जाएगा क्या हाइड्रेटेड कोलेजन के लिए छोड़ दिया जाता है। निर्जलित कोलेजन से कोई भी इस्तेमाल किया जाएगा।
    9. कोलेजन ठोस (मैं का प्रतिशत निर्धारित करने के बादबैच के nitial कोलेजन एकाग्रता), शेष हाइड्रेटेड कोलेजन का उपयोग जारी है। 3 करने के लिए कोलेजन बैच के पीएच को समायोजित करने के लिए एक calibrated पीएच मीटर का प्रयोग करें।
      1. 12 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के (एक समय में 2-5 μl) छोटी मात्रा में जोड़ें। हर समय बर्फ पर रखें। कोलेजन के लिए सीधे हाइड्रोक्लोरिक एसिड न जोड़ें - ट्यूब की ओर करने के लिए एसिड जोड़ें। एसिड जोड़ने के बाद, कोलेजन को एसिड पुश करने के लिए रंग का उपयोग करें और जल्दी मिश्रण हलचल।
    10. एक बार जब यह 3 का पीएच पहुंचता है, कोलेजन बैठते हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर करते हैं।

2. बीएसए रबड़ की तैयारी

  1. गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) समाधान के नीचे सूचीबद्ध प्रक्रिया के बाद तैयार करें।
    1. 2x फॉस्फेट खारा बफर समाधान (पीबीएस) तैयार करें। पानी की 100 मिलीलीटर के लिए दो पीबीएस गोलियाँ जोड़े 0.02 एम पीबीएस समाधान बनाने के लिए।
    2. एक 30% BSA समाधान के नीचे सूचीबद्ध प्रक्रिया का उपयोग कर बनाने के लिए 2x पीबीएस के साथ बीएसए का मिश्रण।
      1. उदाहरण के लिए, 2x पीबीएस के 30 मिलीलीटर के साथ एक 30% बीएसए बनाने के लिए बीएसए की 12.9 जी का उपयोग करें। 2x पीबीएस (जैसे, 10 एमएल) का 1/3 हलचल पट्टी के साथ एक फ्लास्क में जोड़े। बीएसए (जैसे, 6.45 छ बीएसए) फ्लास्क का 1/2 जोड़ें और एक रंग का उपयोग कर, शुष्क घुला हुआ गीला।
      2. सभी घुला हुआ जब तक पीबीएस और उसके बाद बीएसए को जोड़ने की इस प्रक्रिया को दोहराएं और विलायक कुप्पी में है। सभी घुला हुआ गीला करने के लिए रंग का प्रयोग करें। यह कुछ तरल और झुरमुटों के एक मिश्रण की तरह दिखेगा। यह लगभग 30 मिनट के लिए बैठते हैं।
      3. फिर, एक कम चक्र पर दोषी की बारी है और यकीन है कि हलचल पट्टी के आसपास कोई झुरमुटों देखते हैं कि सुनिश्चित करें। यह 90 मिनट ले समाधान में सब कुछ पाने के लिए करना चाहिए या यह 4 डिग्री सेल्सियस पर सरगर्मी हे / एन छोड़ा जा सकता है। बाद घुला हुआ पदार्थ सभी भंग कर रहा है, एक 20 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान जगह और एक 0.20 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ छाया हुआ है। फिल्टर के माध्यम से तरल निष्कासित और एक नया ट्यूब में निष्फल समाधान इकट्ठा करने के लिए सवार दबाएँ। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    3. 3% glutaraldehyde soluti तैयारबाँझ फ़िल्टर 2x पीबीएस के साथ 25% glutaraldehyde समाधान गिराए द्वारा पर। उदाहरण के लिए, 3% glutaraldehyde समाधान के 10 मिलीलीटर के लिए, 25% glutaraldehyde के 2 मिलीलीटर और 2x पीबीएस के 8 मिलीलीटर का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

3. Molds उपचार

नोट: प्रोटोटाइप इस पत्र में वर्णित एक कस्टम बनाया स्टेनलेस स्टील Y ढालना टुकड़ा उपयोग करता है। मोल्ड इनफ्लो और के 4 और 3 मिमी, क्रमशः दो बहिर्वाह चैनल शामिल हैं। सबसे पहले, स्वच्छ नए नए साँचे, उन्हें असंतृप्त चरबी के साथ स्प्रे, और उन्हें बाँझ। नीचे वर्णित प्रक्रिया के बाद नए नए साँचे तैयार करें।

  1. साफ स्टेनलेस स्टील 35 kHz के एक आवृत्ति पर sonicator का उपयोग कर नए नए साँचे। sonicator में नए नए साँचे रखें और उन्हें पानी और बर्फ के साथ डूब। जबकि sonicator चल रहा है हर समय ठंड के नए नए साँचे रखें। 90 मिनट की अवधि के लिए 2 sonicator चलाएँ।
    1. प्रत्येक अवधि के बाद, सुनिश्चित करें Luer में कोई सामग्री ताला स्टेनलेस स्टील या ख है कि वहाँ बनाने के लिए एक सुई का उपयोगrass कनेक्टर। नए नए साँचे के दो पहलू की पूरी सतह को साफ करने के लिए साबुन और पानी का प्रयोग करें। सत्यापित करें चैनलों में कोई रुकावट नहीं है।
  2. एक आटोक्लेव बैग में नए नए साँचे, शिकंजा, और Luer ताला कनेक्टर प्लेस और यह आटोक्लेव।
  3. बोतल है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चरबी (मिश्रित फैटी एसिड रिलीज एजेंट) के साथ एक हवाई स्प्रेयर आधे रास्ते करने के लिए देता भरें। एक नियमित रूप से टोपी की बोतल के साथ टोपी की जगह। यह एक आटोक्लेव बैग में रखें और इसे आटोक्लेव।
    नोट: चिकना सामग्री है कि बाद में इंजेक्शन प्रतिक्रिया हो जाएगा (बीएसए रबर) की रिहाई की सुविधा के लिए प्रयोग किया जाता है। autoclave- में स्प्रेयर बोतल ढक्कन जगह यह आंतरिक मुहर नुकसान पहुंचा सकता है मत करो।
  4. 45 सेकंड के लिए या अपनी स्पष्ट और एक माइक्रोवेव में जब तक तरल चरबी गर्म। चरबी बोतल के ढक्कन हवा स्प्रेयर भाड़ में। स्प्रेयर के साथ ढक्कन कनेक्ट करें। प्रयोगशाला बेंच पर हवा स्रोत को स्प्रेयर संलग्न। हवा वाल्व खोलने, और स्प्रेयर की नोक समय तक खुला है यह सतह गीला शुरू होता हैएक कागज तौलिया का।
  5. मिट्टी की सतह के लिए सीधा चरबी स्प्रे जब तक सतह पूरी तरह से कवर किया जाता है। बाद प्रत्येक टुकड़ा छिड़काव किया गया है, उनमें एक पेट्री डिश में डाल दिया है और इसे सील। 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नए नए साँचे रखें।
  6. 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के लिए सतह को उजागर द्वारा नए नए साँचे बाँझ लिए आगे बढ़ें। उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर वापस प्लेस, जब तक वे प्रतिक्रिया इंजेक्शन जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं।

4. बीएसए रबड़ की प्रतिक्रिया इंजेक्शन

नोट: सभी सामग्री और समाधान ठंड का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक अगले चरणों में बीएसए रबर के समय से पहले की स्थापना को रोकने के लिए रख दिया जाना चाहिए।

  1. इन चरणों का पालन करने के लिए नए नए साँचे बीएसए रबर पहुंचाने के लिए निकालने की मशीन तैयार करें।
    1. मिश्रण घटकों के सभी जीवाणुरहित (दो हे अंगूठियां, सिरिंज टोपी, डबल सिरिंज, टिप मिश्रण, और 4: 1 की मशीन) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) हुड में 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के लिए उन्हें उजागर करके।
      नोट: एक पीसीआर हुड क्योंकि टी इस्तेमाल किया गया थाउसकी प्रक्रिया fixatives शामिल है। इन रसायनों जोखिम और कोशिकाओं को विषाक्तता के जोखिम के कारण सेल / टिशू कल्चर हुड में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। किसी भी अन्य हुड कि एक पराबैंगनी प्रकाश में शामिल उपयुक्त हो जाएगा।
    2. समाधान धारक पर टिप टोपी रखें।
    3. बीएसए की: 1 के अनुपात: एक 4 पर मिश्रण और इंजेक्शन प्रदर्शन glutaraldehyde। डबल सिरिंज चैम्बर कि समाधान की सबसे अधिक राशि वितरित करेंगे करने के लिए 30% बीएसए जोड़ें (यह लगभग 4 मिलीलीटर ले भरने के लिए) होगा। पर्याप्त जगह छोड़ने के लिए आदेश सटे कक्ष के ढेर और प्रदूषण को रोकने के लिए हे अंगूठी जगह सुनिश्चित करें।
    4. अन्य चैम्बर के लिए 3% glutaraldehyde समाधान जोड़ें (इसके बारे में 1 मिलीलीटर ले भरने के लिए) होगा। पर्याप्त जगह छोड़ने के लिए हे अंगूठी जगह से सटे कक्ष के ढेर और प्रदूषण को रोकने के लिए सुनिश्चित करें।
    5. निकालने की मशीन पर डबल सिरिंज रखें। विधानसभा खड़ी झुकाव इतना है कि सिरिंज टोपी शीर्ष पर है। मिश्रण टिप के साथ टोपी की जगह।
    6. सुप्रीम कोर्टदो स्टेनलेस स्टील ढालना टुकड़े को एक साथ REW।
    7. विधानसभा एक आटोक्लेव बैग के अंदर रखें।
    8. मशीन में किसी भी हवा निकालने के लिए, ईमानदार स्थिति में पकड़ और जल्दी से संभाल एक बार glutaraldehyde के साथ मिश्रित बीएसए की एक छोटी राशि जारी करने के लिए निचोड़। तो जल्दी से सिरिंज टिप करने के लिए स्टेनलेस स्टील Y मोल्ड के Luer ताला कनेक्टर देते हैं।
    9. बाएं हाथ और सही पर बीएसए glutaraldehyde मिश्रण मशीन के साथ स्टेनलेस स्टील Y ढालना पकड़ो। वैकल्पिक आटोक्लेव बैग के पक्षों के निकास दबाने यकीन अंदर रिक्तियों समाधान के साथ भर रहे हैं बनाने के द्वारा बहिर्वाह चैनलों के बाएँ और दाएँ निकास से प्रत्येक को कवर। फिर, नए नए साँचे क्षैतिज जगह और फिर इंजेक्षन।
    10. एक 25 मिमी पेट्री डिश में औषधि और जगह से नए नए साँचे को अलग करें।
    11. रबर के निर्जलीकरण को रोकने के लिए पेट्री डिश के आसपास Parafilm रखें।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज हे / एन में ढालना रखें।

नोट: कोलेजन प्रक्रिया के दौरान सभी समय पर बर्फ पर रखा जाना चाहिए।

  1. कोलेजन ठोस प्रतिशत का उपयोग कर कोलेजन एकाग्रता को संशोधित करें।
    1. ठंडे पानी के साथ प्रारंभिक कोलेजन एकाग्रता का समायोजन करके 1.75% कोलेजन के 10 मिलीलीटर बनाओ।
    2. एक calibrated पीएच मीटर का प्रयोग, 12 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करने के लिए 3 पीएच को समायोजित। कोलेजन से सीधे हाइड्रोक्लोरिक एसिड न जोड़ें ट्यूब की ओर करने के लिए एसिड जोड़ें। एसिड जोड़ने के बाद, कोलेजन में एसिड पुश करने के लिए रंग का उपयोग करें और जल्दी मिश्रण हलचल।
    3. एक अलग शंक्वाकार ट्यूब में कोलेजन के 4 ग्राम वजन।
    4. कोलेजन अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस और 20-30 मिनट के लिए 9343 XG पर हवा निकालने के लिए।
    5. यूवी 30 मिनट के लिए सेल संस्कृति हुड बाँझ, और 4 मिलीलीटर कोलेजन को laminin के 14 μl जोड़ें। यह 10 माइक्रोग्राम / μl के अंतिम laminin एकाग्रता में परिणाम होगा। नोट: Laminin रों प्रदान करता हैtructural अखंडता, आसंजन, और विभिन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देता है।
    6. मुड़ें नसबंदी के लिए हुड उपयोग करने से पहले पीसीआर यूवी 20-30 मिनट के लिए पर प्रकाश।
    7. Luer ताला टोपी की जगह, एक 2 घंटे के लिए इथेनॉल में एक 20 मिलीलीटर सिरिंज को देते हैं। तो फिर, यह सूखी और पराबैंगनी प्रकाश में जगह के लिए अनुमति देते हैं।
    8. गामा 8.6 मिनट के लिए कोलेजन चमकाना 1,200 cGy तक पहुंचने के लिए।
      नोट: समय सीज़ियम स्रोत के क्षय पर निर्भर करेगा। समय में एक ही खुराक तक पहुँचने के लिए समायोजित करें।

बीएसए रबर पर कोलेजन 6.Casting

  1. 1: 1 के अनुपात (कोलेजन: HEPES: सदस्य) कोलेजन भाजन करने के लिए, एक 8 का उपयोग करें। निम्नलिखित प्रक्रिया अम्लीय कोलेजन (चरण 5.1.8 से) की एक प्रारंभिक 4 जी पर आधारित है।
    1. पानी में एक 0.2 एन HEPES समाधान करें, और छोटे (1-5 μl) 1-5 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) समाधान की मात्रा जोड़कर 9 पीएच को समायोजित करें। एक calibrated पीएच मीटर का उपयोग करना, इसके अलावा एक के बाद समाधान के पीएच की निगरानी। 4 डिग्री सेल्सियस या Ke पर स्टोरबर्फ पर ईपी।
    2. 20-30 मिनट के लिए टिशू कल्चर हुड की पराबैंगनी प्रकाश को चालू हुड बाँझ।
    3. आटोक्लेव संदंश, रंग, और नसबंदी के लिए छुरी।
    4. 0.2 एन HEPES (पीएच 9) और 1.5 10x सदस्य मिलीलीटर टिशू कल्चर हुड का उपयोग कर के 1.5 मिलीलीटर मिक्स। उपयोग करने से पहले 5 सेकंड के लिए बर्फ और यह भंवर पर रखने के लिए सुनिश्चित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या बर्फ पर रहते हैं।
    5. पीसीआर हुड बाँझ करने के लिए, 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश पर बारी।
    6. एक 12 अच्छी तरह से थाली और -20 डिग्री सेल्सियस में एक 20 मिलीलीटर सिरिंज 10 मिनट के लिए जगह है, या तैयार है जब तक जारी रखने के लिए। नोट: उपयोग के लिए तैयार है जब तक सभी सामग्री ठंडा रखें। तापमान में वृद्धि के लिए समय से पहले कोलेजन fibrillogenesis लाती है।
    7. सभी ट्यूबों और अच्छी तरह प्लेटें कि 70% इथेनॉल के साथ हुड में हो सकता है और उन्हें नसबंदी के लिए सूख जाने के लिए जा रहे हैं स्प्रे। एक 20 मिलीलीटर सिरिंज बर्फ पर बाद में उपयोग के लिए शांत करने के लिए रखें।
    8. पीसीआर हुड में, बीएसए रबर और एक छुरी का उपयोग कर जारी करने के लिए स्टेनलेस स्टील के नए नए साँचे खोलने बीएसए आर के निकास चैनलों में कटौतीubber ढालना।
    9. पीसीआर हुड के तहत, बाँझ कोलेजन नलियों को खोलने और HEPES सदस्य समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने (यह सुनिश्चित कर लें कि HEPES सदस्य समाधान निकालने, कि यह अच्छी तरह से मिला है और वहाँ कोई ठोस जमा करने से पहले)।
    10. बाँझ रंग का उपयोग करना, अच्छी तरह से कोलेजन और बफर समाधान मिश्रण।
    11. बंद और भंवर इसे जल्दी से एक अच्छी तरह से मिश्रित हाइड्रोजेल सुनिश्चित करने के लिए।
    12. एक ठंडा 20 मिलीलीटर सिरिंज के लिए स्थानांतरण।
    13. एक हाथ से, अच्छी तरह से अंदर बीएसए रबड़ पकड़ और अन्य का उपयोग कर अच्छी तरह से नीचे पर कोलेजन हाइड्रोजेल समाधान के आधे बांटना।
    14. बाँझ चिमटी का प्रयोग, यह सुनिश्चित करें कि रबर प्रवाह और बहिर्वाह सिरों के पक्ष में अच्छी तरह छू रहे हैं।
    15. रबर के शीर्ष पर कोलेजन समाधान डालो जब तक पूरी तरह से कवर किया जाता है।
    16. सुनिश्चित करें कि बीएसए रबर कोलेजन के भीतर निलंबित कर दिया है और वहाँ कोई बुलबुले, विशेष रूप से रबर के सिरों के पास हैं।
    17. कवर रखें और आसपास लपेटो Parafilmअच्छी तरह से की परिधि।
    18. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखो। पीसीआर पर पराबैंगनी प्रकाश रखें।
  2. कोलेजन के polymerization के बाद, यूवी निम्न प्रक्रिया के माध्यम से हाइड्रोजेल crosslink।
    नोट: कोलेजन की crosslinking एक यूवी crosslinker तंत्र है जिसमें ऊर्जा की मात्रा को नियंत्रित किया जा सकता का उपयोग किया जाएगा।
    1. यूवी crosslinker पर मुड़ें और 630,000 μJ / 2 सेमी के साथ खाली कक्ष चमकाना करने के लिए ऊर्जा की स्थापना का उपयोग करें।
    2. इनक्यूबेटर से जैल निकालें।
    3. इथेनॉल के साथ हाथ स्प्रे, और, कक्ष के अंदर, के रूप में जल्दी संभव के रूप में ढक्कन हटा दें।
    4. चैम्बर बंद और यूवी ऊर्जा सेटिंग का चयन और 630,000 μJ / 2 सेमी irradiating द्वारा हाइड्रोजेल crosslink।
    5. crosslinking चक्र के बाद, पीसीआर हुड पर यूवी प्रकाश बंद
    6. इथेनॉल के साथ हाथ स्प्रे और कक्ष खोलने के लिए, जल्दी से अच्छी तरह से थाली पर ढक्कन रखने के पीछे। अच्छी तरह से थाली ले जाएँपीसीआर हुड के लिए।
    7. बाँझ रंग का प्रयोग, धीरे ढीला और अच्छी तरह से जेल को हटा दें। हुड के तहत जैल फ्लिप हाइड्रोजेल के नीचे crosslink करने के लिए। दोहराएँ कदम 6.2.3 और 6.2.4।

7. बीएसए रबड़ की एंजाइम पाचन

  1. आदेश में एक खोखला कोलेजन पाड़ करने के लिए, एक ही रास्ता है कि आयाम हाइड्रोजेल में एम्बेडेड प्रभावित नहीं करता है में बीएसए रबड़ हटा दें। प्रक्रिया नीचे वर्णित है।
    1. 20-30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश पर बारी टिशू कल्चर हुड बाँझ।
    2. 0.25% trypsin समाधान पीएच 7.8 बनाओ। उदाहरण के लिए, पानी के 15 एमएल के लिए, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में trypsin की .0376 ग्राम जोड़ें। छोटे (2-5 μl) 1 एम NaCl की मात्रा जोड़कर 7.8 पीएच को समायोजित करें। एक 20 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान प्लेस और एक 0.20 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ छाया हुआ है। सवार फिल्टर के माध्यम से तरल निष्कासित और एक नया ट्यूब में बाँझ समाधान इकट्ठा करने के लिए दबाएँ।
    3. नहाने के पानी पर मुड़ें और 30 को तापमान सेटसी।
    4. 30 मिनट के बाद, पराबैंगनी प्रकाश बंद कर देते हैं। सभी ट्यूबों और सामग्री है कि हुड में इस्तेमाल किया जाएगा पर इथेनॉल स्प्रे।
    5. डाकू और अलग शंक्वाकार ट्यूब में जगह के तहत कोलेजन हाइड्रोजेल स्थानांतरण।
    6. लगभग 3-5 मिलीलीटर प्रत्येक ट्यूब 7.8 की एक पीएच के साथ 0.25% trypsin समाधान के (सिर्फ जैल को कवर करने के लिए पर्याप्त) जोड़ें।
    7. लगभग 1 मिनट के लिए Parafilm और भंवर हल्के के साथ ट्यूब सील।
    8. 15-24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। नहाने के पानी में रहते हुए, हल्के से जैल अक्सर भंवर तक बीएसए रबर पचा या हाइड्रोजेल से हटा दिया गया है।
      नोट: आदेश में यदि बीएसए रबर हटा दिया गया है निर्धारित करने के लिए, या तो रबर trypsin समाधान में तैर रही है या वहाँ टूटी डाउन टुकड़े कर रहे हैं। वहाँ हाइड्रोजेल भीतर कोई दृश्य अंधेरे क्षेत्रों में होना चाहिए।
  2. सुनिश्चित करें कि सभी बीएसए रबर और trypsin हाइड्रोजेल से हटा दिया गया है, यह कुल्ला के रूप में नीचे वर्णित है।
    1. पीसीआर हू चालू करें20-30 मिनट के लिए डी यूवी प्रकाश।
    2. Mosconas समाधान तैयार है। पानी में पोटेशियम क्लोराइड (KCl, 28.6 मिमी), (3 NaHCO, 11.9 मिमी), ग्लूकोज (9.4 मिमी) और (नाह 2 4 पीओ, 0.08 मिमी) का मिश्रण। 1 एम NaOH या 12 एम एचसीएल समाधान के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें। एक 20 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान की जगह और समाधान बाँझ 0.20 माइक्रोन की एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग करें।
    3. हुड पर उन्हें रखने से पहले इथेनॉल के साथ सब कुछ स्प्रे और इथेनॉल के सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
    4. ट्यूब खोलें और एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बाँझ Mosconas समाधान के 5-10 मिलीलीटर हस्तांतरण।
    5. शंक्वाकार ट्यूब कि एंजाइम समाधान शामिल करने के लिए कोलेजन हाइड्रोजेल स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि हाइड्रोजेल पूरी तरह समाधान के साथ कवर किया जाता है सुनिश्चित करें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में एक प्रकार के बरतन में ट्यूब छोड़ दें।
    6. Mosconas समाधान और दोहराने कदम 7.2.5 दो बार aspirate।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

परिणाम दिखाना इस biofabrication तकनीक 3 डी scaffolds कि स्थानिक व्यवस्था में विवो ऊतक में देखा नकल कर सकते हैं पैदा करने में कुशल है। स्थापत्य सुविधाओं ऊतक इंजीनियरिंग आवेदन के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर, विवो सेल बातचीत और ऊतकों की कार्यक्षमता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं।

स्थिरता और बीएसए रबर की mixability एक बीएसए रबर कि सजातीय है और अपने इच्छित आकार को बनाए रखने में सक्षम है का निर्माण करने में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर था। प्रोटीन की घुलनशीलता इस तरह के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, और विलायक है, जो समग्र प्रोटीन व्यवहार पर परिवर्तन लाती है के साथ बातचीत के रूप में आणविक प्रभाव, द्वारा निर्धारित किया जाता है। बीएसए समाधान की चालकता मापा गया था, जो समाधान के नमक एकाग्रता का एक संकेत है। तालिका 1 सूचियों combinatiबीएसए की ons, विलायक, और glutaraldehyde का परीक्षण किया। जैसी कि उम्मीद थी, नमूने है कि उच्चतम चालकता था (2x पीबीएस विलायक) बीएसए की घुलनशीलता मदद की।

एक और बलि इस सामग्री के विकास के लिए उचित स्थिति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल पैरामीटर प्रतिक्रिया की दर थी। उम्मीद के रूप में बीएसए की प्रतिक्रिया समय, glutaraldehyde की एकाग्रता में वृद्धि हुई है के रूप में कमी आई है। लगानेवाला एमिनो एसिड की α अमीनो समूहों, एन पेप्टाइड्स के टर्मिनल अमीनो समूह, और सिस्टीन की sulfhydryl समूह के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। Glutaraldehyde आणविक सहसंयोजक बांड (चित्रा 1 ए) 14 के लिए फार्म लाइसिन की एमिनो समूहों के माध्यम से बीएसए के साथ मुख्य रूप से प्रतिक्रिया करते हैं। एक ऊष्मायन अवधि के बाद, नमूने गहरे पीले और भूरे रंग के लिए हल्के पीले से रंग बदलने से पता चला है, बढ़ glutaraldehyde एकाग्रता (चित्रा 1 बी)। 20%, 30%, एक साथ तीव्रता में बढ़ रही हैडी पानी में 2% glutaraldehyde के साथ 40% बीएसए एक रबर फार्म नहीं था। 40% BSA समाधान, इसकी उच्च चिपचिपापन और उच्च प्रतिक्रियाशील लगानेवाला के कारण, रबर के साथ अलग-अलग शक्ति में हुई। यह व्यवहार ही ढंग प्रोटीन चेन मर्मज्ञ में glutaraldehyde की कठिनाई की वजह से हो सकता है। विलायक बहुत प्रोटीन की घुलनशीलता के साथ ही लगानेवाला के साथ अपनी प्रतिक्रिया को प्रभावित किया। 2x पीबीएस समाधान आसानी से mixable थे। पानी के साथ बीएसए समाधान मिश्रण करने के लिए मुश्किल था। बीएसए घुलनशीलता बहुत विलायक (तालिका 2) की चालकता से प्रभावित है प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन के कारण। सबसे होनहार नमूने 1x पीबीएस और 2x पीबीएस में 3% glutaraldehyde के साथ 30% बीएसए थे।

सुनिश्चित करने के लिए कि रबर निरंतर लोड हो रहा है बलों के लिए सक्षम था, एक संपीड़न परीक्षण किया गया था। बीएसए रबर के चार नमूने के यांत्रिक गुणों मापा गया: 30% बीएसए 3% glutaraldehyde2x पीबीएस, 1x पीबीएस, 1x पीबीएस में 2x पीबीएस में 20% बीएसए 3% और 20% glutaraldehyde बीएसए 2% glutaraldehyde में 30% बीएसए 3% glutaraldehyde। साइन तरंगों लोड और विस्थापन घटता (अनुपूरक चित्रा 2) है कि तनाव और तनाव घटता (अनुपूरक चित्रा 3) को स्थानांतरित कर रहे हैं के बीच एक बहुत छोटे चरण परिवर्तन दिखाया। तनाव और तनाव घटता के आधार पर, पहले तीन नमूने लोडिंग और अनलोडिंग (2A चित्रा -2 सी) के बीच में हिस्टैरिसीस दिखाया। ये तीन नमूनों एक viscoelastic सामग्री है कि लोचदार और चिपचिपा गुण जब बलों लागू किया गया होता है के रूप में व्यवहार किया। 20% बीएसए 2% glutaraldehyde स्थायी विकृति (चित्रा 2 डी) के लक्षण दिखाई। 30% बीएसए 1x पीबीएस और 2x पीबीएस में 3% glutaraldehyde एक समान व्यवहार (चित्रा 2 ई -एक लोडिंग और अनलोडिंग के चक्र) से पता चला। लोचदार मापांक इन चार नमूने (चित्रा 2 एफ) के रैखिक भाग से निर्धारित किया गया था। फॉस्फेट की एकाग्रताविलायक काफी रेंज से परीक्षण (पी = 0.03) पर लोचदार मापांक वृद्धि हुई है। 20% बीएसए 1x पीबीएस में 2% glutaraldehyde आसानी से विकृत, एक कम लोचदार मापांक दिखा।

रबर के enzymatic पाचन का मूल्यांकन करने के लिए, प्रतिक्रिया की दर की गणना बीएसए रबर के लापता होने के आधार पर किया गया था जब विशिष्ट समय बिंदु पर एंजाइम के साथ संपर्क में रखा गया। enzymatic पाचन प्रक्रिया एक बैच रिएक्टर के रूप में इलाज किया गया था। शुरू रबर एकाग्रता उपचार और रबर lyophilized जा रहा पाचन के कैनेटीक्स प्राप्त करने के लिए बनाया गया था के बाद छोड़ दिया करने के लिए पूर्व के बीच एक तुलना। चित्रा 3 glutaraldehyde और बीएसए, विलायक की एकाग्रता के संबंध में प्रत्येक नमूना के लिए प्रतिक्रिया की दर से पता चलता है, और निवास समय। एक स्पष्ट प्रवृत्ति crosslinker सांद्रता और संस्था की हदबंदी की प्रतिक्रिया की दर के बीच मनाया गया। सांख्यिकीय विश्लेषण हर समय बिंदु पर प्रदर्शन किया गया था। वें के लिएई 15 घंटे की समय बिंदु, glutaraldehyde एकाग्रता काफी 0.02 के एपी मूल्य (पूरक तालिका 4) में जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया की दर को प्रभावित किया। उस समय बिंदु के बाद, दोनों glutaraldehyde और बीएसए एकाग्रता काफी दर (अनुपूरक टेबल 5-7) को प्रभावित किया। सबसे प्रभावशाली कारक समग्र glutaraldehyde एकाग्रता, एक और अधिक महत्वपूर्ण पी मूल्य ने संकेत दिया था। glutaraldehyde एकाग्रता में वृद्धि रबर इकाई के पाचन की प्रतिक्रिया की दर में कमी आई है।

प्रोटीन की मात्रा trypsin द्वारा भंग कर एक बीसीए परख (चित्रा 4) का उपयोग निर्धारित किया गया था। एक आम प्रवृत्ति मनाया गया था: कम लगानेवाला की एकाग्रता, और अधिक प्रोटीन बीएसए रबर से पचा गया था। Trypsin बीएसए और नव निर्मित सहसंयोजक बांड glutaraldehyde द्वारा गठित cleaving, इस प्रकार से अधिक समग्र संरचना भंग द्वारा रबर नमूने के साथ बातचीत कीT.I.M.E। ऐसा लगता है 1x पीबीएस के साथ वहाँ एक पहले के समय बिंदु पर अधिक solubilized प्रोटीन 2x पीबीएस की तुलना में है। समय के साथ, वहाँ 15 घंटा पर समाधान में प्रोटीन की वृद्धि हुई है, जो 48 घंटा तक बढ़ाने के लिए जारी रखा और उसके बाद यह कमी आई है। इस trypsin लगातार प्रोटीन cleaving और, इस प्रकार, छोटे पेप्टाइड्स और एमिनो एसिड बनाने के कारण हो सकता है। यह भी परख की सीमाओं, जो केवल यह है कि तीन या अधिक अमीनो एसिड से बना रहे हैं पेप्टाइड्स पढ़ सकते हैं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि बीएसए और glutaraldehyde एकाग्रता काफी बीएसए रबर (पी <0.05) से प्रोटीन की रिहाई को प्रभावित किया। बीएसए एकाग्रता में वृद्धि, तैरनेवाला में प्रोटीन की वृद्धि हुई, जबकि glutaraldehyde में वृद्धि भंग प्रोटीन में कमी का कारण बना।

इस यज्ञ सामग्री की हदबंदी को मापने के लिए, रबर conta में रखने से पहले (गीला आधार) तौला गयाtrypsin के साथ सीटी। रबर एंजाइम पाचन समाधान में रखा की सूखी वजन के बराबर मूल्यों अनुपूरक चित्र 1 में दिखाया एंजाइम समाधान बीएसए रबर के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की, और इस प्रकार, प्रोटीन solubilized का उपयोग निर्धारित किया गया था। रबर उपचार के बाद शेष lyophilized था हे / एन और तौला। चित्रा 5 से पता चलता है कि विलायक रबर की हदबंदी को प्रभावित किया। बीएसए और glutaraldehyde की ही एकाग्रता में, 2x पीबीएस विलायक घिसने 1x पीबीएस की तुलना में उनके माल की अधिक बनाए रखा।

तीन ठोस ढालना टुकड़े गढ़े गए थे: लूप मोल्ड (अनुपूरक चित्रा -4 ए), स्थिरता टुकड़ा (अनुपूरक चित्रा 4 बी), और वाई मोल्ड (चित्रा 6A, बाएं)। स्टेनलेस स्टील Y ढालना टुकड़ा Microlution मशीन (चित्रा 6A, दाएं) का उपयोग कर बनाया गया था। यह मोल्ड प्रतिक्रिया 30% बीएसए और 3% glutaralde साथ इंजेक्ट किया गया था2x पीबीएस (चित्रा 6B, बाएं) में हाइड। रबर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया करने के लिए हे / एन की अनुमति दी थी। रबर कोलेजन (चित्रा 6B, केंद्र) के साथ casted गया था और तब से पच एंजाइम (चित्रा 6B, दाएं)। प्रारंभिक आंकड़ों से सुझाव दिया है कि पीएच 7.8 और 15 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर, बीएसए रबर कोलेजन पाड़ पर न्यूनतम प्रभाव के साथ पचा जा सकता है। 15 घंटे के बाद, रबर एंजाइम और पर्याप्त है कि यह कोलेजन की ज्यामितीय सुविधाओं को प्रभावित किए बिना चैनलों पत्ते ढीला से कमजोर है। एक 3 डी कोलेजन पाड़ बनाया गया था है कि विशिष्ट सुविधाओं ज्यामितीय। चित्रा 6B (दाएं) एक 4 मिमी व्यास चैनल एक कोलेजन हाइड्रोजेल अंदर बीएसए रबर की एंजाइम पाचन के बाद पता चलता है। चैनल एक कैलिपर के साथ मापा गया था कि यह सुनिश्चित करने के लिए मूल आयाम बनाए रखा गया था। दरअसल, कोलेजन हाइड्रोजेल में नया चैनल 4 मिमी था। बीएसए रबर molds 300 माइक्रोन के रूप में छोटे रूप में आयाम पकड़ कर सकते हैं, जो हमें परीक्षण किया गया थास्थिरता ढालना आईएनजी (चित्रा 7)। ये scaffolds अवशिष्ट glutaraldehyde के लिए परीक्षण किया गया है और हम Mosconas washes के बाद कोई अवशेष पाया।

आकृति 1
चित्रा 1. बीएसए रबर। (ए) बीएसए रबर की प्रतिक्रिया। glutaraldehyde सहसंयोजक बांड बनाने के द्वारा बीएसए crosslinks। (बी) बीएसए रबड़। बीएसए के विभिन्न सांद्रता, glutaraldehyde की सांद्रता, और विलायक के प्रकार के 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर casted और ओ / एन प्रतिक्रिया व्यक्त की 4 डिग्री सेल्सियस पर रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. बीएसए घिसने के तनाव तनाव घटता है। बीएसए आरयू के तनाव तनाव घटता bbers। (ए) 2x पीबीएस में 30% बीएसए 3% glutaraldehyde; (बी) 1x पीबीएस में 30% बीएसए 3% glutaraldehyde; (सी) 2x पीबीएस में 20% बीएसए 3% glutaraldehyde; और (डी) 20% बीएसए 2% 1x पीबीएस में glutaraldehyde (3 चक्र)। घटता एसी शो घिसने कुछ hysteris है, लेकिन उनके मूल आकार में वापस है। नमूना डी एक बहुत कम लोचदार मापांक है कि आसानी से लदान और उतराई प्रक्रिया के दौरान स्थायी रूप से विकृत साथ एक रबर पता चलता है। नमूना ए और बी एक बहुत ही इसी तरह के व्यवहार के रूप में ग्राफ ई (प्रत्येक नमूने की एक चक्र के प्रतिनिधि) पर एक लोडिंग और अनलोडिंग के चक्र में देखा दिखाया। लोच लगानेवाला की एकाग्रता और विलायक इस्तेमाल किया (एफ) से प्रभावित था। नमूने लवण की वृद्धि हुई है (** पी <0.05) के साथ मापांक में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया। एक उच्च एकाग्रता लगानेवाला बीएसए घिसने की लोच में उल्लेखनीय वृद्धि (* पी <0.05) के कारण होता है।arget = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. बीएसए रबर के विघटन की प्रतिक्रिया की दर। लगानेवाला बढ़ जाती है, प्रतिक्रिया की दर 1x पीबीएस (ए), 2x पीबीएस (बी), और पानी (सी) में सभी नमूनों के लिए कम हो जाती है। 40% बीएसए 2x पीबीएस में 2% glutaraldehyde प्रतिक्रिया की दर सबसे अधिक का पता चलता है। इस कठिनाई बीएसए प्रोटीन सजातीय बनाने में सामना करने के लिए कारण है। (नीला: 20% बीएसए, बैंगनी: 30% बीएसए, और लाल: 40% बीएसए)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रोटीन quantifi एंजाइम पाचन के बाद केशन। लगानेवाला बढ़ जाती है, प्रोटीन घिसने से भंग 1x पीबीएस (ए), 2x पीबीएस (बी), और पानी (सी) में सभी नमूनों के लिए कम हो जाती है। (नीला: 20% बीएसए, बैंगनी: 30% बीएसए, और लाल: 40% बीएसए)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. रबड़ पाचन। हम शुरू की तुलना और शुष्क आधार उत्पादों अंत तक पचा रबर की राशि निर्धारित की। हम 6% glutaraldehyde नमूना पर पाचन की कम से कम राशि प्राप्त की है और सबसे अधिक 30% पर 1x पीबीएस में बीएसए 2% glutaraldehyde। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ove_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 6
चित्रा 6 शाखित प्रोटोटाइप। (ए) शाखा वाहिका का प्रतिनिधित्व। बाईं तरफ दिखाया ठोस Mastercam में बनाया जो जी संहिता में परिवर्तित कर दिया गया है और के रूप में सही पर देखा Microlution 363-एस का उपयोग कर निर्मित है। स्टेनलेस स्टील मोल्ड टुकड़ा दो 3mm बहिर्वाह चैनलों के साथ एक 4 मिमी प्रवाह चैनल का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) 3 डी कोलेजन पाड़। बाईं तरफ दिखाया बीएसए रबर मोल्ड ऊपर दिखाए का उपयोग किया जाता है। केंद्र रबर कोलेजन हाइड्रोजेल में एम्बेडेड पता चलता है। सही पर चैनलों कोलेजन पाड़ के बाद रबर एंजाइम पचा गया था भीतर छोड़ दिया जाता है दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
चित्रा 7. बीएसए चैनल। ए 300 माइक्रोन बीएसए चैनल स्थिरता टुकड़ा मोल्ड से हटा दिया गया था। वहाँ चैनल के आसपास ढालना रिहाई एजेंट की एक पतली परत है। अतिरिक्त क्षेत्र स्पष्ट रूप से एक खुर्दबीन के नीचे प्रतिष्ठित है और आसानी से हटाया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बीएसए (%) Glutaldehyde (%)
20 2
20 3
20 6
30 2
30 3
30 6
40 2
40 3
6

। तीन अलग-अलग सॉल्वैंट्स का उपयोग: 1 के अनुपात तालिका 1. बीएसए रबर मानकों को बीएसए और लगानेवाला एक 4 में मिलाया गया।

नमूना चालकता (एमएस / सेमी) पीएच
बीएसए (%) विलायक
30 2x पीबीएस 11.43 7.06
30 1x पीबीएस 6.35 7.05
30 डि 2.39 6.76
20 2x पीबीएस 13.00 6.92
20 1x पीबीएस 8.67 7.09
20 डि 2.08

तालिका 2 चालकता और बीएसए के नमूनों का पीएच। conductivities और बीएसए समाधान के पीएच विभिन्न सॉल्वैंट्स की उपस्थिति में मापा गया था। चालकता में वृद्धि हुई है 2x और 1x पीबीएस के बीच दिखाया गया है।

6
बीएसए (%) Glutaraldehyde (%) विलायक टिप्पणियों
20 2 1x पीबीएस शीतल, आसान विरूप्य सामग्री
20 3 1x पीबीएस शीतल लेकिन 2% glutaraldehyde की तुलना में अधिक मजबूत
20 6 1x पीबीएस कड़ी, एक छोटे से भंगुर
30 2 1x पीबीएस अच्छा स्थिरता
30 3 1x पीबीएस अच्छा स्थिरता
30 6 1x पीबीएस नाज़ुक
40 2 1x पीबीएस एक जेल / रबर स्थिरता बनाने में बहुत असंगत
40 3 1x पीबीएस स्थिरता के साथ भिन्न हो नमूना
40 6 1x पीबीएस नाज़ुक
20 2 2x पीबीएस शीतल, आसान विरूप्य सामग्री लेकिन 1x पीबीएस नमूना की तुलना में अधिक मजबूत
20 3 2x पीबीएस शीतल लेकिन 2% से stiffer
20 6 2x पीबीएस अच्छा स्थिरता
30 2 2x पीबीएस अच्छा स्थिरता, 1x पीबीएस के साथ की तुलना में अधिक studry
30 3 2x पीबीएस अच्छा स्थिरता, 1x पीबीएस के साथ की तुलना में अधिक studry
30 2x पीबीएस अच्छा mixability लेकिन britle
40 2 2x पीबीएस स्थिरता के साथ भिन्न हो नमूना
40 3 2x पीबीएस स्थिरता के साथ भिन्न हो नमूना
40 6 2x पीबीएस स्थिरता नमूना साथ भिन्न है और यह भंगुर था
20 2 पानी एक जेल / रबर सामग्री फार्म नहीं था
20 3 पानी एक जेल का गठन लेकिन टी की तुलना में stiffer लगते हैंवह पीबीएस और 2x पीबीएस 1x, असंगत
20 6 पानी एक जेल का गठन लेकिन 1x पीबीएस और 2x पीबीएस से stiffer, असंगत प्रतीत
30 2 पानी एक जेल / रबर सामग्री फार्म नहीं था
30 3 पानी एक जेल का गठन लेकिन 1x पीबीएस और 2x पीबीएस से stiffer, असंगत प्रतीत
30 6 पानी एक जेल का गठन लेकिन 1x पीबीएस और 2x पीबीएस से stiffer, असंगत प्रतीत
40 2 पानी एक जेल / रबर materi फार्म नहीं थाअल
40 3 पानी स्थिरता के साथ नमूना भिन्न - शीर्ष पर कड़ी
40 6 पानी स्थिरता के साथ नमूना भिन्न - शीर्ष पर कड़ी

तालिका 3. बीएसए रबर। बीएसए के बाद रबर प्रतिक्रिया व्यक्त हे / एन, एक 8 मिमी नमूने की बायोप्सी पंच छेद लिया गया था। इस तालिका में स्थिरता और नमूने की उपस्थिति के कुछ दृश्य टिप्पणियों में शामिल है।

पूरक चित्रा 1
अनुपूरक चित्रा 1. ठोस प्रतिशत। प्रत्येक रबर से ठोस का प्रतिशत (सूखी वजन / गीला वजन) निर्धारित किया गया था। विलायक percenta को प्रभावित नहीं कियाठोस जीई (p> 0.05)। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2
अनुपूरक चित्रा 2. पीबीएस 2x 30% बीएसए 3% glutaraldehyde की ज्या लहर। दबाने लोड और नमूना के विस्थापन गुजरे समय के कार्यों के रूप में दिखाया जाता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 3
अनुपूरक चित्रा 3. पीबीएस 2x 30% बीएसए 3% glutaraldehyde की ज्या लहर। तनाव और नमूना के तनाव की गणना की और गुजरे समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते थे। वहाँ एक छोटे चरण में बदलाव, भारतीयों हैरबर के viscoelastic व्यवहार के cative। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 4
अनुपूरक चित्रा 4. Mastercam ठोस। (ए) और लूप (बी) स्थिरता टुकड़े। इन Mastercam का उपयोग कर डिजाइनिंग के बाद, जी कोड आयात किया गया था और एक स्टेनलेस स्टील या पीतल Microlution मशीन या एक टुकड़ा पीएलए Makerbot 3 डी रेप्लिकेटर का उपयोग कर का उपयोग कर टुकड़ा। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

सीमा मिन मैक्स
-17 3
विस्थापन (मिमी) -1.5 0.3
लहर स्तर 1 लेवल 2 आवृत्ति (हर्ट्ज) चक्र
ज्या -15 -3 1 5000
आंकड़ा अधिग्रहण
स्कैन समय १.००८
स्कैन अंक 360
स्कैन की संख्या </ Td> 5
इसके बाद स्कैन स्कैन के बीच १.००८ सेकंड

अनुपूरक तालिका 1. संपीड़न परीक्षण मानकों। एक साइन लहर का उपयोग करना, लोड और विस्थापन के बीच संबंधों को रबर के चार प्रकार के लिए निर्धारित किया गया था। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

एनोवा परिणाम
DF एसएस सुश्री एफ महत्व एफ
वापसी 3 9.85E + 02 3.28E + 02 4.70E + 02 1.06E-18
अवशिष्ट 20 1.40E + 01 6.99E-01
कुल 23 9.99E + 02
प्रतिगमन विश्लेषण
गुणांकों मानक त्रुटि टी स्टेट पी-मूल्य
अवरोधन 1.74E + 00 8.23E-01 2.12E + 00 4.70E-02
बीएसए (%) 7.82E-01 2.09E-02 3.74E + 01 5.49E-20
Glutaraldehyde (%) 3.17E-01 </ Td> 1.03E-01 3.09E + 00 5.71E-03
विलायक 2.61E + 01 2.22E + 01 1.18E + 00 2.53E-01

अनुपूरक तालिका 2 बीएसए रबर में ठोस का प्रतिशत के सांख्यिकीय विश्लेषण। बीएसए और glutaraldehyde काफी ठोस का प्रतिशत प्रभावित किया। विलायक ठोस का प्रतिशत को प्रभावित नहीं किया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

एनोवा परिणाम
DF एसएस सुश्री एफ महत्व एफ
वापसी 3 3.06E + 05 1.02E + 05 1.18E + 01 4.00E-03
अवशिष्ट 7 6.07E + 04 8.67E + 03
कुल 10 3.67E + 05
प्रतिगमन विश्लेषण
गुणांकों मानक त्रुटि टी स्टेट पी-मूल्य
अवरोधन 6.50E + 02 4.25E + 01 1.53E + 01 1.23E-06
बीएसए (%) 4.67E + 00 3.80E + 01 1.23E-01 9.06E-01
विलायक 1.02E + 02 3.80E + 01 2.67E + 00 3.20E-02
Glutaraldehyde (%) 1.16E + 02 5.70E + 01 2.03E + 00 8.21E-02

अनुपूरक तालिका 3. लोचदार पीबीएस एकाग्रता से संबंधित मापांक के सांख्यिकीय विश्लेषण। पीबीएस एकाग्रता काफी लोचदार मापांक को प्रभावित किया। विलायक में लवण की वृद्धि लोचदार मापांक में वृद्धि का कारण बना। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

एनोवा परिणाम
DF एसएस सुश्री एफ महत्व एफ
वापसी 3 6.15E-15 2.05E-15 3.68E + 00 1.67E-02
अवशिष्ट 60 3.34E-14 5.57E-16
कुल 63 3.96E-14
प्रतिगमन विश्लेषण
गुणांकों मानक त्रुटि टी स्टेट पी-मूल्य
अवरोधन 3.74E-08 1.37E-08 2.74E + 00 8.03E-03
बीएसए (%) 3.89E-10 3.62E-10 1.07E + 00 2.88E-01
Glutaraldehyde (%) -5.92E-09 1.83E-09 -3.23E +00 2.02E-03
विलायक -6.78E-08 3.76E-07 -1.80E-01 8.58E-01

अनुपूरक तालिका 4 प्रतिक्रिया की दर के बाद एंजाइम पाचन के 15 घंटा। Glutaraldehyde एकाग्रता काफी अधिक glutaraldehyde सांद्रता में कम से रबर की पाचन की प्रतिक्रिया की दर प्रभावित के सांख्यिकीय विश्लेषण। यहाँ इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पी-मूल्य
एनोवा परिणाम
DF एसएस सुश्री एफ महत्व एफ
वापसी 3 7.36E-15 2.45E-15 3.62E + 01 1.21E-13
अवशिष्ट 62 4.20E-15 6.78E-17
कुल 65 1.16E-14
प्रतिगमन विश्लेषण
गुणांकों मानक त्रुटि टी स्टेट
अवरोधन 2.98E-08 4.77E-09 6.25E + 00 4.22E-08
बीएसए (%) 4.56E-10 1.26E-10 3.62E + 00 6.03E-04
Glutaraldehyde (%) -6.04E-09 6.15E-10 -9.82E +00 3.00E-14
विलायक -6.57E-08 1.31E-07 -5.02E-01 6.17E-01

अनुपूरक टेबल एंजाइम पाचन के 24 घंटे के बाद प्रतिक्रिया की दर से 5. सांख्यिकीय विश्लेषण। बीएसए और glutaraldehyde एकाग्रता काफी रबर की पाचन की प्रतिक्रिया की दर को प्रभावित किया। उच्च glutaraldehyde सांद्रता में, वहाँ टी में एक कमी हैवह प्रतिक्रिया की दर। उच्च बीएसए सांद्रता में, वहाँ प्रतिक्रिया की दर में वृद्धि हुई है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

एनोवा परिणाम
DF एसएस सुश्री एफ महत्व एफ
वापसी 3 3.10E-15 1.03E-15 2.74E + 01 1.64E-11
अवशिष्ट 64 2.42E-15 3.78E-17
कुल 67 5.52E-15
प्रतिगमन विश्लेषण
गुणांकों मानक त्रुटि टी स्टेट पी-मूल्य
अवरोधन 2.17E-08 3.50E-09 6.20E + 00 4.55E-08
बीएसए (%) 2.13E-10 9.20E-11 2.31E + 00 2.39E-02
Glutaraldehyde (%) -3.94E-09 4.53E-10 -8.70E +00 1.90E-12
विलायक 3.04E-08 9.57E-08 3.18E-01 7.51E-01

अनुपूरक टेबल6. एंजाइम पाचन के 48 घंटे के बाद प्रतिक्रिया की दर। बीएसए और glutaraldehyde एकाग्रता के सांख्यिकीय विश्लेषण काफी रबर की पाचन की प्रतिक्रिया की दर को प्रभावित किया। उच्च glutaraldehyde सांद्रता में, वहाँ प्रतिक्रिया की दर में कमी आई है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

एनोवा परिणाम
DF एसएस सुश्री एफ महत्व एफ
वापसी 3 2.19E-15 7.29E-16 3.05E + 01 3.56E-12
अवशिष्ट 61 1.46E-15 2.39E-17
कुल 64 3.64E-15
प्रतिगमन विश्लेषण
गुणांकों मानक त्रुटि टी स्टेट पी-मूल्य
अवरोधन 1.05E-08 2.84E-09 3.69E + 00 4.80E-04
बीएसए (%) 3.61E-10 7.48E-11 4.83E + 00 9.48E-06
Glutaraldehyde (%) -3.07E-09 3.69E-10 -8.33E +00 1.21E-11
इसलिएlvent 3.97E-08 7.80E-08 5.09E-01 6.12E-01

अनुपूरक टेबल एंजाइम पाचन के 72 घंटे के बाद प्रतिक्रिया की दर 7. सांख्यिकीय विश्लेषण। बीएसए और glutaraldehyde एकाग्रता काफी रबर की पाचन की प्रतिक्रिया की दर को प्रभावित किया। उच्च glutaraldehyde सांद्रता में, वहाँ प्रतिक्रिया की दर में कमी आई है। उच्च बीएसए सांद्रता में, वहाँ प्रतिक्रिया की दर में वृद्धि हुई है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biofabrication एक बेहद इन दोनों क्षेत्रों की क्षेत्र है जिसमें जीव विज्ञान और इंजीनियरिंग के सिद्धांतों जटिल सामग्री है कि देशी ऊतक नकल उत्पन्न करने के लिए विलय है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, तकनीक है कि जानकारी में विवो ऊतक से इकट्ठा का उपयोग करें और यह इन विट्रो पाड़ में अनुवाद को विकसित करने की जरूरत है। इस तरह, एक मंच इंजीनियर हो सकता है कि निकट विवो ऊतक के, वास्तु कार्यात्मक, और यांत्रिक गुणों जैसा दिखता है। इष्टतम मचान सामग्री, इस तरह के biocompatible होने के रूप में कुछ गुण, अधिकारी हित के ऊतक के यांत्रिक गुणों की नकल, सेल व्यवहार्यता का समर्थन करने में सक्षम नियंत्रित गिरावट में सक्षम है, और ऊतक 2,3 remodeling की इजाजत देने के लिए सक्षम होना चाहिए।

निर्माण तकनीक की एक भीड़ व्यवहार्य, तीन आयामी निर्माणों उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है। इन प्रौद्योगिकियों के दो प्रमुख श्रेणियों में गिरावट: एक पारंपरिकडी उन्नत। परम्परागत तकनीकों कृत्रिम और प्राकृतिक पारंपरिक सामग्री के उपयोग झरझरा संरचनाओं बनाने के लिए शामिल हैं। कुछ उदाहरण, विलायक कास्टिंग कर रहे हैं सुखाने फ्रीज, और मोल्डिंग पिघला। इन तकनीकों का नुकसान गरीब scaffolds के भीतर आंतरिक चैनलों बनाने के ढांचे के भीतर porosity के नियंत्रण (ताकना आकार और ताकना इंटरकनेक्टिविटी) और कठिनाई शामिल हैं। उन्नत तकनीक स्टीरियोलिथोग्राफी, मोल्डिंग, 3 डी प्रिंटिंग, और electrospinning, दूसरों के बीच 1 शामिल हैं। इन तकनीकों में इस तरह के लंबी दूरी के माइक्रोआर्किटेक्चर चैनलों की कमी है, जबकि छोटे व्यास नलिका, अनुकूलन सामग्री पर निर्भर है के माध्यम से वितरण के लिए सक्षम किया जा रहा है इष्टतम यांत्रिक शक्ति प्रदान करने के लिए, व्यापक बाद के प्रसंस्करण है कि विषाक्त हो सकता है की आवश्यकता होती है सामग्री के चयन के रूप में कमियां हैं, और इन विट्रो निर्माण में आंतरिक आर्किटेक्चर के डिजाइन में प्रतिबंध। 3 डी मुद्रण में एक बड़ी खामी biomaterials कि पर्याप्त सेल वाहक हैं की उपलब्धता हैभी यांत्रिक गुणों एक परिभाषित वास्तु संगठन 12 को बनाए रखने के लिए आवश्यक होने हैं। यहाँ प्रस्तुत प्रौद्योगिकी दोनों पारंपरिक और आधुनिक निर्माण तकनीक को शामिल किया गया। दोनों दुनिया के सर्वश्रेष्ठ कंप्यूटर एडेड विनिर्माण बनाने के लिए, या आयात, एक एंजाइम अस्थिर रबर के विकास के साथ वांछित वास्तुकला के अभिसरण से ली गई है। स्टेनलेस स्टील के सांचे एक मिलिंग मशीन का उपयोग कर बनाया गया था, लेकिन उनकी इस तकनीक का निर्माण करने के लिए सीमित नहीं है। एक 3 डी प्रिंटर (जैसे, Makerbot) का उपयोग करना, एक ही नए नए साँचे polylactic एसिड (पीएलए) से गढ़े गए थे। नकारात्मक नए नए साँचे वास्तु सीएडी कार्यक्रम है, जो ठोस molds कि किसी भी सामग्री के लिए सुविधाओं की एक आसान और विश्वसनीय हस्तांतरण बनाने प्रदान करता है के द्वारा डिजाइन किए निर्देशों का उपयोग कर milled थे। में है कि यह न केवल बाहरी ऊतक संरचना के नियंत्रण की अनुमति देता है यह तकनीक महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी अत्यधिक जटिल आंतरिक संरचना की। काम यहाँ प्रस्तुत, मुख्य रूप से बीएसए रबर, समान रूप से, आसानी से समय का एक उचित मात्रा में पच जाता है मिलाया जा सकता है जो के लक्षण वर्णन पर केंद्रित है इसकी संरचना में परिवर्तन करने के लिए प्रतिरोधी था, और मिनट विशेषताओं की नकल करने के लिए है, जबकि कास्टिंग प्रक्रिया के दौरान अपनी स्थिरता पकड़े सक्षम है । इस तकनीक की सीमा परीक्षण किया गया था और बलि सामग्री का संकल्प व्यास में 300 माइक्रोन के रूप में छोटे आयाम बनाए रख सकते हैं। हालांकि, चित्रा 7 चलता है कि चैनल ढालना रिहाई एजेंट की एक पतली परत से घिरा हुआ है। एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, इस अतिरिक्त क्षेत्र स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित है और वांछित आयाम को हटाया जा सकता है। इस biofabrication तकनीक आंतरिक संरचनाओं कि स्थूल से सूक्ष्म पैमाने पर करने के लिए सीमा की एक विस्तृत विविधता की प्रतिकृति की अनुमति देता है।

सीरम albumin संचार प्रणाली में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन होता है। चूंकि प्रोटीन polyelectrolytes हैं, घुलनशीलता electrostatic बातचीत के द्वारा निर्धारित किया गया था 15-17। यह कम नमक सांद्रता में दिखाया गया है कि, वहाँ एक नमकीन में प्रोटीन इसकी घुलनशीलता 18 को सुविधाजनक बनाने पर प्रभाव है। Glutaraldehyde एक crosslinking एजेंट है कि एल्बुमिन के गुणों में परिवर्तन का कारण बनता है। रंग बदलने चित्रा 1 में देखा aldimine लिंकेज 19-21 के गठन के लिए जिम्मेदार ठहराया है। Glutaraldehyde आणविक सहसंयोजक बांड 14 के लिए फार्म लाइसिन की एमिनो समूहों के माध्यम से बीएसए के साथ मुख्य रूप से प्रतिक्रिया करते हैं। डेटा इंगित करता है कि लवण की वृद्धि रबर की लोच में सुधार (1x पीबीएस से पीबीएस 2x करने के लिए)। उच्च glutaraldehyde एकाग्रता stiffer जैल कि पहले सेट कम एकाग्रता वालों की तुलना में पैदा करता है। हालांकि, वे, बांटना homogenously मिश्रण करने के लिए और अधिक कठिन हैं, और वे भंगुर जैल के रूप में। सांचों में बीएसए रबर की उचित मात्रा में देने के लिए, विधानसभा के हर हिस्से ठंड रखा जाना चाहिए क्योंकि उच्च तापमान glutaraldehyde और बीएसए प्रतिक्रिया में तेजी लाने के।आदर्श रबर (30% बीएसए 2x पीबीएस या 1x पीबीएस में 3% glutaraldehyde) एक viscoelastic सामग्री है कि स्थायी रूप से विरूपण के बिना लोड हो रहा सामना कर सकते हैं के रूप में व्यवहार करता है। यह बहुत महत्वपूर्ण है जब से निपटने और बीएसए रबर संरचना के आसपास सामग्री कास्टिंग हो जाता है।

Trypsin एक सेरीन प्रोटीज कि प्रोटीन hydrolyzes है। Trypsin एक व्यापक रूप से इस्तेमाल एंजाइम उच्च दरार विशिष्टता है कि है। यह अमीनो एसिड लाइसिन की carboxyl पक्ष में मुख्य रूप से पेप्टाइड श्रृंखला cleaves और 22 arginine। बीएसए पानी में कम मात्रा में आसानी से घुलनशील है, और trypsin आसानी से कोलेजन बरकरार है और अपेक्षाकृत अछूता जा बीएसए रबर पच। सामग्री कोशिकाओं के साथ कोई संपर्क नहीं होगा। निर्माण मुक्त glutaraldehyde की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया गया था और वहाँ इस लगानेवाला का कोई निशान थे। इस biofabrication के लिए एक बलि सामग्री के रूप में बीएसए रबर की प्रभावकारिता को दर्शाता है। इस प्रोटोकॉल में, कोलेजन पाड़ सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन किसी भी ओ.टी.उसकी सामग्री है कि trypsin पाचन के लिए प्रतिरोधी है इस्तेमाल किया जा सकता है।

भविष्य के काम endothelial और fibroblast कोशिकाओं के साथ पाड़ बोने से हाइड्रोजेल भीतर संवहनी घटक पुनर्गठन पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा। चुनौतियों में से एक चैनल है कि देशी 3 डी वितरण की नकल के अंदर भर में कोशिकाओं का एक समान वितरण बनाने के लिए है। इस मुद्दे के समाधान के लिए, एक रणनीति विकसित किया जा रहा है कि सीलिंग या चैनलों की plugging और सेल निलंबन के इंजेक्शन की अनुमति देता है। सामग्री का परीक्षण किया Pluronic F127 है, जो एक thermoreversible जेल, 4 डिग्री सेल्सियस पर तरल और 30 डिग्री सेल्सियस से ऊपर 23,24 एक ठोस है। Pluronic के एक उच्च एकाग्रता आवश्यक अस्थायी मुहर बनाने में सफल रहा था। बाद सेल निलंबन पाड़ के चैनलों के भीतर है, इकाई समय की एक विशेष राशि के लिए घुमाया जा रहा है जब तक कोशिकाओं 3 डी संरचना के सभी पक्षों का पालन करें। अंदर चैनल को बनाए रखने के लिए पर्याप्त मीडिया होगासेल अस्तित्व। Pluronic अपने जेल के रूप रखता है और एक जलीय वातावरण में आसानी से घुलनशील है। एक बार कोशिकाओं का पालन करना, हाइड्रोजेल मीडिया से भर जाएगा, और स्थिर या प्रवाह की स्थिति में संवर्धित किया जा सकता है, अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करता है। इस पद्धति आगे मूल्यांकन किया जाएगा और इस प्रकाशन के लिए अनुवर्ती हो जाएगा। biofabrication तकनीक यहाँ बताया वर्तमान में एक मानव गुर्दे धमनी की एक पाड़ प्रतिकृति विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। एक ही दृष्टिकोण इस तरह के हृदय के ऊतकों के रूप में अन्य प्रकार के साथ किया जा सकता है, नैदानिक ​​अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस तकनीक के लागू विस्तार करने के लिए।

यहां विकसित biofabrication तकनीक इन विट्रो scaffolds कि आंतरिक ज्यामितीय सुविधाओं जल्दी और मज़बूती से पुनरावृत्ति कर सकते हैं की पीढ़ी में एक कदम आगे है। एक प्राकृतिक सामग्री, इस तरह के रूप में कोलेजन, इसलिए चुना गया क्योंकि यह इष्टतम रासायनिक और सिंथेटिक सामग्री से अधिक कोशिकाओं को शारीरिक संकेतों प्रदान करता है। ये NAसांस्कृतिक सामग्री, विकास, कुरूपता, और रोग के ऊतकों की इन विट्रो मॉडल के रूप में, चिकित्सीय अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और साथ ही क्षतिग्रस्त ऊतकों के प्रतिस्थापन के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I Collagen extracted from calf hide
Hydrocloric Acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) MP Biomedical U5378 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS
Albumium from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A9647
Glutaraldehyde Sigma -Aldrich G5882 Toxic
Lard Fields 3090
Stainless Steel Molds Milled using Microlution Machine
Air Brush Kit Central Pneumatic 47791
Mixing Tip for double syringe Medmix ML2.5-16-LLM Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med
Small O ring for double syringe Medmix PPB-X05-04-02SM Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural
Double Syringe cap  Medmix VLX002-SM Cap, 4:1/10:1, PE brown, med
Big O ring for double syringe Medmix PPA-X05-04-02SM Piston A, 5 ml, 4:1
Double Syringe Medmix SDL X05-04-50M Double syringe, 5 ml, 4:1
Double Syringe Dispenser Medmix DL05-0400M Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain
Laminim 3.6 mg/ml - extracted USC lab
20 ml Syringe Luer Lock Tip BD 302830
Luer Lock Caps Fisher JGTCBLLX
HEPES Sigma -Aldrich H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) Life Technologies 1143-030
Trypsin Life Technologies 27250-018
UV Crosslinker  Spectroline UV XLE1000
Sodium Cloride (NaCl) Fisher S271-10 To prepare Mosconas
Potassium chloride (KCl) Sigma -Aldrich P5405-250 To prepare Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328-500 To prepare Mosconas
Glucose Sigma -Aldrich G-8270 To prepare Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S-7907 To prepare Mosconas
Sterile Filter for syringes Corning 431224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
  2. Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
  3. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
  4. Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
  5. Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
  6. Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  7. Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
  8. Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
  9. Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
  10. Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
  11. Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
  12. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  13. Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
  14. Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
  15. Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
  16. Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
  17. Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
  18. Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
  19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
  20. Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
  21. Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
  22. Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
  23. Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723 (2012).
  24. Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 108 Biomimetic मज्जा बीएसए ऊतक इंजीनियरिंग Biofabrication biomaterials मोल्डिंग कास्टिंग hydrogels कंप्यूटर सहायता सॉफ्टवेयर सीएडी 3 डी scaffolds
तीन आयामी Biomimetic प्रौद्योगिकी: उपन्यास Biorubber कोलेजन hydrogels में निर्धारित सूक्ष्म और स्थूल पैमाने आर्किटेक्चर बनाता है
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J.… More

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter