Abstract
Тканевые каркасы играют решающую роль в процессе регенерации тканей. Идеальный каркас должен выполнить ряд требований, таких как наличие надлежащего состава, целевого модуля, и четко определенными архитектурными особенностями. Биоматериалы, которые воспроизводят внутреннюю архитектуру естественных тканей в жизненно важны для изучения заболеваний, а также для облегчения восстановления утерянных и искаженной мягких тканей. Новую технику biofabrication был разработан который сочетает современные изображения, трехмерной печати (3D), и селективной ферментативной активности создать новое поколение биоматериалов для исследований и клинического применения. Разработан материал, бычий сывороточный альбумин каучук, является реакция под давлением в литейную, которая поддерживает конкретные геометрические особенности. Это расходуемый материал позволяет надлежащей передаче архитектурных особенностей к естественному каркасный материал. Прототип состоит из 3D коллагеновой матрицей с 4 до 3 мм каналов, которые ReprESENT разветвленную архитектуру. Эта статья подчеркивает использование этой техники biofabrication для генерации природных конструкций. Этот протокол использует компьютерное программное обеспечение с (CAD), чтобы изготовить прочную форму, которая будет реакция вводили BSA каучука с последующим ферментативным расщеплением резины, оставляя его архитектурные особенности в пределах каркасной материала.
Introduction
В тканевой инженерии области возможность изготовления каркасов ткани является жизненно важным. Подходящий каркас ткань имеет 3D структуру, состоит из биосовместимых материалов, и имитирует в архитектуре ткани естественных способствовать росту и ремоделирования клеток и тканей. Это каркас должен позволять транспортировку питательных веществ и удаление отходов 1-4. Одним из главных препятствий в производстве этих каркасов является способность повторять конкретные геометрические особенности в биосовместимого материала. Несколько методов biofabrication сообщалось контролировать геометрические характеристики этих каркасов, примеры электроформования 5-8, растворитель литье 9, стереолитографии 10, и 3D-печати 11, среди других. Эти методы лишены в обеспечении относительно легко переносить контролируемых внутренних и внешних архитектурных особенностей, которые дорого, ограничиваются их разрешения и печатными (
Во многих коммерческих системах изготовления, создание внутренних пустот, каналов и функций достигается применением песка или других подходящих съемных или жертвенные материалы. Металл или пластик часть формируется вокруг песчаной форме, и как только она затвердевает, песок удаляется. В той же манере, что следующее поколение биоматериалов нуждается в biosand эквивалент. Таким образом, резиновое БСА был разработан в качестве замены для biosand. Резины БСА является недавно сформулированы материал, который состоит из бычьего сывороточного альбумина, сшитой с помощью глутаральдегида. Конечной целью является воссоздание конкретных архитектурных особенностей в биоразлагаемых коллагеновой матрицей. Характеристики жертвенного biorubber который поддерживает и размерную точность с плесенью исходного ткани описаны.
виво эластичность тканей в и другие характеристики интересующей ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Определить процент твердых веществ в Batch коллагена
- Экстракт коллагена следующей ранее опубликованной методике 13. Оттепель минимум 20 мл коллагена. Определить начальную процент коллагена твердых веществ в партии для того, чтобы манипулировать концентрацию коллагена в образованных гидрогелей.
- Нарезать три кусочка алюминиевой фольги (около 6 х 6 см) и форма каждый как на сковороде, используя дно стакана 25 мл. Запишите вес каждого поддона.
- Добавьте небольшое количество коллагена в каждую кастрюлю и записывать общий вес алюминиевого поддона и коллагена. Добавить 0,5 - 0,8 г коллагена на каждом алюминиевую кастрюлю.
Примечание: После этого шага, есть три кастрюли из алюминиевой фольги и каждый из них должен иметь небольшое количество коллагена. Убедитесь, чтобы записать вес каждого (всего 3) пустой алюминиевой посуде и вес поддона после добавления коллагена. - Рассчитывают вес коллагена в каждую чашку с использованием пollowing формулу:
Коллаген вес = Pan и вес коллаген - вес Pan - Поместите три алюминиевые кастрюли, которые держат коллаген в духовке при температуре 100 ° С в течение 24 ч.
- Через 24 часа, записывать вес каждого алюминиевую кастрюлю и обезвоженную коллагена.
- Рассчитывают вес обезвоженного коллагена, используя следующее уравнение:
Высушенные вес коллагена = Pan и обезвоженной массы коллаген - Пан вес - Вычислить процент твердого вещества в течение трех образцах для определения концентрации твердого коллагена, используя формулу ниже:
- Рассчитывают среднюю коллагена содержание твердого вещества в пакете с использованием процент коллагена твердых для каждого из трех образцов.
Примечание: Коллаген, который будет использоваться то, что осталось от гидратированного коллагена. не будут использованы Ни один из обезвоженного коллагена. - После определения процентного содержания коллагена твердого вещества (Initial концентрация коллагена) из партии, продолжать использовать оставшееся гашеной коллагена. Используйте калиброванный рН-метр для доведения рН коллагеновой партии к 3.
- Добавить небольшое количество (2-5 мкл одновременно) от 12 N соляной кислотой (HCl). Держите на льду во все времена. Не следует добавлять соляную кислоту непосредственно к коллагену - добавить кислоту в стороне трубки. После добавления кислоты, используют шпатель, чтобы подтолкнуть кислоты к коллагену и быстро размешать смесь.
- Когда она достигнет рН 3, пусть коллаген сидеть O / N при 4 ° С.
2. Подготовка BSA Резина
- Приготовьте раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в соответствии с процедурой, перечисленных ниже.
- Получают раствор 2x фосфатно-солевом буферном (PBS). Добавить две таблетки PBS до 100 мл воды, чтобы сделать 0,02 М раствора PBS.
- Объединить BSA с 2x PBS, чтобы создать 30% раствора BSA с помощью приведенной ниже процедуре.
- Например, чтобы сделать 30% BSA в 30 мл 2 раза PBS, использовать 12,9 г BSA. Добавить 1/3 2x PBS (например, 10 мл) в колбе с мешалкой. Добавить 1/2 БСА (например, 6,45 г BSA) в колбу и с помощью шпателя, смачивать сухой растворенное вещество.
- Повторите этот процесс добавления PBS, а затем BSA, пока все вещества и растворителя в колбе. Используйте лопаточку, чтобы смочить всю растворенное вещество. Это будет выглядеть как смесь некоторой жидкости и сгустки. Пусть сидят в течение примерно 30 мин.
- Затем включите мешалку на низкой цикла и убедитесь, что нет скопления вокруг мешалки. Следует принять 90 мин, чтобы все в растворе или он может быть оставлен перемешивании O / N при 4 ° С. После растворенное вещество полного растворения, поместите раствор в 20 мл шприц и закрыты шприцевой фильтр 0,20 мкм. Нажмите на поршень, чтобы изгнать жидкость через фильтр и собирают стерилизованного раствора в новую пробирку. Хранить при 4 ° С.
- Подготовьте 3% глутаральдегида Solutiна разбавлением 25% раствора глутаральдегида стерильного отфильтрованного 2x PBS. Например, в течение 10 мл 3% -ного раствора глутарового альдегида, использовать 2 мл 25% глутаральдегида и 8 мл 2 раза PBS. Хранить при 4 ° С.
3. Формы обращения
Примечание: Прототип описано в этой статье использует пользовательский сделал из нержавеющей стали Y формы кусок. Плесень содержит приток и отток два канала 4 и 3 мм соответственно. Во-первых, чистые формы, спрей их с ненасыщенным сала, и стерилизовать их. Подготовьте формы в соответствии с процедурой, описанной ниже.
- Чистые формы из нержавеющей стали с использованием ультразвукового при частоте 35 кГц. Поместите формочки в ультразвуковом и погрузить их с водой и льдом. Держите формы холодной во все времена во время обработки ультразвуком работает. Запуск ультразвукового течение 2 периодов 90 мин.
- После каждого периода, используйте иглу, чтобы убедиться, что нет материала в Luer защелкнулись нержавеющую сталь или бРасс разъем. Используйте мыло и воду, чтобы очистить всю поверхность обеих сторон изложницы. Убедитесь, что нет никаких препятствий в каналах.
- Поместите формочки, винты и разъем замка Luer в автоклаве сумку и автоклаве.
- Наполните бутылку, которая крепит к половине пути воздушного распылителя с коммерчески доступного сала (смешанное жирных кислот релиз агента). Замените крышку с регулярной колпачок бутылки. Поместите его в автоклаве сумку и автоклаве.
Примечание: Сало используется, чтобы облегчить выпуск материала, который будет реакция вводят позже (BSA каучук). Не оставляйте крышку распылитель бутылки в autoclave- это может повредить внутреннюю прокладку. - Разминка сало в течение 45 секунд или до его ясным и жидкости в микроволновой печи. Винт воздушный распылитель крышку на бутылку сало. Подключение крышку с распылителя. Присоединить распылитель к источнику воздуха на лабораторном столе. Откройте воздушный клапан, и открыть сопло распылителя пока она не начнет смачивания поверхностииз бумажным полотенцем.
- Спрей сало перпендикулярно поверхности формы, пока поверхность не полностью покрыта. После каждый кусок был распылен, поместите их в чашку Петри и запечатать его. Поместите формочки при 4 ° С в течение 2 ч.
- Продолжать стерилизовать формы, подвергая поверхность воздействию УФ света в течение 30 мин. Поместите их обратно при 4 ° С, пока они не готовы быть реакция вводили.
4. Реакция Инъекция BSA Резина
Примечание: Все материалы и решение должно быть держать холод до готовый использовать не для предотвращения преждевременного установку резины BSA в следующих шагах.
- Подготовьте дозатор для подачи резины BSA к пресс-формам, выполнив следующие действия.
- Стерилизовать всех смесительных компонентов (двух уплотнительных колец, шприц крышкой, дважды шприцев, смешать наконечник, и 4: 1 диспенсер), подвергая их ультрафиолетовым светом в течение 30 мин в полимеразной цепной реакции (ПЦР) капот.
Примечание: ПЦР капот был использован, потому что тего процедура включает фиксаторы. Эти химические вещества не могут быть использованы в капот культуре клеток / тканей из-за риска заражения и токсичностью по отношению к клеткам. Любой другой капот, который содержит ультрафиолетовый свет будет подходящим. - Поместите крышку наконечника на держателе раствора.
- Выполните сведение и инъекции в соотношении 4: 1 БСА: Глютаральдегид. Добавьте 30% BSA к двойному шприца камеры, которые будут доставлять наибольшее количество раствора (Это займет приблизительно 4 мл для заполнения). Убедитесь, чтобы оставить достаточно места, чтобы разместить уплотнительное кольцо, чтобы предотвратить перелива и загрязнения прилегающей камере.
- Добавить 3% -ный раствор глутарового альдегида в другую камеру (это займет около 1 мл для заполнения). Убедитесь, чтобы оставить достаточно места, чтобы разместить уплотнительное кольцо для предотвращения перелива и загрязнения прилегающей камере.
- Поместите двойной шприц на дозатор. Наклоните сборку вертикально, так что шприц колпачок находится на вершине. Замените крышку с наконечником для смешивания.
- Южная КаролинаREW два нержавеющих куски стальной формы вместе.
- Поместите сборку внутри автоклава сумку.
- Чтобы удалить весь воздух в дозаторе, удерживать ее в вертикальном положении и быстро выжимать ручку один раз, чтобы освободить небольшое количество БСА, смешанного с помощью глутаральдегида. Затем быстро прикрепить разъем замка Luer нержавеющей стали Y пресс-формы для наконечника шприца.
- Удерживая нержавеющей стали Y форму с левой стороны, и БСА-Глютаральдегид смеси дозатором справа. Альтернативный охватывающих каждую из левой и правой выхлопе выпускных каналов нажатием выхлоп по бокам автоклава пакет, чтобы убедиться, что внутри пустоты заполнены раствором. Затем поместите формочки в горизонтальном и впрыснуть снова.
- Отделить формочки из дозатора и место в 25 мм чашки Петри.
- Поместите парафином вокруг чашку Петри, чтобы предотвратить дегидратацию резины.
- Поместите форму в 4 ° C холодильник O / N.
- Стерилизовать всех смесительных компонентов (двух уплотнительных колец, шприц крышкой, дважды шприцев, смешать наконечник, и 4: 1 диспенсер), подвергая их ультрафиолетовым светом в течение 30 мин в полимеразной цепной реакции (ПЦР) капот.
Примечание: Коллаген должны храниться на льду в течение всего времени процесса.
- Изменение концентрации коллагена, используя процент коллагена твердых веществ.
- Сделать 10 мл 1,75% коллагена, регулируя начальную концентрацию коллагена с холодной водой.
- Используя калиброванный рН-метр, доведения рН до 3 с помощью 12 N соляной кислотой. Не следует добавлять соляную кислоту непосредственно к коллагеном добавить кислоту в стороне трубки. После добавления кислоты, использовать лопаточку, чтобы подтолкнуть кислоты в коллагена и быстро размешать смесь.
- Взвесить 4 г коллагена в отдельном коническую трубку.
- Центрифуга коллаген, чтобы удалить воздух при 4 ° С и 9,343 мкг в течение 20-30 мин.
- УФ стерилизации капот культуре клеток в течение 30 мин, и добавить 14 мкл ламинин к 4 мл коллагена. Это приведет к конечной концентрации ламинина 10 мкг / мкл. Примечание: Laminin обеспечивает секtructural целостности, адгезии и способствует развитию различных клеточных реакций.
- Поверните ПЦР УФ-светом в течение 20-30 мин до использования капот для стерилизации.
- Поместите блокировки колпачок Luer, чтобы прикрепиться к 20 мл шприц, в этаноле в течение 2 ч. Затем дайте ему высохнуть и поместить его в ультрафиолетовом свете.
- Гамма облучать коллаген 8,6 мин, чтобы достичь 1200 сГр.
Примечание: Время будет зависеть от распада источника цезия. Регулировка времени, чтобы достичь той же дозировке.
6.Casting коллаген на БСА Резина
- Чтобы полимеризовать коллаген, используют 8: 1: 1 соотношение (коллаген: HEPES: MEM). Следующая процедура основана на начальной 4 г подкисленного коллагена (из стадии 5.1.8).
- Делают 0,2 н раствора HEPES в воде, и доведени рН до 9 добавлением небольших количеств (1-5 мкл) 1-5 М раствором гидроксида натрия (NaOH). Используя калиброванный рН-метр, мониторинг рН раствора после каждого добавления. Хранить при 4 ° С или кеер на льду.
- Включите УФ свете капот культуре ткани в течение 20-30 мин, чтобы стерилизовать капот.
- Автоклав щипцы, лопаточки и скальпель для стерилизации.
- Смешайте 1,5 мл 0,2 N HEPES (рН 9) и 1,5 мл 10х MEM с использованием тканевой культуры капот. Удостоверьтесь, чтобы держать его на льду и вихря в течение 5 сек до использования. Хранить при 4 ° С или держать на льду.
- Для стерилизации капот ПЦР, включите ультрафиолетового света в течение 30 мин.
- Поместите 12 пластины также и 20 мл шприц в -20 ° C в течение 10 мин, или до готовый продолжить. Примечание: Держите все материалы на холоде до готовности к использованию. Повышение температуры вызывает преждевременное коллагена фибриллогенез.
- Спрей все трубы и луночных, которые собираются находиться в капот с 70% этанола и дайте им высохнуть на стерилизацию. Поместите 20 мл шприц на льду для охлаждения для последующего использования.
- В капотом ПЦР, открыть формы из нержавеющей стали, чтобы освободить BSA резины и с помощью скальпеля, разрезать выхлопные каналы БСА гubber плесень.
- Под капотом ПЦР, открыть стерильные коллагеновые трубки и добавить 1 мл раствора HEPES-MEM (убедитесь, что перед извлечением решение HEPES-MEM, что это хорошо перемешивается и нет твердых отложений).
- Используя стерильный шпатель, тщательно перемешать коллагена и буферный раствор.
- Закрыть и вихрь быстро, чтобы обеспечить хорошо перемешанную гидрогель.
- Переход к холодной 20 мл шприц.
- С одной стороны, провести BSA Резина внутри скважины и, используя другой, обойтись половину раствора коллагена гидрогеля на дне колодца.
- Используя стерильные пинцеты, убедитесь, что приток резины и отток концы касаясь стороны скважины.
- Налейте раствора коллагена в верхней части каучука, пока не будет полностью покрыт.
- Убедитесь, что резиновая БСА подвешен внутри коллагена и что нет никаких пузырей, особенно вблизи концов резины.
- Поместите крышку и завернуть парафином вокругокружности скважины.
- Поместите в инкубаторе в течение 1 ч при 37 ° С. Держите ПЦР УФ свет.
- После полимеризации коллагена, УФ сшивания гидрогеля с помощью следующей процедуры.
Примечание: Сшивание коллагена будет сделано с использованием УФ сшивающего аппарата, в котором количество энергии может быть контролируемой.- Включите УФ сшивателя и использовать настройку энергии облучать пустой камеру с 630000. мкДж / см 2.
- Удалить гели из инкубатора.
- Спрей руки с этанолом, и, внутри камеры, снять крышку как можно быстрее.
- Закройте камеру и УФ сшивания гидрогели, выбрав настройку энергии и облучение 630000 мкДж / см 2.
- После цикла сшивки, выключить ультрафиолетовый свет на капот ПЦР
- Спрей руки с этанолом и открыть камеру, быстро поставив крышку обратно на луночного планшета. Перемещение луночного планшетак капоту ПЦР.
- Используя стерильный шпатель, аккуратно ослабить и удалить гель из колодца. Флип гели под капотом для сшивания дна гидрогеля. Повторите шаг 6.2.3 и 6.2.4.
7. Фермент Расщепление BSA Резина
- Для того чтобы иметь полую коллагеновой матрицей, удалить BSA Резина таким образом, что не влияет на размеры внедренных в гидрогеле. Эта процедура описана ниже.
- Включите УФ-светом в течение 20-30 мин для стерилизации капот культуры ткани.
- Сделать 0.25% раствора трипсина рН 7,8. Например, в течение 15 мл воды, добавить 0,0376 г трипсина в 50 мл коническую пробирку. Доводят рН до 7,8 путем добавления небольших количеств (2-5 мкл) 1 М NaCl. Поместите раствор в 20 мл шприц и закрыты шприцевой фильтр 0,20 мкм. Нажмите на поршень, чтобы изгнать жидкость через фильтр и собирают стерильный раствор в новую пробирку.
- Включите водяной бане и установить температуру до 30° С.
- Через 30 мин выключить ультрафиолетовый свет. Спрей этанол на всех труб и материалов, которые будут использованы в капотом.
- Перенести коллагена гидрогель под капотом и место в отдельном коническую трубку.
- Добавьте около 3-5 мл (достаточно, чтобы покрыть гели) от 0,25% раствора трипсина при рН 7,8 в каждую пробирку.
- Уплотнение трубки парапленкой и вихря слегка в течение приблизительно 1 мин.
- Место в ванной С 30 ° С водяной для 15-24 ч. В то время как в водяной бане, слегка вихрь гелей часто, пока резиновая БСА не была переваривается или удалены из гидрогеля.
Примечание: Для того чтобы определить, является ли резиновая БСА была удалена, либо резиновый плавает в растворе трипсина или есть раздолбанные штук. Там не должно быть никаких видимых темные участки гидрогеля.
- Чтобы гарантировать, что все БСА резины и трипсин был удален из гидрогелей, промыть его, как описано ниже.
- Включите ого ПЦРУльтрафиолетовый свет в день в течение 20-30 мин.
- Приготовьте раствор Mosconas. Объединить хлорид калия (KCl, 28,6 мМ), (NaHCO 3, 11,9 мМ), глюкозу (9,4 мм) и (NaH 2 PO 4, 0,08 ммоль) в воде. Регулировка рН до 7,4 с помощью 1 М NaOH или 12 М раствора HCl. Поместите раствор в 20 мл шприц и использовать шприц фильтр 0,20 мкм для стерилизации раствора.
- Спрей все с этанолом до размещения их на капот и позволяют этанол высохнуть.
- Открыть трубку и перенесите 5-10 мл стерильного раствора Mosconas к новому 50 мл коническую пробирку.
- Перенести коллагена гидрогель к конической трубе, содержащей раствор фермента. Убедитесь, что гидрогель полностью покрыта раствором. Оставьте трубку в шейкере в холодильнике при 4 ° С в течение 30 мин.
- Аспирируйте решение Mosconas и повторите шаг 7.2.5 вдвое.
- Хранить при 4 ° С.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Полученные результаты показывают, что эта методика biofabrication эффективен в генерировании 3D каркасов, которые могут имитировать пространственное расположение видно на ин виво ткани. Архитектурные особенности являются жизненно важными параметрами для тканевой инженерии применения, играющие ключевую роль во взаимодействии в естественных клеток и функциональности ткани.
Последовательность и смешиваемость резины BSA был важный параметр в производстве резины BSA, которое однородно и способен поддерживать его предполагаемое форму. Растворимость белков определяется межмолекулярными эффектами, такими как белок-белкового взаимодействия, и взаимодействия с растворителем, который индуцирует изменения на общее поведение белка. Измеряли проводимость раствора BSA, который является показателем концентрации солей растворов. В таблице 1 приведены combinatiзащ- BSA, растворитель, и глутаральдегид проходят. Как и ожидалось, образцы, которые имели самый высокий проводимость (2x PBS растворитель) способствовало растворимости BSA.
Другой параметр, используемый для определения соответствующего условию для развития этой расходуемого материала была скорость реакции. Время реакции БСА уменьшилось, так как концентрация глутарового альдегида повышенной, как ожидалось. Фиксатор взаимодействует с альфа-аминогрупп аминокислот, в N концевой аминогруппой пептидов и сульфгидрильную группу цистеина. Глутаральдегид реагирует преимущественно с БСА через аминогрупп лизина с образованием межмолекулярных ковалентных связей (рис 1а) 14. После инкубационного периода, образцы показали изменение цвета от бледно-желтого до темно-желтого и коричневого, активизируются с повышенной концентрацией глутаральдегида (Фиг.1В). 20%, 30%, чтод 40% БСА 2% глутаральдегида в воде не образуют каучук. 40% раствор БСА, из-за его высокой вязкости и высокой реакционной фиксатором, в результате различной силы вдоль резины. Такое поведение может быть вызвано трудностью глутаральдегида в проникновении в белковые цепи гомогенно. Растворитель большое влияние на растворимость белка, а также его реакцию с фиксатором. В 2x решения PBS были легко смешивается. Раствор БСА водой было трудно смешать. Растворимость BSA сильно зависит от проводимости растворителя (таблица 2), в результате чего конформационные изменения в белке. Наиболее перспективными образцы были 30% БСА с добавлением 3% глутаральдегида в 1x PBS и 2x PBS.
Чтобы гарантировать, что резиновая смог устойчивых погрузочных сил, тест сжатия был выполнен. Были измерены механические свойства четырех образцов БСА резины: 30% BSA 3% глутарового альдегида в2x PBS, 30% BSA 3% глутарового альдегида в 1x PBS, 20% BSA 3% глутаральдегида в PBS 2x и 20% BSA 2% глутаральдегида в 1x PBS. В синусоиды показали очень небольшое изменение фаз между кривыми нагрузки и перемещения (Дополнение Рисунок 2), передаваемых напряжений и деформаций кривых (Дополнение рисунок 3). На основании кривой напряжения и деформации, первые три образца показали гистерезис между погрузки и разгрузки (2А-2С). Эти три образца вел себя как вязкоупругого материала, который содержит упругие и вязкие свойства при применялись силы. 20% BSA 2% глутаральдегид показал признаки остаточной деформации (рис 2D). 30% BSA 3% глутарового альдегида в 1x PBS и 2x PBS показали сходное поведение (рис 2E -он погрузка и разгрузка цикла). Модуль упругости определяли из линейной части этих четырех образцов (рис 2F). Концентрация фосфатаРастворитель значительно увеличило упругости при исследованном диапазоне (р = 0,03). 20% БСА 2% глутарового альдегида в 1x PBS легко деформируется, показывающий более низкий модуль упругости.
Чтобы оценить ферментативного расщепления резины, скорость реакции была рассчитана на основе исчезновения резины BSA при помещении в контакт с ферментом при определенной временной точке. Ферментативная процесс пищеварения, обрабатывали, как реактор периодического действия. Сравнение между исходной концентрации каучука до обработки и резины, оставшегося после того лиофилизировали было сделано, чтобы получить кинетику пищеварения. 3 показана скорость реакции для каждого образца по отношению к концентрации глутарового альдегида и БСА, растворитель, и время пребывания. Явная тенденция наблюдалась между концентрациями сшивающих и скорости реакции диссоциации лица. Статистический анализ проводили в каждый момент времени. Для гое 15-часовой временной точке, концентрация глутарового альдегида существенное влияние на скорость реакции, что приводит к ар стоимости 0,02 (Дополнение таблица 4). После этого момента времени, как глутаральдегид и концентрация БСА существенное влияние на скорость (Дополнение Таблица 5-7). Наиболее влиятельным фактором в целом был концентрация глутарового альдегида, обозначаются более существенное значение р. Увеличение концентрации глутаральдегида снижало скорость реакции переваривания резиновой лица.
Количество белка растворяется трипсина определяли с использованием анализа ВСА (рис.4). Наблюдалась общая тенденция: чем ниже концентрация фиксатора, тем больше белка, переваривают с резиной BSA. Трипсин взаимодействие с образцом каучука путем расщепления БСА и вновь созданные ковалентные связи, образованные в глутаральдегид, таким растворением общую структуру надвремя. Похоже, что с 1x PBS есть больше солюбилизированный белок на более ранней временной точке по сравнению с 2х PBS. Со временем, происходит увеличение белков в растворе при 15 ч, который продолжал расти до 48 час, а затем уменьшается. Это может быть связано с трипсин постоянно расщепления белков и, таким образом, создавая меньшие пептиды и аминокислоты. Она также может быть связано с ограничениями анализе, который может только читать пептиды, которые состоят из трех или более аминокислот. Статистический анализ показал, что концентрация БСА и глутаральдегид существенно влияет на высвобождение белка из резины BSA (р <0,05). Увеличение концентрации БСА вызвал увеличение белка в надосадочной жидкости, а увеличение глутаральдегид вызвало уменьшение растворенного белка.
Для измерения диссоциации этой расходуемого материала, резиновая взвешивали (влажную основу) перед установкой его в КонтаКТ с трипсином. Эквивалент сухого веса резины, помещенного в раствор фермента пищеварения была определена с использованием значений, указанных в Дополнение рисунке 1. Раствор фермента в реакцию с резиной BSA, и, таким образом, солюбилизировали белок. Резины оставшегося после обработки лиофилизировали O / N и взвешивают. Рисунок 5 показывает, что растворитель влияет диссоциацию резины. В то же концентрации БСА и глутаральдегид, каучуки 2x PBS растворителей сохранил больше их материала по сравнению с 1x PBS.
Были изготовлены три твердые кусочки плесени: Петля Mold (Дополнение 4А), шт Стабильность (Дополнение Фиг.4В), и Y Mold (6А, слева). Нержавеющей стали Y формы кусок была создана при машину Microlution (рис 6A, справа). Эта форма была реакция вводили 30% BSA и 3% glutaraldeHyde в 2х PBS (фиг.6В, слева). Резины давали реагировать O / N при 4 ° С. Резины отлили с коллагеном (рис 6В, в центре), а затем фермент переваривается (6В, справа). Предварительные данные свидетельствуют о том, что при рН 7,8 и температуре 30 ° С в течение 15 ч, резиновая БСА могут быть переварены с минимальным воздействием на коллагеновой матрицей. Через 15 ч, резиновая ослабляется под действием фермента и достаточно того, что она покидает каналы, не затрагивая геометрические особенности коллагена свободно. 3D-коллаген каркас был создан, что имеет определенные геометрические особенности. Фиг.6В (справа) показывает канал диаметром 4 мм внутри коллагеновой гидрогеля после ферментативного расщепления резины BSA. Канал был измерен с суппортом чтобы гарантировать, что исходный размер поддерживали. Действительно, новый канал в коллагеновой гидрогеля 4 мм. Резиновые формы BSA может держать размеры как малые, как 300 мкм, который был протестирован намиING плесень стабильности (Рисунок 7). Эти леса были протестированы на остаточную глутаральдегиду и мы не нашли следов после промывок Mosconas.
Рисунок 1. BSA резины. (А) BSA резины реакция. Глутаральдегид сшивает БСА путем создания ковалентных связей. (Б) БСА Резина. Различные концентрации БСА, концентрации глутаральдегида, и тип растворителя отливали на 24-луночные планшеты и взаимодействию O / N при 4 ° С. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2. напряженно-деформированного кривые BSA резин. Напряженно-деформированного кривые BSA ру bbers. (А) 30% BSA 3% глутарового альдегида в 2х PBS; (Б) 30% BSA 3% глутарового альдегида в 1x PBS; (С) 20% BSA 3% глутарового альдегида в 2х PBS; и (D) 20% БСА 2% глутарового альдегида в 1x PBS (3 цикла). Кривые AC показать каучуки, которые имеют некоторую hysteris, но вернуться к своей первоначальной форме. Образец D показывает каучук с очень низким модулем упругости, который легко деформируется, постоянно в ходе процессов загрузки и выгрузки. Образец А и В показали очень сходное поведение как видно на одном погрузки и разгрузки цикла на графике Е (представитель одного цикла каждого образца). Эластичность зависела от концентрации фиксатором и используемого растворителя (F). Образцы демонстрировали значительное увеличение модуля с увеличением солей (** р <0,05). Более высокая концентрация фиксатор вызвало значительное увеличение эластичности резины BSA (* р <0,05).Arget = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. Скорость реакции распада резины BSA. Как фиксирующие увеличивается, скорость реакции уменьшается для всех образцов в 1x PBS (A), 2x PBS (В) и воды (C). 40% BSA 2% глутаральдегид в 2х PBS показывает один из самых высоких показателей реакции. Это связано с трудностью столкнулись в результате чего белок БСА однородным. (синий: 20% BSA, фиолетовый: 30% BSA, и красный: 40% BSA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4. Белок quantifi Катион после ферментативного расщепления. Как фиксирующие увеличивается, белок растворяют из каучуков уменьшается для всех образцов в 1x PBS (A), 2x PBS (В) и воды (C). (синий: 20% BSA, фиолетовый: 30% BSA, и красный: 40% BSA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 5. Резиновая пищеварение. Мы определили количество резины переваренной путем сравнения начальной и конечной сухой основе продуктов. Мы получили наименьшее количество пищеварения на 6% выборки глутаральдегида и в наибольшей степени 30% BSA 2% глутаральдегид в 1x PBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 6. разветвленной прототип. (А) Представление филиала сосудистой сети. С левой представляет собой твердый создаются в Mastercam, который превращают в соль кодекса и изготовлены с использованием Microlution 363-S, как видно на рисунке справа. Нержавеющей стали формы кусок представляет собой 4 мм впускной канал с двумя 3мм оттока каналов. (B) 3D коллагена эшафот. С левой является BSA резины с использованием формы, показанной выше. Центр показывает резину встроенный в коллагена гидрогеля. С правой стороны находятся каналы остаются в коллагеновой матрицей после каучук фермент переваренной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
Рисунок 7. BSA канала. Канал BSA 300 мкм удаляли из стабильного штуку плесени. Существует тонкий слой смазки для форм агента вокруг канала. Дополнительная площадь четко отличать под микроскопом, и может быть легко удалена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
| БСА (%) | Glutaldehyde (%) |
| 20 | 2 |
| 20 | 3 |
| 20 | 6 |
| 30 | 2 |
| 30 | 3 |
| 30 | 6 |
| 40 | 2 |
| 40 | 3 |
| 6 |
. Таблица 1. BSA резиновые параметры BSA и фиксатор смешивали в соотношении 4: 1 с использованием трех различных растворителей.
| Образец | Проводимость (мСм / см) | pH | |
| БСА (%) | растворитель | ||
| 30 | 2x PBS | 11.43 | 7,06 |
| 30 | 1x PBS | 6,35 | 7,05 |
| 30 | DI | 2.39 | 6,76 |
| 20 | 2x PBS | 13.00 | 6,92 |
| 20 | 1x PBS | 8.67 | 7,09 |
| 20 | DI | 2.08 | |
Таблица 2. Проводимость и рН образцов, BSA. Проводимость и рН растворов БСА была измерена в присутствии различных растворителей. Увеличение проводимости показана между 2x и 1x PBS.
| БСА (%) | Глютаральдегид (%) | растворитель | наблюдения | |||
| 20 | 2 | 1x PBS | Мягкий, легкий деформируемый материал | |||
| 20 | 3 | 1x PBS | Мягкий, но более надежное, чем 2% глутаральдегида | |||
| 20 | 6 | 1x PBS | Жесткая, немного хрупкими | |||
| 30 | 2 | 1x PBS | Хорошая последовательность | |||
| 30 | 3 | 1x PBS | Хорошая последовательность | |||
| 30 | 6 | 1x PBS | хрупкий | |||
| 40 | 2 | 1x PBS | Очень непоследовательно в создании гель / резины согласованность | |||
| 40 | 3 | 1x PBS | Консистенция изменяться вдоль образца | |||
| 40 | 6 | 1x PBS | хрупкий | |||
| 20 | 2 | 2x PBS | Мягкий, легкий деформируемый материал, но более надежное, чем образца 1x PBS | |||
| 20 | 3 | 2x PBS | Мягкий, но жестче, чем 2% | |||
| 20 | 6 | 2x PBS | Хорошая последовательность | |||
| 30 | 2 | 2x PBS | Хорошая последовательность, более studry чем 1х PBS | |||
| 30 | 3 | 2x PBS | Хорошая последовательность, более studry чем 1х PBS | |||
| 30 | 2x PBS | Хорошо смешиваемость но ломкими | ||||
| 40 | 2 | 2x PBS | Консистенция изменяться вдоль образца | |||
| 40 | 3 | 2x PBS | Консистенция изменяться вдоль образца | |||
| 40 | 6 | 2x PBS | Консистенция изменяться вдоль образца, и это было хрупким | |||
| 20 | 2 | вода | Не образуют / резинового материала геля | |||
| 20 | 3 | вода | Сформированный гель но кажется жестче, чем тон 1X PBS и 2x PBS, несовместимы | |||
| 20 | 6 | вода | Сформированный гель но кажется жестче, чем 1x PBS и 2x PBS, несовместимы | |||
| 30 | 2 | вода | Не образуют / резинового материала геля | |||
| 30 | 3 | вода | Сформированный гель но кажется жестче, чем 1x PBS и 2x PBS, несовместимы | |||
| 30 | 6 | вода | Сформированный гель но кажется жестче, чем 1x PBS и 2x PBS, несовместимы | |||
| 40 | 2 | вода | Не образуют гель / резины Материаль | |||
| 40 | 3 | вода | Консистенция изменяться вдоль образца - жестче сверху | |||
| 40 | 6 | вода | Консистенция изменяться вдоль образца - жестче сверху | |||
Таблица 3. BSA резины. После резиновая BSA отреагировал O / N, 8-мм трепанобиопсия отверстие образца был взят. Эта таблица содержит некоторые визуальные наблюдения консистенции и внешнему виду образцов.
Дополнение Рисунок 1. Твердые процент. Процент твердых частиц из каждого резины определяли (сухой вес / сырого веса). Растворитель не влияет на PercentaGE твердых (р> 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнение Рисунок 2. Синусоидальная 30% BSA 3% глутарового альдегида 2x PBS. Сжимающей нагрузки и смещение образца приведены как функции времени, отводимого. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнение Рисунок 3. Синусоидальный 30% BSA 3% глутарового альдегида 2x PBS. Стресс и напряжение образца были рассчитаны и построены в зависимости от затраченного времени. Существует небольшая фазовый сдвиг, индиcative вязкоупругого поведения резины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнение Рисунок 4. Mastercam Solids. (A) Петлевые и (Б) стабильность штук. После разработки их с помощью Mastercam, код G был импортирован и нержавеющая сталь или латунь шт использованием машины Microlution или кусок PLA с помощью Makerbot 3D репликатора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| рамки | Минимальная | Максимум | ||
| -17 | 3 | | ||
| Объем (мм) | -1,5 | 0,3 | ||
| Волна | 1-й уровень | Уровень 2 | Частота (Гц) | цикл |
| Синус | -15 | -3 | 1 | 5000 |
| Получение данных | ||||
| время сканирования | 1,008 | |||
| Сканирование точки | 360 | |||
| Количество сканирований </ TD> | 5 | |||
| Последующее сканирование | 1,008 сек от сканирования | |||
Дополнение Таблица 1. Параметры испытания на сжатие. Использование синусоиду, отношения между нагрузкой и перемещением определяли для четырех типов резины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Результаты ANOVA | |||||
| DF | СС | МИЗ | F | Значение F | |
| регрессия | 3 | 9.85E + 02 | 3.28E + 02 | 4.70E + 02 | 1.06E-18 |
| остаточная | 20 | 1.40E + 01 | 6.99E-01 | ||
| Всего | 23 | 9.99E + 02 | |||
| Регрессивный анализ | |||||
| коэффициенты | Стандартная ошибка | т Stat | P-значение | ||
| перехват | 1.74E + 00 | 8.23E-01 | 2.12E + 00 | 4.70E-02 | |
| БСА (%) | 7.82E-01 | 2.09E-02 | 3.74E + 01 | 5.49E-20 | |
| Глютаральдегид (%) | 3.17E-01 </ TD> | 1.03E-01 | 3.09E + 00 | 5.71E-03 | |
| растворитель | 2.61E + 01 | 2.22E + 01 | 1.18E + 00 | 2.53E-01 | |
Дополнение Таблица 2. Статистический анализ процентного содержания твердых веществ в каучуке BSA. БСА и глутаральдегид существенно влияет на процент твердых веществ. Растворитель не влияет на процент твердых веществ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Результаты ANOVA | |||||
| DF | СС | МИЗ | F | Значение F | |
| регрессия | 3 | 3.06E + 05 | 1.02E + 05 | 1.18E + 01 | 4.00E-03 |
| остаточная | 7 | 6.07E + 04 | 8.67E + 03 | ||
| Всего | 10 | 3.67E + 05 | |||
| Регрессивный анализ | |||||
| коэффициенты | Стандартная ошибка | т Stat | P-значение | ||
| перехват | 6.50E + 02 | 4.25E + 01 | 1.53E + 01 | 1.23E-06 | |
| БСА (%) | 4.67E + 00 | 3.80E + 01 | 1.23E-01 | 9.06E-01 | |
| растворитель | 1.02E + 02 | 3.80E + 01 | 2.67E + 00 | 3.20E-02 | |
| Глютаральдегид (%) | 1.16E + 02 | 5.70E + 01 | 2.03E + 00 | 8.21E-02 | |
Дополнение Таблица 3. Статистический анализ модуля упругости, связанной с концентрацией PBS. Концентрация PBS существенно влияет на модуль упругости. Увеличение солей в растворителе вызвало увеличение модуля упругости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| ANOVA Результат | |||||
| DF | СС | МИЗ | F | Значение F | |
| регрессия | 3 | 6.15E-15 | 2.05E-15 | 3.68E + 00 | 1.67E-02 |
| остаточная | 60 | 3.34E-14 | 5.57E-16 | ||
| Всего | 63 | 3.96E-14 | |||
| Регрессивный анализ | |||||
| коэффициенты | Стандартная ошибка | т Stat | P-значение | ||
| перехват | 3.74E-08 | 1.37E-08 | 2.74E + 00 8.03E-03 | ||
| БСА (%) | 3.89E-10 | 3.62E-10 | 1.07E + 00 | 2.88E-01 | |
| Глютаральдегид (%) | -5.92E-09 | 1.83E-09 | -3.23E + 00 | 2.02E-03 | |
| растворитель | -6.78E-08 | 3.76E-07 | -1.80E-01 | 8.58E-01 | |
Дополнение Таблица 4. Статистический анализ скорости реакции после 15 ч ферментативного расщепления. Концентрация глутаральдегид существенное влияние на скорость реакции переваривания резины путем уменьшения при более высоких концентрациях глутаральдегида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Результаты ANOVA | |||||
| DF | СС | МИЗ | F | Значение F | |
| регрессия | 3 | 7.36E-15 | 2.45E-15 | 3.62E + 01 | 1.21E-13 |
| остаточная | 62 | 4.20E-15 | 6.78E-17 | ||
| Всего | 65 | 1.16E-14 | |||
| Регрессивный анализ | |||||
| коэффициенты | Стандартная ошибка | т Stat | |||
| перехват | 2.98E-08 | 4.77E-09 | 6.25E + 00 | 4.22E-08 | |
| БСА (%) | 4.56E-10 | 1.26E-10 | 3.62E + 00 | 6.03E-04 | |
| Глютаральдегид (%) | -6.04E-09 | 6.15E-10 | -9.82E + 00 | 3.00E-14 | |
| растворитель | -6.57E-08 | 1.31E-07 | -5.02E-01 | 6.17E-01 | |
Дополнение Таблица 5. Статистический анализ скорости реакции после 24 ч от ферментативного расщепления. Концентрация БСА и глутаральдегид существенно влияет на скорость реакции при переваривании каучуке. При более высоких концентрациях глутаральдегида, происходит снижение в тон скорость реакции. При более высоких концентрациях BSA, происходит увеличение скорости реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Результаты ANOVA | |||||
| DF | СС | МИЗ | F | Значение F | |
| регрессия | 3 | 3.10E-15 | 1.03E-15 | 2.74E + 01 | 1.64E-11 |
| остаточная | 64 | 2.42E-15 | 3.78E-17 | ||
| Всего | 67 | 5.52E-15 | |||
| Регрессивный анализ | |||||
| коэффициенты | Стандартная ошибка | т Stat | P-значение | ||
| перехват | 2.17E-08 | 3.50E-09 | 6.20E + 00 | 4.55E-08 | |
| БСА (%) | 2.13E-10 | 9.20E-11 | 2.31E + 00 | 2.39E-02 | |
| Глютаральдегид (%) | -3.94E-09 | 4.53E-10 | -8.70E + 00 | 1.90E-12 | |
| растворитель | 3.04E-08 | 9.57E-08 | 3.18E-01 | 7.51E-01 | |
Дополнение Таблица6. Статистический анализ скорости реакции после 48 ч от ферментативного расщепления. БСА и глутаральдегид концентрации существенно влияет на скорость реакции при переваривании каучуке. При более высоких концентрациях глутаральдегида, происходит снижение скорости реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Результаты ANOVA | |||||
| DF | СС | МИЗ | F | Значение F | |
| регрессия | 3 | 2.19E-15 | 7.29E-16 | 3.05E + 01 | 3.56E-12 |
| остаточная | 61 | 1.46E-15 2.39E-17 | |||
| Всего | 64 | 3.64E-15 | |||
| Регрессивный анализ | |||||
| коэффициенты | Стандартная ошибка | т Stat | P-значение | ||
| перехват | 1.05E-08 | 2.84E-09 | 3.69E + 00 | 4.80E-04 | |
| БСА (%) | 3.61E-10 | 7.48E-11 | 4.83E + 00 | 9.48E-06 | |
| Глютаральдегид (%) | -3.07E-09 | 3.69E-10 | -8.33E + 00 | 1.21E-11 | |
| Такlvent | 3.97E-08 | 7.80E-08 | 5.09E-01 | 6.12E-01 | |
Дополнение Таблица 7. Статистический анализ скорости реакции после 72 ч от ферментативного расщепления. Концентрация БСА и глутаральдегид существенно влияет на скорость реакции при переваривании каучуке. При более высоких концентрациях глутаральдегида, происходит снижение скорости реакции. При более высоких концентрациях BSA, происходит увеличение скорости реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biofabrication является весьма междисциплинарной областью, в которой биологии и инженерных принципов слияния для создания сложных материалов, которые имитируют родной ткани. Для того чтобы добиться этого, существует потребность в разработке методов, которые используют информацию, собранную из ткани в естественных условиях и перевести его в в пробирке эшафот. Таким образом, платформа может быть сконструирована, что напоминает архитектурные, функциональные, и механические свойства в естественных условиях ткани. Оптимальное подмости материал должен обладать определенными свойствами, такими как будучи биосовместимый, имитировать механические свойства интересующей ткани, быть способен контролируемой деградации, способны поддерживать жизнеспособность клеток, и способны обеспечить ремоделирование тканей 2,3.
Множество методов изготовления были разработаны, чтобы генерировать жизнеспособные, трехмерные конструкции. Эти технологии делятся на две основные категории: обычный апd расширенный. Обычные методы включают использование синтетических и натуральных традиционных материалов, чтобы сделать пористых структур. Некоторые примеры растворителей литье, сублимационной сушки, и формование расплава. Недостатки этих методов включают плохое управление пористости в структуре (размер пор и поры взаимосвязанность) и проблемы при создании внутренних каналов в пределах каркасах. Усовершенствованные методы включают стереолитографии, литье, 3D печать и электроформования, среди других 1. Эти методы имеют свои недостатки, такие как отсутствие микроархитектуры каналов на большие расстояния, выбор материала, чтобы обеспечить оптимальную механическую прочность и при этом способен дозирования через сопла малого диаметра, оптимизации зависит от материала, требуют обширной постобработки, которые могут быть токсичными, и ограничение в оформлении внутренних архитектур в конструкции в пробирке. Основным недостатком в 3D-печати является наличие биоматериалов, которые адекватные носители сотовые, В то же время имея механические свойства, необходимые для поддержания определенных архитектурных организацию 12. Технология, представленная здесь включает в себя как обычные, так и передовые методы изготовления. Лучшее из обоих миров происходит от конвергенции изготовления автоматизированного создания или импорта, требуемой архитектуры с развитием ферментом лабильным резины. Формы из нержавеющей стали были созданы с использованием фрезерного станка, но их изготовление не ограничивается этой технике. Использование 3D принтера (например, Makerbot), те же формы были изготовлены из полимолочной кислоты (PLA). Негативные формы, измельчали с использованием архитектурных директивы разработанные программы CAD, которая обеспечивает твердые формы, которые создают легкую и надежную передачу функций к любому материалу. Эта технология является существенным в том, что она позволяет не только контроль состава внешнего тканей, но также и весьма сложной внутренней архитектуры. Представленная работа здесьсосредоточена главным образом на характеристике резины BSA, которое может быть смешано гомогенно, легко переваривается в течение разумного промежутка времени, был устойчив к изменениям в его структуре, и имеет возможность имитировать минуту особенности, удерживая его стабильность во время процесса литья , Ограничение этого метода была проверена и разрешение расходуемого материала может поддерживать размеры размером до 300 мкм в диаметре. Однако Фиг.7 показывает, что канал окружен тонким слоем смазки для форм. Используя микроскоп, эта дополнительная зона четко выделены и могут быть удалены, чтобы иметь желаемый размер. Эта методика позволяет biofabrication репликацию широкого спектра внутренних структур, которые варьируются от макро- к микро-масштабе.
Сывороточный альбумин является наиболее распространенный белок в кровеносной системе. Поскольку белки являются полиэлектролиты, растворимость определяли электростатических взаимодействий 15-17. Было показано, что при низких концентрациях соли, существует высаливания в силу на белке, облегчающей его растворимость 18. Глютаральдегид является сшивающий агент, который вызывает изменение свойств альбумина. Изменение цвета показано на рисунке 1 приписывается формирования альдимином связей 19-21. Глутаральдегид реагирует преимущественно с БСА через аминогрупп лизина с образованием межмолекулярных ковалентных связей 14. Данные показывают, что увеличение солей улучшается эластичность резины (с 1x PBS до 2x PBS). Чем выше концентрация глутарового альдегида производит жесткие гели, которые устанавливают ранее по сравнению с низкими те концентрации. Тем не менее, они являются более сложно дозировать, смешивать гомогенно, и они образуют хрупкие гели. Чтобы доставить соответствующее количество BSA резины в формы, каждая часть сборки должны храниться холодно, потому что более высокие температуры ускоряют глутаральдегид и реакцию BSA.Идеальный каучук (30% BSA 3% глутарового альдегида в 2х PBS или 1x PBS) ведет себя как вязкоупругого материала, который способен выдерживать нагрузку без необратимой деформации. Это становится очень важным при обращении и литья материала вокруг резиновой структуры БСА.
Трипсин является сериновой протеазы, который гидролизует белки. Трипсин является широко используемым ферментом, который обладает высокой специфичностью расщепления. Это расщепляет пептидные цепи основном по карбоксильной стороне аминокислот лизина и аргинина 22. БСА хорошо растворим при низких концентрациях в воде, и трипсин легко переваривается BSA резину оставляя коллаген неповрежденными и относительно нетронутым. Материал не будет иметь никаких контактов с клетками. Конструкт был протестирован на наличие свободной глутаральдегид и не было никаких следов этого фиксатором. Это демонстрирует эффективность резины BSA в качестве расходуемого материала для biofabrication. В этом протоколе, коллаген был использован в качестве каркасного материала, но любой OTможет быть использована ее материал, который устойчив к трипсина пищеварения.
Дальнейшая работа будет сосредоточена на воссоздании сосудистые компоненты в гидрогелей путем посева на эшафот с эндотелиальных и фибробластов. Одна из проблем заключается в создании равномерного распределения клеток по всему внутренней части каналов, которые имитируют родной распределение 3D. Чтобы решить эту проблему, стратегия разрабатывается, что позволяет уплотнение или закупорки каналов и инъекции суспензии клеток. Материал тестируемый Pluronic F127, который является термообратимый гель, жидкость при температуре 4 ° С и твердое выше 30 ° С 23,24. Высокая концентрация Pluronic был успешным в создании необходимой временной пломбы. После клеточной суспензии в каналах строительных лесов, компания вращается в течение определенного времени, пока клетки не придерживаться всех сторон 3D структуры. Внутри канала будет иметь адекватную носитель для сохранениявыживаемость клеток. Pluronic сохраняет свою форму геля и хорошо растворим в водной среде. Как только клетки придерживаться, гидрогель будет залита сред, и может культивироваться в стационарных или проточных условиях, в зависимости от цели исследования. Эта методика будет также оценить и станет следить за этой публикации. Методика biofabrication описано здесь в настоящее время используется для разработки эшафот реплику человеческого почечной артерии. Тот же самый подход может быть сделано с другими типами тканей, таких как сердечные, чтобы расширить применимость этого метода для широкого круга клинических применений.
Методика biofabrication разработаны здесь является шагом вперед в генерации каркасов в пробирке, которые могут повторять внутренние геометрические особенности быстро и надежно. Натуральный материал, такой как коллаген, была выбрана потому, что она обеспечивает оптимальную химические и физические сигналы к клеткам более синтетических материалов. Эти натурные материалы могут быть использованы для терапевтических исследований, как модели в пробирке развития, уродства, и ткани болезни, а также для замены поврежденной ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen type I | Collagen extracted from calf hide | ||
| Hydrocloric Acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) | MP Biomedical | U5378 | 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS |
| Albumium from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Glutaraldehyde | Sigma -Aldrich | G5882 | Toxic |
| Lard | Fields | 3090 | |
| Stainless Steel Molds | Milled using Microlution Machine | ||
| Air Brush Kit | Central Pneumatic | 47791 | |
| Mixing Tip for double syringe | Medmix | ML2.5-16-LLM | Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med |
| Small O ring for double syringe | Medmix | PPB-X05-04-02SM | Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural |
| Double Syringe cap | Medmix | VLX002-SM | Cap, 4:1/10:1, PE brown, med |
| Big O ring for double syringe | Medmix | PPA-X05-04-02SM | Piston A, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe | Medmix | SDL X05-04-50M | Double syringe, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe Dispenser | Medmix | DL05-0400M | Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain |
| Laminim | 3.6 mg/ml - extracted USC lab | ||
| 20 ml Syringe Luer Lock Tip | BD | 302830 | |
| Luer Lock Caps | Fisher | JGTCBLLX | |
| HEPES | Sigma -Aldrich | H4034 | |
| Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) | Life Technologies | 1143-030 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 | |
| UV Crosslinker | Spectroline UV | XLE1000 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Fisher | S271-10 | To prepare Mosconas |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma -Aldrich | P5405-250 | To prepare Mosconas |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328-500 | To prepare Mosconas |
| Glucose | Sigma -Aldrich | G-8270 | To prepare Mosconas |
| Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S-7907 | To prepare Mosconas |
| Sterile Filter for syringes | Corning | 431224 |
References
- Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
- Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
- Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
- Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
- Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
- Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
- Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
- Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
- Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
- Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
- Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
- Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
- Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
- Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
- Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
- Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723 (2012).
- Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).
