Abstract
組織足場は、組織再生の過程において重要な役割を果たしています。理想的な足場は、そのような適切な組成を有するなど、いくつかの要件、対象と弾性率、および明確に定義されたアーキテクチャ機能を満たす必要があります。 in vivoでの組織の本質的なアーキテクチャを再現生体材料は、疾患を研究するだけでなく、失われ、不正な形式の軟組織の再生を促進するために不可欠です。新規biofabrication技術は、研究および臨床用途のための生体材料の新世代を作成する技術の画像、3次元（3D）印刷法、選択的酵素活性の状態を組み合わせた開発されました。開発した材料、ウシ血清アルブミンゴムは、特定の幾何学的特徴を掲げ型に注入反応です。この犠牲材料は、天然の足場材料への建築の特徴を十分に転送できます。プロトタイプは4と3ミリメートルチャンネルのreprで3Dコラーゲン足場で構成されてい分岐構造をESENT。本論文では、自然の構築物の生成のためのこのbiofabrication技術の使用を強調しています。このプロトコルは、足場材料内にその建築の特徴を残して、ゴムの酵素消化に続いて、BSAゴムを注入し、反応になる固体の金型を製造するためのコンピュータ支援ソフトウェア（CAD）を利用します。
Introduction
組織工学の分野では、組織スキャフォールドを製造する能力が不可欠です。適切な組織足場は、3次元構造を有する、生体適合性材料から構成されており、 生体内組織アーキテクチャの模倣は、細胞および組織の増殖及びリモデリングを容易にします。この足場は、栄養素の輸送や廃棄物1-4の除去を可能にしなければなりません。これらの足場の製造における主な障害の一つは、生体適合性材料に特有の幾何学的特徴を再現する能力です。いくつかのbiofabrication技術がこれらの足場の幾何学的特徴を制御するために報告されており、例としては、溶媒キャスティング9、造形10 5-8エレクトロスピニングされ、とりわけ、11 3Dは、印刷します。これらの技術は、制御可能な内部および外部の建築の特徴を比較的容易に転送を提供するには及ばない高価であり、（彼らの解像度と印刷適性によって制限されています
多くの商業的な製造システムでは、内部空隙、チャネル、および機能の作成は、砂または他の適切な取り外し可能または犠牲材料を使用して達成されます。金属又はプラスチック部品は、砂型の周囲に形成され、そしてそれが固化した後、砂を除去します。ほぼ同じ方法で、生体材料の次世代biosand相当を必要とします。したがって、BSAゴムはbiosandの代替品として開発されました。 BSAゴムはグルタルアルデヒドで架橋されたウシ血清アルブミンから成る新たに処方材料です。究極の目標は、生分解性コラーゲン足場に固有のアーキテクチャ機能を再作成することです。元の組織の型と次元の忠実度を維持し、犠牲biorubberの特性が記載されています。
は 、生体内の組織の弾力性と関心の組織の他の特性を模倣するように調整することができる高忠実度、比較的容易かつタイムリーな問題で生分解性材料に固有の幾何学的な有益を提供するために実行可能な技術を提供します。
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Protocol
1.コラーゲンバッチ中の固形分の割合を決定
- 以前に公開されている手順13以下のコラーゲンを抽出します。コラーゲンの20ミリリットルの最小値を解凍します。形成されたハイドロゲル中のコラーゲン濃度を操作するために、バッチ中のコラーゲン固形分の最初の割合を決定します。
- アルミ箔（約6×6センチ）の3枚をカットし、25ミリリットルのビーカーの底を使用して、パンなどの各1を形作ります。各パンの重量を記録します。
- 各パンにコラーゲンの少量を追加し、アルミニウムパンとコラーゲンの総重量を記録します。各アルミニウムパンにコラーゲンの0.8グラム - 0.5を追加します。
注：このステップの後、そこに3アルミ箔鍋があり、それぞれ1はコラーゲンの少量を持っている必要があります。各（合計3）空のアルミニウム製パンの重量とコラーゲンの添加後のパンの重量を記録するようにしてください。 - Fを使用して各皿中のコラーゲンの量を計算します式をollowing：
コラーゲン量=パンとコラーゲンの重量 - パンの重量 - 24時間100℃のオーブンでコラーゲンを保持する3アルミニウム皿を置きます。
- 24時間後、それぞれのアルミニウムパンと脱水コラーゲンの重量を記録します。
- 以下の式を用いて脱水したコラーゲンの量を計算します。
脱水コラーゲン量=パン、脱水コラーゲン重量 - パン重量 - 以下の式を使用してコラーゲン固形分濃度を決定するための3つのサンプルのための固体の百分率を計算します。
- 3つのサンプルのそれぞれのためのコラーゲン固形分の割合を使用してバッチの平均コラーゲン固形分を計算します。
注意：使用されるコラーゲンは、水和したコラーゲンから残っているものです。脱水コラーゲンのいずれも使用されません。 - 固体コラーゲンの割合を決定した後（ⅰバッチのnitialコラーゲン濃度）は、残りの水和したコラーゲンを使用し続けます。 3にコラーゲンバッチのpHを調整するために較正されたpHメーターを使用。
- 12 N塩酸（HCl）の少量（一度に2-5μl）を追加します。すべての回で、氷上で保管してください。コラーゲンに直接塩酸を追加しないでください - チューブの側面に酸を追加します。酸を添加した後、コラーゲンに酸をプッシュするためにスパチュラを使用してすばやく混合物をかき混ぜます。
- それは3のpHに到達すると、コラーゲンは4℃でO / Nを座らせて。
BSAゴムの調製
- 以下に記載されている手順に従って、ウシ血清アルブミン（BSA）溶液を調製します。
- 2倍のリン酸緩衝溶液（PBS）を準備します。 0.02 M PBS溶液を作るために水100mlに2 PBS錠を追加します。
- 以下に示す手順を用いて30％BSA溶液を作成するために、2×PBSでBSAを兼ね備えています。
- 例えば、2×PBSの30ミリリットルと30％のBSAを作るために、BSAの12.9グラムを使用します。攪拌棒を備えたフラスコに2×PBS（ 例えば、10ミリリットル）の1/3を追加します。フラスコにBSA（ 例えば、6.45グラムのBSA）の1/2を追加し、スパチュラを用いて、乾燥溶質を濡らします。
- すべての溶質と溶媒をフラスコになるまでPBS、その後、BSAを追加するこのプロセスを繰り返します。すべての溶質を濡らすためにへらを使用します。これは、いくつかの液体と塊の混合物のようになります。それは約30分間座ってみましょう。
- そして、低サイクルに攪拌機をオンにし、攪拌棒周りに塊がないことを確認します。これは、溶液中のすべてを取得するために90分を取るべきか、4℃でO / N撹拌したままにすることができます。溶質がすべて溶解した後、20mLの注射器で溶液を配置し、0.20μmのシリンジフィルターでキャップ。フィルターを通して液体を排出し、新しいチューブで滅菌溶液を収集するためにプランジャーを押してください。 4℃で保存。
- 3％のグルタルアルデヒドsolutiを準備滅菌濾過し2倍PBSで25％グルタルアルデヒド溶液を希釈することにより、上。例えば、3％グルタルアルデヒド溶液を10mlのために、2~25％のグルタルアルデヒドmlの2×PBS 8mlのを使用。 4℃で保存。
3.金型の治療
注：このホワイトペーパーで説明したプロトタイプは、カスタムメイドのステンレス製Y型部品を使用しています。金型は、それぞれ、流入と4と3ミリメートルの2の流出チャネルを含みます。まず、クリーンな金型は、不飽和のラードでそれらをスプレーし、それらを滅菌します。以下の手順で金型を準備します。
- 35キロヘルツの周波数で超音波処理を使用して清浄なステンレス製の金型。超音波処理器で金型を置き、水と氷でそれらを沈めます。超音波処理器が動作している間、すべての回で冷たい金型を保管してください。 90分の2の期間のための超音波処理装置を実行します。
- 各期間の後、ステンレス鋼またはbをロックルアーでない材料がないことを確認するために針を使用RASSコネクタ。金型の両側の表面全体をきれいに石鹸と水を使用してください。チャンネル内の障害物がないことを確認します。
- オートクレーブ袋に金型、ネジ、及びルアーロックコネクタを配置し、それをオートクレーブ。
- 市販のラード（混合脂肪酸離型剤）と空気噴霧器半分に取り付けられるボトルを埋めます。正規のキャップボトルとキャップを交換してください。オートクレーブ袋に入れて、それをオートクレーブ。
注：ラード反応が（BSAゴム）に後で注入される物質の放出を容易にするために使用されます。それは内部のシールを損傷することがautoclave-にスプレーボトルの蓋を置かないでください。 - 45秒間または電子レンジでそのはっきりと液体になるまでラードをウォームアップ。ラードボトルに空気噴霧器の蓋をねじ込みます。スプレーで蓋を接続します。実験台の空気源に噴霧器を取り付けます。エアーバルブを開き、それは表面を濡らし始めるまで噴霧器のノズルを開きますペーパータオルの。
- 表面が完全に覆われるまで金型表面に対して垂直ラードスプレー。各ピースを噴霧した後、ペトリ皿に置き、それを密封します。 2時間4℃で金型を置きます。
- 30分間UV光に表面を露出させることにより、金型を殺菌するために進んでください。彼らは反応注入する準備が整うまで4℃でそれらをバックに置きます。
BSAゴムの4反応射出
注：すべての材料とソリューションは、次の手順で、BSAゴムの早期設定を防止するために使用する準備ができるまで冷たい維持されるべきです。
- 以下の手順に従って、金型にBSAゴムを配信するためのディスペンサーを準備します。
- ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）フード中で30分間UV光にそれを暴露することによって：混合成分（1ディスペンサ2個のOリング、シリンジキャップ、ダブルシリンジ先端を混合し、4）の全てを滅菌します。
注：PCRフードがトンために使用しました彼の手順では、固定剤を伴います。これらの化学物質は、細胞への暴露と毒性のリスクに起因する細胞/組織培養フード内で使用することができません。 UV光を含む任意の他のフードが適切であろう。 - ソリューションホルダーの先端キャップを置きます。
- BSAの1の比率：4：4で混合し、注入を実行グルタルアルデヒドを。ソリューションの最高額をお届けしますダブルシリンジ室に30％のBSAを追加します（これは、埋めるために約4ミリリットルがかかります）。あふれと隣接する室内の汚染を防止するためにOリングを配置するために十分なスペースを残していることを確認してください。
- （それは埋めるために、約1ミリリットルがかかります）、他のチャンバーに3％グルタルアルデヒド溶液を追加します。あふれと隣接する室内の汚染を防止するためにOリングを配置するために十分なスペースを残していることを確認してください。
- ディスペンサーの二重注射器を置きます。シリンジキャップが上になるように垂直にアセンブリを傾けます。ミキシングチップとキャップを交換してください。
- 皮下2つのステンレス鋼の鋳型片をREW。
- オートクレーブバッグの内側にアセンブリを配置します。
- ディスペンサーに空気を除去するには、直立位置に保持し、すぐにハンドルをグルタルアルデヒドと混合BSAの少量を解放するために1時間を絞ります。その後すぐに、シリンジ先端にステンレス製Y型のルアーロックコネクタを取り付けます。
- 左側、右側にBSA-グルタルアルデヒド混合ディスペンサー付きステンレス製のY型を保持します。代替内部の空隙が溶液で満たされていることを確認するオートクレーブバッグの側面に排気を押して、流出路の左右の排気のそれぞれをカバーしています。そして、水平方向に金型を配置して、再注入します。
- 25ミリメートルペトリ皿にディスペンサーと場所から金型を外します。
- ゴムの脱水を防ぐために、ペトリ皿の周りにパラフィルムを置きます。
- 4℃の冷蔵庫のO / Nで金型を置きます。
- ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）フード中で30分間UV光にそれを暴露することによって：混合成分（1ディスペンサ2個のOリング、シリンジキャップ、ダブルシリンジ先端を混合し、4）の全てを滅菌します。
注：コラーゲンは、プロセス中にすべての回で氷上に維持されるべきです。
- コラーゲン固形分の割合を使用して、コラーゲン濃度を変更します。
- 冷水で最初のコラーゲン濃度を調整することにより、1.75％のコラーゲンの10ミリリットルを加えます。
- 較正されたpHメーターを使用して、12 N塩酸を用いてpHを3に調整します。コラーゲンチューブの側面に酸を追加するに直接塩酸を追加しないでください。酸を添加した後、コラーゲンの中に酸を押し、すぐに混合物を攪拌するへらを使用しています。
- 別個のコニカルチューブ中のコラーゲンを4g秤量します。
- 4℃、20〜30分間、9343×gで空気を除去するためにコラーゲンを遠心します。
- UVを30分間、細胞培養フードを滅菌し、4ミリリットルのコラーゲンへのラミニンの14μlを添加します。これは、10μgの/μlの最終ラミニン濃度になります。注：ラミニンがsを提供tructural完全性、密着性、および様々な細胞応答を促進します。
- 滅菌前のためのフードを使用してPCR UVは20〜30分間点灯し電源を入れます。
- 2時間エタノール中で、20ミリリットル注射器に取り付けられるように、ルアーロックキャップを置きます。そして、それは乾燥し、UV光の中でそれを配置することができます。
- ガンマは1200 cGyでに到達するために8.6分間コラーゲンを照射します。
注：時間はセシウム源の減衰に依存します。同じ投与量に達するまでの時間を調整します。
BSAゴムにコラーゲンを6.Casting
- 1：1の比率（コラーゲン：HEPES：MEM）コラーゲンを重合するために、8を使用します。以下の手順は（ステップ5.1.8から）酸性化し、コラーゲンの最初の4グラムに基づいています。
- 水中の0.2 N HEPES溶液を作製し、1-5 M水酸化ナトリウム（NaOH）溶液の少量（1-5μl）を添加することによりpHを9に調整します。較正されたpHメーターを使用して、各添加後の溶液のpHを監視します。 4°CまたはKEで保存氷上のEP。
- フードを滅菌するために20〜30分間組織培養フードのUV光をオンにします。
- オートクレーブ鉗子、へら、と滅菌用メス。
- 組織培養フードを使用して、0.2 N HEPES（pH値9）とミリリットル10倍MEMの1.5の1.5ミリリットルを混ぜます。使用前に氷の上にそれを維持し、5秒のためにそれをボルテックスすることを確認します。 4℃で保存したり、氷上に保ちます。
- PCRフードを滅菌するために、30分間、UV光をオンにします。
- 10分間-20℃で12ウェルプレートと20ミリリットル注射器を置き、または準備ができるまで継続します。注：使用する準備ができるまで冷たいすべての材料を保管してください。温度の上昇は、早期コラーゲン原線維形成を誘導します。
- 70％エタノールでフードにされ、殺菌のためにそれらを乾燥させしようとしている全てのチューブおよびウェルプレートをスプレーします。後で使用するために冷却するために氷上で20ミリリットル注射器を置きます。
- PCRフード内で、BSAゴムを解放するためにステンレス鋼の金型を開いて、メスを用いて、BSA Rの排気チャネルを切断ubber金型。
- PCRフードの下で、（それは十分に混合し、固形の付着物がないことを、HEPES-MEM液を抽出する前に、そのことを確認してください）滅菌コラーゲンチューブを開き、HEPES-MEM溶液1mlを追加します。
- 無菌のスパチュラを用いて、徹底的にコラーゲンおよび緩衝溶液を混合。
- 閉じると渦、それはすぐに十分に混合されたヒドロゲルを確保します。
- 冷たい20ミリリットル注射器に移します。
- 片手で、井戸の内部のBSAゴムを保持し、他を使用して、ウェルの底部にコラーゲンヒドロゲル溶液の半分を分注します。
- 滅菌ピンセットを用いて、ゴムの流入と流出端部がウェルの側面に触れていることを確認してください。
- 完全に覆われるまで、ゴムの上にコラーゲン溶液を注ぎます。
- BSAゴムはコラーゲンの中に中断されていること、特にゴムの端の近くに気泡が、存在しないことを確認してください。
- カバーを置き、周りにパラフィルムを包みます井戸の周囲。
- 37℃で1時間培養器に入れてください。上のPCR UV光を保管してください。
- コラーゲンの重合後、UVは、以下の手順を介してヒドロゲルを架橋します。
注：コラーゲンの架橋は、エネルギー量を制御することができる紫外線架橋装置を用いて行われます。- UVクロスリンカーをオンにして、63万μJ/ cm 2の空室を照射するエネルギー設定を使用します。
- インキュベーターからゲルを削除します。
- エタノールで手をスプレーし、そして、チャンバ内に、可能な限り迅速にふたを取り外します。
- チャンバーを閉じ、UVは、エネルギー設定を選択し、63万μJ/ cm 2で照射することによりヒドロゲルを架橋します。
- 架橋サイクル後、PCRフードにUV光をオフにします
- エタノールで手をスプレーし、すぐにウェルプレートに裏蓋を配置し、チャンバーを開きます。ウェルプレートを移動PCRフードへ。
- 無菌のスパチュラを用いて、優しく井戸からゲルを緩め、取り外します。ハイドロゲルの底部を架橋するためにボンネットの下にゲルを反転します。繰り返しステップ6.2.3と6.2.4。
BSAゴムの7酵素消化
- 中空コラーゲン足場を有するためには、ヒドロゲル中に埋め込まれた寸法に影響を与えない方法で、BSAラバーを削除します。手順を以下に説明します。
- 組織培養フードを滅菌するために20〜30分間、UV光をオンにします。
- 0.25％トリプシン溶液のpHは7.8にします。例えば、水の15ミリリットルのために、50ミリリットルコニカルチューブにトリプシンの0.0376グラムを追加します。 1MのNaClの少量（2-5μl）を加えることによって、pHを7.8に調整します。 20ミリリットル注射器内の溶液を配置し、0.20μmのシリンジフィルターでキャップ。フィルターを通して液体を排出し、新しいチューブ内の無菌溶液を収集するためにプランジャーを押してください。
- 水浴をオンにして、30に温度を設定°C。
- 30分後、UV光をオフにします。フードに使用される全てのチューブおよび材料にエタノールをスプレーします。
- 個別のコニカルチューブ内のフードと場所の下にコラーゲンハイドロゲルを転送します。
- 各チューブに7.8のpHを有する0.25％トリプシン溶液（ゲルをカバーするのに十分なだけ）の周りに3〜5ミリリットルを追加します。
- パラフィルムと約1分間軽くボルテックスでチューブを密封します。
- 15-24時間、30℃の水浴に入れ。 BSAゴムは消化又はヒドロゲルから除去されるまで水浴中ながら、軽く頻繁にゲルをボルテックス。
注：BSAゴムが除去されたかどうかを決定するために、いずれかのゴムをトリプシン溶液中に浮遊しているか、壊れた部分があります。ヒドロゲル内には視覚的な暗い部分があってはなりません。
- 以下に説明するように、すべてのBSAゴムおよびトリプシンは、ヒドロゲルから削除されたことを確実にするために、それをすすぎます。
- PCRホーオンにします20〜30分間のD UV光。
- Mosconas溶液を調製します。塩化カリウム（KClを、28.6ミリモル）、（のNaHCO 3、11.9ミリモル）、グルコース（9.4ミリモル）及び（のNaH 2 PO 4、0.08 mM）を水に結合します。 1 M NaOHまたは12 M HCl溶液でpHを7.4に調整します。 20ミリリットル注射器内の溶液を配置し、解決策を滅菌するために0.20ミクロンのシリンジフィルターを使用します。
- ボンネット上に置くする以前に、エタノールですべてをスプレーし、エタノールを乾燥させます。
- チューブを開き、新しい50mlコニカルチューブに無菌Mosconas溶液を5〜10mlのを転送します。
- 酵素液が含まれているコニカルチューブにコラーゲンハイドロゲルを転送します。ヒドロゲルは完全に溶液で覆われていることを確認してください。 4℃で30分間冷蔵庫でシェーカーにチューブを残します。
- Mosconas液二回繰り返しステップ7.2.5を吸引。
- 4℃で保存。
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Representative Results
結果は、このbiofabrication技術は、インビボで組織に見られる空間的配置を模倣することができる三次元足場を生成するのに効率的であることを示しています。建築の特徴は、組織の in vivoでの細胞の相互作用と機能性において重要な役割を果たしている組織工学アプリケーションのための重要なパラメータです。
BSAゴムの一貫性と混合性が均一であり、その意図された形状を維持することが可能であるBSAゴムの製造において重要なパラメータでした。タンパク質の溶解性は、タンパク質 - タンパク質相互作用、および全体的なタンパク質の挙動の変化を誘導する溶媒との相互作用などの分子間作用によって決定されます。 BSA溶液の導電率は、溶液の塩濃度の指標である、測定された。 表1はcombinatiBSAのアドオンは、溶剤、及びグルタルアルデヒドは、試験しました。予想されるように、最も高い導電性を有していた試料（2×PBS溶媒）はBSAの溶解性を促進しました。
この犠牲材料の開発のための適切な条件を決定するために使用される他のパラメータは、反応率でした。予想通りBSAの反応時間は、増加したグルタルアルデヒドの濃度が減少しました。固定剤は、アミノ酸のαアミノ基、ペプチドのN末端アミノ基およびシステインのスルフヒドリル基と反応します。グルタルアルデヒドは、分子間共有結合（ 図1A）14 を形成するために、リシンのアミノ基を介してBSAと主に反応します。インキュベーション期間の後、サンプルは、増加したグルタルアルデヒド濃度（ 図1B）。20％、30％、と強度が増加し、暗黄色及び茶色の淡黄色の色の変化を示しました。水中2％グルタルアルデヒドとD 40％のBSAは、ゴムを形成しませんでした。 40％BSA溶液は、その高い粘度及び高反応性固定剤を、ゴムに沿って強度が変化をもたらしました。この動作は、均一タンパク質鎖を貫通におけるグルタルアルデヒドの困難性に起因することができます。溶媒が大幅にタンパク質の溶解性だけでなく、固定剤との反応に影響を与えました。 2×PBSソリューションは簡単に混合可能でした。水とBSA溶液を混合することが困難でした。 BSAへの溶解度が大きく、タンパク質の立体構造変化を引き起こし、溶媒（ 表2）の導電率に影響されます。最も有望なサンプルは、1×PBSおよび2×PBS中の3％グルタルアルデヒドで30％BSAでした。
ゴム持続負荷力にできたことを確認するために、圧縮試験を行いました。 BSAゴムの4つのサンプルの機械的性質を測定した：30％BSA 3％グルタルアルデヒドで2×PBS、1×PBS、1×PBS中の2×PBS中20％BSA、3％グルタルアルデヒド、20％のBSA、2％グルタルアルデヒド中の30％BSA、3％グルタルアルデヒド。正弦波は、応力とひずみ曲線（ 補足図3）に転送される荷重と変位曲線（ 補足図2）との間の非常に小さな位相変化を示しました。応力とひずみ曲線に基づいて、最初の3サンプルがロードとアンロード（ 図2A-2C）との間にヒステリシスを示しました。これらの3つの試験片は、力が適用されたときに、弾性と粘性のプロパティが含まれている粘弾性材料として振る舞いました。 20％BSA、2％グルタルアルデヒドは、永久変形（ 図2D）の徴候を示しました。 1×PBSおよび2×PBS中30％BSA 3％グルタルアルデヒドは、同様の動作（ 図2E -オンロードとアンロードサイクル）を示しました。弾性率は、これらの4つのサンプル（ 図2F）の直線部分から決定しました。リン酸塩濃度溶媒を大幅に試験範囲た（p = 0.03）での弾性率を増加させました。 1×PBS中20％BSA、2％グルタルアルデヒドは、低弾性率を示す、容易に変形。
ゴムの酵素消化を評価するために、反応速度は、特定の時点で酵素と接触させて配置BSAゴムの消失に基づいて計算しました。酵素消化プロセスは、バッチ式反応器として処理しました。治療消化の速度を得るためになされた凍結乾燥された後に残ったゴムの前に原料ゴム濃度との比較は、 図3には、グルタルアルデヒド及びBSA、溶剤の濃度に関連して各サンプルの反応速度を示し、そして滞留時間。明確な傾向は、架橋剤濃度およびエンティティの解離の反応速度の間に観察されました。統計分析は、各時点で実施しました。目のため電子の15時間の時点では、グルタルアルデヒド濃度が大幅に0.02のp値（ 補足表4）で得られた反応速度に影響を与えました。その時点の後、グルタルアルデヒド及びBSA濃度の両方が大幅率（ 補足表5-7）の影響を受けます。最も影響力のある要因は、全体的に、より有意なp値で示されるグルタルアルデヒド濃度でした。グルタルアルデヒド濃度の増加は、ゴムエンティティの消化の反応速度を低下させました。
トリプシンによって溶解したタンパク質の量は、BCAアッセイ（ 図4）を用いて決定しました 。一般的な傾向が観察された固定の低濃度は、多くのタンパク質は、BSAゴムで消化しました。トリプシンは、このように全体構造の上に溶解し、BSAおよびグルタルアルデヒドによって形成され、新しく作成した共有結合を切断することによって、ゴム試料と相互作用時間。 1×PBSで2回、PBSと比較して、より早い時点でより多くの可溶化タンパク質があるようです。時間が経つにつれて、48時間まで増加し続け、その後、それは減少し15時間での溶液中のタンパク質の増加が、そこにあります。これは、トリプシン、常により小さなペプチドとアミノ酸を生成、したがって、タンパク質を切断し、に起因している可能性があります。また、3つだけ、またはそれ以上のアミノ酸から構成されているペプチドを読み取ることができるアッセイの限界に起因し得ます。統計分析は、BSAとグルタルアルデヒド濃度が有意BSAゴム（P <0.05）からのタンパク質の放出に影響を与えたことを示しました。グルタルアルデヒドの増加が溶解したタンパク質の減少を引き起こしながら、BSAの濃度の増加は、上清中のタンパク質の増加を引き起こしました。
この犠牲材料の分解を測定するために、ゴムはコンタに置く前に、（湿量基準）を秤量しました。トリプシンでCT。酵素消化溶液中に入れ、ゴムの乾燥重量の同等の酵素溶液をBSAゴムと反応し、従って、タンパク質を可溶化補足図1に示された値を用いて決定しました。治療後に残っているゴムは、O / Nを凍結乾燥し、秤量した。 図5は、溶媒は、ゴムの解離に影響を与えたことを示しています。 BSAおよびグルタルアルデヒドの同じ濃度で、2×PBS溶剤ゴムは1×PBSと比較して、それらの材料の多くを保持していました。
スリー固体モールド片を作製した：ループモールド（ 補足図4A）、安定ピース（ 補足図4B）、およびYの金型（ 図6A、左）。ステンレス製Y型片（右、 図6A）Microlution機を使用して作成されました。この金型は、反応は30％のBSA及び3％glutaraldeを注射しました2×PBS（左図6B）でハイド。ゴムは、4℃でO / Nを反応させました。ゴムはコラーゲン（ 図6B、中央）でキャストした後、酵素（右、 図6B）消化し ました。予備データは、pH 7.8および15時間、30℃の温度で、BSAゴムはコラーゲン足場への影響を最小限に抑えて消化することができることを示唆しました。 15時間後、ゴム、酵素、それがコラーゲンの幾何学的特徴に影響を与えることなく、チャネルを残すように十分緩いによって弱められます。 3Dコラーゲン足場は、特定の幾何学的特徴を持っているが作成された。 図6B（右）BSAゴムの酵素消化後にコラーゲンハイドロゲル内部に直径4mmのチャネルを示しています。チャネルが元の寸法を維持したことを確実にするためにカリパスで測定しました。実際、コラーゲンハイドロゲル中の新しいチャネルは4mmでした。 BSAゴム金型は、私たちをテストした300ミクロン、と小さい寸法を保持することができます安定型をる（ 図7）。これらの足場は、残留グルタルアルデヒドについて試験した、我々はMosconas洗浄後に残留物を発見しました。
図1 BSAゴム（A）BSAゴム反応。グルタルアルデヒドは、共有結合を作成することにより、BSAを架橋します。 （B）BSAゴム。異なるBSAの濃度、グルタルアルデヒドの濃度は、溶媒の種類は、24ウェルプレート上にキャストし、4℃でO / Nを反応させた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
BSAゴムの図2.応力-ひずみ曲線。BSA RUの応力-ひずみ曲線 bbers。 （A）2×PBS中30％BSA 3％のグルタルアルデヒド; （B）1×PBS中30％BSA 3％のグルタルアルデヒド; （C）2×PBS中20％BSA 3％のグルタルアルデヒド; 1×PBSおよび（D）20％BSA、2％グルタルアルデヒド（3サイクル）。いくつかのhysterisを持っていますが、それらの元の形状に戻る曲線ACショーゴム。サンプルDは、簡単にロードおよびアンロード処理中に恒久的に変形する非常に低弾性率を有するゴムを示しています。グラフE（各サンプルの一周期を表す）上の1つのロードおよびアンロードサイクルで見られるように、サンプルA及びBは、非常に似た挙動を示しました。弾性は固定剤の濃度及び使用される溶媒（F）の影響を受けていました。サンプルは、塩の増加（** p <0.05）と弾性率の有意な増加を示しました。より高い固定濃度はBSAゴムの弾力性の有意な増加（* p <0.05）を引き起こしました。ARGET = "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
BSAゴムの崩壊の図3の反応率は、固定が増加すると、反応速度が1×PBS（A）、2×PBS（B）、及び水（C）内のすべてのサンプルに対して減少します。 2×PBS中40％BSA、2％グルタルアルデヒドは、反応の最も高いレートのうちの1つを示しています。これは、BSAタンパク質が均質行う際に遭遇する困難さによるものです。 （青：20％のBSA、紫：30％のBSA、および赤：40％のBSA）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.タンパク質quantifi酵素消化後の陽イオンは、固定が増加すると、ゴムから溶解したタンパク質は、1×PBS（A）、2×PBS（B）、及び水（C）内のすべてのサンプルに対して減少します。 （青：20％のBSA、紫：30％のBSA、および赤：40％のBSA）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.ゴム消化。私たちは出発を比較することにより、消化ゴムの量を決定し、乾燥ベースの製品を終了します。私たちは、6％のグルタルアルデヒドのサンプルおよび1×PBS中で最も30％でBSA 2％グルタルアルデヒドで消化の最低額を得た。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6.分岐したプロトタイプ。分岐血管系の（A）表現。左図のGコードに変換し、右側に見られるようにMicrolution 363-Sを使用して製造されたのMastercamで作成した固体です。ステンレス製のモールド部品は、二の3mm流出チャンネル4mMの流入路を表します。 （B）は、3Dコラーゲン足場。上に示した金型を用いて作られたBSAゴムが左側に示されています。センターは、コラーゲンハイドロゲルに埋め込まれたゴムを示しています。ゴムは酵素消化し た後にコラーゲン足場内で左チャンネルが右に示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図7 BSAチャネル300ミクロンBSAチャネルが安定片金型から取り出しました。チャネルの周りの離型剤の薄層があります。追加領域は、顕微鏡下で明確に区別され、容易に除去することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| BSA（％） | グルタルアルデヒド（％） |
| 20 | 2 |
| 20 | 3 |
| 20 | 6 |
| 30 | 2 |
| 30 | 3 |
| 30 | 6 |
| 40 | 2 |
| 40 | 3 |
| 6 |
。三つの異なる溶媒を用いて1：1の比率表1 BSAゴムパラメータ BSAおよび固定液を4で混合しました。
| サンプル | 伝導度（mS / cm）で | pHは | |
| BSA（％） | 溶媒 | ||
| 30 | 2×PBS | 11.43 | 7.06 |
| 30 | 1×PBS | 6.35 | 7.05 |
| 30 | DI | 2.39 | 6.76 |
| 20 | 2×PBS | 13.00 | 6.92 |
| 20 | 1×PBS | 8.67 | 7.09 |
| 20 | DI | 2.08 | |
表2導電率とBSAのサンプルのpH。 BSA溶液の導電率、pHを異なる溶媒の存在下で測定しました。導電率の増加が2倍と1×PBSとの間に示されています。
| BSA（％） | グルタルアルデヒド（％） | 溶媒 | 観測 | |||
| 20 | 2 | 1×PBS | 柔らかく、容易に変形可能な材料 | |||
| 20 | 3 | 1×PBS | ソフトが、2％グルタルアルデヒドよりも頑丈 | |||
| 20 | 6 | 1×PBS | 硬い、少し脆いです | |||
| 30 | 2 | 1×PBS | グッド一貫性 | |||
| 30 | 3 | 1×PBS | グッド一貫性 | |||
| 30 | 6 | 1×PBS | 脆いです | |||
| 40 | 2 | 1×PBS | ゲル/ゴムの一貫性を作成するのに非常に一貫性のありません | |||
| 40 | 3 | 1×PBS | 一貫性は、サンプルに沿って変化します | |||
| 40 | 6 | 1X PBS | 脆いです | |||
| 20 | 2 | 2×PBS | 柔らかく、容易に変形可能な材料が、1×PBSのサンプルよりも頑丈 | |||
| 20 | 3 | 2×PBS | ソフトしかし、2％よりも剛性 | |||
| 20 | 6 | 2×PBS | グッド一貫性 | |||
| 30 | 2 | 2×PBS | グッド一貫性、1×PBSでよりstudry | |||
| 30 | 3 | 2×PBS | グッド一貫性、1×PBSでよりstudry | |||
| 30 | 2×PBS | グッド混合性が、britle | ||||
| 40 | 2 | 2×PBS | 一貫性は、サンプルに沿って変化します | |||
| 40 | 3 | 2×PBS | 一貫性は、サンプルに沿って変化します | |||
| 40 | 6 | 2×PBS | 一貫性は、試料に沿って変化し、それが脆く | |||
| 20 | 2 | 水 | ゲル/ゴム材料を形成しませんでした | |||
| 20 | 3 | 水 | ゲルを形成したが、トンよりも剛性見えます彼は、一貫性のないPBSおよび2回PBSを1倍 | |||
| 20 | 6 | 水 | ゲルを形成したが、1×PBSと2倍PBSよりも剛性、矛盾しているようです | |||
| 30 | 2 | 水 | ゲル/ゴム材料を形成しませんでした | |||
| 30 | 3 | 水 | ゲルを形成したが、1×PBSと2倍PBSよりも剛性、矛盾しているようです | |||
| 30 | 6 | 水 | ゲルを形成したが、1×PBSと2倍PBSよりも剛性、矛盾しているようです | |||
| 40 | 2 | 水 | ゲル/ゴムmateriを形成しませんでしたアル | |||
| 40 | 3 | 水 | 一貫性は、サンプルに沿って変化 - 上に硬め | |||
| 40 | 6 | 水 | 一貫性は、サンプルに沿って変化 - 上に硬め | |||
表3 BSAゴム。BSAゴムはO / N、サンプルの8 mmの生検パンチ孔が撮影された反応後。このテーブルには、サンプルの一貫性と外観のいくつかの視覚的な観察が含まれています。
補足図1.ソリッドパーセンテージ。各ゴムからの固体の割合は、（乾燥重量/湿重量）を測定しました。溶媒をpercentaに影響を及ぼしませんでした固体のGEた（p> 0.05）。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
PBS 2倍30％BSA 3％グルタルアルデヒドの補足図2.正弦波。サンプルの圧縮荷重と変位は経過時間の関数として示されている。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
30％BSA、3％グルタルアルデヒドの補足図3正弦波は、サンプルの応力および歪みを計算し、経過時間の関数としてプロットした。PBSを2倍 。小さな位相シフト、INDIがありますゴムの粘弾性挙動のcative。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足図4. Mastercamの固形物。（A）ループと（B）の安定性片。 Mastercamのを使用して、これらを設計した後、GコードはMicrolution機やMakerbot 3Dリプリケータを使用して、PLAピースを使用してインポートし、ステンレス鋼や真鍮片ました。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| 境界 | ミン | マックス | ||
| -17 | 3 | | ||
| 変位量（mm）と | -1.5 | 0.3 | ||
| 波 | レベル1 | レベル2 | 周波数（Hz） | サイクル |
| 正弦 | -15 | -3 | 1 | 5,000 |
| データ収集 | ||||
| 走査時間 | 1.008 | |||
| スキャンポイント | 360 | |||
| スキャンの数 </ TD> | 5 | |||
| その後のスキャン | スキャンの間に1.008秒 | |||
補足表1.圧縮試験パラメータ。正弦波を用いて、荷重と変位との関係は、ゴムの4種類について決定した。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| ANOVAの結果 | |||||
| DF | SS | ミズ | F | 意義F | |
| 回帰 | 3 | 9.85E + 02 | 3.28E + 02 | 4.70E + 02 | 1.06E-18 |
| 残余 | 20 | 1.40E + 01 | 6.99E-01 | ||
| 合計 | 23 | 9.99E + 02 | |||
| 回帰分析 | |||||
| 係数 | 標準誤差 | トンスタット | P値 | ||
| インターセプト | 1.74E + 00 | 8.23E-01 | 2.12E + 00 | 4.70E-02 | |
| BSA（％） | 7.82E-01 | 2.09E-02 | 3.74E + 01 | 5.49E-20 | |
| グルタルアルデヒド（％） | 3.17E-01 </ TD> | 1.03E-01 | 3.09E + 00 | 5.71E-03 | |
| 溶媒 | 2.61E + 01 | 2.22E + 01 | 1.18E + 00 | 2.53E-01 | |
BSAゴム中の固形分の割合の補足表2.統計分析。BSAおよびグルタルアルデヒドが大幅に固形物の割合に影響を与えました。溶剤は、固形物の割合に影響を及ぼさなかった。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| ANOVAの結果 | |||||
| DF | SS | ミズ | F | 意義F | |
| 回帰 | 3 | 3.06E + 05 | 1.02E + 05 | 1.18E + 01 | 4.00E-03 |
| 残余 | 7 | 6.07E + 04 | 8.67E + 03 | ||
| 合計 | 10 | 3.67E + 05 | |||
| 回帰分析 | |||||
| 係数 | 標準誤差 | トンスタット | P値 | ||
| インターセプト | 6.50E + 02 | 4.25E + 01 | 1.53E + 01 | 1.23E-06 | |
| BSA（％） | 4.67E + 00 | 3.80E + 01 | 1.23E-01 | 9.06E-01 | |
| 溶媒 | 1.02E + 02 | 3.80E + 01 | 2.67E + 00 | 3.20E-02 | |
| グルタルアルデヒド（％） | 1.16E + 02 | 5.70E + 01 | 2.03E + 00 | 8.21E-02 | |
PBS濃度に関連する弾性率の補足表3統計分析。PBSの濃度が著しく弾性率に影響を与えました。溶媒中の塩の増加は、弾性率の増加を引き起こした。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| ANOVAの結果 | |||||
| DF | SS | ミズ | F | 意義F | |
| 回帰 | 3 | 6.15E-15 | 2.05E-15 | 3.68E + 00 | 1.67E-02 |
| 残余 | 60 | 3.34E-14 | 5.57E-16 | ||
| 合計 | 63 | 3.96E-14 | |||
| 回帰分析 | |||||
| 係数 | 標準誤差 | トンスタット | P値 | ||
| インターセプト | 3.74E-08 | 1.37E-08 | 2.74E + 00 8.03E-03 | ||
| BSA（％） | 3.89E-10 | 3.62E-10 | 1.07E + 00 | 2.88E-01 | |
| グルタルアルデヒド（％） | -5.92E-09 | 1.83E-09 | -3.23E + 00 | 2.02E-03 | |
| 溶媒 | -6.78E-08 | 3.76E-07 | -1.80E-01 | 8.58E-01 | |
補足表酵素消化の15時間は、グルタルアルデヒド濃度が有意に高いグルタルアルデヒド濃度で減少させることによりゴムの消化の反応速度に影響を与えた後に、反応速度の4統計解析 。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| ANOVAの結果 | |||||
| DF | SS | ミズ | F | 意義F | |
| 回帰 | 3 | 7.36E-15 | 2.45E-15 | 3.62E + 01 | 1.21E-13 |
| 残余 | 62 | 4.20E-15 | 6.78E-17 | ||
| 合計 | 65 | 1.16E-14 | |||
| 回帰分析 | |||||
| 係数 | 標準誤差 | トンスタット | |||
| インターセプト | 2.98E-08 | 4.77E-09 | 6.25E + 00 | 4.22E-08 | |
| BSA（％） | 4.56E-10 | 1.26E-10 | 3.62E + 00 | 6.03E-04 | |
| グルタルアルデヒド（％） | -6.04E-09 | 6.15E-10 | -9.82E + 00 | 3.00E-14 | |
| 溶媒 | -6.57E-08 | 1.31E-07 | -5.02E-01 | 6.17E-01 | |
酵素消化の24時間後の反応速度の補足表5.統計分析。BSAおよびグルタルアルデヒド濃度が大幅にゴムの消化の反応速度に影響を与えました。高いグルタルアルデヒド濃度では、トンの減少があります彼の反応速度。高いBSAの濃度では、反応速度の増加があります。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| ANOVAの結果 | |||||
| DF | SS | ミズ | F | 意義F | |
| 回帰 | 3 | 3.10E-15 | 1.03E-15 | 2.74E + 01 | 1.64E-11 |
| 残余 | 64 | 2.42E-15 | 3.78E-17 | ||
| 合計 | 67 | 5.52E-15 | |||
| 回帰分析 | |||||
| 係数 | 標準誤差 | トンスタット | P値 | ||
| インターセプト | 2.17E-08 | 3.50E-09 | 6.20E + 00 | 4.55E-08 | |
| BSA（％） | 2.13E-10 | 9.20E-11 | 2.31E + 00 | 2.39E-02 | |
| グルタルアルデヒド（％） | -3.94E-09 | 4.53E-10 | -8.70E + 00 | 1.90E-12 | |
| 溶媒 | 3.04E-08 | 9.57E-08 | 3.18E-01 | 7.51E-01 | |
サプリメント表酵素消化の48時間後の反応速度の6統計分析。BSAおよびグルタルアルデヒド濃度が大幅にゴムの消化の反応速度に影響を与えました。高いグルタルアルデヒド濃度では、反応速度の低下があります。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| ANOVAの結果 | |||||
| DF | SS | ミズ | F | 意義F | |
| 回帰 | 3 | 2.19E-15 | 7.29E-16 | 3.05E + 01 | 3.56E-12 |
| 残余 | 61 | 1.46E-15 2.39E-17 | |||
| 合計 | 64 | 3.64E-15 | |||
| 回帰分析 | |||||
| 係数 | 標準誤差 | トンスタット | P値 | ||
| インターセプト | 1.05E-08 | 2.84E-09 | 3.69E + 00 | 4.80E-04 | |
| BSA（％） | 3.61E-10 | 7.48E-11 | 4.83E + 00 | 9.48E-06 | |
| グルタルアルデヒド（％） | -3.07E-09 | 3.69E-10 | -8.33E + 00 | 1.21E-11 | |
| そうlvent | 3.97E-08 | 7.80E-08 | 5.09E-01 | 6.12E-01 | |
酵素消化の72時間後の反応速度の補足表7.統計分析。BSAおよびグルタルアルデヒド濃度が大幅にゴムの消化の反応速度に影響を与えました。より高いグルタルアルデヒドの濃度で、反応速度の低下があります。高いBSAの濃度では、反応速度の増加があります。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
Biofabricationは、生物学と工学の原則は、天然組織を模倣する複雑な材料を生成するためにマージする高度に学際的分野です。これを達成するために、in vivoでの組織から収集した情報を使用して、 インビトロ足場に翻訳技術を開発する必要があります。この方法では、プラットフォームは、密接にin vivoでの組織の、建築の機能的、および機械的特性に似ていることを操作することができます。最適な足場材料は、生体適合性であるような特定の特性を有する目的の組織の機械的特性を模倣する、制御された分解が可能な細胞の生存を支持することができ、そして組織リモデリング2,3を可能にすることが可能であるべきです。
製造技術の多くは、実行可能な、三次元構造を生成するために開発されてきました。これらの技術は、2つの主要なカテゴリに分類されます。従来のANをdが進みました。従来技術では、多孔質構造を作るために合成及び天然の伝統的な材料の使用を含みます。いくつかの例は、凍結乾燥、溶媒キャストされ、成形溶融します。これらの技術の欠点は、足場内の内部チャネルを作る貧しい構造内の空隙率の制御（細孔径と細孔の相互接続性）と難しさがあります。高度な技術は、他の1の間の光学的立体造形、成形、3D印刷、エレクトロスピニングが挙げられます。これらの技術は、長距離マイクロチャンネルの欠如、小径ノズル、材料に依存して最適化を介して分配することが可能でありながら、毒性である可能性がある大規模な後処理を必要とする最適な機械的強度を提供するために、材料の選択のような欠点を有し、そしてin vitroでの構築物中の内部アーキテクチャの設計上の制約。 3Dプリントでの主な欠点は、十分な細胞キャリアである生体材料の可用性ですまた、定義されたアーキテクチャの組織12を維持するのに必要な機械的特性を有しています。ここで紹介する技術は両方とも、従来と高度な製造技術を採用しています。両方の長所は、酵素に不安定なゴムの開発に、またはインポート、希望のアーキテクチャを作成するために、コンピュータ支援製造の収束に由来します。ステンレス鋼製の型をフライス盤を使用して作成されたが、それらの製造は、この技術に限定されるものではありません。 3Dプリンター（ 例えば 、Makerbot）を用いて、同一の金型は、ポリ乳酸（PLA）から製造しました。負の金型は、任意の材料に特徴の簡単かつ信頼性の高い転送を作成する固体の金型を提供するCADプログラムによって設計された建築のディレクティブを使用して粉砕しました。それだけでなく、外部の組織組成物だけでなく、非常に複雑な内部構造の制御を可能にするという点で、この技術が重要です。ここで提示仕事、主に均一に混合することができるBSAゴムの特性に焦点を当てて、鋳造プロセス中にその安定性を保持しながら容易に、妥当な時間で消化し、その構造の変化に対して耐性であり、微小機能を模倣することが可能です。この技術の限界は、試験し、犠牲材料の解像度は直径300μm程度と小さい寸法を維持することができます。しかしながら、 図7は、チャネルは、離型剤の薄層に囲まれていることを示しています。顕微鏡を用いて、この付加的な領域が明確に区別され、所望の寸法を有するように除去することができます。このbiofabrication技術は、マクロからミクロスケールの範囲で内部構造の多種多様の複製を可能にします。
血清アルブミンは、循環系において最も豊富なタンパク質です。タンパク質は高分子電解質であるので、溶解度は、静電相互作用によって決定されました15-17。低塩濃度で、塩析イン効果の溶解度18を容易にするタンパク質には存在することが示されています。グルタルアルデヒドは、アルブミンの特性の変化を引き起こす架橋剤です。 図1に見られる色の変化は、アルジミン結合19〜21の形成に起因します。グルタルアルデヒドは、分子間の共有結合14を形成するために、リシンのアミノ基を介してBSAと主に反応します。データは、塩の増加は（PBSを2倍の1×PBSから）ゴムの弾力性を改善したことを示しています。高いグルタルアルデヒド濃度が低濃度のものに比べて、以前の設定より堅いゲルを生成します。しかし、それらは、分配均質に混合することがより困難であり、それらは脆いゲルを形成します。より高い温度は、グルタルアルデヒドとBSAの反応を促進するため、金型の中にBSAゴムの適切な量を送達するために、アセンブリのすべての部分が冷たい保たなければなりません。理想的なゴム（30％BSA 2倍PBSまたは1x PBS中3％グルタルアルデヒド）が恒久的に変形させずに負荷に耐えることができる粘弾性材料として振る舞います。取り扱いおよびBSAゴム構造の周りに材料を鋳造する際に非常に重要になります。
トリプシンはタンパク質を加水分解するセリンプロテアーゼです。トリプシンは、高い切断特異性を有し、広く使用されている酵素です。それは、アミノ酸のリジン及びアルギニン22のカルボキシル側で主にペプチド鎖を切断します。 BSAは、水中の低濃度で容易に溶解し、そしてトリプシンが容易に無傷で、比較的手つかずコラーゲンを残すBSAゴムを消化しました。材料は、細胞との接触を持っていません。構築物は、自由グルタルアルデヒドの存在について試験し、この固定剤の痕跡はなかったです。これはbiofabricationのための犠牲材料としてBSAゴムの有効性を示します。このプロトコルでは、コラーゲン足場材料として使用されるが、任意のOTましたトリプシン消化に耐性であり、彼女の材料を使用することができます。
今後の課題は、内皮細胞および線維芽細胞と足場を播種することによりハイドロゲル内の血管のコンポーネントを再構成を中心に説明します。課題の一つは、ネイティブの3D分布を模倣するチャネルの内側全体に細胞の均一な分布を作成することです。この問題に対処するために、戦略は、シールまたはチャネルの閉塞、細胞懸濁液の注入を可能にする開発されています。試験された材料は、4℃で熱可逆性ゲル、液体およびC 23,24〜30℃以上の固体であるプルロニックF127、です。プルロニックの高濃度が必要な一時的なシールを形成することに成功しました。細胞懸濁液は、足場のチャネル内にある後、細胞は、3D構造の全ての側面に付着するまで、エンティティは、特定の時間のために回転されます。内部チャネルは、維持するための適切なメディアを持つことになります細胞の生存。プルロニックは、ゲル状を維持し、水性環境中で容易に溶解します。細胞が付着した後、ヒドロゲルは、メディアが殺到され、研究の目的に応じて、静止または流動条件下で培養することができます。この方法論はさらに評価され、このパブリケーションにフォローアップになります。本明細書に記載さbiofabrication技術は、現在、ヒト腎動脈の骨格レプリカを開発するために使用されています。同じアプローチは、臨床応用の広い範囲にこの技術の適用性を拡大するために、心臓のような組織の他のタイプで行うことができます。
ここで開発biofabrication技術は、迅速かつ確実に固有の幾何学的特徴を再現することができますin vitroでの足場の世代で一歩前進です。それは合成材料の上に細胞に最適な化学的および物理的な手がかりを提供していますので、コラーゲンのような自然な材料は、選択されました。これらのナtural材料は、同様に損傷を受けた組織を置換するために、開発、奇形、および疾患組織のインビトロモデルとして、治療研究のために使用することができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen type I | Collagen extracted from calf hide | ||
| Hydrocloric Acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) | MP Biomedical | U5378 | 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS |
| Albumium from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Glutaraldehyde | Sigma -Aldrich | G5882 | Toxic |
| Lard | Fields | 3090 | |
| Stainless Steel Molds | Milled using Microlution Machine | ||
| Air Brush Kit | Central Pneumatic | 47791 | |
| Mixing Tip for double syringe | Medmix | ML2.5-16-LLM | Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med |
| Small O ring for double syringe | Medmix | PPB-X05-04-02SM | Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural |
| Double Syringe cap | Medmix | VLX002-SM | Cap, 4:1/10:1, PE brown, med |
| Big O ring for double syringe | Medmix | PPA-X05-04-02SM | Piston A, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe | Medmix | SDL X05-04-50M | Double syringe, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe Dispenser | Medmix | DL05-0400M | Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain |
| Laminim | 3.6 mg/ml - extracted USC lab | ||
| 20 ml Syringe Luer Lock Tip | BD | 302830 | |
| Luer Lock Caps | Fisher | JGTCBLLX | |
| HEPES | Sigma -Aldrich | H4034 | |
| Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) | Life Technologies | 1143-030 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 | |
| UV Crosslinker | Spectroline UV | XLE1000 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Fisher | S271-10 | To prepare Mosconas |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma -Aldrich | P5405-250 | To prepare Mosconas |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328-500 | To prepare Mosconas |
| Glucose | Sigma -Aldrich | G-8270 | To prepare Mosconas |
| Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S-7907 | To prepare Mosconas |
| Sterile Filter for syringes | Corning | 431224 |
References
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