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Bioengineering

Dreidimensionale Biomimetic Technologie: Neuartige Biorubber Erzeugt definierte Mikro- und Makro-Skala Architekturen in Collagen Hydrogele

doi: 10.3791/53578 Published: February 12, 2016

Abstract

Gewebegerüste spielen eine entscheidende Rolle bei der Geweberegeneration Prozess. Das ideale Gerüst müssen mehrere Anforderungen erfüllen, wie beispielsweise mit richtigen Zusammensetzung, gezielte Modul und gut definierten architektonischen Besonderheiten. Biomaterials, dass die intrinsische Architektur der in vivo Gewebe sind von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung Erkrankungen sowie zur Erleichterung der Regeneration von verloren und fehlerhafte Weichgewebe rekapitulieren. Eine neuartige biofabrication Technik entwickelt, die Stand der Technik Bildgebung kombiniert, dreidimensionale (3D) Drucken und selektive enzymatische Aktivität eine neue Generation von Biomaterialien für die Forschung und klinische Anwendung zu erstellen. Das entwickelte Material, Rinderserumalbumin Gummi, ist die Reaktion in eine Form gespritzt, die bestimmte geometrische Merkmale bestätigt. Das Opfermaterial ermöglicht die ausreichende Übertragung von architektonischen Besonderheiten zu einem natürlichen Gerüstmaterial. Der Prototyp besteht aus einem 3D-Kollagen-Gerüst mit 4 und 3 mm Kanäle, die reprESENT eine verzweigte Architektur. Das Papier betont die Verwendung dieser biofabrication Technik für die Erzeugung von natürlichen Konstrukten. Dieses Protokoll nutzt eine computergestützte Software (CAD) eine feste Form zu fertigen, die Reaktion mit BSA Gummi, gefolgt von der enzymatischen Abbau des Kautschuks, so dass seine architektonischen Besonderheiten innerhalb der Gerüstmaterial eingespritzt wird.

Introduction

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Im Engineering-Bereich Gewebe die Fähigkeit, Gewebegerüste herzustellen ist lebenswichtig. Ein geeignetes Gewebegerüst eine 3D-Struktur aufweist, wird aus biokompatiblen Materialien bestehen, und ahmt in vivo Gewebearchitektur Zell- und Gewebewachstum und Umbau zu erleichtern. Dieses Gerüst muß den Transport von Nährstoffen und die Entfernung von Abfällen 1-4 ermöglichen. Eines der Haupthindernisse für die Herstellung dieser Gerüste ist die Fähigkeit, bestimmte geometrische Merkmale in einem biokompatiblen Material zu rekapitulieren. Mehrere biofabrication Techniken, um die geometrischen Merkmale dieser Gerüste zur Steuerung gemeldet worden sind, werden Beispiele 5-8 Elektrospinnen, Lösungsmittelgießen 9, Stereolithographie 10 und 3D-Print 11, unter anderem. Diese Techniken fallen kurz in eine relativ einfache Übertragung von steuerbaren internen und externen architektonischen Besonderheiten bietet, sind teuer, zeichnen sich durch ihre Auflösung und Bedruckbarkeit begrenzt ( 12 zu produzieren erfordert.

In vielen kommerziellen Herstellungssysteme, die Schaffung von inneren Hohlräumen, Kanälen und Funktionen wird Sand oder anderen geeigneten abnehmbaren oder Opfermaterialien erreicht werden. Das Metall oder Kunststoffteil ist um die Sandform gebildet wird, und sobald es erstarrt ist, wird der Sand entfernt. In der gleichen Art und Weise, die nächste Generation von Biomaterialien braucht die BioSand gleichwertig. Daher wurde die BSA-Kautschuk als Ersatz für BioSand entwickelt. Die BSA-Kautschuk ist ein neu formulierten Material, das mit Glutaraldehyd vernetzt Rinderserumalbumin besteht. Das ultimative Ziel ist spezifisch architektonischen Besonderheiten in einem biologisch abbaubaren Kollagengerüst zu erstellen. Die Eigenschaften des Opfer biorubber, die mit der Form des ursprünglichen Gewebes Dimensionstreue hält beschrieben.

in vivo Gewebeelastizität und andere Eigenschaften des Gewebes von Interesse nachahmen.

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Protocol

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1. Ermitteln Sie den Prozentsatz an Feststoffen in der Kollagen-Batch

  1. Entpacken Sie die Kollagen nach einem zuvor veröffentlichten Verfahren 13. Auftauen mindestens 20 ml Kollagen. Bestimmen Sie die anfängliche Anteil von Kollagen Feststoffe in der Partie, um die Kollagenkonzentration in den gebildeten Hydrogele zu manipulieren.
    1. Schneiden drei Stücke von Aluminiumfolie (ca. 6 x 6 cm), und jeder als pan Form durch den Boden eines 25 ml Becherglas werden. Das Gewicht der einzelnen Pfanne.
    2. Fügen Sie eine kleine Menge von Kollagen zu jeder Pfanne und notieren Sie die Gesamtgewicht der Aluminiumschale und Kollagen. In 0,5-0,8 g Collagen auf jedem Aluminiumpfanne.
      Anmerkung: Nach diesem Schritt gibt es drei Aluminiumfolie Pfannen und jeder sollte eine geringe Menge an Kollagen aufweisen. Achten Sie darauf, das Gewicht der einzelnen (insgesamt 3) leere Aluminiumpfanne und das Gewicht der Pfanne nach der Zugabe von Kollagen zu erfassen.
    3. Berechnen des Gewichts des Kollagens in jeder Pfanne mit den fach Formel:
      Collagen Gewicht = Pan und Kollagen Gewicht - Pan Gewicht
    4. Zeigen die drei Aluminiumpfannen, dass das Kollagen in den Ofen bei 100 ° C für 24 Stunden halten.
    5. Nach 24 Stunden und das Gewicht der einzelnen Aluminiumschale und des entwässerten Kollagens.
    6. Berechnen des Gewichts des entwässerten Kollagens unter Verwendung der folgenden Gleichung:
      Dehydrierte Kollagen Gewicht = Pan und dehydrierte Kollagen Gewicht - Pan Gewicht
    7. Der prozentuale Anteil von Fest für die drei Proben die Kollagenfeststoffkonzentration nach folgender Formel zu bestimmen:
      Gleichung 2
    8. Berechnen der durchschnittlichen Kollagenfeststoffgehalt der Charge mit dem Prozentsatz der Kollagenfeststoffe für jede der drei Proben.
      Hinweis: Das Kollagen, das verwendet wird, ist das, was der hydratisierten Kollagen gelassen wird. Keine der entwässerte Collagen verwendet.
    9. Nach den Prozentsatz der Kollagenfeststoff (i Bestimmungnitial Kollagenkonzentration) der Charge, bleiben die übrigen hydratisierten Kollagen verwenden. Verwenden eines kalibrierten pH-Meters der pH-Wert der Kollagen Ansatz auf 3 einzustellen.
      1. Hinzufügen kleiner Mengen (2-5 & mgr; l zu einer Zeit) von 12 N Salzsäure (HCl). Halten auf Eis zu allen Zeiten. direkt an das Kollagen nicht die Salzsäure hinzu - die Säure zu der Seite des Rohrs hinzuzufügen. Nach Hinzufügen der Säure, verwenden Sie den Spachtel um die Säure zu dem Kollagen zu schieben und rühren Sie schnell die Mischung.
    10. Sobald es einen pH-Wert von 3 erreicht, lassen Sie die Kollagen-O / N bei 4 ° C sitzen.

2. Herstellung des BSA Rubber

  1. Bereiten Sie die Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung nach dem Verfahren unten.
    1. Bereiten 2x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). In zwei PBS Tabletten zu 100 ml Wasser 0,02 M PBS-Lösung zu machen.
    2. Kombinieren BSA mit 2x PBS mit 30% BSA-Lösung zu schaffen, die Prozedur unten aufgeführt werden.
      1. Um beispielsweise eine 30% BSA mit 30 ml 2x PBS zu machen, nutzen 12,9 g BSA. Hinzufügen 1/3 des 2x PBS (beispielsweise 10 ml) in einen Kolben mit einem Rührstab. In 1/2 der BSA (zB 6,45 g BSA) in den Kolben und mit einem Spatel, befeuchten die trockenen gelösten Stoffes.
      2. Wiederholen dieses Prozesses der Zugabe PBS BSA und dann, bis alle den gelösten Stoff und das Lösungsmittel wird in den Kolben. Verwenden Sie den Spatel all den gelösten Stoff zu benetzen. Es sieht wie eine Mischung aus etwas Flüssigkeit und Klumpen. Lassen Sie es für etwa 30 Minuten sitzen.
      3. Schalten Sie dann den Rührer auf einem niedrigen Zyklus und stellen Sie sicher, dass sich keine Klumpen um den Rührstab. Es sollte 90 Minuten dauern, um alles in Lösung zu erhalten, oder es kann O / N bei 4 ° C stehen gelassen werden gerührt. Nach der gelöste Stoff alles gelöst ist, legen Sie die Lösung in einem 20-ml-Spritze und mit einem 0,20 um Spritzenfilter begrenzt. Drücken Sie den Kolben Flüssigkeit durch den Filter zu vertreiben und die sterilisierte Lösung in ein neues Röhrchen sammeln. Lagerung bei 4 ° C.
    3. Bereiten Sie 3% Glutaraldehyd solutiauf 25% Glutaraldehyd-Lösung mit steril filtriert 2x PBS verdünnen. Beispielsweise ist für 10 ml 3% ige Glutaraldehydlösung Verwenden 2 ml 25% Glutaraldehyd und 8 ml 2x PBS. Lagerung bei 4 ° C.

3. Formen Behandlung

Hinweis: Der Prototyp in diesem Papier verwendet eine benutzerdefinierte Edelstahl Y Formstück gemacht. Die Form enthält einen Zulauf und zwei Abströmkanäle von 4 und 3 mm. Erstens, saubere Formen, sprühen sie mit ungesättigten Schmalz, und sie sterilisieren. Bereiten Sie die Formen nach der unten beschriebenen Vorgehensweise.

  1. Sauberen rostfreien Stahlformen bei einer Frequenz von 35 kHz unter Verwendung von Ultraschallgerät. Legen Sie die Formen in der Ultraschallgerät und tauchen sie mit Wasser und Eis. Halten Sie die Formen Kälte zu jeder Zeit während der Ultraschallgerät läuft. Führen Sie das Ultraschallgerät für zwei Perioden von 90 min.
    1. Nach jeder Zeit, verwenden Sie eine Nadel, um sicherzustellen, dass es in der Luer kein Material Edelstahl sperren ist oder brass Anschluss. Wasser und Seife verwenden, die gesamte Oberfläche der beiden Seiten der Formen zu reinigen. Stellen Sie sicher, dass es keine Hindernisse in den Kanälen ist.
  2. Legen Sie die Formen, Schrauben und Luer-Lock-Anschluss in einem Autoklaven Tasche und Autoklaven es.
  3. Füllen Sie die Flasche, die mit handelsüblichen Schmalz (gemischte Fettsäure Trennmittel) mit einer Luftspritze auf halbem Weg legt. Setzen Sie die Kappe mit einem regelmäßigen Kappe Flasche. Legen Sie sie in einem Autoklaven Tasche und Autoklaven es.
    Hinweis: Schweinefett verwendet wird, um die Freisetzung des Materials zu erleichtern, die Reaktions später injiziert werden (BSA-Kautschuk). Sie nicht die Sprüherflasche Deckel in der autoclave- legen es die innere Dichtung beschädigt werden kann.
  4. Warm up, das Schmalz für 45 Sekunden oder bis zu seiner klar und flüssig in einer Mikrowelle. Schrauben Sie die Luftspritze Deckel mit dem Schmalz Flasche. Schließen Sie den Deckel mit der Spritze. Bringen Sie die Spritze mit der Luftquelle auf dem Labortisch. Öffnen Sie das Luftventil, und öffnen Sie die Düse der Spritze, bis es beginnt die Oberflächenbenetzungsvon einem Papiertuch.
  5. Spray Schmalz senkrecht zu der Oberfläche der Form, bis die Oberfläche vollständig abgedeckt wird. Nach jedem Stück gespritzt wurde, legen Sie sie in einer Petrischale und abdichten. Platzieren der Formen bei 4 ° C für 2 Stunden.
  6. Gehen die Formen zu sterilisieren, indem die Oberfläche mit UV-Licht für 30 Minuten ausgesetzt. Legen Sie sie bei 4 ° C zurück, bis sie bereit sind, Reaktion eingespritzt werden.

4. Reaction Injection des BSA Rubber

Hinweis: Alle Materialien und Lösung sollte kalt werden halten, bis sie bereit vorzeitige Einstellung des BSA-Kautschuk in den nächsten Schritten zu verwenden, um zu verhindern.

  1. Bereiten Sie die Spender zur Abgabe des BSA Gummi an den Formen dieser Schritte.
    1. Sterilisieren Sie alle der Mischungskomponenten (zwei O-Ringe, Spritzenkappe, Doppelspritze, mischen Spitze, und 4: 1 Dispenser), indem Sie sie mit UV-Licht ausgesetzt wird für 30 Minuten in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Kapuze.
      Hinweis: Ein PCR-Haube wurde verwendet, weil tseine Verfahren beinhaltet Fixiermittel. Diese Chemikalien können nicht wegen der Gefahr der Exposition und Toxizität für die Zellen in der Zell- / Gewebekulturhaube verwendet werden. Jede andere Haube, die eine UV-Licht enthält, wird als geeignet.
    2. Setzen Sie die Verschlusskappe auf die Lösung Halter.
    3. Führen Sie die Misch- und Einspritzen bei einem 4: 1-Verhältnis von BSA: Glutaraldehyd. Fügen Sie den 30% BSA dem Doppelspritzenkammer, die die höchste Menge der Lösung liefern wird (Es dauert etwa 4 ml zu füllen). Achten Sie darauf, genügend Platz zu verlassen, den O-Ring zu platzieren, um zum Überlaufen und eine Verunreinigung der benachbarten Kammer zu verhindern.
    4. In 3% Glutaraldehyd-Lösung in die andere Kammer (es dauert ca. 1 ml zu füllen). Achten Sie darauf, genügend Platz zu verlassen, den O-Ring zu platzieren Überlaufen und eine Verunreinigung der benachbarten Kammer zu verhindern.
    5. Der doppelte Spritze auf dem Spender. Kippen Sie die Montage vertikal, so dass die Spritzenkappe an der Spitze ist. Setzen Sie die Kappe mit dem Mischspitze.
    6. Screw die beiden Edelstahl Formstücke zusammen.
    7. Legen Sie die Baugruppe im Inneren eines Autoklaven Tasche.
    8. Um jegliche Luft in den Spender zu entfernen, sie in aufrechter Position zu halten und schnell drücken Sie den Griff einmal eine kleine Menge des BSA mit dem Glutaraldehyd gemischt zu lösen. Bringen Sie dann schnell die Edelstahl Y Form des Luer-Lock-Anschluss an der Spitze der Spritze.
    9. Halten Sie die Edelstahl Y Form mit der linken Hand und der BSA-Glutaraldehyd Mischung Spender auf der rechten Seite. Alternative abdecken jeweils links und rechts der Abgasabflusskanäle durch das Abgas zu den Seiten des Autoklaven Beutel drücken, um sicherzustellen, dass die im Inneren Hohlräume mit der Lösung gefüllt sind. Dann legen die Formen horizontal und wieder injizieren.
    10. Nehmen Sie die Formen von Spender und in eine 25 mm Petrischale.
    11. Platzieren Parafilm um die Petrischale Dehydratisierung des Gummis zu verhindern.
    12. Legen Sie die Form in der 4 ° C Kühlschrank O / N.

Hinweis: Das Kollagen sollte während des Verfahrens zu jeder Zeit auf Eis gehalten werden.

  1. Ändern Sie die Kollagen-Konzentration den Prozentsatz der Kollagenfeststoffe verwendet wird.
    1. Machen Sie 10 ml 1,75% Kollagen durch die Anfangskollagenkonzentration mit kaltem Wasser eingestellt wird.
    2. Mit einem kalibrierten pH-Meter, den pH-Wert auf 3 unter Verwendung von 12 N Salzsäure. Setzen Sie die Salzsäure nicht direkt in den das Kollagen um die Säure zu der Seite der Röhre hinzu. Nach Hinzufügen der Säure, verwenden Sie den Spatel die Säure in die Kollagen zu schieben und rühren Sie schnell die Mischung.
    3. Man wiegt 4 g von Kollagen in einem separaten konischen Rohr.
    4. Zentrifugieren Sie die Kollagen-Luft bei 4 ° C und 9343 × g für 20 bis 30 min zu entfernen.
    5. UV-Sterilisation für 30 Minuten der Zellkultur Kapuze, und 14 ul von Laminin auf die 4 ml Kollagen hinzuzufügen. Dies wird in einem letzten Laminin Konzentration von 10 ug / ul führen. Hinweis: Laminin bietet structural Integrität, Haftung und fördert verschiedene zelluläre Antworten.
    6. Schalten Sie die PCR-UV-Licht auf für 20-30 Minuten vor der Verwendung der Haube für die Sterilisation.
    7. Setzen Sie den Luer-Lock-Kappe, mit einem 20-ml-Spritze zu befestigen, in Ethanol für 2 Stunden. Dann lassen Sie es sie im UV-Licht, um zu trocknen und legen.
    8. Gamma bestrahlt das Kollagen für 8,6 min 1.200 cGy zu erreichen.
      Hinweis: Die Zeit auf den Zerfall des Cäsiumquelle abhängt. Stellen Sie die Zeit, um die gleiche Dosierung zu erreichen.

6.Casting Collagen auf BSA Gummi

  1. Um das Kollagen polymerisieren, verwenden Sie einen 8: 1: 1-Verhältnis (Kollagen: HEPES: MEM). Das folgende Verfahren basiert auf einer anfänglichen 4 g Kollagen angesäuert (aus Schritt 5.1.8).
    1. Machen Sie eine 0,2 N HEPES-Lösung in Wasser, und der pH-Wert auf 9 durch Zugabe geringer Mengen (1-5 ul) von 1-5 M Natriumhydroxid (NaOH) -Lösung. Verwendung eines kalibrierten pH-Meters, überwachen den pH der Lösung nach jeder Zugabe. Lagerung bei 4 ° C oder keep auf Eis.
    2. Schalten Sie das UV-Licht der Gewebekulturhaube für 20-30 min die Haube zu sterilisieren.
    3. Autoklav Pinzetten, Spatel und Skalpell für die Sterilisation.
    4. Mischen 1,5 ml 0,2 N HEPES (pH 9) und 1,5 ml 10x MEM Verwendung der Gewebekulturhaube. Achten Sie darauf, es zu halten, auf Eis und Wirbel es für 5 Sekunden vor der Verwendung. Lagerung bei 4 ° C oder auf Eis halten.
    5. Um die PCR-Haube sterilisieren, schalten Sie die UV-Licht für 30 Minuten.
    6. Legen Sie eine 12-Well-Platte und eine 20-ml-Spritze in -20 ° C für 10 Minuten, oder bis sie bereit, um fortzufahren. Hinweis: Bewahren Sie alle Materialien Kälte bis zum Gebrauch. Die Temperaturerhöhung bewirkt eine vorzeitige Kollagen Fibrillogenese.
    7. Spray alle Rohre und Wellplatten, die in der Haube mit 70% Ethanol sein werden und lassen Sie sie zur Sterilisation trocken. Legen Sie eine 20-ml-Spritze auf Eis für eine spätere Verwendung zu kühlen.
    8. In der PCR-Haube, öffnen Sie die Formen aus rostfreiem Stahl, die BSA-Kautschuk zu lösen und mit einem Skalpell, schneiden Sie die Abgaskanäle des BSA rubber Form.
    9. Im Rahmen der PCR-Haube, öffnen Sie die sterile Kollagenröhren und 1 ml des HEPES-MEM-Lösung (darauf achten, dass vor dem HEPES-MEM-Lösung zu extrahieren, dass alles gut vermischt ist und es gibt keine festen Ablagerungen).
    10. Mit dem sterilen Spatel gründlich gemischt, um das Kollagen und Pufferlösung.
    11. Schließen und Wirbel es schnell eine gut gemischte Hydrogel zu gewährleisten.
    12. Transfer zu einem Kalt 20-ml-Spritze.
    13. Mit einer Hand halten Sie die BSA Gummi im Inneren des Brunnens und die andere verwenden, verzichten Hälfte des Kollagen-Hydrogel-Lösung auf den Boden des Bohrlochs.
    14. Mit den sterilen Pinzette, sicherzustellen, dass die Gummi-und Abfluss Enden an den Seiten des Bohrlochs berühren.
    15. Gießen Kollagenlösung auf der Gummi bis vollständig bedeckt.
    16. Sicherzustellen, dass die Gummi BSA im Kollagen suspendiert wird und dass es keine Blasen, insbesondere nahe den Enden des Kautschuks.
    17. Legen Sie die Abdeckung und wickeln Parafilm rund um dasUmfang des Brunnens.
    18. bei 37 ° C für 1 Stunde in den Brutschrank gestellt. Halten Sie die PCR-UV-Licht auf.
  2. Nach der Polymerisation des Kollagens, vernetzen UV das Hydrogel über die folgende Prozedur.
    Hinweis: Die Vernetzung des Kollagens wird eine UV-Vernetzer Vorrichtung getan werden, bei dem die Energiemenge gesteuert werden kann.
    1. Schalten Sie die UV-Vernetzer und nutzen die Energie Einstellung der leeren Kammer zur Bestrahlung mit 630.000 & mgr; J / cm 2.
    2. Entfernen Sie die Gele aus dem Inkubator.
    3. Spray Hände mit Ethanol, und, im Inneren der Kammer, entfernen Sie den Deckel so schnell wie möglich.
    4. Schließen der Kammer und UV Vernetzung der Hydrogele durch die Energieeinstellung auszuwählen und Bestrahlen 630.000 & mgr; J / cm 2.
    5. Nach der Vernetzung Zyklus, schalten Sie das UV-Licht auf die PCR-Haube aus
    6. Spray Hände mit Ethanol und die Kammer öffnen, den Deckel rasch wieder auf die Well-Platte legen. Bewegen Sie den Well-Plattezu dem PCR-Haube.
    7. Mit dem sterilen Spatel vorsichtig lockern und das Gel aus dem Bohrloch zu entfernen. Drehen Sie die Gele unter der Haube die Unterseite des Hydrogels zu vernetzen. Wiederholen Sie Schritt 6.2.3 und 6.2.4.

7. Enzym Verdauung der BSA-Gummi

  1. Um einen hohlen Kollagengerüst zu haben, entfernen BSA Gummi in einer Weise, die nicht die Dimensionen im Hydrogel eingebettet auswirkt. Das Verfahren wird nachfolgend beschrieben.
    1. Schalten Sie die UV-Licht für 20-30 Minuten die Gewebekultur Haube zu sterilisieren.
    2. Machen 0,25% Trypsin-Lösung pH 7,8. Beispielsweise ist für 15 ml Wasser, hinzu 0,0376 g Trypsin in einem 50 ml konischen Röhrchen. Den pH-Wert auf 7,8 durch Zugabe geringer Mengen (2-5 & mgr; l) mit 1 M NaCl. Legen Sie die Lösung in einem 20-ml-Spritze und verschlossen mit einem 0,20 um Spritzenfilter. Drücken Sie den Kolben Flüssigkeit durch den Filter zu vertreiben und die sterile Lösung in ein neues Röhrchen sammeln.
    3. Schalten Sie das Wasserbad und die Temperatur auf 30° C.
    4. Nach 30 Minuten, schalten Sie die UV-Licht aus. Spray Ethanol auf alle Rohre und Materialien, die in der Haube verwendet wird.
    5. Übertragen Sie die Kollagen-Hydrogel unter der Haube und in getrennten konischen Röhrchen.
    6. Hinzufügen etwa 3-5 ml (gerade genug, um die Gele zu bedecken) von 0,25% Trypsin-Lösung mit einem pH von 7,8 zu jedem Röhrchen.
    7. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und Wirbel leicht für ca. 1 min.
    8. Platz in der 30 ° C warmen Wasserbad für 15-24 Std. Während im Wasserbad, Strudel leicht die Gele häufig, bis der BSA-Kautschuk aus dem Hydrogel verdaut oder entfernt worden ist.
      Hinweis: Um zu bestimmen, ob die BSA Gummi entfernt wurde, entweder der Kautschuk in der Trypsinlösung schwimmt oder es gibt gebrochenen Stücke. Es darf keine visuellen dunkle Bereiche innerhalb des Hydrogels sein.
  2. Um sicherzustellen, dass alle BSA Gummi und Trypsin wurde von den Hydrogelen entfernt worden ist, spülen sie wie unten beschrieben.
    1. Schalten Sie den PCR-hood UV-Licht für 20-30 min.
    2. Bereiten Mosconas Lösung. Kombinieren Kaliumchlorid (KCl, 28,6 mM), (NaHCO 3, 11,9 mM), Glucose (9,4 mM) und (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) in Wasser. PH-Wert auf 7,4 mit 1 M NaOH oder 12 M HCl-Lösung. Platzieren der Lösung in einer 20 ml Spritze und mit einem Spritzenfilter von 0,20 & mgr; m, um die Lösung zu sterilisieren.
    3. Spray alles mit Ethanol, bevor sie auf der Motorhaube platziert und lassen Sie das Ethanol zu trocknen.
    4. Öffne die Tube und übertragen 5-10 ml sterilem Mosconas Lösung auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen.
    5. Übertragen der Kollagen-Hydrogel zu dem konischen Rohr, das die Enzymlösung enthält. Stellen Sie sicher, dass das Hydrogel vollständig mit der Lösung bedeckt ist. Verlassen das Rohr in dem Schüttler im Kühlschrank bei 4 ° C für 30 min.
    6. Saugen Sie das Mosconas Lösung und wiederholen Sie Schritt zweimal 7.2.5.
    7. Lagerung bei 4 ° C.

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Representative Results

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Die Ergebnisse zeigen, dass diese Technik in biofabrication Erzeugung 3D-Gerüste effizient ist, die die räumliche Anordnung in in vivo Gewebe gesehen nachahmen kann. Die architektonischen Merkmale sind Vitalparameter für das Tissue Engineering Anwendung, eine entscheidende Rolle bei der In-vivo-Zell-Interaktion und Funktionalität des Gewebes zu spielen.

Die Konsistenz und Mischbarkeit des BSA-Kautschuk war ein wichtiger Parameter in ein BSA-Kautschuks, der homogen und in der Lage, seine beabsichtigte Form zu halten. Die Löslichkeit von Proteinen wird durch intermolekulare Effekte, wie dem Protein-Protein-Wechselwirkung und das Zusammenwirken mit dem Lösungsmittel bestimmt, die Änderungen auf die Gesamtprotein Verhalten induziert. Die Leitfähigkeit der BSA-Lösung wurde gemessen, was ein Hinweis auf die Salzkonzentration der Lösung ist. In Tabelle 1 sind die combions von BSA, Lösungsmittel und Glutaraldehyd getestet. Wie erwartet, die Proben, die die höchste Leitfähigkeit (2x PBS Lösungsmittel) erleichtert die Löslichkeit des BSA hatte.

Ein weiterer Parameter verwendet, um die geeigneten Bedingungen für die Entwicklung dieses Opfermaterial zu bestimmen, war die Reaktionsgeschwindigkeit. Die Reaktionszeit des BSA verringert, wenn die Konzentration von Glutaraldehyd erhöht, wie erwartet. Das Fixiermittel reagiert mit den α-Aminogruppen der Aminosäuren der N-terminalen Aminogruppe von Peptiden, und die Sulfhydrylgruppe von Cystein. Die Glutaraldehyd reagiert vorwiegend mit dem BSA durch die Aminogruppen von Lysin 14 die intermolekularen kovalenten Bindungen (1A) zu bilden. Nach einer Inkubationszeit zeigten die Proben eine Farbänderung von hellgelb bis dunkelgelb und braun, in der Intensität mit erhöhten Glutaraldehyd-Konzentration (Abbildung 1B) zu erhöhen. Die 20%, 30%, eind 40% BSA mit 2% Glutaraldehyd in Wasser hat keinen Gummi bilden. Die 40% ige BSA-Lösung, wegen seiner hohen Viskosität und der hochreaktive Fixiermittel führte Stärke entlang der Gummi in variieren. Dieses Verhalten kann in Eindringen in die Proteinketten homogen durch die Schwierigkeit des Glutaraldehyd verursacht werden. Das Lösungsmittel beeinflusst stark die Löslichkeit des Proteins sowie dessen Reaktion mit dem Fixiermittel. Die 2x PBS-Lösungen waren leicht mischbar. Die BSA-Lösung mit Wasser war schwierig zu mischen. BSA Löslichkeit wird durch die Leitfähigkeit des Lösungsmittels (Tabelle 2), was zu Konformationsänderungen in dem Protein stark betroffen. Die vielversprechendsten waren die Proben 30% BSA mit 3% Glutaraldehyd in PBS 1x und 2x PBS.

Um sicherzustellen, dass das Gummi zu einer nachhaltigen Belastungskräfte konnte, wurde ein Drucktest durchgeführt. Die mechanischen Eigenschaften von vier Proben von BSA Kautschuk wurden gemessen: 30% BSA 3% Glutaraldehyd in2x PBS, 30% BSA 3% Glutaraldehyd in 1x PBS, 20% BSA 3% Glutaraldehyd in PBS 2x und 20% BSA 2% Glutaraldehyd in 1x PBS. Die Sinuswellen zeigte eine sehr kleine Phasenänderung zwischen den Last- und Verdrängungskurven (Supplement 2), die mit den Spannungs- und Dehnungskurven (Supplement 3) übertragen werden. Basierend auf den Spannungs- und Dehnungskurven zeigten die ersten drei Proben Hysterese zwischen Be- und Entladen (2A-2C). Diese drei Proben als viskoelastische Material verhielt sich die elastischen und viskosen Eigenschaften enthält, wenn Kräfte angewendet wurden. Die 20% BSA 2% Glutaraldehyd zeigte Anzeichen einer bleibenden Verformung (2D). Die 30% ige BSA 3% Glutaraldehyd in 1x PBS und 2x PBS zeigten ein ähnliches Verhalten (2E -on Be- und Entladen Zyklus). Der Elastizitätsmodul wurde aus dem linearen Teil dieser vier Proben (2F) bestimmt. Die Konzentration des PhosphatsLösungsmittel signifikant erhöht das Elastizitätsmodul im Bereich getestet (p = 0,03). Die 20% BSA 2% Glutaraldehyd in PBS 1x leicht verformt, einen niedrigeren Elastizitätsmodul zeigen.

Um die enzymatische Verdauung des Gummi bewerten, wurde die Reaktionsgeschwindigkeit auf das Verschwinden des BSA Gummi berechnet, wenn in Kontakt mit dem Enzym bei bestimmten Zeitpunkt angeordnet. Die enzymatische Verdauung wurde als Batch-Reaktor behandelt. Ein Vergleich zwischen der Ausgangsgummi-Konzentration vor der Behandlung und der Gummi links nach gemacht wurde lyophilisiert werden, um die Kinetik der Verdauung zu erhalten. Abbildung 3 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit für jede Probe in Bezug auf die Konzentration von Glutaraldehyd und BSA, Lösungsmittel und die Verweildauer. Ein klarer Trend war zwischen den Vernetzer Konzentration und der Reaktionsgeschwindigkeit der Dissoziation des Unternehmens beobachtet. Die statistische Analyse wurde zu jedem Zeitpunkt durchgeführt. für thE 15-Stunden-Zeitpunkt, beeinflusst die Glutaraldehyd-Konzentration erheblich die Reaktionsgeschwindigkeit in einem p-Wert von 0,02 resultierende (Ergänzung Tabelle 4). Nach diesem Zeitpunkt werden sowohl die Glutaraldehyd und die BSA-Konzentration beeinflusst signifikant die Rate (Ergänzung Tabelle 5-7). Der einflussreichste Faktor war insgesamt die Glutaraldehyd-Konzentration durch eine signifikante p-Wert angegeben. Der Anstieg der Konzentration von Glutaraldehyd vermindert die Reaktionsgeschwindigkeit des Aufschlusses des Gummi Einheit.

Die Menge des Proteins durch Trypsin gelöst wurde unter Verwendung eines BCA-Assay (Figur 4) bestimmt. Eine allgemeine Tendenz wurde beobachtet: je niedriger die Konzentration des Fixiermittels, die mehr Protein wurde aus der BSA-Kautschuk verdaut. Trypsin in Wechselwirkung mit der Kautschukprobe durch das BSA zu spalten und die neu erstellten kovalente vom Glutaraldehyd gebildeten Bindungen, wodurch die Gesamtstruktur Auflösen überZeit. Es scheint, dass mit dem 1x PBS es zu einem früheren Zeitpunkt im Vergleich zu der PBS 2x mehr solubilisierte Protein ist. Im Laufe der Zeit gibt es eine Zunahme von Proteinen in Lösung bei 15 Stunden, die bis zu 48 Stunden zu erhöhen, fortgesetzt und dann sank sie. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, Trypsin ständig die Proteine ​​spalten und somit kleinere Peptide und Aminosäuren zu schaffen. Es kann auch auf den Test der Einschränkungen zurückzuführen ist, die nur Peptide lesen kann, die von drei oder mehr Aminosäuren zusammengesetzt sind. Die statistische Analyse zeigte, dass die BSA und Glutaraldehyd-Konzentration signifikant die Freisetzung des Proteins aus dem BSA Gummi betroffen (p <0,05). Eine Erhöhung der BSA-Konzentration führte zu einem Anstieg des Proteins im Überstand, während eine Erhöhung in Glutaraldehyd eine Abnahme der gelösten Proteins verursacht.

Um die Dissoziation des Opfermaterials messen, wurde das Gummi (feucht) gewogen, bevor es in Conta Platzierungct mit dem Trypsin. Das Äquivalent von Trockengewicht der in der Enzymverdauungslösung gelegt Kautschuk wurde Die ermittelten Werte in Supplement dargestellt mit 1. Die Enzymlösung mit dem BSA-Kautschuk umgesetzt wird, und somit das Protein solubilisiert. Der Kautschuk nach der Behandlung zurückblieb, wurde O / N lyophilisiert und gewogen. 5 zeigt, dass das Lösungsmittel die Dissoziation des Kautschuks beeinflusst. Bei der gleichen Konzentration von BSA und Glutaraldehyd, behielten die 2x PBS Lösungsmittel Kautschuke mehr ihres Materials gegenüber dem 1x PBS.

Drei feste Formteile wurden hergestellt: Loop Mold (Ergänzung 4A), Stabilität Stück (Ergänzung 4B) und Y-Form (6A, links). Die Edelstahl-Y Formteil wurde mit der Microlution Maschine erstellt (6A, rechts). Diese Form wurde die Reaktion mit 30% BSA und 3% glutaralde injiziertHyde in 2x PBS (6B, links). Der Kautschuk wurde auf O / N bei 4 ° C reagieren. Der Kautschuk wurde mit Kollagen (6B, Mitte) gegossen und dann Enzym verdaut (6B, rechts). Vorläufigen Daten legten nahe, dass bei pH 7,8 und einer Temperatur von 30 ° C für 15 Stunden, die BSA-Kautschuk kann mit minimalen Auswirkungen auf die Kollagengerüst verdaut werden. Nach 15 h wird der Kautschuk durch das Enzym und locker genug geschwächt, dass sie die Kanäle verlässt, ohne die geometrischen Eigenschaften des Kollagens zu beeinflussen. Ein 3D-Kollagen-Gerüst wurde erstellt, die bestimmte geometrische Merkmale. 6B (rechts) zeigt einen 4 mm Durchmesser Kanal in einem Kollagen-Hydrogel nach Enzymspaltung der BSA-Gummi hat. Der Kanal wurde mit einem Greifzirkel gemessen, um sicherzustellen, dass die ursprüngliche Dimension gehalten wurde. Tatsächlich war der neue Kanal in der Kollagen-Hydrogel 4 mm. Die BSA Gummiformen als 300 & mgr; m Abmessungen so klein halten, was uns getestet wurdeing die Stabilität Form (Abbildung 7). Diese Gerüste wurden für Rest Glutaraldehyd getestet und wir fanden keine Rückstände nach den Mosconas wäscht.

Abbildung 1
Abbildung 1. BSA Gummi. (A) BSA Gummi Reaktion. Die Glutaraldehyd vernetzt das BSA durch kovalente Bindungen zu schaffen. (B) BSA Gummi. Verschiedene Konzentrationen von BSA, Konzentrationen von Glutaraldehyd und Art des Lösungsmittels wurden auf 24-Well-Platten gegossen und reagierte O / N bei 4 ° C. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Spannungs-Dehnungskurven von BSA-Kautschuke. Spannungs-Dehnungskurven von BSA ru bbers. (A) 30% BSA 3% Glutaraldehyd in PBS 2x; (B) 30% BSA 3% Glutaraldehyd in 1x PBS; (C) 20% BSA 3% Glutaraldehyd in PBS 2x; und (D) 20% BSA 2% Glutaraldehyd in 1x PBS (3 Zyklen). Die Kurven AC Show Kautschuke, die eine gewisse Hysteresebereichs haben, aber wieder in ihre ursprüngliche Form zurück. Probe D zeigt eine Kautschuk mit einem sehr niedrigen Elastizitätsmodul, die leicht dauerhaft während der Be- und Entladevorgänge verformt. Probe A und B zeigten eine sehr ähnliches Verhalten wie in einer Be- und Entladen Zyklus auf die Grafik E (repräsentativ für einen Zyklus jeder Probe) zu sehen. Die Elastizität wurde durch die Konzentration des Fixiermittels und des verwendeten Lösungsmittels (F) beeinflusst. Die Proben zeigten eine signifikante Erhöhung des Moduls mit einem Anstieg von Salzen (** p <0,05). Eine höhere Konzentration Fixiermittel durch einen signifikanten Anstieg in der Elastizität der BSA-Kautschuke (* p <0,05).Arget = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Reaktionsgeschwindigkeit der Zersetzung der BSA-Kautschuk. Als Fixiermittel zunimmt, nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit für alle Proben in 1x PBS (A), 2 x PBS (B) und Wasser (C). Die 40% BSA 2% Glutaraldehyd in 2x PBS zeigt eine der höchsten Raten der Reaktion. Dies ist aufgrund der Schwierigkeit bei der Herstellung der BSA-Protein homogen angetroffen. (blau: 20% BSA, lila: 30% BSA und rot: 40% BSA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Protein Quantifi Kationen nach Enzymverdau. Als Fixiermittel zunimmt, das Protein aus den Kautschuken gelöst abnimmt für alle Proben in 1x PBS (A), 2 x PBS (B) und Wasser (C). (blau: 20% BSA, lila: 30% BSA und rot: 40% BSA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Gummi Verdauung. Wir bestimmten die Menge an Kautschuk verdaut durch den Start vergleichen und Trockenbasis Produkte beenden. Wir erhalten die geringste Menge an Verdauung auf 6% igem Glutaraldehyd Probe und das bei 30% Glutaraldehyd BSA 2% in 1x PBS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Abbildung 6
Abbildung 6. Verzweigte Prototyp. (A) Darstellung von Zweiggefäßsystem. Dargestellt auf der linken Seite ist der Feststoff in Mastercam erstellt, die zu G-Code umgewandelt wurde und hergestellt, um die Microlution 363-S mit, wie auf der rechten Seite zu sehen. Die Edelstahl-Formteil für eine 4 mm Zulaufkanal mit zwei 3 mm Abflusskanäle. (B) 3D-Kollagen-Gerüst. Dargestellt auf der linken Seite ist die BSA Gummi die Form oben gezeigt hergestellt werden. Das Zentrum zeigt das Gummi in der Kollagen-Hydrogel eingebettet. Dargestellt auf der rechten Seite sind die linken Kanäle innerhalb der Kollagengerüst nachdem der Kautschuk wurde Enzym verdaut. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
Abbildung 7. BSA-Kanal. Ein 300 um BSA-Kanal wurde von der Stabilität Stück Form entfernt. Es ist eine dünne Schicht aus Trennmittel um den Kanal herum. Die zusätzliche Fläche wird deutlich unter dem Mikroskop aus und kann leicht entfernt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

BSA (%) Glutaraldehyd (%)
20 2
20 3
20 6
30 2
30 3
30 6
40 2
40 3
6

. Drei verschiedenen Lösungsmitteln Verhältnis 1: Tabelle 1 BSA Gummi Parameter BSA und Fixiermittel wurden bei einer 4 gemischt.

Sample Leitfähigkeit (mS / cm) pH-Wert
BSA (%) Lösungsmittel
30 2x PBS 11,43 7,06
30 1x PBS 6,35 7,05
30 DI 2.39 6,76
20 2x PBS 13.00 6,92
20 1x PBS 8.67 7,09
20 DI 2,08

Tabelle 2. Leitfähigkeit und pH-Wert von BSA-Proben. Die Leitfähigkeiten und der pH der BSA-Lösungen wurde in Gegenwart verschiedener Lösungsmittel gemessen. Eine Erhöhung in der Leitfähigkeit zwischen 2x und 1x PBS gezeigt.

6
BSA (%) Glutaraldehyd (%) Lösungsmittel Beobachtungen
20 2 1x PBS Weich, leicht verformbaren Material
20 3 1x PBS Weich, aber robuster als die 2% Glutaraldehyd
20 6 1x PBS Steif, ein wenig spröde
30 2 1x PBS gute Konsistenz
30 3 1x PBS gute Konsistenz
30 6 1x PBS Spröde
40 2 1x PBS Sehr widersprüchlich ein Gel / Kautschuk Konsistenz bei der Schaffung
40 3 1x PBS Die Konsistenz variieren entlang der Probe
40 6 1x PBS Spröde
20 2 2x PBS Weich, leicht verformbaren Material, aber robuster als die 1x PBS Probe
20 3 2x PBS Weich, aber steifer als die 2%
20 6 2x PBS gute Konsistenz
30 2 2x PBS Gute Abstimmung, mehr studry als mit 1x PBS
30 3 2x PBS Gute Abstimmung, mehr studry als mit 1x PBS
30 2x PBS Gute Mischbarkeit aber britle
40 2 2x PBS Die Konsistenz variieren entlang der Probe
40 3 2x PBS Die Konsistenz variieren entlang der Probe
40 6 2x PBS Die Konsistenz variieren entlang der Probe und es war spröde
20 2 Wasser Haben Sie nicht ein Gel / Kautschuk-Material bilden
20 3 Wasser Bildete ein Gel scheinen aber steifer als ter 1x PBS und 2x PBS, inkonsistent
20 6 Wasser Bildete ein Gel scheinen aber steifer als die 1x PBS und 2x PBS, inkonsistent
30 2 Wasser Haben Sie nicht ein Gel / Kautschuk-Material bilden
30 3 Wasser Bildete ein Gel scheinen aber steifer als die 1x PBS und 2x PBS, inkonsistent
30 6 Wasser Bildete ein Gel scheinen aber steifer als die 1x PBS und 2x PBS, inkonsistent
40 2 Wasser Haben Sie nicht ein Gel / Kautschuk-Materi bildenal
40 3 Wasser Die Konsistenz variieren entlang der Probe - steifer oben
40 6 Wasser Die Konsistenz variieren entlang der Probe - steifer oben

Tabelle 3. BSA Gummi. Nach dem BSA Gummi reagiert O / N, ein 8-mm-Biopsie Lochung der Probe genommen wurde. Diese Tabelle enthält einige visuelle Beobachtungen der Konsistenz und Aussehen der Proben.

Ergänzende Abbildung 1
Supplement Abbildung 1. Fester Prozentsatz. Der Prozentsatz von Feststoffen aus jeder Kautschuk wurde bestimmt (Trockengewicht / Nassgewicht). Das Lösungsmittel hatte keinen Einfluss auf die Percentage von Feststoffen (p> 0,05). Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2
Supplement Abbildung 2. Sinus von 30% BSA 3% Glutaraldehyd 2x PBS. Die Druckbelastung und Verschiebung der Probe werden in Abhängigkeit von der verstrichenen Zeit angezeigt. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3
Supplement Abbildung 3. Sinuswelle von 30% BSA 3% Glutaraldehyd 2x PBS. Die Spannung und Dehnung der Probe wurden berechnet und aufgetragen als eine Funktion der verstrichenen Zeit. Es gibt eine kleine Phasenverschiebung, indimunikativen des viskoelastischen Verhaltens des Kautschuks. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4
Supplement Abbildung 4. Mastercam Feststoffe. (A) Schleife und (B) Stabilität Stücke. Nachdem diese mit Mastercam Gestaltung wurde die G-Code importiert und ein rostfreier Stahl oder Messing und die Microlution Maschine oder eine PLA Stück mit dem MakerBot 3D Replicator verwenden. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

Limits min Max
-17 3
Verschiebung (mm) -15 0,3
Welle Level 1 Level 2 Frequenz (Hz) Zyklus
Sinus -15 -3 1 5000
Datenerfassung
Scanzeit 1,008
Scan Punkte 360
Anzahl der Scans </ Td> 5
nachfolgende Scan 1,008 sec zwischen Scan

Supplement Tabelle 1. Drucktestparameter. Mit einer Sinuswelle, die Beziehung zwischen der Belastung und Verschiebung wurde für die vier Arten von Gummi bestimmt. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

ANOVA Ergebnisse
df SS FRAU F Bedeutung F
Regression 3 9.85E + 02 3.28E + 02 4.70E + 02 1.06E-18
Rest 20 1.40E + 01 6.99E-01
Gesamt 23 9.99E + 02
Regressionsanalyse
Koeffizienten Standart Fehler t Stat P-Wert
Abfangen 1.74E + 00 8.23E-01 2.12E + 00 4.70E-02
BSA (%) 7.82E-01 2.09E-02 3.74E + 01 5.49E-20
Glutaraldehyd (%) 3.17E-01 </ Td> 1.03e-01 3.09E + 00 5.71E-03
Lösungsmittel 2.61E + 01 2.22E + 01 1.18E + 00 2.53E-01

Supplement Tabelle 2. Statistische Analyse des Prozentsatzes an Feststoffen in der BSA-Kautschuk. Der BSA und Glutaraldehyd beeinflusst signifikant den Prozentsatz an Feststoffen. Das Lösungsmittel hatte keinen Einfluss auf den Prozentsatz von Feststoffen. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

ANOVA Ergebnisse
df SS FRAU F Bedeutung F
Regression 3 3.06E + 05 1.02E + 05 1.18E + 01 4.00E-03
Rest 7 6.07E + 04 8.67E + 03
Gesamt 10 3.67E + 05
Regressionsanalyse
Koeffizienten Standart Fehler t Stat P-Wert
Abfangen 6.50E + 02 4.25E + 01 1.53E + 01 1.23E-06
BSA (%) 4.67E + 00 3.80E + 01 1.23E-01 9.06E-01
Lösungsmittel 1.02E + 02 3.80E + 01 2.67E + 00 3.20E-02
Glutaraldehyd (%) 1.16E + 02 5.70E + 01 2.03E + 00 8.21E-02

Supplement Tabelle 3 Die statistische Analyse der Elastizitätsmodul der Konzentration PBS bezogen. Die PBS-Konzentration beeinflusst wesentlich den Elastizitätsmodul. Der Anstieg der Salze im Lösungsmittel eine Erhöhung des Elastizitätsmoduls verursacht. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

ANOVA Ergebnis
df SS FRAU F Bedeutung F
Regression 3 6.15E-15 2.05E-15 3.68E + 00 1.67E-02
Rest 60 3.34E-14 5.57E-16
Gesamt 63 3.96E-14
Regressionsanalyse
Koeffizienten Standart Fehler t Stat P-Wert
Abfangen 3.74E-08 1.37E-08 2.74E + 00 8.03E-03
BSA (%) 3.89E-10 3.62E-10 1.07E + 00 2.88E-01
Glutaraldehyd (%) -5.92E-09 1.83E-09 -3.23E + 00 2.02E-03
Lösungsmittel -6.78E-08 3.76E-07 -1.80E-01 8.58E-01

Supplement Tabelle 4. Die statistische Analyse der Reaktionsgeschwindigkeit nach 15 h Enzym die Verdauung. Die Glutaraldehyd-Konzentration erheblich die Reaktionsgeschwindigkeit der Verdauung des Gummi betroffen von bei höheren Konzentrationen Glutaraldehyd abnimmt. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

P-Wert
ANOVA Ergebnisse
df SS FRAU F Bedeutung F
Regression 3 7.36E-15 2.45E-15 3.62E + 01 1.21E-13
Rest 62 4.20E-15 6.78E-17
Gesamt 65 1.16E-14
Regressionsanalyse
Koeffizienten Standart Fehler t Stat
Abfangen 2.98E-08 4.77E-09 6.25E + 00 4.22E-08
BSA (%) 4.56E-10 1.26E-10 3.62E + 00 6.03E-04
Glutaraldehyd (%) -6.04E-09 6.15E-10 -9.82E + 00 3.00E-14
Lösungsmittel -6.57E-08 1.31E-07 -5.02E-01 6.17E-01

Supplement Tabelle 5. Die statistische Analyse der Reaktionsrate nach 24 h Enzymverdauung. Der BSA und Glutaraldehyd-Konzentration beeinflusst signifikant die Reaktionsgeschwindigkeit des Aufschlusses des Kautschuks. Bei höheren Konzentrationen Glutaraldehyd, gibt es eine Abnahme in ter Reaktionsgeschwindigkeit. Bei höheren BSA-Konzentrationen gibt es eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

ANOVA Ergebnisse
df SS FRAU F Bedeutung F
Regression 3 3.10E-15 1.03e-15 2.74E + 01 1.64e-11
Rest 64 2.42E-15 3.78E-17
Gesamt 67 5.52E-15
Regressionsanalyse
Koeffizienten Standart Fehler t Stat P-Wert
Abfangen 2.17E-08 3.50E-09 6.20E + 00 4.55E-08
BSA (%) 2.13E-10 9.20E-11 2.31E + 00 2.39E-02
Glutaraldehyd (%) -3.94E-09 4.53E-10 -8.70E + 00 1.90E-12
Lösungsmittel 3.04E-08 9.57E-08 3.18E-01 7.51E-01

Supplement Tabelle6. Die statistische Analyse der Reaktionsgeschwindigkeit nach 48 h Enzym die Verdauung. Die BSA und Glutaraldehyd Konzentration beeinträchtigt erheblich die Reaktionsgeschwindigkeit der Verdauung des Kautschuks. Bei höheren Konzentrationen von Glutaraldehyd, gibt es eine Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

ANOVA Ergebnisse
df SS FRAU F Bedeutung F
Regression 3 2.19E-15 7.29E-16 3.05E + 01 3.56E-12
Rest 61 1.46E-15 2.39E-17
Gesamt 64 3.64E-15
Regressionsanalyse
Koeffizienten Standart Fehler t Stat P-Wert
Abfangen 1.05E-08 2.84E-09 3.69E + 00 4.80E-04
BSA (%) 3.61E-10 7.48E-11 4.83E + 00 9.48E-06
Glutaraldehyd (%) -3.07E-09 3.69E-10 -8.33E + 00 1.21E-11
Damitlvent 3.97E-08 7.80E-08 5.09E-01 6.12E-01

Supplement Tabelle 7. Die statistische Analyse der Reaktionsgeschwindigkeit nach 72 h Enzym die Verdauung. Die BSA und Glutaraldehyd Konzentration beeinträchtigt erheblich die Reaktionsgeschwindigkeit der Verdauung des Kautschuks. Bei höheren Konzentrationen Glutaraldehyd, gibt es eine Abnahme in der Reaktionsgeschwindigkeit. Bei höheren BSA-Konzentrationen gibt es eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit. Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

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Biofabrication ist ein sehr interdisziplinäres Feld, in dem Biologie und Konstruktionsprinzipien komplexen Materialien zu erzeugen, zusammenführen, die nativem Gewebe nachahmen. Um dies zu erreichen, besteht ein Bedarf, Techniken zu entwickeln, die die Information verwenden, um von in vivo Gewebe gesammelt und übersetzt es in ein in vitro-Gerüst. Auf diese Weise kann eine Plattform entwickelt werden, dass ähnelt die architektonischen, funktionalen und mechanischen Eigenschaften des in-vivo-Gewebe. Die optimale Gerüstmaterial sollte bestimmte Eigenschaften besitzen, wie beispielsweise biokompatibel, um die mechanischen Eigenschaften des Gewebes von Interesse nachahmen, können der Lage kontrollierten Abbau, die Lebensfähigkeit der Zellen zu unterstützen und in der Lage erlauben Gewebe 2,3 Umbau.

Eine Vielzahl von Herstellungstechniken entwickelt wurden lebensfähige, dreidimensionale Konstrukte zu generieren. Diese Technologien lassen sich in zwei Hauptkategorien: konventionelle eind vorgerückt. Die herkömmlichen Techniken umfassen die Verwendung von synthetischen und natürlichen traditionellen Materialien porösen Strukturen zu machen. Einige Beispiele sind Lösungsmittel-Gießen, Gefriertrocknung und Schmelzformen. Nachteilig bei diesen Techniken gehören schlechte Kontrolle der Porosität innerhalb der Struktur (Porengröße und Vernetzung) und Schwierigkeiten, interne Kanäle innerhalb der Gerüste. Fortgeschrittene Techniken umfassen die Stereolithographie, Formen, 3D-Druck, und Elektrospinnen, ua 1. Diese Techniken haben Nachteile wie das Fehlen von Langstrecken-Mikroarchitektur Kanäle, Materialauswahl optimale mechanische Festigkeit zu verleihen, während der Abgabe durch Düsen kleinen Durchmessers der Lage ist, die Optimierung abhängig vom Material, erfordern eine umfangreiche Nachbearbeitung, die giftig sein können, und Einschränkung bei der Gestaltung der inneren Architekturen in einem in vitro-Konstrukt. Ein Hauptnachteil in den 3D-Druck ist die Verfügbarkeit von Biomaterialien, die ausreichende Zellträger sindUnd gleichzeitig die mechanischen Eigenschaften benötigt, um eine definierte architektonische Organisation 12 aufrechtzuerhalten. Die Technologie präsentiert hier umfasst sowohl konventionelle als auch fortgeschrittenen Herstellungstechniken. Das Beste aus beiden Welten von der Konvergenz von Computer Aided Manufacturing abgeleitet zu schaffen, oder importieren, die gewünschte Architektur mit der Entwicklung eines Enzym-labile Gummi. Die Edelstahlformen wurden unter Verwendung einer Fräsmaschine erstellt, aber ihre Herstellung wird auf diese Technik beschränkt. Verwendung eines 3D-Drucker (zB MakerBot) wurden die gleichen Formen aus Polymilchsäure (PLA) hergestellt. Die Negativformen wurden unter Verwendung von architektonischen Richtlinien durch das CAD-Programm entwickelt, gefräste, die festen Formen bereitstellt, die eine einfache und zuverlässige Übertragung von Funktionen auf jedes Material erstellen. Diese Technologie ist von Bedeutung, daß es nicht nur die Steuerung der externen Gewebezusammensetzung ermöglicht, sondern auch der sehr komplexe interne Architektur. Die vorliegende Arbeitin erster Linie auf die Charakterisierung des BSA Gummi konzentriert, die homogen gemischt werden können, leicht in einem angemessenen Zeitraum verdaut wird, war zu Veränderungen in seiner Struktur beständig und in der Lage ist Minute Eigenschaften nachzuahmen, während seine Stabilität während des Gießprozesses Halte . Die Einschränkung dieser Technik wurde getestet, und die Auflösung des Opfermaterial kann als 300 um in Durchmesserabmessungen so klein halten. Jedoch 7 zeigen, dass der Kanal durch eine dünne Schicht aus Trennmittel umgeben ist. Mit einem Mikroskop ist diese zusätzliche Fläche deutlich unterschieden und kann entfernt werden, um das gewünschte Maß zu haben. Diese biofabrication Technik ermöglicht die Replikation von einer Vielzahl von internen Strukturen, die aus makro mikroskaliger reichen.

Serum Albumin ist das häufigste Protein in das Kreislaufsystem. Da die Proteine ​​Polyelektrolyte sind, wurde die Löslichkeit durch elektrostatische Wechselwirkungen bestimmt 15-17. Es hat sich bei niedrigen Salzkonzentrationen gezeigt wurde, gibt es eine Salz-in-Effekt auf dem Protein erleichtern seine Löslichkeit 18. Glutaraldehyd ist ein Vernetzungsmittel, die Änderungen in den Eigenschaften von Albumin verursacht. Die Farbänderung in 1 zu sehen ist 19-21 zur Bildung der Aldimin-Bindungen zugeschrieben. Die Glutaraldehyd reagiert vorwiegend mit dem BSA durch die Aminogruppen von Lysin 14 die intermolekularen kovalenten Bindungen zu bilden. Daten zeigen, dass die Erhöhung von Salzen die Elastizität des Kautschuks (von 1x PBS PBS auf 2x) verbessert. Je höher Glutaraldehyd-Konzentration erzeugt steifer Gele, die früher eingestellt im Vergleich zu niedriger Konzentration diejenigen. Allerdings sind sie schwieriger zu dosieren, mischen homogen und bilden spröde Gele. Um die entsprechende Menge an BSA-Kautschuk in die Formen liefern, muss jeder Teil der Anordnung gehalten werden kalt, weil höhere Temperaturen die Glutaraldehyd und BSA Reaktion beschleunigen.Die ideale Kautschuk (30% BSA 3% Glutaraldehyd in 2x PBS oder 1x PBS) verhält sich wie ein viskoelastisches Material, das Laden, ohne permanent verformt standhalten kann. Dies wird sehr wichtig, bei der Handhabung und Gussmaterial rund um die BSA Gummistruktur.

Trypsin ist eine Serinprotease, die Proteine ​​hydrolysiert. Trypsin ist ein weit verbreitetes Enzym, das hohe Spaltungsspezifität hat. Es spaltet die Peptidketten hauptsächlich an der Carboxylseite von den Aminosäuren Lysin und Arginin 22. BSA ist bei niedrigen Konzentrationen in Wasser leicht löslich, und das Trypsin verdaut leicht die BSA Gummi des Kollagens intakt und relativ unberührt bleibt. Das Material kann kein Kontakt mit Zellen haben. Das Konstrukt wurde für die Anwesenheit von freiem Glutaraldehyd getestet und es gab keine Spuren dieses Fixiermittels. Dies zeigt die Wirksamkeit des BSA Kautschuk als Opfermaterial für biofabrication. In diesem Protokoll wurde Kollagen als Gerüstmaterial verwendet, aber jede otihr Material, das Trypsin Verdauung resistent ist, verwendet werden.

Zukünftige Arbeiten werden durch Impfen das Gerüst mit Endothelzellen und Fibroblasten-Zellen, die auf Wiederherstellung der Gefäß Komponenten innerhalb der Hydrogele fokussiert werden. Eine der Herausforderungen besteht darin, eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im ganzen innerhalb der Kanäle zu erstellen, die die native 3D-Verteilung zu imitieren. Zur Lösung dieses Problems wurde eine Strategie entwickelt wird, dass das Dicht oder Verstopfen der Kanäle und die Injektion der Zellsuspension ermöglicht. Das Test-Material ist Pluronic F127, die eine thermoreversible Gel, Flüssigkeit bei 4 ° C und einem Feststoff über 30 ° C 23,24. Eine hohe Konzentration des Pluronic wurde erfolgreich in die notwendige zeitliche Dichtung erzeugt. Nachdem die Zellsuspension in den Kanälen des Gerüsts ist, wird die Einheit für eine bestimmte Zeitdauer gedreht, bis die Zellen an allen Seiten des 3D-Struktur haften. Das Innere Kanal ausreichend Medien haben für die Aufrechterhaltungdas Überleben der Zelle. Pluronic behält seine Gelform und ist in einer wässrigen Umgebung leicht löslich. Sobald die Zellen haften, wird das Hydrogel mit Medien geflutet werden, und kann in stationären oder Strömungsbedingungen kultiviert werden, abhängig vom Zweck der Studie. Diese Methodik wird nochmals geprüft und wird die zu dieser Veröffentlichung folgen werden. Die biofabrication hier beschriebenen Technik derzeit verwendet wird ein Gerüst Nachbildung eines menschlichen Nierenarterie zu entwickeln. Der gleiche Ansatz könnte mit anderen Arten von Gewebe, wie Herzdurchgeführt, um die Anwendbarkeit dieser Technik auf eine Vielzahl von klinischen Anwendungen zu erweitern.

Die biofabrication Technik hier entwickelt wurde, ist ein Schritt nach vorn bei der Erzeugung von in-vitro-Gerüste, die innere geometrische Merkmale schnell und zuverlässig wiederholen kann. Ein natürliches Material, wie Kollagen, wurde ausgewählt, weil es eine optimale chemische und physikalische Signale zu den Zellen über synthetische Materialien bietet. diese naliche Materialien können für therapeutische Forschung, als in vitro-Modelle der Entwicklung, Fehlbildung, und Krankheitsgewebe sowie für den Ersatz von beschädigtem Gewebe verwendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I Collagen extracted from calf hide
Hydrocloric Acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) MP Biomedical U5378 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS
Albumium from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A9647
Glutaraldehyde Sigma -Aldrich G5882 Toxic
Lard Fields 3090
Stainless Steel Molds Milled using Microlution Machine
Air Brush Kit Central Pneumatic 47791
Mixing Tip for double syringe Medmix ML2.5-16-LLM Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med
Small O ring for double syringe Medmix PPB-X05-04-02SM Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural
Double Syringe cap  Medmix VLX002-SM Cap, 4:1/10:1, PE brown, med
Big O ring for double syringe Medmix PPA-X05-04-02SM Piston A, 5 ml, 4:1
Double Syringe Medmix SDL X05-04-50M Double syringe, 5 ml, 4:1
Double Syringe Dispenser Medmix DL05-0400M Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain
Laminim 3.6 mg/ml - extracted USC lab
20 ml Syringe Luer Lock Tip BD 302830
Luer Lock Caps Fisher JGTCBLLX
HEPES Sigma -Aldrich H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) Life Technologies 1143-030
Trypsin Life Technologies 27250-018
UV Crosslinker  Spectroline UV XLE1000
Sodium Cloride (NaCl) Fisher S271-10 To prepare Mosconas
Potassium chloride (KCl) Sigma -Aldrich P5405-250 To prepare Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328-500 To prepare Mosconas
Glucose Sigma -Aldrich G-8270 To prepare Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S-7907 To prepare Mosconas
Sterile Filter for syringes Corning 431224

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References

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Dreidimensionale Biomimetic Technologie: Neuartige Biorubber Erzeugt definierte Mikro- und Makro-Skala Architekturen in Collagen Hydrogele
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Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).More

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).

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