Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Driedimensionale Biomimetic Technologie: Novel Biorubber Creëert Defined micro- en macro-schaal Architectures in Collageen Hydrogels

doi: 10.3791/53578 Published: February 12, 2016

Abstract

Weefsel steigers spelen een cruciale rol in het weefsel regeneratieproces. De ideale steiger moet voldoen aan een aantal eisen, zoals het hebben van een goede samenstelling, gerichte modulus, en goed gedefinieerde architectonische kenmerken. Biomaterialen die de intrinsieke structuur van in vivo weefsel herhalen van vitaal belang voor het bestuderen van ziekten en voor de regeneratie van verloren misvormde weke delen te vergemakkelijken. Een nieuwe biofabrication techniek ontwikkeld die geavanceerde imaging, driedimensionale (3D) drukken en selectieve enzymatische activiteit waarmee een nieuwe generatie van biomaterialen voor onderzoek en klinische toepassing. Het ontwikkelde materiaal, runderserumalbumine rubber, is de reactie geïnjecteerd in een mal die specifieke geometrische kenmerken handhaaft. Dit offeren materiaal maakt het mogelijk een adequate overdracht van de architectonische kenmerken van een natuurlijke steiger materiaal. Het prototype bestaat uit een 3D collageen steiger met 4 en 3 mm kanalen die reprESENT een vertakte architectuur. Dit document benadrukt het gebruik van deze biofabrication techniek voor het genereren van natuurlijke constructen. Dit protocol maakt gebruik van een computer-aided software (CAD) aan een vaste matrijs die reactiegegoten met BSA rubber gevolgd door enzymatische digestie van het rubber zal produceren, waardoor de architecturale eigenschappen in de dragermateriaal.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Op het gebied van tissue engineering de mogelijkheid om weefsel steigers fabriceren is van vitaal belang. Een geschikte weefselskelet een 3D structuur bestaat uit biocompatibele materialen, en bootst in vivo weefselarchitectuur naar cel en weefselgroei en remodellering bevorderen. Deze steiger moet het transport van voedingsstoffen en de verwijdering van afvalstoffen 1-4 toestaan. Een van de belangrijkste obstakels bij de productie van deze steigers is de mogelijkheid om specifieke geometrische kenmerken herhalen in een biocompatibel materiaal. Biofabrication verscheidene technieken zijn gerapporteerd aan de geometrische kenmerken van deze steigers temperen, electrospinning voorbeelden 5-8, solvent-casting 9, 10 stereolithografie en 3D-printen 11, onder anderen. Deze technieken tekortschieten bij het verstrekken van een relatief eenvoudige overdracht van beheersbare interne en externe architectonische kenmerken, zijn duur, worden beperkt door hun resolutie en bedrukbaarheid ( 12 te produceren vereist.

In veel commerciële fabricage systemen, is het ontstaan ​​van holten, kanalen en kenmerken bereikt met zand of andere geschikte verwijderbare of te offeren materiaal. De metalen of plastic deel wordt gevormd rond de zandmal en zodra deze is gestold, wordt het zand verwijderd. In vrijwel dezelfde manier, de volgende generatie van biomaterialen heeft de BioSand equivalent. Daarom werd de BSA rubber ontwikkeld ter vervanging van BioSand. De BSA rubber een nieuw samengestelde materiaal dat uit runderserumalbumine verknoopt met glutaaraldehyd. Het uiteindelijke doel is om specifieke architectonische kenmerken herscheppen in een biologisch afbreekbaar collageen schavot. De kenmerken van de opofferende biorubber die dimensionele getrouwheid handhaaft de vorm van het oorspronkelijke weefsel beschreven.

in vivo weefsel elasticiteit en andere eigenschappen van het weefsel van belang na te bootsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Bepaal het percentage van vaste stoffen in de Collagen Batch

  1. Pak de collageen na een eerder gepubliceerde procedure 13. Dooi minste 20 ml collageen. Bepaal de initiële percentage collageen vaste stoffen in de batch om de collageenconcentratie manipuleren de hydrogelen.
    1. Snijd drie stukjes aluminiumfolie (ongeveer 6 x 6 cm) en vormen elk een pan met de bodem van een 25 ml bekerglas. Noteer het gewicht van elke pan.
    2. Voeg een kleine hoeveelheid collageen aan elke pan en noteer het totale gewicht van de aluminium pan en collageen. Voeg 0,5-0,8 g collageen op elke aluminium pan.
      Opmerking: Na deze stap zijn er drie aluminiumfolie pannen en elk moet een kleine hoeveelheid collageen hebben. Zorg ervoor dat het gewicht van elk (totaal 3) lege aluminium pan en het gewicht van de pan na de toevoeging van collageen op te nemen.
    3. Bereken het gewicht van het collageen in elke pan behulp van de fadat formule:
      Collageen gewicht = Pan en collageen gewicht - Pan gewicht
    4. Plaats de drie aluminium pannen die het collageen in de oven op 100 ° C gedurende 24 uur aanhouden.
    5. Na 24 uur op te nemen het gewicht van elke aluminium pan en het uitgedroogd collageen.
    6. Bereken het gewicht van het gedroogde collageen met de volgende formule:
      Gedehydrateerde collageen gewicht = Pan en vochtarme collageen gewicht - Pan gewicht
    7. Bereken het percentage vaste stof van de drie monsters aan het collageen vaste concentratie te bepalen volgens de onderstaande formule:
      vergelijking 2
    8. Bereken de gemiddelde collageen vaste-stofgehalte van de partij via het percentage collageen vaste stoffen voor elk van de drie monsters.
      Opmerking: Het collageen dat wordt gebruikt is wat overblijft van de gehydrateerde collageen. Geen van de gedroogde collageen wordt gebruikt.
    9. Na het bepalen van het percentage collageen vaste stof (initial collageen concentratie) van de partij, voort te zetten met behulp van de resterende gehydrateerd collageen. Gebruik een gekalibreerde pH-meter om de pH van het collageen batch passen aan 3.
      1. Voeg kleine hoeveelheden (2-5 gl tegelijk) van 12 N zoutzuur (HCl). Blijf op ijs te allen tijde. Niet zoutzuur rechtstreeks aan het collageen - toevoegen van het zuur aan de zijkant van de buis. Na toevoeging van het zuur, de spatel gebruikt om het zuur te duwen aan het collageen en snel roer het mengsel.
    10. Zodra een pH van 3 bereikt, laat het collageen zitten O / N bij 4 ° C.

2. Voorbereiding van de BSA Rubber

  1. Bereid de oplossing runderserumalbumine (BSA) volgens de onderstaande procedure.
    1. Bereid 2x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg twee PBS tabletten 100 ml water aan 0,02 M PBS-oplossing.
    2. Combineer BSA 2x met PBS tot een 30% BSA-oplossing volgens de procedure hieronder creëren.
      1. Bijvoorbeeld, een 30% BSA maken met 30 ml 2x PBS, gebruik 12,9 g BSA. Voeg 1/3 van de 2x PBS (bijvoorbeeld 10 ml) in een kolf met een roerstaaf. Voeg 1/2 van de BSA (bijvoorbeeld 6,45 g BSA) aan de kolf en met een spatel, nat droge opgeloste stof.
      2. Herhaal deze procedure voor het toevoegen PBS en BSA totdat alle opgeloste stof en oplosmiddel uit de kolf. Gebruik de spatel om alle opgeloste stof bevochtigen. Het zal lijken op een mix van wat vloeistof en bosjes. Laat het zitten voor ongeveer 30 min.
      3. Draai vervolgens de roerder op een lage cyclus en zorg ervoor dat er geen klonten rondom het roerstaafje. Moet 90 min om alles in oplossing te krijgen of kan worden overgelaten roeren O / N bij 4 ° C. Nadat de opgeloste stof wordt alle opgeloste Plaats de oplossing in een 20 ml spuit en afgedekt met een 0,20 urn spuitfilter. Druk op de zuiger om vloeistof te verdrijven door het filter en het verzamelen van de gesteriliseerde oplossing in een nieuwe buis. Bewaren bij 4 ° C.
    3. Bereid 3% glutaraldehyde solutidoor verdunning van 25% glutaaraldehyde oplossing steriel gefiltreerd 2x PBS. Bijvoorbeeld, voor 10 ml van 3% glutaraldehyde-oplossing, gebruik 2 ml 25% glutaaraldehyde en 8 ml 2x PBS. Bewaren bij 4 ° C.

3. Mallen Treatment

Opmerking: De in dit document beschreven prototype maakt gebruik van een op maat gemaakte roestvrijstalen Y mal stuk. De matrijs bevat een instroom en uitstroom twee kanalen 4 en 3 mm, respectievelijk. Ten eerste, schone mallen, spuiten ze met onverzadigde reuzel, en steriliseer hen. Bereid de vormen volgens de hierna beschreven procedure.

  1. Schone roestvrij stalen mallen gebruikt sonicator met een frequentie van 35 kHz. Plaats de vormen in de ultrasoonapparaat en dompel ze met water en ijs. Houd de vormen koude allen tijde tijdens de ultrasoonapparaat loopt. Voer het ultrasoonapparaat gedurende 2 perioden van 90 min.
    1. Na elke periode gebruiken een naald om ervoor te zorgen dat er geen materiaal in de Luerslot roestvrij staal of bRass connector. Zeep en water om het gehele oppervlak van beide zijden van de matrijzen te reinigen. Controleer of er geen obstakel in de kanalen.
  2. Plaats de mallen, schroeven en Luer lock connector in een autoclaaf zak en autoclaaf is.
  3. Vul de fles die hecht aan een lucht spuit halverwege met in de handel verkrijgbaar reuzel (gemengde vetzuur release agent). Plaats de dop met een gewone dop fles. Plaats het in een autoclaaf zak en autoclaaf het.
    Opmerking: Reuzel wordt gebruikt om de afgifte van het materiaal reactiegegoten later zal (BSA rubber) te vergemakkelijken. Plaats het deksel spuitbusfles in de autoclave- kan de interne afdichting beschadigen.
  4. Warmen de reuzel voor 45 seconden of totdat het duidelijk en vloeistof in een magnetron. Schroef de lucht spuit deksel aan de reuzel fles. Sluit de deksel met de sproeier. Bevestig de spuit om de lucht bron bij de labtafel. Open de luchtklep, en open het mondstuk van de spuit totdat het begint het bevochtigen van het oppervlakvan een papieren handdoek.
  5. Spray reuzel loodrecht op het matrijsoppervlak tot het oppervlak volledig wordt bedekt. Na elk stuk is bespoten, plaats ze in een petrischaal en verzegelen. Plaats de schimmels bij 4 ° C gedurende 2 uur.
  6. Ga verder met de mallen steriliseren van het oppervlak aan UV-licht blootgesteld gedurende 30 min. Plaats ze terug bij 4 ° C tot ze klaar zijn om de reactie geïnjecteerd worden.

4. Injectie van de Reactie van de BSA Rubber

Opmerking: Alle materialen en oplossing moet koud blijven tot het eerste gebruik om voortijdige instelling van de BSA rubber in de volgende stappen te voorkomen.

  1. Bereid de dispenser voor het leveren van de BSA rubber om de matrijzen de volgende stappen.
    1. Steriliseren alle mengcomponenten (twee O-ringen, spuitkap, dubbele spuit, mengen tip en 4: 1 dispenser) door ze bloot te stellen aan UV licht gedurende 30 min in de polymerasekettingreactie (PCR) kap.
      Opmerking: Een PCR kap werd gebruikt omdat tZijn procedure houdt fixatieven. Deze chemicaliën kunnen niet worden gebruikt in de cel / weefselkweek kap vanwege het risico van blootstelling en toxiciteit voor de cellen. Iedere andere kap die een UV-licht bevat zal geschikt zijn.
    2. Plaats het dopje op de oplossing houder.
    3. Voer de meng- en injectie op een 4: 1 verhouding van BSA glutaraldehyde. Voeg de 30% BSA aan de dubbele spuit kamer die het hoogste bedrag van de oplossing zal opleveren (Het duurt ongeveer 4 ml te nemen in te vullen). Zorg ervoor dat u voldoende ruimte laten aan de O-ring te plaatsen om de overvolle en vervuiling van de aangrenzende kamer te voorkomen.
    4. Voeg 3% glutaaraldehyde oplossing voor de andere kamer (het zal ongeveer 1 ml naar vullen). Zorg ervoor dat u voldoende ruimte laten aan de O-ring te plaatsen om overlopen en vervuiling van de aangrenzende kamer te voorkomen.
    5. Plaats de dubbele spuit op de dispenser. Kantel de montage verticaal, zodat de spuit cap is op de top. Plaats de dop met het mengen tip.
    6. ScREW de twee roestvrij stalen mal stukken samen.
    7. Plaats het aan de binnenzijde van een autoclaaf tas.
    8. Om de lucht in de dispenser verwijderen, houd hem rechtop en snel knijp de handgreep eenmaal een kleine hoeveelheid BSA gemengd met glutaaraldehyde los. Dan snel bevestig de RVS Y mal Luer lock-connector aan de spuit.
    9. Houd de roestvrijstalen Y mal met de linkerhand en de BSA-Glutaraldehyd mengsel dispenser aan de rechterkant. Afwisselende waartoe elk der linker en rechter uitlaat van de uitstroomkanalen door de uitlaat naar de zijkanten van de autoclaafzak te zorgen dat de binnenste holtes gevuld met de oplossing. Dan, plaats de mallen horizontaal en weer te injecteren.
    10. Maak de mallen van de dispenser en plaats in een 25 mm petrischaal.
    11. Plaats Parafilm rond de petrischaal om uitdroging van het rubber te voorkomen.
    12. Plaats de vorm in de 4 ° C koelkast O / N.

Opmerking: Het collageen dient op ijs te allen tijde tijdens het proces blijven.

  1. Wijzig de collageenconcentratie met het percentage collageen vaste stoffen.
    1. Voeg 10 ml van 1,75% collageen door instelling van de oorspronkelijke collageenconcentratie met koud water.
    2. Met een geijkte pH-meter, op pH 3 met behulp 12 N zoutzuur. Mis zoutzuur niet rechtstreeks aan het collageen voeg het zuur aan de zijkant van de buis. Na toevoeging van het zuur, de spatel gebruikt om het zuur te duwen in het collageen en snel roer het mengsel.
    3. Weeg 4 g collageen in een afzonderlijke conische buis.
    4. Centrifugeer de collageen lucht te verwijderen bij 4 ° C en 9343 g gedurende 20-30 minuten.
    5. UV steriliseren celkweek kap 30 min en voeg 14 ul van laminine voor de 4 ml collageen. Dit resulteert in een uiteindelijke laminine concentratie van 10 ug / ul. Opmerking: Laminine biedt structural integriteit, hechting en bevordert verschillende cellulaire reacties.
    6. Draai de PCR UV licht gedurende 20-30 min alvorens de kap voor sterilisatie.
    7. Plaats de Luer lock dop te hechten aan een 20 ml injectiespuit, in ethanol gedurende een 2 uur. Vervolgens laten drogen en plaats het in UV-licht.
    8. Gamma bestralen het collageen voor 8,6 min tot 1200 cGy bereiken.
      Opmerking: Het zal afhangen van het verval van het cesium source. Stel de tijd om dezelfde dosis te bereiken.

6.Casting Collageen op BSA Rubber

  1. Aan het collageen polymeriseren Gebruik een 8: 1: 1 verhouding (collageen: HEPES: MEM). De volgende procedure is gebaseerd op een aanvankelijke 4 g aangezuurde collageen (uit stap 5.1.8).
    1. Voeg een 0,2 N HEPES-oplossing in water en breng de pH op 9 door toevoeging van kleine hoeveelheden (1-5 ui) van 1-5 M natriumhydroxide (NaOH). Met een geijkte pH-meter, bewaken de pH van de oplossing na elke toevoeging. Bewaren bij 4 ° C of keep op ijs.
    2. Zet het UV licht van de weefselkweek kap gedurende 20-30 minuten aan de kap steriliseren.
    3. Autoclaaf tang, spatel en scalpel voor sterilisatie.
    4. Meng 1,5 ml 0,2 N HEPES (pH 9) en 1,5 ml van 10x MEM met de weefselkweek kap. Zorg ervoor om het op ijs en vortex het voor 5 seconden voorafgaand aan het gebruik te houden. Bewaar bij 4 ° C of te houden op ijs.
    5. Om de PCR kap steriliseren, zet het UV-licht gedurende 30 minuten.
    6. Plaats een 12 wells plaat en een 20 ml injectiespuit bij -20 ° C gedurende 10 minuten, of tot gebruik blijven. Opmerking: Houd alle materialen koude totdat klaar voor gebruik. De temperatuurstijging veroorzaakt premature collageen fibrillogenese.
    7. Spray alle buizen en goed platen die zullen worden in de kap met 70% ethanol en laat ze drogen voor sterilisatie. Plaats een 20 ml spuit op ijs afgekoeld voor later gebruik.
    8. In de PCR-kap, opent u de roestvrij stalen mallen om de BSA rubber en met behulp van een scalpel los, snijd de uitlaat kanalen van de BSA rubber schimmel.
    9. Onder de motorkap PCR, open de steriele collageen buizen en voeg 1 ml van de HEPES-MEM-oplossing (zorg ervoor dat voordat het extraheren van de HEPES-MEM-oplossing, dat het goed gemengd en er zijn geen vaste deposito's).
    10. Met de steriele spatel, meng het collageen en bufferoplossing.
    11. Sluiten en vortex snel een goed gemengde hydrogel waarborgen.
    12. Over te dragen aan een koude 20 ml spuit.
    13. Met één hand de BSA Rubber binnenkant van de put en, met de andere afzien helft van het collageen hydrogel oplossing op de bodem van de put.
    14. Met behulp van de steriele pincet, ervoor te zorgen dat de rubberen in- en uitstroom uiteinden goed raken de zijkanten van het.
    15. Pour collageenoplossing bovenop het rubber tot volledig bedekt.
    16. Controleer of de BSA rubber in het collageen is opgehangen en dat er geen luchtbellen, in het bijzonder nabij de uiteinden van de rubber.
    17. Plaats het deksel en wikkel Parafilm rond deomtrek van de put.
    18. Zet in de incubator gedurende 1 uur bij 37 ° C. Houd de PCR UV-licht op.
  2. Na de polymerisatie van het collageen, UV verknopen de hydrogel via de volgende procedure.
    Opmerking: De verknoping van het collageen wordt uitgevoerd met een UV crosslinker inrichting waarin de hoeveelheid energie kan worden bestuurd.
    1. Schakel de UV crosslinker en wordt de energie instelling om de lege ruimte te bestralen met 630.000 uJ / cm 2.
    2. Verwijder de gels uit de incubator.
    3. Spray handen met ethanol, en, binnen de kamer, verwijdert u het deksel zo snel mogelijk.
    4. Sluit de tank en UV verknopen de hydrogelen van de energie-instelling te selecteren en bestralen 630.000 uJ / cm 2.
    5. Na de verknoping cyclus, zet het UV-licht op de PCR-kap
    6. Spray handen met ethanol en open de kamer snel plaatsen van het deksel weer op de wells plaat. Verplaats de well plaatde PCR kap.
    7. Met behulp van de steriele spatel voorzichtig los te maken en verwijder de gel uit de put. Flip de gels onder de motorkap naar de bodem van de hydrogel verknopen. Herhaal stap 6.2.3 en 6.2.4.

7. enzymdigestie van de BSA Rubber

  1. Met het oog op een holle collageen schavot hebben, verwijderen BSA rubber op een manier die geen afbreuk doet aan de afmetingen ingebed in de hydrogel. De procedure wordt hieronder beschreven.
    1. Zet het UV-licht voor 20-30 min naar de weefselkweek kap steriliseren.
    2. Voeg 0,25% trypsine-oplossing pH 7,8. Bijvoorbeeld, voor 15 ml water, voeg 0,0376 g trypsine in een 50 ml conische buis. Breng de pH op 7,8 door toevoeging van kleine hoeveelheden (2-5 ul) van 1 M NaCl. Plaats de oplossing in een 20 ml spuit en afgedekt met een 0,20 urn spuitfilter. Druk op de zuiger om vloeistof te verdrijven door het filter en het verzamelen van de steriele oplossing in een nieuwe buis.
    3. Zet het waterbad en zet de temperatuur tot 30° C.
    4. Na 30 min, zet het UV-licht. Spray ethanol over alle buizen en materialen die worden gebruikt in de kap.
    5. Breng de collageen hydrogel onder de motorkap en plaats in een aparte conische buis.
    6. Voeg ongeveer 3-5 ml (net genoeg om de gels te dekken) van 0,25% trypsine-oplossing met een pH van 7,8 aan elke buis.
    7. Sluit de buizen met Parafilm en vortex lichtjes gedurende ongeveer 1 minuut.
    8. Plaats in de 30 ° C waterbad gedurende 15-24 uur. Terwijl in het waterbad, licht vortex de gels dikwijls tot de BSA rubber is geknipt of uit de hydrogel.
      Opmerking: Om te bepalen of de BSA rubber is verwijderd, ofwel de rubber drijft in de trypsine oplossing of er kapotte stukken. Er mogen geen visuele donkere gebieden binnen de hydrogel.
  2. Om ervoor te zorgen dat alle BSA rubber en trypsine heeft uit de hydrogels is verwijderd, spoel het zoals hieronder beschreven.
    1. Zet de PCR hood UV-licht voor 20-30 min.
    2. Bereid Mosconas oplossing. Combineer kaliumchloride (KCl, 28,6 mM), (NaHCO3, 11,9 mM), glucose (9,4 mM) en (NaH 2PO 4, 0,08 mM) in water. Pas de pH op 7,4 met 1 M NaOH of 12 M HCl-oplossing. Plaats de oplossing in een 20 ml spuit en gebruik een spuitfilter van 0,20 urn om de oplossing te steriliseren.
    3. Spray alles met ethanol voordat ze op de kap en laat de ethanol te drogen.
    4. Open de tube en breng 5-10 ml steriele Mosconas oplossing voor een nieuwe 50 ml conische buis.
    5. Breng de collageen hydrogel de conische buis die de enzymoplossing bevat. Zorg ervoor dat de hydrogel volledig bedekt is met de oplossing. Laat de buis in de shaker in de koelkast bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    6. Zuig het Mosconas oplossing en herhaal stap 7.2.5 tweemaal.
    7. Bewaren bij 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De resultaten tonen aan dat dit biofabrication techniek efficiënt in het genereren van 3D draagstructuren die de ruimtelijke rangschikking gezien in vivo weefsel nabootsen. De architectonische kenmerken zijn vitale parameters voor weefselregeneratie toepassing, spelen een cruciale rol in de in vivo cel interactie en functionaliteit van het weefsel.

De consistentie en mengbaarheid van de BSA rubber was een belangrijke parameter in het produceren van een BSA rubber die homogeen en kan de beoogde vorm te behouden. De oplosbaarheid van eiwitten wordt bepaald door intermoleculaire effecten, zoals eiwit-eiwit interactie, en de interactie met het oplosmiddel, die veranderingen in de totale proteïne gedrag induceert. De geleidbaarheid van de BSA oplossing werd gemeten, wat een indicatie van de zoutconcentratie van de oplossing. Tabel 1 vermeldt de combinations van BSA, oplosmiddel en glutaaraldehyde getest. Zoals verwacht, de monsters die de hoogste geleidbaarheid had (2x PBS oplosmiddel) vergemakkelijkt de oplosbaarheid van BSA.

Een andere parameter gebruikt om de juiste conditie te bepalen voor de ontwikkeling van deze opofferingsmateriaal was de reactiesnelheid. De reactietijd van de BSA af als de concentratie van glutaaraldehyde toegenomen, zoals verwacht. Het fixeermiddel reageert met de α-aminogroepen van de aminozuren, de N-eindstandige aminogroep van peptiden en de sulfhydrylgroep van cysteine. Glutaaraldehyde voornamelijk reageert met de BSA via de aminogroepen van lysine aan de intermoleculaire covalente bindingen (Figuur 1A) 14 vormen. Na een incubatieperiode, de monsters vertoonden een kleurverandering van lichtgeel tot donkergeel en bruin, neemt in intensiteit toegenomen glutaaraldehyde concentratie (Figuur 1B). De 20%, 30%, eend 40% BSA met 2% glutaaraldehyde in water heeft een rubberen vormen. De 40% BSA-oplossing, vanwege de hoge viscositeit en de zeer reactieve fixeermiddel, resulteerde in variërende sterkte langs het rubber. Dit probleem kan worden veroorzaakt door de moeilijkheid van het glutaaraldehyde in het penetreren van de eiwitketens homogeen. Het oplosmiddel sterk beïnvloed de oplosbaarheid van het eiwit en zijn reactie met het fixeermiddel. De 2x PBS oplossingen waren gemakkelijk mengbaar. De BSA-oplossing met water was moeilijk te mengen. BSA oplosbaarheid wordt sterk beïnvloed door de geleidbaarheid van het oplosmiddel (tabel 2), waardoor conformationele veranderingen in het eiwit. De meest veelbelovende monsters werden de 30% BSA met 3% glutaaraldehyde in 1x PBS en 2x PBS.

Opdat de rubber kon aanhoudende belastingskrachten, werd een drukproef uitgevoerd. De mechanische eigenschappen van vier monsters van BSA rubber werden gemeten: 30% BSA 3% glutaraldehyde in2x PBS, 30% BSA 3% glutaaraldehyde in 1x PBS, 20% BSA 3% glutaaraldehyde in PBS en 2x 20% BSA 2% glutaaraldehyde in 1x PBS. De sinusgolven vertoonde een zeer geringe faseverandering tussen de lading en verplaatsingscurven (supplement figuur 2) worden overgebracht om de spanning en rek krommen (supplement figuur 3). Op basis van de spanning en rek kromme, de eerste drie toonden hysterese tussen het laden en lossen (Figuur 2A-2C). Deze drie exemplaren gedroeg zich als een visco-elastisch materiaal dat elastische en visceuze eigenschappen bevat wanneer krachten werden toegepast. De 20% BSA 2% glutaaraldehyde tekenen van blijvende vervorming (figuur 2D). De 30% BSA 3% glutaaraldehyde in 1x PBS en 2x PBS vertoonden een soortgelijk gedrag (Figuur 2E -on laad- en ontlaadcyclus). De elasticiteitsmodulus werd bepaald uit het lineaire gedeelte van deze vier monsters (figuur 2F). De concentratie van het fosfaatoplosmiddel een significant verhoogde elastische modulus in het geteste bereik (p = 0,03). De 20% BSA 2% glutaaraldehyde in 1x PBS vervormd eenvoudig, met een lagere elasticiteitsmodulus.

De enzymatische digestie van het rubber te evalueren, werd de reactiesnelheid berekend op basis van het verdwijnen van de BSA rubber wanneer geplaatst in contact met het enzym op specifieke tijdstip. De enzymatische vertering werd behandeld als een batch-reactor. Een vergelijking tussen de uitgangsrubber concentratie vóór de behandeling en de rubber vertrokken na gevriesdroogd werd de kinetiek van de vertering te verkrijgen. Figuur 3 toont de reactiesnelheid voor elk monster met betrekking tot de concentratie van glutaaraldehyde en BSA, oplosmiddel en de verblijftijd. Een duidelijke trend werd waargenomen tussen de crosslinker concentraties en de reactiesnelheid van dissociatie van de entiteit. Statistische analyse werd uitgevoerd op elk tijdstip. voor the 15-uur tijdstip, het glutaaraldehyde concentratie beïnvloedde de reactiesnelheid leidt tot een p waarde van 0,02 (Supplement Tabel 4). Na dat tijdstip, zowel de glutaaraldehyde en de BSA concentratie beïnvloedde de snelheid (Supplement Tabel 5-7). De meest invloedrijke factor algemeen was de glutaaraldehyde concentratie aangeduid door een grotere waarde p. De toename van glutaaraldehyde concentratie daalde de reactiesnelheid van de afbraak van de rubber entiteit.

De hoeveelheid eiwit, oplosbaar in trypsine werd bepaald met een BCA assay (figuur 4). Een algemene trend waargenomen: hoe lager de concentratie van het fixeermiddel werd meer eiwitten gedigereerd de BSA rubber. Trypsine wisselwerking met de rubber monster door het splitsen van het BSA en de nieuw gecreëerde covalente bindingen gevormd door de glutaraldehyde, waardoor het oplossen van de algemene structuur overtijd. Het schijnt dat de 1x PBS er meer oplosbaar eiwit op een eerder tijdstip in vergelijking met het 2x PBS. Tijd, is er een toename van eiwitten in oplossing bij 15 uur, die bleef stijgen tot 48 uur en daalde het. Dit kan te wijten zijn aan het trypsine voortdurend splitsen van het eiwit en dus maken kleinere peptiden en aminozuren. Het kan ook worden toegeschreven aan de beperkingen van de bepaling, die alleen peptiden die zijn samengesteld uit drie of meer aminozuren kunnen lezen. Statistische analyse toonde dat de BSA en glutaaraldehyde concentratie beïnvloedde de afgifte van het proteïne uit de BSA rubber (p <0,05). Een toename van BSA concentratie veroorzaakt een toename van eiwit in het supernatant, terwijl een verhoging van glutaaraldehyde een afname in opgeloste eiwitten veroorzaakt.

Om de dissociatie van dit offer materiaal te meten, werd het rubber gewogen (natte basis) voordat u hem in Contact met trypsine. Het equivalent van droog gewicht van de rubber geplaatst in de enzymdigestie werd bepaald volgens de in Supplement figuur 1. De waarden enzymoplossing omgezet met de BSA rubber, en dus het eiwit opgelost. De na behandeling rubber werd gelyofiliseerd O / N en gewogen. Figuur 5 toont dat het oplosmiddel beïnvloed de dissociatie van het rubber. Bij dezelfde concentratie van BSA en glutaaraldehyd, de 2x PBS oplosmiddel rubbers behouden meer van hun materiaal vergeleken met 1x PBS.

Drie stevige mal stukken werden gefabriceerd: Loop Mold (Supplement Figuur 4A), Stability Stuk (Supplement figuur 4B), en Y-Mold (Figuur 6A, links). De roestvrijstalen Y mal stuk werd gemaakt met de Microlution machine (Figuur 6A, rechts). Deze vorm werd reactiegegoten met 30% BSA en 3% glutaraldehyde in 2x PBS (figuur 6B, links). De rubberen liet reageren O / N bij 4 ° C. Het rubber werd gegoten met collageen (figuur 6B, midden) en vervolgens enzym verteerd (figuur 6B, rechts). Voorlopige gegevens suggereren dat bij pH 7,8 en een temperatuur van 30 ° C gedurende 15 uur, kan het BSA rubber worden gedigereerd met minimale impact op de collageen schavot. Na 15 uur wordt het rubber verzwakt door het enzym en los genoeg zich ter kanalen zonder de geometrische kenmerken van het collageen. Een 3D collageen scaffold werd gecreëerd die specifieke geometrische kenmerken heeft. Figuur 6B (rechts) toont een 4 mm diameter kanaal in een collageen hydrogel na enzymdigestie van de BSA rubber. Het kanaal werd gemeten met een schuifmaat zodat de oorspronkelijke afmeting gehandhaafd. Inderdaad, de nieuwe zender in het collageen hydrogel was 4 mm. De BSA rubber mallen kunnen afmetingen zo klein te houden als 300 urn, die ons werd getesting de stabiliteit matrijs (Figuur 7). Deze steigers werden getest op achtergebleven glutaaraldehyde en we vonden geen residu na de Mosconas wasbeurten.

Figuur 1
Figuur 1. BSA rubber. (A) BSA rubber reactie. Glutaaraldehyde verknoopt BSA door het creëren van covalente bindingen. (B) BSA Rubber. Verschillende concentraties van BSA, concentraties van glutaraldehyde, en het type van het oplosmiddel werden gegoten op 24-well platen en reageerde O / N bij 4 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. Stress-Strain curven van BSA rubbers. Stress-Strain curven van BSA ru bbers. (A) 30% BSA 3% glutaaraldehyde in 2x PBS; (B) 30% BSA 3% glutaaraldehyde in 1x PBS; (C) 20% BSA 3% glutaaraldehyde in 2x PBS; en (D) 20% BSA 2% glutaaraldehyde in 1x PBS (3 cycli). De curven AC tonen rubbers dat sommige hysteris, maar terugkeren naar hun oorspronkelijke vorm. Monster D toont een rubber met een lage elasticiteitsmodulus die gemakkelijk permanent vervormt tijdens het laden en lossen processen. Monster A en B vertoonden een vergelijkbaar gedrag gezien in een laad- en ontlaadcyclus op grafiek E (vertegenwoordiger van een cyclus van elk monster). De elasticiteit werd beïnvloed door de concentratie van het fixeermiddel en het gebruikte oplosmiddel (F). De monsters vertoonden een aanzienlijke toename van de modulus met een toename van zouten (** p <0,05). Een hogere concentratie fixeermiddel veroorzaakte een significante toename van de elasticiteit van de BSA rubbers (* p <0,05).arget = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. De reactiesnelheid van het uiteenvallen van de BSA rubber. Aangezien het fixeermiddel toeneemt, neemt de reactiesnelheid af voor alle monsters in 1x PBS (A), 2x PBS (B) en water (C). De 40% BSA 2% glutaaraldehyde in 2x PBS toont één van de hoogste percentages van de reactie. Dit komt door de moeilijkheid in het maken van de BSA-proteïne homogeen. (blauw: 20% BSA, paars: 30% BSA, en rood: 40% BSA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Eiwit kwantificering catie na enzymdigestie. Aangezien het fixeermiddel toeneemt, het eiwit opgelost uit de rubbers af voor alle monsters in 1x PBS (A), 2x PBS (B) en water (C). (blauw: 20% BSA, paars: 30% BSA, en rood: 40% BSA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Rubber spijsvertering. We bepaalden de hoeveelheid rubber verteerd door vergelijking van de start- en droge basis producten. We kregen de minste hoeveelheid van de spijsvertering op de 6% glutaaraldehyde monster en de meeste 30% BSA 2% glutaaraldehyde in 1x PBS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figuur 6
Figuur 6. Vertakt prototype. (A) Vertegenwoordiging van tak vaatstelsel. Getoond aan de linkerkant is de vaste gecreëerd in Mastercam die werd omgezet in G-code en vervaardigd met behulp van de Microlution 363-S zoals te zien aan de rechterkant. De roestvrij stalen mal stuk staat voor een 4 mm inlaatkanaal met twee-3mm uitstroom kanalen. (B) 3D collageen schavot. Getoond aan de linkerkant is de BSA rubber gemaakt met behulp van de mal hierboven weergegeven. Het midden is het rubber ingebed in het collageen hydrogel. Getoond aan de rechterkant zijn de links binnen de collageen schavot na de rubber enzym werd verteerd kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
Figuur 7. BSA-kanaal. Een 300 pm BSA kanaal werd verwijderd uit de stabiliteit stuk mal. Er is een dunne laag lossingsmiddel rond het kanaal. De extra ruimte is duidelijk onderscheiden onder een microscoop en kan gemakkelijk worden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BSA (%) Glutaldehyde (%)
20 2
20 3
20 6
30 2
30 3
30 6
40 2
40 3
6

. Tabel 1. BSA rubber parameters BSA en fixatief werden gemengd in een 4: 1 verhouding met behulp van drie verschillende oplosmiddelen.

Monster Geleidbaarheid (mS / cm) pH
BSA (%) solvent
30 2x PBS 11.43 7.06
30 1x PBS 6.35 7.05
30 DI 2.39 6.76
20 2x PBS 13.00 6.92
20 1x PBS 8.67 7.09
20 DI 2.08

Tabel 2. geleidbaarheid en pH van BSA monsters. De geleidbaarheden en pH van de BSA oplossing werd gemeten in de aanwezigheid van verschillende oplosmiddelen. Een verhoging in de geleidbaarheid wordt getoond tussen 2x en 1x PBS.

6
BSA (%) Glutaaraldehyde (%) solvent waarnemingen
20 2 1x PBS Zacht, gemakkelijk vervormbaar materiaal
20 3 1x PBS Zacht maar steviger dan 2% glutaaraldehyde
20 6 1x PBS Stijf, een beetje broos
30 2 1x PBS goede consistentie
30 3 1x PBS goede consistentie
30 6 1x PBS Bros
40 2 1x PBS Zeer inconsistent in het creëren van een gel / rubber consistentie
40 3 1x PBS De consistentie variëren over het monster
40 6 1x PBS Bros
20 2 2x PBS Zacht, gemakkelijk vervormbaar materiaal, maar steviger dan 1x PBS monster
20 3 2x PBS Zacht, maar stijver dan 2%
20 6 2x PBS goede consistentie
30 2 2x PBS Goede consistentie, meer studry dan met 1x PBS
30 3 2x PBS Goede consistentie, meer studry dan met 1x PBS
30 2x PBS Goede mengbaarheid maar britle
40 2 2x PBS De consistentie variëren over het monster
40 3 2x PBS De consistentie variëren over het monster
40 6 2x PBS De consistentie variëren over het monster en het was bros
20 2 Water Heeft een gel / rubber materiaal vormen geen
20 3 Water Vormde een gel maar lijken stijver dan thij 1x PBS en 2x PBS, inconsistent
20 6 Water Vormde een gel maar lijken stijver dan de 1x PBS en 2x PBS, inconsistent
30 2 Water Heeft een gel / rubber materiaal vormen geen
30 3 Water Vormde een gel maar lijken stijver dan de 1x PBS en 2x PBS, inconsistent
30 6 Water Vormde een gel maar lijken stijver dan de 1x PBS en 2x PBS, inconsistent
40 2 Water Niet vormen een gel / rubber materialenal
40 3 Water De consistentie variëren langs het monster - stijver bovenop
40 6 Water De consistentie variëren langs het monster - stijver bovenop

Tabel 3. BSA rubber. Na de BSA rubber gereageerd O / N, een 8-mm biopsie punch gat van het monster is genomen. Deze tabel bevat enkele visuele observaties van de consistentie en het uiterlijk van de monsters.

Aanvullende Figuur 1
Supplement Figuur 1. Solid percentage. Het percentage van de vaste stoffen uit elk rubber werd bepaald (droog gewicht / nat gewicht). Het oplosmiddel geen invloed op de percentage van vaste stoffen (p> 0,05). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2
Supplement Figuur 2. Sinus van 30% BSA 3% glutaaraldehyde 2x PBS. De drukbelasting en de verplaatsing van de steekproef worden getoond als functie van de verstreken tijd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3
Supplement Figuur 3. Sinus van 30% BSA 3% glutaaraldehyde 2x PBS. De spanning en rek van het monster werden berekend en uitgezet als een functie van verstreken tijd. Er is een kleine faseverschuiving, inditieve van de visco-elastische gedrag van de rubber. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 4
Supplement Figuur 4. Mastercam vaste stoffen. (A) Loop en (B) de stabiliteit stukken. Na het ontwerpen van deze met behulp van Mastercam, werd de G-code ingevoerd en een roestvrij staal of messing stuk met behulp van de Microlution machine of een PLA stuk met behulp van de Makerbot 3D Replicator. Klik hier om dit bestand te downloaden.

grenzen min Max
-17 3
Verplaatsing (mm) -1,5 0.3
Golf Niveau 1 niveau 2 (Hz) Cyclus
Sinus -15 -3 1 5000
data Acquisition
scantijd 1.008
scan punten 360
Aantal Scans </ Td> 5
latere Scan 1.008 sec tussen scan

Supplement Tabel 1. Compressie testen parameters. Met behulp van een sinus, de relatie tussen de lading en de verplaatsing werd bepaald voor de vier soorten rubber. Klik hier om dit bestand te downloaden.

ANOVA resultaten
df SS MEVROUW F betekenis F
regressie 3 9.85E + 02 3.28E + 02 4.70E + 02 1.06E-18
overgebleven 20 1,40 e + 01 6.99E-01
Totaal 23 9.99E + 02
Regressie analyse
coëfficiënten Standaardfout t Stat P-waarde
Onderscheppen 1.74E + 00 8.23E-01 2.12E + 00 4.70E-02
BSA (%) 7.82E-01 2.09E-02 3.74E + 01 5.49E-20
Glutaaraldehyde (%) 3.17E-01 </ Td> 1.03E-01 3.09E + 00 5.71E-03
solvent 2.61E + 01 2.22E + 01 1.18E + 00 2.53E-01

Supplement Tabel 2. Statistische analyse van het percentage vast materiaal in de BSA rubber. Het BSA en glutaaraldehyde beïnvloedde de percentage vast materiaal. Het oplosmiddel had geen invloed op het percentage van de vaste stoffen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

ANOVA resultaten
df SS MEVROUW F betekenis F
regressie 3 3.06E + 05 1.02E + 05 1.18E + 01 4.00E-03
overgebleven 7 6.07E + 04 8.67E + 03
Totaal 10 3.67E + 05
Regressie analyse
coëfficiënten Standaardfout t Stat P-waarde
Onderscheppen 6.50E + 02 4.25E + 01 1.53E + 01 1.23E-06
BSA (%) 4.67E + 00 3.80E + 01 1.23E-01 9.06E-01
solvent 1.02E + 02 3.80E + 01 2.67E + 00 3.20E-02
Glutaaraldehyde (%) 1.16E + 02 5.70E + 01 2.03E + 00 8.21E-02

Supplement Tabel 3. Statistische analyse van de elasticiteitsmodulus betrekking tot de PBS concentratie. De concentratie PBS beïnvloedde de elasticiteitsmodulus. De toename van de zouten in het oplosmiddel veroorzaakt een toename van de elastische modulus. Klik hier om dit bestand te downloaden.

ANOVA Resultaat
df SS MEVROUW F betekenis F
regressie 3 6.15E-15 2.05E-15 3.68E + 00 1.67E-02
overgebleven 60 3.34E-14 5.57E-16
Totaal 63 3.96E-14
Regressie analyse
coëfficiënten Standaardfout t Stat P-waarde
Onderscheppen 3.74E-08 1.37E-08 2.74E + 00 8.03E-03
BSA (%) 3.89E-10 3.62E-10 1.07E + 00 2.88E-01
Glutaaraldehyde (%) -5.92E-09 1.83E-09 -3.23E + 00 2.02E-03
solvent -6.78E-08 3.76E-07 -1.80E-01 8.58E-01

Supplement Tabel 4. Statistische analyse van de reactiesnelheid na 15 uur van enzymdigestie. De glutaaraldehyde concentratie significant beïnvloed de reactiesnelheid van de vertering van het rubber door het verminderen bij hogere concentraties glutaaraldehyd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

P-value
ANOVA resultaten
df SS MEVROUW F betekenis F
regressie 3 7.36E-15 2.45E-15 3.62E + 01 1.21E-13
overgebleven 62 4.20E-15 6.78E-17
Totaal 65 1.16E-14
Regressie analyse
coëfficiënten Standaardfout t Stat
Onderscheppen 2.98E-08 4.77E-09 6.25E + 00 4.22E-08
BSA (%) 4.56E-10 1.26E-10 3.62E + 00 6.03E-04
Glutaaraldehyde (%) -6.04E-09 6.15E-10 -9.82E + 00 3.00E-14
solvent -6.57E-08 1.31E-07 -5.02E-01 6.17E-01

Supplement Tabel 5. Statistische analyse van de reactiesnelheid na 24 h enzymdigestie. De BSA en glutaaraldehyde concentratie beïnvloedde de reactiesnelheid van de afbraak van de rubber. Bij hogere concentraties glutaaraldehyde, er een afname in tHij reactiesnelheid. Bij hogere BSA concentraties, is er een toename van de reactiesnelheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

ANOVA resultaten
df SS MEVROUW F betekenis F
regressie 3 3.10E-15 1.03E-15 2.74E + 01 1.64E-11
overgebleven 64 2.42E-15 3.78E-17
Totaal 67 5.52E-15
Regressie analyse
coëfficiënten Standaardfout t Stat P-waarde
Onderscheppen 2.17E-08 3.50E-09 6.20E + 00 4.55E-08
BSA (%) 2.13E-10 9.20E-11 2.31E + 00 2.39E-02
Glutaaraldehyde (%) -3.94E-09 4.53E-10 -8.70E + 00 1.90E-12
solvent 3.04E-08 9.57E-08 3.18E-01 7.51E-01

supplement Tabel6. Statistische analyse van de reactiesnelheid na 48 h enzymdigestie. De BSA en glutaaraldehyde concentratie beïnvloedde de reactiesnelheid van de afbraak van de rubber. Bij hogere glutaaraldehyde-concentraties, is er een daling van de reactiesnelheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

ANOVA resultaten
df SS MEVROUW F betekenis F
regressie 3 2.19E-15 7.29E-16 3.05E + 01 3.56E-12
overgebleven 61 1.46E-15 2.39E-17
Totaal 64 3.64E-15
Regressie analyse
coëfficiënten Standaardfout t Stat P-waarde
Onderscheppen 1.05E-08 2.84E-09 3.69E + 00 4.80E-04
BSA (%) 3.61E-10 7.48E-11 4.83E + 00 9.48E-06
Glutaaraldehyde (%) -3.07E-09 3.69E-10 -8.33E + 00 1.21E-11
Zolvent 3.97E-08 7.80E-08 5.09E-01 6.12E-01

Supplement Tabel 7. Statistische analyse van de reactiesnelheid na 72 h enzymdigestie. De BSA en glutaaraldehyde concentratie beïnvloedde de reactiesnelheid van de afbraak van de rubber. Bij hogere concentraties glutaaraldehyde, er een afname van de reactiesnelheid. Bij hogere BSA concentraties, is er een toename van de reactiesnelheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biofabrication is een zeer multidisciplinair veld waarin biologie en engineering principes fuseren tot complexe materialen die thuishoren weefsel na te bootsen te genereren. Om dit te bereiken, is er een behoefte aan technieken die de informatie uit in vivo weefsel gebruiken en deze in een in vitro scaffold ontwikkelen. Zo kan een platform worden gemanipuleerd dat lijkt op het architectonische, functionele en mechanische eigenschappen van het weefsel in vivo. De optimale steigermateriaal moeten bepaalde eigenschappen, zoals het biocompatibele bezitten, bootsen de mechanische eigenschappen van het weefsel van belang, in staat gecontroleerde degradatie, kunnen levensvatbaarheid van de cellen te ondersteunen, en kan toestaan ​​tissue remodeling 2,3.

Een veelheid van fabricagetechnieken ontwikkeld levensvatbare, driedimensionale constructen. Deze technologieën vallen in twee grote categorieën: conventionele eend gevorderd. De conventionele technieken omvatten het gebruik van synthetische en natuurlijke traditionele materialen om poreuze structuren. Voorbeelden zijn oplosmiddel-gieten, vriesdrogen, en smelt vormen. Nadelen van deze technieken zijn: een slechte controle van de porositeit binnen de structuur (poriegrootte en poriën interconnectiviteit) en moeilijk kunnen maken van interne kanalen in de steigers. Geavanceerde technieken omvatten stereolithografie, molding, 3D-printen, en elektrospinproces, onder anderen 1. Deze technieken hebben nadelen zoals het ontbreken van lange afstand microarchitectuur kanalen, materiaalkeuze optimale mechanische sterkte maar in staat is afgifte met kleine diameters, optimalisatie afhankelijk van het materiaal, dat uitgebreide nabewerking die giftig kunnen zijn, en beperking in het ontwerp van inwendige architecturen in een in vitro construct. Een belangrijk nadeel in 3D printing is de beschikbaarheid van biomaterialen die adequate cel dragers, Terwijl ook de mechanische eigenschappen vereist om een bepaalde architecturale ordening 12 te handhaven. De technologie die hier wordt gepresenteerd bevat zowel conventionele en geavanceerde fabricagetechnieken. Het beste van twee werelden is afgeleid van de convergentie van computer-aided manufacturing te maken of importeren, de gewenste architectuur met de ontwikkeling van een enzym-labiele rubber. De roestvrijstalen mallen zijn gemaakt met een freesmachine, maar de vervaardiging is niet beperkt tot deze techniek. Met een 3D printer (bijvoorbeeld Makerbot) werden dezelfde mallen vervaardigd van polymelkzuur (PLA). De negatieve mallen werden gemalen met behulp van architectonische richtlijnen ontworpen door de CAD-programma, waarin vaste schimmels die een gemakkelijke en betrouwbare overdracht van functies om het even welk materiaal te creëren biedt. Deze technologie is belangrijk omdat het mogelijk maakt niet alleen de controle van de externe weefselsamenstelling, maar ook van de zeer complexe interne architectuur. Het werk dat hier wordt gepresenteerdvooral gericht op het karakteriseren van de BSA rubber, dat kan worden gemengd homogeen wordt gemakkelijk verteerd in een redelijke hoeveelheid tijd, was bestand tegen veranderingen in de structuur, en kan minute functies nabootsen, terwijl de stabiliteit die tijdens het gietproces . De beperking van deze techniek werd getest en resolutie te offeren materiaal kan afmetingen zo klein als 300 urn diameter handhaven. Echter, Figuur 7 blijkt dat het kanaal wordt omgeven door een dun laagje losmiddel. Met behulp van een microscoop, deze extra gebied duidelijk onderscheiden en kan worden verwijderd om de gewenste dimensie. Deze biofabrication techniek kan de replicatie van een grote verscheidenheid van interne structuren die variëren van macro- naar microschaal.

Serum albumine is het meest overvloedige eiwit in de bloedsomloop. Omdat de eiwitten polyelektrolyten oplosbaarheid werd bepaald door elektrostatische wisselwerkingen 15-17. Er is aangetoond dat bij lage zoutconcentraties, er zouten in effect op het eiwit vergemakkelijkt de oplosbaarheid 18. Glutaaraldehyde is een verknopingsmiddel dat veranderingen in de eigenschappen van albumine veroorzaakt. De kleurverandering te zien in figuur 1 wordt toegeschreven aan de vorming van de aldimine bindingen 19-21. Glutaaraldehyde voornamelijk reageert met de BSA via de aminogroepen van lysine aan de intermoleculaire covalente bindingen 14 vormen. Gegevens blijkt dat de toename van zouten verbeterde de elasticiteit van de rubber (van 1x PBS 2x PBS). Hoe hoger glutaaraldehyde concentratie produceert stijver gels die eerder ingesteld in vergelijking met lage concentratie degenen. Ze zijn echter moeilijker te doseren, mengen homogeen, en zij vormen brosse gels. Om de juiste hoeveelheid BSA rubber te leveren in de mallen, moet elk deel van het samenstel koud worden gehouden, omdat hogere temperaturen de glutaraldehyde en BSA reactie te versnellen.De ideale rubber (30% BSA 3% glutaraldehyde in 2x PBS of 1x PBS) gedraagt ​​zich als een visco-elastisch materiaal dat belasting kan weerstaan ​​zonder blijvend te vervormen. Dit wordt erg belangrijk bij het hanteren en het gieten van materiaal rond de BSA rubber structuur.

Trypsine is een serine protease dat eiwitten hydrolyseert. Trypsine is een veel gebruikte enzym dat hoge splitsingsspecificiteit heeft. Het klieft de peptideketens vooral aan de carboxylzijde van de aminozuren lysine en arginine 22. BSA gemakkelijk oplosbaar bij lage concentraties in water, en gemakkelijk trypsine gedigereerde BSA rubber waardoor de collageen intact en relatief onaangetast. Het materiaal zal geen contact met cellen. Het construct werd getest op de aanwezigheid van vrije glutaaraldehyde en er waren geen sporen van dit fixeermiddel. Dit toont de effectiviteit van het BSA rubber als offeren materiaal voor biofabrication. In dit protocol werd collageen toegepast als het dragermateriaal, maar elke othaar materiaal dat bestand is tegen trypsine digestie kan worden gebruikt.

Toekomstige werkzaamheden zal gericht zijn op het reconstrueren van de vasculaire componenten binnen de hydrogels door zaaien het schavot met endotheliale en fibroblast cellen. Een van de uitdagingen is om een ​​uniforme verdeling van cellen te creëren gedurende de binnenzijde van de kanalen die de native 3D verdeling nabootsen. Om dit probleem aan te pakken, is een strategie ontwikkeld die de sluiting of verstopping van de kanalen en de injectie van de celsuspensie mogelijk maakt. Het geteste materiaal is Pluronic F127, een thermoreversibele gel, vloeibaar bij 4 ° C en een vaste stof boven 30 ° C 23,24. Een hoge concentratie pluronic was succesvol in het creëren van de noodzakelijke tijdelijke afdichting. Na de celsuspensie in de kanalen van het skelet, is de entiteit gedraaid voor een bepaalde tijd totdat de cellen zich aan alle zijden van de 3D-structuur. De binnenkant kanaal zal voldoende media voor het handhaven van hebbenceloverleving. Pluronic behoudt zijn gelvorm en gemakkelijk oplosbaar in een waterige omgeving. Zodra de cellen hechten, wordt de hydrogel worden overspoeld met media, en kunnen worden gekweekt in vast of stromingsomstandigheden, afhankelijk van het doel van de studie. Deze methodologie zal verder onderzocht worden en zal uitgegroeid tot de follow-up van deze publicatie. De biofabrication techniek hierin beschreven wordt momenteel gebruikt om een ​​steiger replica van een mens nierslagader ontwikkelen. Dezelfde benadering kan worden uitgevoerd met andere typen weefsels, zoals hart, om de toepasbaarheid van deze techniek uitbreiden tot een breed scala van klinische toepassingen.

De biofabrication techniek ontwikkeld hier is een stap voorwaarts in de generatie van in vitro steigers die intrinsieke geometrische functies snel en betrouwbaar kunnen recapituleren. Een natuurlijk materiaal, zoals collageen, werd gekozen omdat het optimale chemische en fysische signalen naar cellen over kunststoffen. deze nabouw- materialen kunnen worden gebruikt voor therapeutische onderzoek, in vitro modellen van ontwikkeling, misvorming en ziekte weefsel, alsook voor de vervanging van beschadigd weefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I Collagen extracted from calf hide
Hydrocloric Acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) MP Biomedical U5378 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS
Albumium from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A9647
Glutaraldehyde Sigma -Aldrich G5882 Toxic
Lard Fields 3090
Stainless Steel Molds Milled using Microlution Machine
Air Brush Kit Central Pneumatic 47791
Mixing Tip for double syringe Medmix ML2.5-16-LLM Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med
Small O ring for double syringe Medmix PPB-X05-04-02SM Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural
Double Syringe cap  Medmix VLX002-SM Cap, 4:1/10:1, PE brown, med
Big O ring for double syringe Medmix PPA-X05-04-02SM Piston A, 5 ml, 4:1
Double Syringe Medmix SDL X05-04-50M Double syringe, 5 ml, 4:1
Double Syringe Dispenser Medmix DL05-0400M Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain
Laminim 3.6 mg/ml - extracted USC lab
20 ml Syringe Luer Lock Tip BD 302830
Luer Lock Caps Fisher JGTCBLLX
HEPES Sigma -Aldrich H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) Life Technologies 1143-030
Trypsin Life Technologies 27250-018
UV Crosslinker  Spectroline UV XLE1000
Sodium Cloride (NaCl) Fisher S271-10 To prepare Mosconas
Potassium chloride (KCl) Sigma -Aldrich P5405-250 To prepare Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328-500 To prepare Mosconas
Glucose Sigma -Aldrich G-8270 To prepare Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S-7907 To prepare Mosconas
Sterile Filter for syringes Corning 431224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
  2. Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
  3. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
  4. Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
  5. Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
  6. Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  7. Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
  8. Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
  9. Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
  10. Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
  11. Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
  12. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  13. Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
  14. Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
  15. Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
  16. Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
  17. Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
  18. Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
  19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
  20. Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
  21. Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
  22. Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
  23. Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723 (2012).
  24. Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).
Driedimensionale Biomimetic Technologie: Novel Biorubber Creëert Defined micro- en macro-schaal Architectures in Collageen Hydrogels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).More

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter