Abstract
Vävnadsstöd spelar en avgörande roll i vävnaden regenereringsprocessen. Den idealiska byggnadsställning måste uppfylla flera krav, såsom att ha rätt sammansättning, riktad modul och väldefinierade arkitektoniska detaljer. Biomaterial som sammanfatta den inneboende arkitektur in vivo vävnad är avgörande för att studera sjukdomar samt för att underlätta regenerering av förlorad och missbildade mjukvävnad. En roman biofabrication tekniken utvecklades som kombinerar toppmodern avbildning, tredimensionell (3D) tryckning, och selektiv enzymatisk aktivitet för att skapa en ny generation av biomaterial för forskning och klinisk tillämpning. Den utvecklade materialet, bovint serumalbumin gummi, är reaktions insprutas i en form som upprätthåller specifika geometriska funktioner. Denna offermaterialet tillåter tillräcklig överföring av arkitektoniska funktioner till ett naturligt ställningsmaterial. Prototypen består av en 3D kollagenbyggnadsställning med 4 och 3 mm kanaler som reprESENT en grenad arkitektur. Detta papper betonar användningen av denna biofabrication teknik för generering av naturliga konstruktioner. Detta protokoll använder en datorstödd mjukvara (CAD) för att tillverka en fast form, som kommer att vara reaktionen injiceras med BSA gummi följt av enzymatisk nedbrytning av gummit, vilket lämnar dess arkitektoniska funktioner inom byggnadsställningsmaterial.
Introduction
I vävnadstekniska området är avgörande för möjligheten att tillverka vävnadsstöd. En lämplig vävnad byggnadsställning har en 3D-struktur, består av biokompatibla material, och härmar in vivo vävnadsarkitektur för att underlätta cell- och vävnadstillväxt och ombyggnad. Denna byggnadsställning måste tillåta transport av näringsämnen och avlägsnande av avfall 1-4. Ett av de största hindren i produktionen av dessa ställningar är förmågan att sammanfatta specifika geometriska funktioner i ett biokompatibelt material. Flera biofabrication tekniker har rapporterats att kontrollera de geometriska egenskaperna hos dessa ställningar, är exempel elektrospinning 5-8, lösningsmedelsgjutning 9 stereolithography 10, och 3D-utskrift 11, bland andra. Dessa tekniker misslyckas att tillhandahålla en relativt enkel överföring av styr interna och externa arkitektoniska detaljer, är dyra, begränsas av deras upplösning och tryckbarhet (
I många kommersiella tillverknings system är skapandet av inre hålrum, kanaler och funktioner som uppnås med hjälp av sand eller andra lämpliga löstagbara eller offermaterial. Metallen eller plastdelen bildas runt sandformen, och när det väl är stelnat sanden avlägsnas. På samma sätt, nästa generation av biomaterial behöver biosand motsvarande. Därför var BSA gummi utvecklats som ett substitut för biosand. BSA gummit är ett nyligen formulerade material som består av bovint serumalbumin som tvärbundits med glutaraldehyd. Det slutliga målet är att återskapa specifika arkitektoniska detaljer i en biologiskt nedbrytbar kollagenbyggnadsställning. Egenskaperna hos offer biorubber som upprätthåller dimensionell trohet med formen av den ursprungliga vävnaden beskrivs.
in vivo-vävnadens elasticitet och andra egenskaper hos vävnaden av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bestäm Andel Solids i kollagen Batch
- Extrahera kollagen efter ett tidigare publicerat förfarande 13. Tina ett minimum av 20 ml kollagen. Kontrollera den initiala procentandelen kollagen fasta ämnen i satsen för att manipulera kollagenkoncentrationen i de bildade hydrogelerna.
- Skär tre bitar av aluminiumfolie (ca 6 x 6 cm) och forma varje en som en pan med hjälp av botten av en 25 ml bägare. Notera vikten av varje pan.
- Tillsätt en liten mängd av kollagen till varje pan och registrera den totala vikten av den aluminiumpanna och kollagen. Lägg 0,5-0,8 g kollagen på varje aluminiumpanna.
Notera: Efter detta steg finns det tre aluminiumfolie kokkärl och var och en bör ha en liten mängd kollagen. Se till att registrera vikten på varje (totalt 3) tom aluminiumpanna och vikten av pannan efter tillsatsen av kollagen. - Beräkna vikten av kollagenet i varje panna med hjälp av ffter formel:
Kollagen vikt = Pan och kollagen vikt - Pan vikt - Placera de tre aluminiumpannor som håller kollagenet i ugnen vid 100 ° C under 24 h.
- Efter 24 timmar, notera vikten av varje aluminiumpanna och uttorkad kollagen.
- Beräkna vikten av den dehydratiserade kollagen med hjälp av följande ekvation:
Uttorkad kollagen vikt = Pan och uttorkad kollagen vikt - Pan vikt - Beräkna procentandelen av fast för de tre proven för att bestämma kollagenfastsubstanskoncentration med användning av formeln nedan:
- Beräkna den genomsnittliga kollagen fasta innehållet av partiet med hjälp av den andel av kollagen fasta ämnen för vart och ett av de tre proven.
Obs: kollagen som kommer att användas är det som är kvar av den hydratiserade kollagen. Ingen av den dehydratiserade kollagen kommer att användas. - Efter bestämning av procentandel kollagen fast (initial kollagenkoncentration) av partiet, fortsätta att använda den återstående hydrerad kollagen. Använda en kalibrerad pH-mätare för att justera pH av kollagen satsen till 3.
- Tillsätta små mängder (2-5 pl åt gången) av 12 N saltsyra (HCl). Håll på is hela tiden. Lägg inte till saltsyran direkt till kollagenet - tillsätta syran till sidan av röret. Efter tillsats av syran, använda spateln för att driva syran till kollagen och snabbt rör blandningen.
- När den når ett pH på 3, låt kollagen sitta O / N vid 4 ° C.
2. Beredning av BSA Rubber
- Förbered bovint serumalbumin (BSA) lösning enligt proceduren som anges nedan.
- Förbered 2x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Lägg till två PBS tabletter till 100 ml vatten för att göra 0,02 M PBS-lösning.
- Kombinera BSA med 2x PBS för att skapa en BSA-lösning 30% med användning av förfarandet som anges nedan.
- Till exempel, för att göra en 30% BSA med 30 ml 2x PBS, använder 12,9 g BSA. Lägga 1/3 av 2x PBS (t.ex. 10 ml) till en kolv med en omrörarstav. Lägga 1/2 av BSA (t.ex. 6,45 g BSA) till kolven och med användning av en spatel, väta den torra lösta ämnet.
- Upprepa denna process att lägga PBS och sedan BSA tills allt löst ämne och lösningsmedel är i kolven. Använd spateln för att väta alla lösta. Det ser ut som en blandning av lite vätska och klumpar. Låt det sitta i ca 30 minuter.
- Slå sedan omröraren på en låg nivå och se till att det inte finns några klumpar runt omrörare. Det bör ta 90 minuter för att få allt i lösning eller den kan lämnas under omröring O / N vid 4 ° C. Efter det lösta ämnet är allt löst sig, placera lösningen i en 20 ml spruta och utjämnade med ett 0,20 fim sprutfilter. Tryck på kolven för att driva ut vätska genom filtret och samla den steriliserade lösningen i ett nytt rör. Lagra vid 4 ° C.
- Förbereda 3% glutaraldehyd solutipå genom att späda 25% glutaraldehydlösning med steril filtrerad 2x PBS. Till exempel, för 10 ml av 3% glutaraldehyd-lösning, använd 2 ml av 25% glutaraldehyd och 8 ml 2x PBS. Lagra vid 4 ° C.
3. Press-former Behandling
Obs: Prototypen som beskrivs i detta dokument använder en skräddarsydd rostfritt stål Y formelementet. Formen innehåller ett inflöde och två utflödeskanaler 4 och 3 mm, respektive. Först, rena formar, spraya dem med omättade ister, och sterilisera dem. Förbered formarna enligt det förfarande som beskrivs nedan.
- Rena formar av rostfritt stål med hjälp av sonikator vid en frekvens av 35 kHz. Placera formarna i sonikator och dränka dem med vatten och is. Håll formarna kallt hela tiden medan ultraljuds körs. Kör sonikator under 2 perioder om 90 min.
- Efter varje period, använd en nål för att se till att det inte finns något material i Luer lås rostfritt stål eller bRass kontakt. Använd tvål och vatten för att rengöra hela ytan av de två sidorna av formarna. Kontrollera att det inte finns något hinder i kanalerna.
- Placera formarna, skruvar, och Luer-lås-kontakt i en autoklav påse och autoklavera den.
- Fyll flaskan som fäster vid en luftspruta halvvägs med kommersiellt tillgängliga ister (blandad fettsyrasläppmedel). Sätt tillbaka locket med en vanlig mössa flaska. Lägg den i en autoklav påse och autoklavera den.
Obs: Ister används för att underlätta frigörandet av material som kommer att vara reaktionen injiceras senare (BSA gummi). Placera inte locket sprutan flaskan i autoclave- det kan skada den inre tätningen. - Värm upp ister under 45 sekunder eller tills dess klar och flytande i en mikrovågsugn. Skruva luftspruta locket till ister flaskan. Ansluta locket med sprutan. Fäst sprutan till luftkällan vid laboratoriebänken. Öppna luftventilen och öppna munstycket på sprutan tills den börjar att väta ytanav en pappershandduk.
- Spray ister vinkelrätt mot formytan tills ytan är helt täckt. Efter varje bit har besprutats, placera dem i en petriskål och försegla den. Placera formarna vid 4 ° C under 2 h.
- Fortsätt att sterilisera formarna genom att exponera ytan för UV-ljus i 30 min. Placera dem tillbaka vid 4 ° C tills de är redo att reaktionen injiceras.
4. Reaktion Injektion av BSA Rubber
Obs: Allt material och lösningen ska hålla kallt tills den ska användas för att förhindra för tidig inställning av BSA gummi i nästa steg.
- Förbered dispenser för att leverera BSA gummi till formarna efter dessa steg.
- Sterilisera alla blandningskomponenter (två O-ringar, spruta cap, dubbel spruta, blanda spets, och 4: 1 dispenser) genom att exponera dem för UV-ljus under 30 minuter i polymeraskedjereaktionen (PCR) huva.
Obs: En PCR huva användes eftersom thans förfarande innebär fixativ. Dessa kemikalier kan inte användas i cell / vävnadsodling huva på grund av risken för exponering och toxicitet för cellerna. Någon annan huv som innehåller en UV-ljus kommer att vara lämpliga. - Placera spetsen locket på lösning hållaren.
- Utföra blandnings- och injektion vid ett 4: 1 förhållande av BSA: Glutaraldehyd. Tillsätt 30% BSA till dubbla sprutkammaren som kommer att leverera den högsta mängd lösning (Det tar cirka 4 ml för att fylla). Se till att lämna tillräckligt med utrymme för att placera O-ringen för att förhindra överfyllda och kontaminering av intilliggande kammare.
- Tillsätt 3% glutaraldehyd lösning på den andra kammaren (det tar ca 1 ml för att fylla). Se till att lämna tillräckligt med utrymme för att placera O-ringen för att förhindra överfyllda och kontaminering av intilliggande kammare.
- Placera det dubbla sprutan på automaten. Luta aggregatet vertikalt så att sprutan locket är på toppen. Sätt på locket med blandningsspetsen.
- scRew de två rostfria form ihop bitarna.
- Placera aggregatet inuti en autoklav påse.
- För att avlägsna eventuell luft i dispensern, håll den i upprätt läge och snabbt pressa handtaget en tid att släppa en liten mängd av BSA blandat med glutaraldehyd. Sedan snabbt fästa rostfritt stål Y formens Luer-kontakt till sprutspetsen.
- Håll rostfritt stål Y mögel med vänster hand och BSA-Glutaraldehyd blandning dispenser till höger. Alternate täcker var och en av vänster och höger avgassystem utflödeskanalerna genom att trycka avgaserna till sidorna av autoklaveringspåse för att se insidan hålrum är fyllda med lösning. Sedan placera formarna horisontellt och injicera igen.
- Loss formarna från dispenser och placera det i en 25 mm petriskål.
- Placera Parafilm runt petriskålen för att förhindra uttorkning av gummit.
- Placera mögel i 4 ° C kylskåp O / N.
- Sterilisera alla blandningskomponenter (två O-ringar, spruta cap, dubbel spruta, blanda spets, och 4: 1 dispenser) genom att exponera dem för UV-ljus under 30 minuter i polymeraskedjereaktionen (PCR) huva.
Notera: Kollagenet bör hållas på is vid alla tidpunkter under processen.
- Ändra kollagenkoncentrationen med successiv kollagen fasta ämnen.
- Göra 10 ml av 1,75% kollagen genom att justera den initiala kollagenkoncentration med kallt vatten.
- Användning av en kalibrerad pH-mätare, justera pH till 3 med användning av 12 N klorvätesyra. Lägg inte till saltsyran direkt till collagen- tillsätta syran till sidan av röret. Efter tillsats av syran, använda spateln för att driva syran in i kollagen och snabbt rör blandningen.
- Väg 4 g av kollagen i en separat koniskt rör.
- Centrifugera kollagen för att ta bort luft vid 4 ° C och 9343 x g under 20 till 30 min.
- UV sterilisera cellodlings huven under 30 minuter, och tillsätt 14 | il av laminin till 4 ml kollagen. Detta kommer att resultera i en slutlig laminin koncentration av 10 ug / ul. Obs: Laminin erbjuder sSTRUKTUR integritet, vidhäftning, och främjar olika cellulära svar.
- Vrid PCR UV ljus på under 20-30 minuter före användning av huven för sterilisering.
- Placera Luer-låset locket, för att fästa till en 20 ml spruta, i etanol i en 2 tim. Sedan, låt den torka och placera den i UV-ljus.
- Gamma bestråla kollagen för 8,6 minuter att nå 1200 cGy.
Obs: Tiden kommer att bero på sönderfallet av cesiumkälla. Justera tiden för att nå samma dosering.
6.Casting Collagen på BSA Rubber
- Att polymerisera kollagen, använd en 8: 1: 1-förhållande (kollagen: HEPES: MEM). Följande procedur är baserad på en första fyra g syrad kollagen (från steg 5.1.8).
- Gör en 0,2 N HEPES-lösning i vatten, och justera pH till 9 genom tillsats av små mängder (1-5 | il) av 1-5 M natriumhydroxid (NaOH) -lösning. Användning av en kalibrerad pH-mätare, övervaka lösningens pH efter varje tillsats. Lagra vid 4 ° C eller keep på is.
- Sätt på UV-ljus med vävnadsodling huven under 20-30 minuter för att sterilisera huven.
- Autoklav pincett, spatel och skalpell för sterilisering.
- Blanda 1,5 ml av 0,2 N HEPES (pH 9) och 1,5 ml av 10x MEM med hjälp av vävnadsodling huva. Se till att hålla den på is och skaka den i 5 sek före användning. Förvara vid 4 ° C eller hålla på is.
- Att sterilisera PCR huva, slå på UV-ljus under 30 min.
- Placera en 12-brunnsplatta och en 20 ml spruta i -20 ° C i 10 min eller tills den ska fortsätta. Obs: Förvara alla material kallt tills den ska användas. Temperaturökningen inducerar tidig kollagen fibrilogenes.
- Spraya alla rör och brunnsplattor som kommer att vara i huven med 70% etanol och låt dem torka för sterilisering. Placera en 20 ml spruta på is för att kyla för senare användning.
- I PCR huva, öppna formar de rostfria för att frigöra BSA gummi och med hjälp av en skalpell, skär avgaskanaler BSA rubber mögel.
- Under PCR huven, öppnar sterila kollagenrören och tillsätt 1 ml HEPES-MEM-lösning (se till att innan extrahera HEPES-MEM lösning, att det är väl blandad och det finns inga fasta avsättningar).
- Genom att använda den sterila spatel, grundligt blanda kollagen och buffertlösningen.
- Nära och virvel det snabbt för att säkerställa en väl blandad hydrogel.
- Överföring till en kall 20 ml spruta.
- Med ena handen håller BSA Gummi insidan av brunnen och med hjälp av andra, fördela hälften av kollagen hydrogel lösning på botten av brunnen.
- Med användning av de sterila pincetter, se till att de gummi inflödes- och utflödesändar är vidröra sidorna av brunnen.
- Pour kollagenlösning ovanpå gummit tills är helt täckt.
- Säkerställa att BSA gummit är upphängd inuti kollagen och att det inte finns några bubblor, speciellt nära ändarna av gummit.
- Placera locket och linda Parafilm runtomkrets av brunnen.
- Placeras i inkubatorn under 1 timme vid 37 ° C. Håll PCR UV-ljus på.
- Efter polymerisationen av kollagenet, UV tvärbinda hydrogelen via följande procedur.
Obs: tvärbindning av kollagen kommer att ske med hjälp av en UV-tvärbindningsanordning i vilken den mängd energi kan styras.- Sätt på UV-tvärbindningsmedel och använda den inställning som energi för att bestråla den tomma kammaren med 630000 μJ / cm 2.
- Ta gelerna från inkubatorn.
- Spray händer med etanol, och inne i kammaren, ta bort locket så fort som möjligt.
- Stäng kammaren och UV tvärbinda hydrogelerna genom att välja energiinställningen och bestråla 630.000 μJ / cm2.
- Efter tvärbindningscykeln, stänga av UV-ljus på PCR huva
- Spray händer med etanol och öppna kammaren, snabbt placera tillbaka locket på brunnar. Flytta brunnsplattatill PCR-huven.
- Genom att använda den sterila spatel, försiktigt lossa och ta bort gelén från brunnen. Flip gelerna under huven för att tvärbinda botten av hydrogelen. Upprepa steg 6.2.3 och 6.2.4.
7. Enzymdigestion av BSA Rubber
- För att ha en ihålig kollagenbyggnadsställning, ta bort BSA Gummi på ett sätt som inte påverkar de mått som är inbäddade i hydrogelen. Proceduren beskrivs nedan.
- Sätt på UV-ljus under 20 till 30 min för att sterilisera vävnadsodling huven.
- Gör 0,25% trypsinlösning pH 7,8. Till exempel, för 15 ml vatten, tillsätt 0,0376 g trypsin i en 50 ml koniskt rör. Justera pH till 7,8 genom tillsats av små mängder (2-5 | il) av 1 M NaCl. Placera lösningen i en 20 ml spruta och utjämnade med ett 0,20 fim sprutfilter. Tryck på kolven för att driva ut vätska genom filtret och samla den sterila lösning i ett nytt rör.
- Slå på vattenbadet och ställa in temperaturen till 30° C.
- Efter 30 minuter, stänga av UV-ljus. Spraya etanol på alla rör och material som kommer att användas i huven.
- Överför kollagen hydrogel under huven och plats i separata koniska rör.
- Lägg cirka 3-5 ml (bara tillräckligt för att täcka gelerna) 0,25% trypsinlösning med ett pH på 7,8 till varje rör.
- Försegla rören med Parafilm och vortexa lätt under ca 1 min.
- Plats i 30 ° C vattenbad i 15 till 24 h. Även i vattenbadet, lätt virvel gelerna ofta tills BSA gummit har klyvts eller avlägsnats från hydrogelen.
Obs: För att avgöra om BSA gummi har avlägsnats, antingen gummit flyter i trypsin lösning eller om det finns trasiga-down bitar. Det får inte finnas några synliga mörka områden inom hydrogel.
- För att säkerställa att alla BSA gummi och trypsin har tagits bort från hydrogeler, skölj den som beskrivs nedan.
- Slå på PCR hood UV-ljus under 20-30 min.
- Förbereda Mosconas lösning. Kombinera kaliumklorid (KCl, 28,6 mM), (NaHCO 3, 11,9 mM), glukos (9,4 mM) och (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) i vatten. Justera pH till 7,4 med 1 M NaOH eller 12 M HCl-lösning. Placera lösningen i en 20 ml spruta och använda ett sprutfilter av 0,20 um för att sterilisera lösningen.
- Spraya allt med etanol innan placera dem på huven och låta etanolen torka.
- Upp tuben och överföra 5-10 ml steril Mosconas lösning i ett annat 50 ml koniska rör.
- Överföra kollagen hydrogel till det koniska röret som innehåller enzymlösningen. Se till att hydrogelen är helt täckt med lösningen. Lämna röret i skakapparaten i kylen vid 4 ° C under 30 min.
- Aspirera Mosconas lösning och upprepa steg 7.2.5 två gånger.
- Lagra vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten visar att denna biofabrication teknik är effektiv i att generera 3D-ställningar som kan imitera den rumsliga arrangemanget sett i in vivo vävnad. De arkitektoniska detaljer är viktiga parametrar för tissue engineering program, spelar en avgörande roll i in vivo cellinteraktion och funktionalitet av vävnaden.
Konsistensen och blandbarhet av BSA gummi var en viktig parameter vid framställning av en BSA gummi som är homogen och kan bibehålla sin avsedda form. Lösligheten av proteiner bestäms genom intermolekylära effekter, såsom protein-proteininteraktioner, och samspelet med lösningsmedel, som framkallar förändringar på den totala protein beteende. Konduktiviteten hos BSA-lösningen mättes, vilket är en indikation på saltkoncentrationen av lösningarna. Tabell 1 listar den combinations av BSA, lösningsmedel, och glutaraldehyd testades. Som väntat, de prover som hade den högsta ledningsförmågan (2x PBS lösningsmedel) underlättade lösligheten av BSA.
En annan parameter som används för att bestämma den lämpliga villkor för utvecklingen av denna offermaterial var reaktionshastigheten. Reaktionstiden för den BSA minskade när koncentrationen av glutaraldehyd ökade, som förväntat. Fixativet reagerar med a-aminogrupperna i aminosyrorna, den N-terminala aminogruppen hos peptider och sulfhydrylgruppen i cystein. Glutaraldehyd reagerar främst med BSA genom aminogrupperna i lysin för att bilda de intermolekylära kovalenta bindningar (Figur 1A) 14. Efter en inkubationstid, proverna visade en färgförändring från blekt gul till mörkt gult och brunt, ökar i intensitet med ökad glutaraldehyd koncentration (Figur 1B). Den 20%, 30%, end 40% BSA med 2% glutaraldehyd i vatten bildade inte ett gummi. Den 40% BSA-lösning, på grund av dess höga viskositet och den mycket reaktiva fixativ, resulterade i varierande styrka längs gummit. Detta kan bero på svårigheten att glutaraldehyd i penetrera proteinkedjor homogent. Lösnings påverkas kraftigt lösligheten av proteinet samt dess reaktion med fixativet. 2x PBS lösningarna var lätt blandbar. BSA-lösningen med vatten var svårt att blanda. BSA löslighet påverkas i hög grad av ledningsförmåga av lösningsmedlet (tabell 2), vilket konformationsförändringar i proteinet. De mest lovande proverna var den 30% BSA med 3% glutaraldehyd i 1 x PBS och 2x PBS.
För att säkerställa att gummit kunde ihållande belastningskrafter, var ett kompressionstest utförs. De mekaniska egenskaperna hos fyra prov av BSA gummi uppmättes: 30% BSA 3% glutaraldehyd i2x PBS, 30% BSA 3% glutaraldehyd i 1 x PBS, 20% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS och 20% BSA 2% glutaraldehyd i 1 x PBS. De sinusvågor visade en mycket liten förändring fas mellan de belastnings- och förskjutningskurvor (Tillägg Figur 2) som överförs till stress och påfrestningar kurvor (Tillägg Figur 3). Baserat på spännings- och töjningskurvor, de tre första proven visade hysteres mellan lastning och lossning (Figur 2A-2C). Dessa tre exemplar betedde sig som ett viskoelastiskt material som innehåller elastiska och viskösa egenskaper när krafter tillämpades. 20% BSA 2% glutaraldehyd visade tecken på permanent deformering (figur 2D). 30% BSA 3% glutaraldehyd i 1x PBS och 2x PBS uppvisade en liknande beteende (figur 2E -on lastning och lossning cykel). Elasticitetsmodulen bestämdes från den linjära delen av dessa fyra prover (Figur 2F). Koncentrationen av fosfatlösningsmedel ökade signifikant elasticitetsmodulen vid den testade intervallet (p = 0,03). Den 20% BSA 2% glutaraldehyd i 1 x PBS deformeras lätt, visar en lägre elasticitetsmodul.
För att utvärdera den enzymatiska digerering av gummi, var reaktionshastigheten beräknas baserat på försvinnandet av BSA gummi när den placeras i kontakt med enzymet vid specifika tidpunkten. Den enzymatiska digestion process behandlades som en satsvis reaktor. En jämförelse mellan utgångsgummikoncentrationen före behandling och gummit kvar efter att lyofiliseras gjordes för att erhålla kinetiken för matsmältningen. Figur 3 visar reaktionshastigheten för varje prov i förhållande till koncentrationen av glutaraldehyd och BSA, lösningsmedel och uppehållstiden. En tydlig trend observerades mellan de tvärbindande koncentrationer och reaktionshastigheten för dissociation av enheten. Statistisk analys utfördes vid varje tidpunkt. för the 15-hr tidpunkt, påverkade glutaraldehyd koncentrationen signifikant reaktionshastigheten resulterar i ap värde på 0,02 (Supplement Tabell 4). Efter denna tidpunkt, både glutaraldehyd och BSA koncentration påverkade signifikant hastigheten (Tillägg Tabell 5-7). Den mest inflytelserika faktorn övergripande var glutaraldehyd koncentrationen, vilket indikeras av en större p-värde. Ökningen av halten glutaraldehyd minskade reaktionshastigheten för nedbrytning av gummi enhet.
Mängden protein upplöses av trypsin bestämdes med användning av en BCA-analys (Figur 4). En gemensam trend observerades: ju lägre koncentrationen av fixerings var mer protein diger från BSA gummi. Trypsin interagerat med gummiprov genom klyvning av BSA och nyskapade kovalenta bindningar bildas av glutaraldehyd, alltså lösa den övergripande strukturen övertid. Det verkar som att med 1 x PBS det finns mer solubiliserade proteinet vid en tidigare tidpunkt jämfört med 2x PBS. Med tiden, det finns en ökning av proteiner i lösning vid 15 timmar, som fortsatte att öka fram till 48 timmar och sedan minskade. Detta kan vara på grund av det trypsin ständigt klyva proteinerna och således skapar mindre peptider och aminosyror. Den kan också tillskrivas den assay: s begränsningar, som endast kan läsa peptider som består av tre eller flera aminosyror. Statistisk analys visade att BSA och glutaraldehyd koncentration påverkas signifikant frisättningen av proteinet från BSA gummi (p <0,05). En ökning av BSA koncentration orsakade en ökning av protein i supernatanten, medan en ökning av glutaraldehyd orsakade en minskning i löst protein.
För att mäta dissociation av denna offermaterial, var gummi vägs (våt bas) innan den släpps ut i contaCT med trypsin. Motsvarigheten av torrvikten av gummit placerades i enzymdigerelösningen bestämdes med användning av de värden som visas i Supplement Figur 1. Enzymlösningen reageras med BSA gummi, och sålunda, solubiliserade proteinet. Gummit som återstår efter behandlingen lyofiliserades O / N och vägdes. Figur 5 visar att lösningsmedlet påverkade dissociationen av gummit. Vid samma koncentration av BSA och glutaraldehyd, de 2x PBS lösningsmedels gummin behållit mer av deras material jämfört med 1 x PBS.
Tre fasta formstycken tillverkades: Loop Mold (Supplement Figur 4A), Stabilitet Piece (Supplement figur 4B), och Y Mold (Figur 6A, vänster). Rostfritt stål Y mögel lappar skapades med hjälp av Microlution maskinen (Figur 6A, höger). Denna Formen reaktion injiceras med 30% BSA och 3% glutaraldehyde i 2x PBS (Figur 6B, vänster). Gummit fick reagera O / N vid 4 ° C. Gummit göts med kollagen (Figur 6B, mitten) och sedan enzymdigere (Figur 6B, höger). Preliminära data tyder på att vid pH 7,8 och en temperatur av 30 ° C under 15 h, kan BSA gummidigereras med minimal påverkan på kollagenbyggnadsställning. Efter 15 h, är gummit försvagas av enzymet och löst nog att den lämnar kanalerna utan att påverka de geometriska egenskaperna hos kollagen. En 3D kollagenbyggnadsställning skapades som har specifika geometriska egenskaper. Figur 6B (höger) visar en kanal 4 mm diameter i en kollagen hydrogel efter enzymsmältning av BSA gummi. Kanalen mättes med ett skjutmått för att säkerställa att den ursprungliga dimension bibehölls. Faktum är att den nya kanalen i kollagen hydrogelen var 4 mm. Gummi formar BSA kan hålla dimensioner så små som 300 pm, som testades ossing stabilitets formen (Figur 7). Dessa ställningar testades för resterande glutaraldehyd och vi hittade inga rester efter Mosconas tvättar.
Figur 1. BSA gummi. (A) BSA gummi reaktion. Glutaraldehyd tvärbinder BSA genom att skapa kovalenta bindningar. (B) BSA Rubber. Olika koncentrationer av BSA, koncentrationer av glutaraldehyd, och typ av lösningsmedel gjuten på 24-brunnsplattor och reagerade O / N vid 4 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. spännings-töjningskurvor BSA gummin. Spännings-töjningskurvor BSA ru bbers. (A) 30% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS; (B) 30% BSA 3% glutaraldehyd i 1x PBS; (C) 20% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS; och (D) 20% BSA 2% glutaraldehyd i 1 x PBS (3 cykler). Kurvorna AC visar gummi som har någon hysteresområde, men återgå till sin ursprungliga form. Prov D visar ett gummi med en mycket låg elasticitetsmodul som lätt deformeras permanent under lastnings- och lossningsprocesser. Prov A och B visade en mycket liknande beteende som sett i en lastning och lossning cykel på rutat E (representativ för en cykel av varje prov). Elasticiteten påverkades av koncentrationen av fixeringsmedel och det använda lösningsmedlet (F). Proverna uppvisade en signifikant ökning i modul med en ökning av salter (** p <0,05). En högre fixerings koncentration orsakade en betydande ökning av elasticiteten i BSA gummin (* p <0,05).Arget = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Reaktionshastigheten av upplösningen av BSA gummi. Som fixativet ökar, minskar reaktionshastigheten för alla prov i 1 x PBS (A), 2x PBS (B), och vatten (C). 40% BSA 2% glutaraldehyd i 2x PBS visar en av de högsta nivåerna av reaktion. Detta beror på den svårighet som möter vid framställning av BSA-proteinet homogen. (blå: 20% BSA, lila: 30% BSA och röd: 40% BSA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Protein quantifi katjon efter enzymdigerering. Som fixativet ökar, det protein löses ut från den gummin minskar för samtliga prover i 1 x PBS (A), 2x PBS (B), och vatten (C). (blå: 20% BSA, lila: 30% BSA och röd: 40% BSA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Gummi digestion. Vi bestämde mängden gummi digererad genom att jämföra utgångs- och slut torr basis produkter. Vi fick minsta uppslutning på glutaraldehyd provet 6% och mest 30% BSA 2% glutaraldehyd i 1x PBS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Grenade prototyp. (A) Framställning av grenkärlen. Visas till vänster är den fasta skapas i Mastercam som omvandlades till G Code och tillverkas med hjälp av Microlution 363-S som kan ses på höger sida. Den rostfria stålformelementet representerar en 4 mm inflödeskanal med två-3mm utflödeskanaler. (B) 3D kollagenbyggnadsställning. Visas till vänster är BSA gummi görs med formen som visas ovan. Centrum visar gummit inbäddade i kollagen hydrogel. Visas till höger är de kanaler kvar i kollagen ställningen efter gummit enzymet smälta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
Figur 7. BSA-kanal. En 300 ^ m BSA kanal avlägsnades från stabilitetsstycket formen. Det finns ett tunt skikt av formsläppmedel runt kanalen. Den ytterligare ett område är tydligt urskiljas under ett mikroskop och kan lätt tas bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| BSA (%) | Glutaldehyd (%) |
| 20 | 2 |
| 20 | 3 |
| 20 | 6 |
| 30 | 2 |
| 30 | 3 |
| 30 | 6 |
| 40 | 2 |
| 40 | 3 |
| 6 |
. Tabell 1. BSA gummiparametrar BSA och fixerings blandades i en 4: 1-förhållande med hjälp av tre olika lösningsmedel.
| Prov | Konduktivitet (mS / cm) | pH | |
| BSA (%) | Lösningsmedel | ||
| 30 | 2x PBS | 11,43 | 7,06 |
| 30 | 1x PBS | 6,35 | 7,05 |
| 30 | DI | 2,39 | 6,76 |
| 20 | 2x PBS | 13,00 | 6,92 |
| 20 | 1x PBS | 8,67 | 7,09 |
| 20 | DI | 2,08 | |
Tabell 2. Konduktivitet och pH hos BSA prover. De ledningsförmågorna och pH av de BSA-lösningarna mättes i närvaro av olika lösningsmedel. En ökning i konduktivitet visas mellan 2x och 1x PBS.
| BSA (%) | Glutaraldehyd (%) | Lösningsmedel | observationer | |||
| 20 | 2 | 1x PBS | Mjukt, lätt deformerbart material | |||
| 20 | 3 | 1x PBS | Mjuk men mer robust än 2% glutaraldehyd | |||
| 20 | 6 | 1x PBS | Stiff, lite spröd | |||
| 30 | 2 | 1x PBS | bra konsistens | |||
| 30 | 3 | 1x PBS | bra konsistens | |||
| 30 | 6 | 1x PBS | Spröd | |||
| 40 | 2 | 1x PBS | Mycket inkonsekvent att skapa en gel / gummi konsistens | |||
| 40 | 3 | 1x PBS | Konsistensen varierar längs provet | |||
| 40 | 6 | 1x PBS | Spröd | |||
| 20 | 2 | 2x PBS | Mjuk, lätt deformerbart material, men mer robust än 1x PBS prov | |||
| 20 | 3 | 2x PBS | Mjuk men styvare än 2% | |||
| 20 | 6 | 2x PBS | bra konsistens | |||
| 30 | 2 | 2x PBS | God konsistens, mer studry än med 1x PBS | |||
| 30 | 3 | 2x PBS | God konsistens, mer studry än med 1x PBS | |||
| 30 | 2x PBS | God blandbarhet men britle | ||||
| 40 | 2 | 2x PBS | Konsistensen varierar längs provet | |||
| 40 | 3 | 2x PBS | Konsistensen varierar längs provet | |||
| 40 | 6 | 2x PBS | Konsistensen variera längs provet och det var spröd | |||
| 20 | 2 | Vatten | Bildade inte en gel / gummimaterial | |||
| 20 | 3 | Vatten | Bildat en gel men verkar styvare än than 1x PBS och 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 20 | 6 | Vatten | Bildat en gel men verkar styvare än 1x PBS och 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 30 | 2 | Vatten | Bildade inte en gel / gummimaterial | |||
| 30 | 3 | Vatten | Bildat en gel men verkar styvare än 1x PBS och 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 30 | 6 | Vatten | Bildat en gel men verkar styvare än 1x PBS och 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 40 | 2 | Vatten | Bildade inte en gel / gummi material | |||
| 40 | 3 | Vatten | Konsistensen varierar längs provet - styvare ovanpå | |||
| 40 | 6 | Vatten | Konsistensen varierar längs provet - styvare ovanpå | |||
Tabell 3. BSA gummi. Efter BSA gummi reagerade O / N, en 8 mm biopsistans hål av provet togs. Denna tabell innehåller några visuella observationer av konsistens och utseende av proverna.
Supplement Figur 1. Solid procentsats. Den procentuella andelen fasta ämnen från varje gummi bestämdes (torrvikt / våtvikt). Lösningsmedlet påverkade inte Percentage av fasta ämnen (p> 0,05). Klicka här för att ladda ner filen.
Tillägg Figur 2. Sine våg av 30% BSA 3% glutaraldehyd 2x PBS. Den tryckbelastning och förskjutning av provet visas som funktion av förfluten tid. Klicka här för att ladda ner filen.
Tillägg Figur 3. Sine våg av 30% BSA 3% glutaraldehyd 2x PBS. Stress och påfrestningar av provet beräknades och avsattes som en funktion av förfluten tid. Det finns en liten fasförskjutning, indicative av viskoelastiska beteendet hos gummit. Klicka här för att ladda ner filen.
Tillägg Figur 4. Mastercam fasta ämnen. (A) Loop och (B) stabilitets bitar. Efter att utforma dessa med Mastercam, var G-koden importeras och ett rostfritt stål eller mässing lappar genom att använda maskinen Microlution eller en PLA bit med hjälp av MakerBot 3D Replicator. Klicka här för att ladda ner filen.
| gränser | min | max | ||
| -17 | 3 | | ||
| Förskjutning (mm) | -1,5 | 0,3 | ||
| Våg | Nivå 1 | nivå 2 | Frekvens (Hz) | Cykel |
| Sinus | -15 | -3 | 1 | 5000 |
| Datainsamling | ||||
| Scan tid | 1,008 | |||
| skanningspunkter | 360 | |||
| Antal Scans </ Td> | 5 | |||
| efterföljande Scan | 1,008 sek mellan scan | |||
Tillägg Tabell 1. Kompressionstestparametrar. Med hjälp av en sinusvåg, var förhållandet mellan lasten och förskjutningen fastställts för de fyra typerna av gummi. Klicka här för att ladda ner filen.
| ANOVA-resultat | |||||
| df | SS | FRÖKEN | F | signifikans F | |
| regression | 3 | 9.85E + 02 | 3.28E + 02 | 4.70E + 02 | 1.06E-18 |
| Resterande | 20 | 1,40 eur e + 01 | 6.99E-01 | ||
| Total | 23 | 9.99E + 02 | |||
| Regressionsanalys | |||||
| koefficienter | Standard fel | t-stat | P-värde | ||
| Snappa upp | 1.74E + 00 | 8.23E-01 | 2.12E + 00 | 4.70E-02 | |
| BSA (%) | 7.82E-01 | 2.09E-02 | 3.74E + 01 | 5.49E-20 | |
| Glutaraldehyd (%) | 3.17E-01 </ Td> | 1.03E-01 | 3.09E + 00 | 5.71E-03 | |
| Lösningsmedel | 2.61E + 01 | 2.22E + 01 | 1.18E + 00 | 2.53E-01 | |
Tillägg Tabell 2. Statistisk analys av procentandelen fasta ämnen i BSA gummi. BSA och glutaraldehyd kraftigt påverkat andelen fasta ämnen. Lösningsmedlet påverkade inte andelen fasta ämnen. Klicka här för att ladda ner filen.
| ANOVA-resultat | |||||
| df | SS | FRÖKEN | F | signifikans F | |
| regression | 3 | 3.06E + 05 | 1.02E + 05 | 1.18E + 01 | 4.00E-03 |
| Resterande | 7 | 6.07E + 04 | 8.67E + 03 | ||
| Total | 10 | 3.67E + 05 | |||
| Regressionsanalys | |||||
| koefficienter | Standard fel | t-stat | P-värde | ||
| Snappa upp | 6.50E + 02 | 4.25E + 01 | 1.53E + 01 | 1.23E-06 | |
| BSA (%) | 4.67E + 00 | 3.80E + 01 | 1,23E-01 | 9.06E-01 | |
| Lösningsmedel | 1.02E + 02 | 3.80E + 01 | 2.67E + 00 | 3.20E-02 | |
| Glutaraldehyd (%) | 1.16E + 02 | 5.70E + 01 | 2.03E + 00 | 8.21E-02 | |
Supplement Tabell 3. Statistisk analys av elasticitetsmodulen i samband med PBS-koncentrationen. Den PBS koncentrationen påverkade elasticitetsmodul avsevärt. Ökningen av salter i lösningsmedlet orsakat en ökning av elasticitetsmodulen. Klicka här för att ladda ner filen.
| ANOVA Resultat | |||||
| df | SS | FRÖKEN | F | signifikans F | |
| regression | 3 | 6.15E-15 | 2.05E-15 | 3.68E + 00 | 1.67E-02 |
| Resterande | 60 | 3.34E-14 | 5.57E-16 | ||
| Total | 63 | 3.96E-14 | |||
| Regressionsanalys | |||||
| koefficienter | Standard fel | t-stat | P-värde | ||
| Snappa upp | 3.74E-08 | 1.37E-08 | 2.74E + 00 8.03E-03 | ||
| BSA (%) | 3.89E-10 | 3.62E-10 | 1.07E + 00 | 2.88E-01 | |
| Glutaraldehyd (%) | -5.92E-09 | 1.83E-09 | -3.23E + 00 | 2.02E-03 | |
| Lösningsmedel | -6.78E-08 | 3.76E-07 | -1.80E-01 | 8.58E-01 | |
Tillägg Tabell 4. Statistisk analys av reaktionshastigheten efter 15 timmar av enzym matsmältning. Den glutaraldehyd koncentrationen påverkas signifikant reaktionshastigheten för nedbrytning av gummit genom att minska vid högre glutaraldehyd koncentrationer. Klicka här för att ladda ner filen.
| ANOVA-resultat | |||||
| df | SS | FRÖKEN | F | signifikans F | |
| regression | 3 | 7.36E-15 | 2.45E-15 | 3.62E + 01 | 1.21E-13 |
| Resterande | 62 | 4.20E-15 | 6.78E-17 | ||
| Total | 65 | 1.16E-14 | |||
| Regressionsanalys | |||||
| koefficienter | Standard fel | t-stat | |||
| Snappa upp | 2.98E-08 | 4.77E-09 | 6.25E + 00 | 4.22E-08 | |
| BSA (%) | 4.56E-10 | 1.26E-10 | 3.62E + 00 | 6.03E-04 | |
| Glutaraldehyd (%) | -6.04E-09 | 6.15E-10 | -9.82E + 00 | 3,00E-14 | |
| Lösningsmedel | -6.57E-08 | 1.31E-07 | -5.02E-01 | 6.17E-01 | |
Supplement Tabell 5. Statistisk analys av reaktionshastigheten efter 24 h av enzymdigerering. Den BSA och glutaraldehyd koncentration påverkade signifikant reaktionshastigheten för nedbrytning av gummit. Vid högre glutaraldehyd koncentrationer finns en minskning av than reaktionshastigheten. Vid högre BSA koncentrationer finns en ökning av reaktionshastigheten. Klicka här för att ladda ner filen.
| ANOVA-resultat | |||||
| df | SS | FRÖKEN | F | signifikans F | |
| regression | 3 | 3.10E-15 | 1.03E-15 | 2.74E + 01 | 1.64E-11 |
| Resterande | 64 | 2.42E-15 | 3.78E-17 | ||
| Total | 67 | 5.52E-15 | |||
| Regressionsanalys | |||||
| koefficienter | Standard fel | t-stat | P-värde | ||
| Snappa upp | 2.17E-08 | 3.50E-09 | 6.20E + 00 | 4.55E-08 | |
| BSA (%) | 2.13E-10 | 9.20E-11 | 2.31E + 00 | 2.39E-02 | |
| Glutaraldehyd (%) | -3.94E-09 | 4.53E-10 | -8.70E + 00 | 1.90E-12 | |
| Lösningsmedel | 3.04E-08 | 9.57E-08 | 3.18E-01 | 7.51E-01 | |
Supplement Tabell6. Statistisk analys av reaktionshastigheten efter 48 h av enzymdigerering. Den BSA och glutaraldehyd koncentration påverkade signifikant reaktionshastigheten för nedbrytning av gummit. Vid högre glutaraldehyd koncentrationer finns en minskning av reaktionshastigheten. Klicka här för att ladda ner filen.
| ANOVA-resultat | |||||
| df | SS | FRÖKEN | F | signifikans F | |
| regression | 3 | 2.19E-15 | 7.29E-16 | 3.05E + 01 | 3.56E-12 |
| Resterande | 61 | 1.46E-15 2.39E-17 | |||
| Total | 64 | 3.64E-15 | |||
| Regressionsanalys | |||||
| koefficienter | Standard fel | t-stat | P-värde | ||
| Snappa upp | 1.05E-08 | 2.84E-09 | 3.69E + 00 | 4.80E-04 | |
| BSA (%) | 3.61E-10 | 7.48E-11 | 4.83E + 00 | 9.48E-06 | |
| Glutaraldehyd (%) | -3.07E-09 | 3.69E-10 | -8.33E + 00 | 1.21E-11 | |
| Sålvent | 3.97E-08 | 7.80E-08 | 5.09E-01 | 6.12E-01 | |
Tillägg Tabell 7. Statistisk analys av reaktionshastigheten efter 72 timmar av enzymklyvning. BSA och glutaraldehyd koncentration påverkade signifikant reaktionshastigheten för nedbrytning av gummit. Vid högre glutaraldehyd koncentrationer, finns det en minskning i reaktionshastigheten. Vid högre BSA koncentrationer finns en ökning av reaktionshastigheten. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biofabrication är ett mycket tvärvetenskapligt område där biologi och tekniska principer samman för att skapa komplexa material som efterliknar naturlig vävnad. För att uppnå detta finns det ett behov att utveckla tekniker som använder den information som samlats in från in vivo vävnad och översätta det till en in vitro-ställningen. På detta sätt kan en plattform konstrueras som liknar de arkitektoniska, funktionella och mekaniska egenskaperna hos den in vivo vävnad. Den optimala ställningsmaterial bör ha vissa egenskaper, såsom att vara biokompatibla, efterlikna de mekaniska egenskaperna hos vävnaden av intresse, ha förmåga att kontrollerad nedbrytning, kunna stödja cellviabilitet, och med förmåga att tillåta vävnadsombildning 2,3.
En mängd tillverkningstekniker har utvecklats för att generera livskraftiga, tredimensionella konstruktioner. Dessa tekniker kan delas in i två huvudkategorier: konventionell end avancerade. De konventionella teknikerna innefattar användning av syntetiska och naturliga traditionella material för att göra porösa strukturer. Några exempel är lösningsmedelsgjutning, frystorkning, och smältformning. Nackdelar med dessa tekniker innefattar dålig kontroll av porositet i strukturen (porstorlek och por sammankoppling) och svårighet att göra interna kanaler inom ställningar. Avancerad teknik innefattar stereolitografi, gjutning, 3D-utskrifter, och elektrospinning, bland andra 1. Dessa tekniker har nackdelar såsom avsaknad av långväga mikroarkitektur kanaler, materialval för att ge optimal mekanisk hållfasthet och samtidigt vara i stånd att dispensering genom munstycken med liten diameter, optimering beroende av material, kräver omfattande efterbehandling som kan vara toxiska, och begränsning i utformningen av inner arkitekturer i en in vitro-konstruktion. En stor nackdel i 3D-utskrift är tillgången på biomaterial som är lämpliga cellbärareSamtidigt har de mekaniska egenskaper som krävs för att bibehålla en definierad arkitektonisk organisation 12. Den teknik som presenteras här innehåller både konventionella och avancerade tillverkningstekniker. Det bästa av två världar kommer från konvergensen av datorstödd tillverkning för att skapa, eller import, den önskade arkitekturen med utvecklingen av ett enzym känsliga gummi. formar de rostfria stål skapades med användning av en fräsmaskin, men deras tillverkning är inte begränsad till denna teknik. Med hjälp av en 3D-skrivare (t.ex. MakerBot), användes samma formar tillverkade av polymjölksyra (PLA). De negativa formarna maldes med hjälp av arkitektoniska direktiv designade av CAD-programmet, som ger fasta formar som skapar ett enkelt och tillförlitligt överföring av funktioner för alla material. Denna teknik är väsentlig i det att den inte bara tillåter kontroll av den externa vävnadssammansättning, utan också av den mycket komplexa interna arkitekturen. Arbetet som presenteras härfrämst inriktat på karaktärisering av BSA gummi, som kan blandas homogent, är lättsmält i en rimlig tid, var resistent mot förändringar i sin struktur, och kan härma minut funktioner, medan du håller sin stabilitet under gjutningsprocessen . Begränsningen av denna teknik har testats och offermaterialet upplösning kan upprätthålla dimensionerna så små som 300 nm i diameter. Emellertid Figur 7 visar att kanalen är omgiven av ett tunt skikt av formsläppmedel. Med hjälp av ett mikroskop, är detta ytterligare ett område tydligt skiljas och kan tas bort för att få önskad dimension. Detta biofabrication teknik möjliggör replikation av ett brett utbud av interna strukturer som sträcker sig från makro- till mikroskala.
Serumalbumin är det mest förekommande proteinet i cirkulationssystemet. Eftersom proteinerna är polyelektrolyter, var lösligheten bestämdes genom elektrostatiska interaktioner 15-17. Det har visat sig att vid låga saltkoncentrationer, det finns en saltning in effekt på proteinlätta dess löslighet 18. Glutaraldehyd är ett tvärbindningsmedel som orsakar förändringar i egenskaperna hos albumin. Färgförändringen framgår av fig 1 hänför sig till bildningen av de aldimin bindningar 19-21. Glutaraldehyd reagerar främst med BSA genom aminogrupperna i lysin för att bilda de intermolekylära kovalenta bindningar 14. Data indikerar att ökningen av salter förbättrade elasticiteten hos gummi (från 1 x PBS till 2x PBS). Ju högre glutaraldehyd koncentrationen ger styvare geler som sätter tidigare jämfört med koncentrations sådana låga. Men de är svårare att dosera, blanda homogent, och de bildar spröda geler. Att leverera lämplig mängd BSA gummi i formarna måste varje del av enheten hållas kall eftersom högre temperaturer påskynda glutaraldehyd och BSA reaktion.Den ideala gummi (30% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS eller 1 x PBS) uppför sig som ett viskoelastiskt material som tål belastning utan att permanent deformeras. Detta blir mycket viktigt vid hantering och gjutning material runt gummistrukturen BSA.
Trypsin är ett serinproteas som hydrolyserar proteiner. Trypsin är en allmänt använd enzym som har hög klyvningsspecificitet. Det klyver peptidkedjorna huvudsakligen vid karboxylsidan av aminosyrorna lysin och arginin 22. BSA är lättlöslig vid låga koncentrationer i vatten, och trypsin diger lätt BSA gummi lämnar kollagen intakt och relativt orörd. Materialet kommer inte att ha någon kontakt med celler. Konstruktet testades med avseende på närvaro av fri glutaraldehyd och det fanns inga spår av detta fixativ. Detta visar effekten av BSA gummi som ett offermaterial biofabrication. I detta protokoll var kollagen används som byggnadsställning material utan någon otsitt material som är resistent mot trypsin digestion skulle kunna användas.
Framtida arbete kommer att inriktas på beredning vaskulära komponenter inom hydrogeler genom ympning ställningen med endotelceller och fibroblastceller. En av utmaningarna är att skapa en jämn fördelning av celler i hela insidan av kanalerna som efterliknar den naturliga 3D fördelningen. För att lösa detta problem, är en strategi utvecklas som gör att tätningen eller igensättning av kanalerna och injektion av cellsuspensionen. Det provade materialet är pluronic F127, som är en termoreversibel gel, vätska vid 4 ° C och en fast över 30 ° C 23,24. En hög koncentration av pluronic var framgångsrik i att skapa den nödvändiga tidsmässig tätning. Efter cellsuspensionen är inom de kanaler i byggnadsställningen, är den enhet som roteras för en viss tid tills cellerna vidhäftar till alla sidor av 3D-strukturen. Insidan kanal kommer att ha tillräcklig media för att upprätthållacellöverlevnad. Pluronic bibehåller sin gelform och är lättlösligt i en vattenhaltig miljö. När cellerna vidhäfta, kommer hydrogelen att översvämmas med media, och kan odlas i stationära eller flödesförhållanden, beroende på syftet med studien. Denna metod kommer att utvärderas ytterligare och blir uppföljningen till denna publikation. Den biofabrication beskrivna tekniken används för närvarande för att utveckla en byggnadsställning replik av en human njurartär. Samma tillvägagångssätt skulle kunna göras med andra typer av vävnader, såsom hjärt-, för att utöka tillämpningen av denna teknik för att ett brett spektrum av kliniska tillämpningar.
Den biofabrication teknik som utvecklats här är ett steg framåt i genereringen av in vitro-ställningar som snabbt och tillförlitligt kan rekapitulera inneboende geometriska egenskaper. Ett naturligt material, såsom kollagen, valdes eftersom det erbjuder optimal kemisk och fysiska signaler till celler över syntetiska material. dessa naturella material kan användas för terapeutisk forskning, såsom in vitro-modeller för utveckling, missbildning, och sjukdomsvävnad, samt för ersättning av skadad vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen type I | Collagen extracted from calf hide | ||
| Hydrocloric Acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) | MP Biomedical | U5378 | 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS |
| Albumium from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Glutaraldehyde | Sigma -Aldrich | G5882 | Toxic |
| Lard | Fields | 3090 | |
| Stainless Steel Molds | Milled using Microlution Machine | ||
| Air Brush Kit | Central Pneumatic | 47791 | |
| Mixing Tip for double syringe | Medmix | ML2.5-16-LLM | Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med |
| Small O ring for double syringe | Medmix | PPB-X05-04-02SM | Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural |
| Double Syringe cap | Medmix | VLX002-SM | Cap, 4:1/10:1, PE brown, med |
| Big O ring for double syringe | Medmix | PPA-X05-04-02SM | Piston A, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe | Medmix | SDL X05-04-50M | Double syringe, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe Dispenser | Medmix | DL05-0400M | Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain |
| Laminim | 3.6 mg/ml - extracted USC lab | ||
| 20 ml Syringe Luer Lock Tip | BD | 302830 | |
| Luer Lock Caps | Fisher | JGTCBLLX | |
| HEPES | Sigma -Aldrich | H4034 | |
| Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) | Life Technologies | 1143-030 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 | |
| UV Crosslinker | Spectroline UV | XLE1000 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Fisher | S271-10 | To prepare Mosconas |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma -Aldrich | P5405-250 | To prepare Mosconas |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328-500 | To prepare Mosconas |
| Glucose | Sigma -Aldrich | G-8270 | To prepare Mosconas |
| Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S-7907 | To prepare Mosconas |
| Sterile Filter for syringes | Corning | 431224 |
References
- Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
- Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
- Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
- Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
- Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
- Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
- Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
- Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
- Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
- Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
- Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
- Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
- Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
- Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
- Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
- Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723 (2012).
- Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).
