Abstract
Vev stillasene spille en avgjørende rolle i vev gjenfødelse prosessen. Den ideelle Stillaset må oppfylle flere krav som har riktig sammensetning, målrettet modulus, og veldefinerte arkitektoniske funksjoner. Biomaterialer som rekapitulere den indre arkitekturen i in vivo vev er avgjørende for å studere sykdommer, samt å legge til rette for regenerering av tapt og misformet bløtvev. En roman biofabrication teknikken ble utviklet som kombinerer state of the art bildebehandling, tredimensjonal (3D) utskrift, og selektiv enzymatisk aktivitet for å skape en ny generasjon av biomaterialer for forskning og klinisk anvendelse. Den utviklede materiale, Bovine Serum Albumin gummi, er reaksjonen injisert inn i en form som opprettholder spesifikke geometriske egenskaper. Denne offermaterialet tillater tilstrekkelig overføring av arkitektoniske funksjoner til en naturlig stillasmateriale. Prototypen består av en 3D kollagen stillas med 4 og 3 mm kanaler som ReprESENT en forgrenet arkitektur. Dette papiret fremhever bruken av denne biofabrication teknikk for generering av naturlige konstruksjoner. Denne protokollen benytter et dataassistert programvare (DAK) for å fremstille en fast form som vil bli injisert reaksjon med BSA gummi, etterfulgt av enzymatisk oppslutning av gummi, slik at dens arkitektoniske trekk i stillaset materiale.
Introduction
I tissue engineering feltet evnen til å dikte vev stillasene er avgjørende. En egnet vev stillas har en 3D-struktur, består av biokompatible materialer, og etterligner in vivo vev arkitektur for å lette celle og vev vekst og remodellering. Dette stillas må tillate transport av næringsstoffer og fjerning av avfall 1-4. En av de viktigste hindringer i produksjonen av disse stillasene er evnen til å rekapitulere spesifikke geometriske egenskaper til et biokompatibelt materiale. Flere biofabrication teknikker har blitt rapportert til å styre de geometriske trekk ved disse stillasene, er eksempler electro 5-8, oppløsningsmiddelstøping 9, stereolitografi 10, og 3D-utskrift 11, blant andre. Disse teknikkene bommer i å gi en relativt enkel overføring av kontrollerbare interne og eksterne arkitektoniske funksjoner, er dyrt, er begrenset av sin oppløsning og trykkbarhet (
I mange kommersielle fabrikasjon systemer, er opprettelsen av interne hulrom, kanaler og funksjoner oppnådd ved hjelp av sand eller andre egnede flyttbare eller offer materialer. Metall eller plastdelen er dannet rundt sandform, og når den er stivnet, blir sanden fjernet. På samme måte, den neste generasjonen av biomaterialer trenger biosand tilsvarende. Derfor ble BSA gummi utviklet som en erstatning for biosand. BSA gummi er et nylig utviklet materiale som består av bovint serumalbumin tverrbundet med glutaraldehyd. Det ultimate målet er å gjenskape spesielle arkitektoniske elementer inn i en biologisk nedbrytbar kollagen stillas. Karakteristikken av offer biorubber som opprettholder geometrisk nøyaktighet med formen av det opprinnelige vev er beskrevet.
in vivo vev elastisitet og andre egenskaper av vevet av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bestem Andel Solids i Collagen Batch
- Pakk kollagen følge en tidligere utgitt prosedyre 13. Tine et minimum på 20 ml kollagen. Bestemme startprosentandelen av kollagenfaststoffer i batch for å manipulere den kollagen-konsentrasjonen i de dannede hydrogeler.
- Skjær tre stykker av aluminiumfolie (ca. 6 x 6 cm), og forme hver en som en panne ved hjelp av bunnen av et 25 ml begerglass. Spill vekten av hver pan.
- Tilsett en liten mengde av kollagen til hver panne og registrere den totale vekt av aluminiumpanne og kollagen. Legg 0,5 til 0,8 g av kollagen på hver aluminium pan.
Merk: Etter dette trinnet, er det tre aluminiumsfolie panner og hver av dem bør ha en liten mengde av kollagen. Sørge for å ta opp vekten av hver (totalt 3) tom aluminiumpanne og vekten av pannen etter tilsetning av kollagen. - Beregn vekten av kollagenet i hver panne ved hjelp av following formel:
Kollagen vekt = Pan og kollagen vekt - Pan vekt - Plasser de tre aluminiumspanner som holder kollagen i ovnen ved 100 ° C i 24 timer.
- Etter 24 timer, ta vekten av hver aluminium pan og dehydrert kollagen.
- Beregn vekten av dehydrert kollagen ved hjelp av følgende ligning:
Dehydrert kollagen vekt = Pan og dehydrert kollagen vekt - Pan vekt - Beregn prosentandelen av faststoff for de tre prøver for å bestemme den kollagen tørrstoffinnhold ved hjelp av formelen nedenfor:
- Beregne gjennomsnittlig kollagenfaststoffinnhold av satsen ved hjelp av prosentandelen av kollagen-faststoffer for hver av de tre prøvene.
Merk: kollagen som blir brukt er det som er igjen av det hydratiserte kollagen. Ingen av de dehydratiserte kollagen blir brukt. - Etter å bestemme prosentandelen av kollagen, fast stoff (initial kollagen konsentrasjon) av satsen, fortsette å bruke den gjenværende hydrert kollagen. Bruke en kalibrert pH-meter for å justere pH til kollagen parti til tre.
- Tilsette små mengder (2-5 ul på en gang) av 12 N saltsyre (HCl). Hold på is til alle tider. Ikke tilsett saltsyren direkte til kollagen - legg syren til siden av røret. Etter tilsetning av syre, bruker spatelen for å presse syren til kollagen og raskt å røre blandingen.
- Når den når en pH-verdi på 3, la kollagen sitte O / N ved 4 ° C.
2. Utarbeidelse av BSA Rubber
- Klargjør bovin serum albumin (BSA) løsning ved å følge prosedyren nedenfor.
- Forbered 2x Fosfatbufret fysiologisk saltvann (PBS). Legg to PBS tabletter til 100 ml vann for å gi 0,02 M PBS-oppløsning.
- Kombiner BSA med 2 x PBS for å lage en 30% BSA-løsning ved anvendelse av prosedyren angitt nedenfor.
- For eksempel, for å lage en 30% BSA med 30 ml 2x PBS ved å bruke 12,9 g BSA. Legg 1/3 av 2x PBS (f.eks, 10 ml) til en kolbe med en rørestav. Legg 1/2 av BSA (for eksempel, 6,45 g BSA) til kolben og ved hjelp av en spatel, fukte den tørre oppløsningsmaterialet.
- Gjenta denne prosess med tilsetning av PBS, og deretter BSA inntil alt oppløst stoff og løsningsmiddel er i kolben. Bruk slikkepott til å fukte hele oppløst stoff. Det vil se ut som en blanding av litt væske og klumper. La den sitte i ca 30 min.
- Deretter slår den rører på en lav syklus og sørg for at det ikke er noen klumper rundt rørepinne. Det bør ta 90 min for å få alt i løsning, eller den kan stå under omrøring O / N ved 4 ° C. Etter at den oppløste substans er alt oppløst, plassere løsningen i en 20 ml sprøyte og avsluttes med en 0,20 um sprøytefilter. Trykk på stempelet for å drive ut væsken gjennom filteret og samle den steriliserte oppløsning i en ny slange. Oppbevar ved 4 ° C.
- Forbered 3% glutaraldehyd solutipå ved å fortynne 25% glutaraldehyd løsning med sterilt filtrert 2x PBS. For eksempel, i 10 ml 3% glutaraldehydløsning, bruker 2 ml 25% glutaraldehyd og 8 ml av 2x PBS. Oppbevar ved 4 ° C.
3. Former Treatment
Merk: Prototypen som er beskrevet i denne artikkelen bruker et spesiallaget rustfritt stål Y mold stykke. Formen inneholder en tilsig og to utløpskanaler på henholdsvis 4 og 3 mm,. Først rene former, spray dem med umettet smult, og sterilisere dem. Forbered formene følge prosedyren beskrevet nedenfor.
- Rene rustfritt stålformer ved hjelp av sonikator ved en frekvens på 35 kHz. Sett formene i ultralyd og senk dem med vann og is. Hold formene kaldt hele tiden mens ultralyd kjører. Kjør sonikator i 2 perioder på 90 min.
- Etter hver periode, kan du bruke en nål for å sørge for at det ikke er materiale i Luer låse rustfritt stål eller brass kontakt. Bruk såpe og vann til å rengjøre hele overflaten av de to sidene av formene. Kontroller at det ikke er noen hindringer i kanalene.
- Sett formene, skruer, og Luer lock-kontakt i en autoklav pose og autoklav det.
- Fyll flasken som festes til en luftsprøyte halvveis med kommersielt tilgjengelig smult (blandet fettsyre slippmiddel). Sett lokket med en vanlig cap flaske. Legg den i en autoklav pose og autoklav det.
Merk: Lard brukes til å legge til rette for utgivelsen av materiale som vil være reaksjon injisert senere (BSA gummi). Ikke plasser sprøyten flasken lokket i autoclave- det kan skade den interne segl. - Varm opp smult for 45 sek eller til sin klare og væske i en mikrobølgeovn. Skru luftsprøyte lokket til smult flasken. Koble lokket med sprøyta. Fest sprøyten til luftkilden på lab benken. Åpne luftventilen, og åpner dysen til sprøyten før det begynner å fukte overflatenav et papirhåndkle.
- Spray smult vinkelrett på formoverflaten inntil overflaten er fullstendig dekket. Etter hver brikke har blitt sprayet, plassere dem i en petriskål og forsegle det. Plassere formene ved 4 ° C i 2 timer.
- Fortsett å sterilisere formene ved å utsette overflaten for UV-lys i 30 minutter. Legg dem tilbake ved 4 ° C til de er klare til å være reaksjon injisert.
4. Reaksjon Injeksjon av BSA Rubber
Merk: Alle materialer og oppløsningen skal holde kaldt til det skal brukes til å hindre for tidlig innstilling av BSA gummi i de neste trinnene.
- Forbered dispenser for å levere BSA gummi til formene følgende fremgangsmåte.
- Steril alle av blandingskomponentene (to O-ringer, sprøyte cap, dobbel sprøyte, bland spiss, og 4: 1 automaten) ved å utsette dem for ultrafiolett lys i 30 minutter i en polymerase kjedereaksjon (PCR) hette.
Merk: En PCR panseret ble brukt fordi thans prosedyren innebærer fiksativ. Disse kjemikaliene kan ikke brukes i celle / vev kultur hette på grunn av risikoen for eksponering og toksisitet overfor cellene. Enhver annen hette som inneholder en UV-lys vil være egnet. - Sett hetten på løsning holderen.
- Utføre blanding og injeksjon med en 4: 1 forhold av BSA: Glutaraldehyd. Tilsett 30% BSA til dobbeltsprøytekammeret som skal levere den høyeste mengden av løsning (Det vil ta ca 4 ml å fylle). Sørg for å forlate nok plass til å plassere O-ringen for å hindre overfylte og forurensning av tilstøtende kammeret.
- Tilsett 3% glutaraldehydløsning til det andre kammer (det vil ta omtrent 1 ml til å fylle). Sørg for å forlate nok plass til å plassere O-ringen for å hindre overfylte og forurensning av tilstøtende kammeret.
- Plasser den doble sprøyte på dispenseren. Vipp montering vertikalt slik at sprøytehetten er på toppen. Sett lokket med blandespissen.
- ScREW de to rustfritt stål mold stykker sammen.
- Plassere sammenstillingen på innsiden av en autoklav pose.
- For å fjerne eventuell luft i dispenser, holder den i oppreist stilling og raskt presse håndtaket en gang å slippe en liten mengde av BSA blandet med glutaraldehyd. Så raskt fester i rustfritt stål Y mold er Luer lock-kontakt til sprøytespissen.
- Hold rustfritt stål Y formen med venstre hånd og BSA-Glutaraldehyde blanding dispenser på høyre side. Alternativ dekker hver av venstre og høyre eksos av utløpskanaler ved å trykke på eksos til sidene av autoklavpose å sørge for at de innvendige hulrom er fylt med løsningen. Deretter plasserer formene horisontalt og injisere igjen.
- Ta formene fra dispenser og plasser i en 25 mm petriskål.
- Plasser Parafilm rundt petriskål for å hindre dehydrering av gummien.
- Sett formen i 4 ° C kjøleskap O / N.
- Steril alle av blandingskomponentene (to O-ringer, sprøyte cap, dobbel sprøyte, bland spiss, og 4: 1 automaten) ved å utsette dem for ultrafiolett lys i 30 minutter i en polymerase kjedereaksjon (PCR) hette.
Merk: kollagen bør holdes på is hele tiden under prosessen.
- Modifisere den kollagen-konsentrasjonen ved hjelp av prosentandelen av kollagen faste stoffer.
- Gjøre 10 ml 1,75% kollagen ved å justere den initiale kollagenkonsentrasjon med kaldt vann.
- Ved hjelp av en kalibrert pH-meter, justere pH til 3 ved anvendelse av 12 N saltsyre. Ikke tilsett saltsyren direkte til collagen- legge syren til siden av røret. Etter tilsetning av syre, bruker spatelen for å presse syren inn i kollagen og raskt å røre blandingen.
- Vei 4 g av kollagen i et separat konisk rør.
- Sentrifuger kollagen for å fjerne luft ved 4 ° C og 9343 x g i 20-30 min.
- UV sterilisere cellekultur panseret i 30 minutter, og tilsett 14 mL av laminin til 4 ml kollagen. Dette vil resultere i en endelig laminin konsentrasjon på 10 ug / ul. Merk: Laminin gir structural integritet, heft, og fremmer ulike cellulære responser.
- Snu PCR UV lys på i 20-30 min før du bruker panseret for sterilisering.
- Plasser luer lock, å feste til en 20 ml sprøyte, i etanol for en 2 timers. Deretter, la det tørke og legg den i UV-lys.
- Gamma bestråle kollagen for 8,6 minutter å nå 1200 cGy.
Merk: Tiden vil avhenge av nedbrytning av cesium kilden. Justere tiden for å nå den samme dosering.
6.Casting Kollagen på BSA Rubber
- For å polymerisere kollagen, bruke en 8: 1: 1-forhold (kollagen: HEPES: MEM). Fremgangsmåten nedenfor er basert på en innledende 4 g syrnet kollagen (fra trinn 5.1.8).
- Foreta en 0,2 N HEPES-oppløsning i vann, og justere pH til 9 ved tilsetning av små mengder (1-5 ul) av 1-5 M natriumhydroksid (NaOH) oppløsning. Ved hjelp av en kalibrert pH-meter, overvåke pH-verdien i oppløsningen etter hver tilsetning. Oppbevar ved 4 ° C eller keep på is.
- Slå på UV lys av vevskultur panseret for 20-30 min å sterilisere panseret.
- Autoclave tang, spatel, og skalpell for sterilisering.
- Bland 1,5 ml 0,2 N HEPES (pH 9) og 1,5 ml av 10x MEM ved hjelp av vevskultur hette. Sørg for å holde den på is og vortex det i 5 sekunder før bruk. Oppbevar ved 4 ° C eller holde på is.
- Å sterilisere PCR panseret, slå på UV-lys i 30 min.
- Plasser en 12 brønn plate og en 20 ml sprøyte på -20 ° C i 10 minutter, eller inntil den er klar til å fortsette. Merk: Hold alle materialer kaldt til det skal brukes. Økningen i temperatur induserer tidlig kollagen fibrillogenese.
- Spray alle rør og brønn plater som kommer til å være i panseret med 70% etanol og la dem tørke for sterilisering. Plasser en 20 ml sprøyte på is for å kjøle for senere bruk.
- I PCR hette, åpne rustfrie former for å frigjøre BSA gummi og bruke en skalpell, skjære igjennom røykkanaler av BSA rubber mold.
- Under PCR panseret, åpne sterile kollagen rør og tilsett 1 ml av HEPES-MEM løsning (sørg for at før utpakking av HEPES-MEM løsning, at det er godt blandet og det er ingen faste innskudd).
- Bruk av steril spatel, grundig blande kollagen og bufferløsning.
- Lukk og virvle det raskt for å sikre et godt blandet hydrogel.
- Overføring til en kald 20 ml sprøyte.
- Med en hånd, holder BSA gummi på innsiden av brønnen, og, ved hjelp av den andre, dispensere halvparten av kollagen hydrogel oppløsning på bunnen av brønnen.
- Bruke sterile pinsetter, sikre at gummi tilsig og utstrømningen ender berører sidene av brønnen.
- Hell kollagen løsning på toppen av gummien før er helt dekket.
- Kontroller at BSA gummien er opphengt i kollagen, og at det ikke er noen bobler, særlig i nærheten av endene av gummi.
- Sett dekselet og pakk Parafilm rundtomkrets av brønnen.
- Satt i inkubator i 1 time ved 37 ° C. Hold PCR UV-lys på.
- Etter polymeriseringen av kollagen, UV-fornette hydrogelen via følgende prosedyre.
Merk: kryssbinding av kollagen vil bli gjort ved hjelp av en UV-tverrbindingsapparat hvor mengden av energi kan kontrolleres.- Slå på UV tverrbinder og bruke energien innstillingen til bestråle tomt kammer med 630 000 μJ / cm 2.
- Fjern gels fra inkubatoren.
- Spray hendene med etanol, og inne i kammeret, tar du av lokket så raskt som mulig.
- Lukk kammeret og UV tverrbinde hydrogeler ved å velge energiinnstillingen og bestråle 630000 μJ / cm 2.
- Etter kryssbinding syklus, slå av UV-lys på PCR hette
- Spray hender med etanol og åpne kammeret, raskt å plassere lokket tilbake på brønns platen. Flytt godt platetil PCR hetten.
- Ved å bruke steril spatel, forsiktig løsne og fjerne gelen fra brønnen. Flip gelene under panseret for å tverrbinde bunnen av hydrogel. Gjenta trinn 6.2.3 og 6.2.4.
7. Enzym Fordøyelse av BSA Rubber
- For å ha en hul kollagen stillas, fjerne BSA gummi på en måte som ikke påvirker dimensjonene innleiret i hydrogelen. Fremgangsmåten er beskrevet nedenfor.
- Slå på UV-lys for 20-30 min å sterilisere vevskultur panseret.
- Gjør 0,25% trypsin løsning pH 7,8. For eksempel, i 15 ml vann, tilsett 0,0376 g av trypsin i et 50 ml konisk rør. Juster pH-verdien til 7,8 ved tilsetning av små mengder (2-5 ul) av 1 M NaCl. Sett oppløsning i en 20 ml sprøyte og avsluttes med en 0,20 um sprøytefilter. Trykk på stempelet for å drive ut væsken gjennom filteret og samle den sterile løsning i et nytt rør.
- Slå på vannbad og sett temperaturen til 30° C.
- Etter 30 min, slå av UV-lys. Spray etanol på alle rørene og materialer som skal brukes i hetten.
- Overfør kollagen hydrogel under panseret, og plasser i egen konisk tube.
- Legg rundt 3-5 ml (akkurat nok til å dekke gelene) med 0,25% trypsin-løsning med en pH på 7,8 til hvert rør.
- Tett rør med Parafilm og virvle lett for ca 1 min.
- Sted i 30 ° C vannbad i 15-24 timer. Mens i vannbadet, lett vortex gelene ofte til BSA gummi er blitt oppløst eller fjernet fra hydrogelen.
Bemerk: For å bestemme om BSA gummi er blitt fjernet, enten gummien er flytende i trypsinoppløsning, eller det er brutt ned stykker. Det må ikke være noen visuelle mørke områder innenfor hydrogel.
- For å sikre at all BSA gummi og trypsin er blitt fjernet fra hydrogelene, skyll det som beskrevet nedenfor.
- Slå på PCR hood UV-lys i 20-30 min.
- Forbered Mosconas løsning. Kombiner kaliumklorid (KCl, 28,6 mM), (NaHCO3, 11,9 mM), glukose (9,4 mM) og (NaH 2PO 4, 0,08 mM) i vann. Juster pH til 7,4 med 1 M NaOH eller 12 M HCl-oppløsning. Sett oppløsning i en 20 ml sprøyte og benytte en sprøytefilter med 0,20 um for å sterilisere oppløsningen.
- Spray alt med etanol før du legger dem på panseret og la etanol for å tørke.
- Åpne røret og overføre 5-10 ml sterilt Mosconas løsning i et nytt 50 ml konisk rør.
- Overfør kollagen hydrogelen til det koniske rør som inneholder den enzymoppløsning. Kontroller at hydrogel er helt dekket med løsningen. La røret i shaker i kjøleskapet ved 4 ° C i 30 min.
- Aspirer Mosconas løsning og gjenta trinn 7.2.5 to ganger.
- Oppbevar ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene viser at dette biofabrication teknikken er effektiv i å generere 3D stillaser som kan etterligne den romlige ordning sett i in vivo vev. De arkitektoniske elementene er viktige parametere for tissue engineering søknad, spiller en avgjørende rolle i in vivo celle interaksjon og funksjonalitet av vevet.
Konsistensen og mixability av BSA gummi var en viktig parameter i å produsere en BSA gummi som er homogen og er i stand til å opprettholde sin tiltenkte form. Løseligheten av proteiner, bestemmes av intermolekylære effekter, slik som protein-protein interaksjonen, og interaksjonen med oppløsningsmidlet, noe som induserer endringer i den totale protein oppførsel. Ledningsevnen av den BSA-oppløsning ble målt, noe som er en indikasjon på saltkonsentrasjonen av løsningen. Tabell 1 viser de kombinasons av BSA, oppløsningsmiddel, og glutaraldehyd testet. Som forventet, prøvene som hadde den høyeste ledningsevne (2x PBS løsemiddel) lettes oppløseligheten av BSA.
En annen parameter som brukes til å bestemme den riktige tilstand for utviklingen av denne offermaterialet var reaksjonshastigheten. Reaksjonstiden av BSA ble redusert som konsentrasjonen av glutaraldehyd øket, som forventet. Fiksativ reagerer med a-amino-gruppene av aminosyrene, den N-terminale aminogruppen av peptider, og sulfhydrylgruppen av cystein. Glutaraldehyd reagerer overveiende med BSA gjennom aminogrupper i lysin for å danne de intermolekylære kovalente bindinger (figur 1A) 14. Etter en inkubasjonsperiode, prøvene viste en fargeforandring fra lys gul til mørk gul og brun, øker i intensitet med øket glutaraldehyd-konsentrasjonen (figur 1B). Den 20%, 30%, end 40% BSA med 2% glutaraldehyd i vann ikke danner en gummi. Den 40% BSA-oppløsning, på grunn av sin høye viskositet og den svært reaktive fiksativ, resulterte i varierende styrke langs gummien. Dette kan være forårsaket av vanskeligheten av glutaraldehyd i å trenge inn i proteinkjedene homogent. Løsningsmidlet sterkt påvirket av løseligheten av proteinet, så vel som dens reaksjon med fiksativ. De 2x PBS løsningene var lett blandbare. Den BSA-oppløsning med vann var vanskelig å blande. BSA oppløselighet er sterkt påvirket ved ledningsevnen av oppløsningsmidlet (tabell 2), forårsaker konformasjonsendringer i proteinet. Den mest lovende prøvene var det 30% BSA med 3% glutaraldehyd i 1 x PBS og 2x PBS.
For å sikre at gummien var i stand til vedvarende lasting krefter, ble en kompresjonstest utført. De mekaniske egenskaper av fire prøver av BSA gummi ble målt: 30% BSA 3% glutaraldehyd i2x PBS, 30% BSA 3% glutaraldehyd i 1 x PBS, 20% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS og 20% BSA 2% glutaraldehyd i 1 x PBS. De sinusbølger viste en svært liten faseendring mellom belastning og forskyvning kurver (Supplement figur 2) som er overført til stress og belastning kurver (Supplement figur 3). Basert på stress og belastning kurver, de tre første prøvene viste hysterese i mellom lasting og lossing (figur 2A-2C). Disse tre prøvene oppførte seg som en viskoelastisk materiale som inneholder elastiske og viskøse egenskaper når kreftene ble brukt. Den 20% BSA 2% glutaraldehyd viste tegn til varig deformasjon (figur 2D). Den 30% BSA 3% glutaraldehyd i 1x PBS og 2x PBS viste en lignende oppførsel (figur 2E -en lasting og lossing syklus). Elastisitetsmodulen ble bestemt fra den lineære del av disse fire prøver (figur 2f). Konsentrasjonen av fosfatLøsningsmidlet betydelig økt elastisitetsmodul i området testet (p = 0,03). Den 20% BSA 2% glutaraldehyd i 1 x PBS deformeres lett, og viser en lavere elastisitetsmodul.
For å evaluere den enzymatiske nedbrytning av gummien, ble reaksjonshastigheten beregnet på grunnlag av forsvinningen av BSA gummi når den plasseres i kontakt med enzymet ved bestemte tidspunkt. Den enzymatiske fordøyelse Prosessen ble behandlet som en satsreaktor. En sammenligning mellom utgangs gummi konsentrasjon før behandling og den gummi venstre etter å ha blitt frysetørket ble gjort for å oppnå de kinetikken for fordøyelsen. Figur 3 viser reaksjonshastigheten for hver prøve i forhold til konsentrasjonen av glutaraldehyd og BSA, løsningsmiddel, og oppholdstiden. Det ble observert en klar trend mellom tverrbindings konsentrasjoner og reaksjonshastigheten av dissosiasjon av enheten. Statistisk analyse ble utført ved hvert tidspunkt. for the 15-timers tidspunktet, glutaraldehyd-konsentrasjonen påvirkes i betydelig grad reaksjonshastigheten som resulterer i en p verdi på 0,02 (Supplement tabell 4). Etter dette tidspunktet, både glutaraldehyd og BSA konsentrasjon påvirkes betydelig rate (Supplement Tabell 5-7). Den mest innflytelsesrike faktoren samlet var glutaraldehyd konsentrasjon, angitt med en mer betydelig p-verdi. Økningen av glutaraldehyd-konsentrasjonen sank reaksjonshastigheten av fordøyelsen av gummi enhet.
Mengden av protein oppløst ved trypsin ble bestemt ved anvendelse av en BCA-analyse (figur 4). En vanlig trend ble observert: jo lavere konsentrasjonen av fikseringsmiddel, ble den mer proteinet spaltet fra BSA gummi. Trypsin interaksjon med gummi prøven ved spalting av BSA og de nylig opprettede kovalente bindinger dannet av glutaraldehyd, og dermed oppløsning av den samlede strukturen spissentid. Det ser ut til at med 1 x PBS det er mer solubiliserte protein på et tidligere tidspunkt i forhold til 2x PBS. Over tid, er det en økning av proteiner i oppløsning ved 15 timer, som fortsatte å øke inntil 48 timer og deretter det redusert. Dette kan være på grunn av den stadig trypsin å spalte proteinene og dermed skape mindre peptider og aminosyrer. Det kan også være knyttet til analyse begrensninger, som bare kan leses peptider som er sammensatt av tre eller flere aminosyrer. Statistisk analyse viste at BSA og glutaraldehyd-konsentrasjonen i betydelig grad påvirket frigjøring av proteinet fra det BSA gummi (p <0,05). En økning i BSA-konsentrasjonen forårsaket en økning av protein i supernatanten, mens en økning i glutaraldehyd forårsaket en reduksjon i oppløst protein.
For å måle dissosiasjon av denne offermaterialet, ble gummi veid (våt basis) før du legger den i Contact med trypsin. Det tilsvarer tørrvekten av gummi plassert i den enzymkutting oppløsningen ble bestemt ved hjelp av de verdiene som er vist i tillegget figur 1. Enzymløsningen reagerte med BSA gummi, og således, oppløseliggjort protein. Gummien blir igjen etter behandlingen ble lyofilisert O / N og veiet. Figur 5 viser at oppløsningsmiddelet påvirket dissosiasjon av gummi. På samme konsentrasjon av BSA og glutaraldehyd, de 2x PBS oppløsningsmiddel gummier beholdt mer av deres materiale sammenlignet med 1 x PBS.
Tre solide formdelene ble fabrikkert: Loop Mold (Supplement figur 4A), Stabilitet Piece (Supplement figur 4B), og Y Mold (figur 6A, venstre). Den rustfrie Y mold stykke ble opprettet ved hjelp av Microlution maskinen (figur 6A, høyre). Denne formen ble reaksjons injisert med 30% BSA og 3% glutaraldehyde i 2x PBS (figur 6B, til venstre). Gummien ble tillatt å reagere O / N ved 4 ° C. Gummien ble støpt med kollagen (figur 6B, midten) og deretter enzymet fordøyd (figur 6B, høyre). Foreløpige data antydet at ved pH 7,8 og en temperatur på 30 ° C i 15 timer, kan det BSA gummi bli fordøyd med minimal innvirkning på kollagen stillaset. Etter 15 timer, er det gummi svekket ved hjelp av enzymet og løs nok til at den forlater kanalene uten å påvirke de geometriske trekk ved kollagen. En 3D kollagen stillaset ble opprettet som har spesielle geometriske egenskaper. Figur 6B (til høyre) viser en diameter kanal 4 mm inne i en kollagen hydrogel etter enzymet fordøyelsen av BSA gummi. Kanalen ble målt med en passer for å sikre at den opprinnelige dimensjonen ble opprettholdt. Faktisk, er den nye kanal i kollagen hydrogelen var 4 mm. BSA gummi muggsopp kan holde dimensjoner som liten som 300 mikrometer, som ble testet ossing stabiliteten formen (figur 7). Disse stillasene ble testet for rest glutaraldehyd og vi fant ingen rester etter Mosconas vasker.
Figur 1. BSA gummi. (A), BSA gummi reaksjon. Den glutaraldehyd kryssbinder BSA ved å lage kovalente bindinger. (B) BSA gummi. Ulike konsentrasjoner av BSA, konsentrasjoner av glutaraldehyd og type løsemiddel ble støpt på 24-brønners plater og reagerte O / N ved 4 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Stress-Strain kurver av BSA gummi. Stress-Strain kurver av BSA ru bbers. (A) 30% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS; (B) 30% BSA 3% glutaraldehyd i 1 x PBS; (C) 20% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS; og (D) 20% BSA 2% glutaraldehyd i 1 x PBS (3 sykluser). Kurvene AC viser gummi som har noen hysteris, men vender tilbake til sin opprinnelige form. Prøve D viser en gummi med en svært lav elastisitetsmodul som lett deformeres permanent under lasting og lossing prosesser. Prøve A og B viste en meget lignende oppførsel som ses i en laste- og lossesyklus på grafen E (representativ for en syklus av hver prøve). Elastisiteten ble påvirket av konsentrasjonen av bindemiddel og løsningsmiddel (F). Prøvene viste en betydelig økning i elastisitetsmodul med en økning av salter (** p <0,05). En høyere konsentrasjon fiksativ forårsaket en betydelig økning i elastisiteten av de BSA-gummier (* p <0,05).Arget = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Omsetning hastigheten av oppløsningen av det BSA gummi. Som fikser øker, avtar reaksjonshastigheten for alle prøver i 1 x PBS (A), 2x PBS (B), og vann (C). Den 40% BSA 2% glutaraldehyd i 2x PBS viser en av de høyeste tallene for reaksjon. Dette skyldes vanskeligheten med å gjøre BSA proteinet homogent. (blå: 20% BSA, lilla: 30% BSA, og rødt: 40% BSA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Protein quantifi kation etter enzymbehandling. Som festing øker, proteinet løst opp fra den gummier reduseres for alle prøver i 1 x PBS (A), 2x PBS (B), og vann (C). (blå: 20% BSA, lilla: 30% BSA, og rødt: 40% BSA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Gummi fordøyelse. Vi har fastslått at mengden av gummi fordøyd ved å sammenligne start- og ende tørr basis produkter. Vi fikk minst mulig fordøyelsen på 6% glutaraldehyd prøven og mest på 30% BSA 2% glutaraldehyd i 1x PBS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Forgrenet prototype. (A) Representasjon av grenen blodkar. Vist til venstre er solid laget i Mastercam som ble konvertert til G-koden og fabrikkert ved hjelp av Microlution 363-S som vist til høyre. Den rustfritt stål mold stykke representerer en 4 mm tilsig kanal med to 3mm utløpskanaler. (B) 3D kollagen stillas. Vist til venstre er den BSA gummi laget med formen vist ovenfor. Senteret viser gummi innleiret i kollagen hydrogel. Vist til høyre er de kanalene igjen i kollagen stillaset etter gummien ble enzymet fordøyd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
Figur 7. BSA kanal. En 300 um BSA kanalen ble tatt ut av stabiliteten stykket formen. Det er et tynt lag av formslippmiddel rundt kanalen. Den ekstra Området er tydelig preget under et mikroskop og kan enkelt fjernes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| BSA (%) | Glutaldehyde (%) |
| 20 | 2 |
| 20 | 3 |
| 20 | 6 |
| 30 | 2 |
| 30 | 3 |
| 30 | 6 |
| 40 | 2 |
| 40 | 3 |
| 6 |
. Tabell 1. BSA gummi parametre BSA og fikseringsmiddel ble blandet i et 4: 1 forhold ved hjelp av tre forskjellige løsningsmidler.
| Prøve | Konduktivitet (mS / cm) | pH | |
| BSA (%) | Solvent | ||
| 30 | 2x PBS | 11.43 | 7,06 |
| 30 | 1 x PBS | 6,35 | 7.05 |
| 30 | DI | 2,39 | 6.76 |
| 20 | 2x PBS | 13.00 | 6,92 |
| 20 | 1 x PBS | 8,67 | 7,09 |
| 20 | DI | 2.08 | |
Tabell 2. konduktivitet og pH BSA prøver. Konduktivitetene og pH-verdien i de BSA-oppløsninger ble målt i nærvær av forskjellige løsningsmidler. En økning i ledningsevne er vist mellom 2x og 1x PBS.
| BSA (%) | Glutaraldehyd (%) | Solvent | observasjoner | |||
| 20 | 2 | 1 x PBS | Myk, lett deformerbare materialer | |||
| 20 | 3 | 1 x PBS | Myk, men mer solid enn 2% glutaraldehyd | |||
| 20 | 6 | 1 x PBS | Stiv, litt sprø | |||
| 30 | 2 | 1 x PBS | god konsistens | |||
| 30 | 3 | 1 x PBS | god konsistens | |||
| 30 | 6 | 1 x PBS | Skjør | |||
| 40 | 2 | 1 x PBS | Veldig inkonsekvent i å skape en gel / gummikonsistens | |||
| 40 | 3 | 1 x PBS | Konsistensen variere langs prøven | |||
| 40 | 6 | 1x PBS | Skjør | |||
| 20 | 2 | 2x PBS | Myk, lett deformerbare materiale, men mer solid enn 1x PBS prøven | |||
| 20 | 3 | 2x PBS | Myk men stivere enn 2% | |||
| 20 | 6 | 2x PBS | god konsistens | |||
| 30 | 2 | 2x PBS | God konsistens, mer studry enn med 1x PBS | |||
| 30 | 3 | 2x PBS | God konsistens, mer studry enn med 1x PBS | |||
| 30 | 2x PBS | God mixability men britle | ||||
| 40 | 2 | 2x PBS | Konsistensen variere langs prøven | |||
| 40 | 3 | 2x PBS | Konsistensen variere langs prøven | |||
| 40 | 6 | 2x PBS | Konsistensen variere langs prøven og det var sprø | |||
| 20 | 2 | Vann | Ikke danner en gel / gummimateriale | |||
| 20 | 3 | Vann | Dannet en gel, men synes stivere enn than 1x PBS og 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 20 | 6 | Vann | Dannet en gel, men synes stivere enn 1x PBS og 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 30 | 2 | Vann | Ikke danner en gel / gummimateriale | |||
| 30 | 3 | Vann | Dannet en gel, men synes stivere enn 1x PBS og 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 30 | 6 | Vann | Dannet en gel, men synes stivere enn 1x PBS og 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 40 | 2 | Vann | Ikke danner en gel / gummi materialer;al | |||
| 40 | 3 | Vann | Konsistensen varierer langs sample - stivere på toppen | |||
| 40 | 6 | Vann | Konsistensen varierer langs sample - stivere på toppen | |||
Tabell 3. BSA gummi. Etter at BSA gummi omsatt O / N, 8 mm biopsi dor hull av prøven ble tatt. Denne tabellen inneholder noen visuelle observasjoner av konsistens og utseende av prøvene.
Supplement Figur 1. Fast prosent. Prosentandelen av faststoffer fra hver av gummi ble bestemt (tørrvekt / våtvekt). Løsemiddelet påvirket ikke Percentage av faste stoffer (p> 0,05). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplement Figur 2. sinuskurve på 30% BSA 3% glutaraldehyd 2x PBS. Trykk last og forskyvning av prøven er vist som funksjoner av medgått tid. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplement Figur 3. sinuskurve på 30% BSA 3% glutaraldehyd 2x PBS. Stress og belastning av prøven ble beregnet og plottet som en funksjon av medgått tid. Det er en liten faseforskyvning, indicative av viskoelastisk oppførsel av gummi. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplement Figur 4. Mastercam stoff. (A) Loop og (B) stabilitets stykker. Etter utforme disse bruker Mastercam ble G-kode importert og en rustfritt stål eller messing stykke ved hjelp av Microlution maskin eller en PLA stykke med MakerBot 3D Replicator. Klikk her for å laste ned denne filen.
| grenser | min | Max | ||
| -17 | 3 | | ||
| Displacement (mm) | -1,5 | 0.3 | ||
| Bølge | Nivå 1 | nivå 2 | Frekvens (Hz) | Syklus |
| Sine | -15 | -3 | 1 | 5000 |
| Datainnsamling | ||||
| Scan tid | 1,008 | |||
| scan poeng | 360 | |||
| Antall Scans </ Td> | 5 | |||
| Etterfølgende følgende~~POS=HEADCOMP Scan | 1,008 sek mellom skanning | |||
Supplement Tabell 1. Compression testparametere. Ved hjelp av en sinuskurve, ble forholdet mellom belastning og forskyvning fastsatt for de fire typer gummi. Klikk her for å laste ned denne filen.
| ANOVA resultater | |||||
| df | SS | MS | F | betydning F | |
| regresjon | 3 | 9.85E + 02 | 3.28E + 02 | 4.70E + 02 | 1.06E-18 |
| residual | 20 | 1.40e + 01 | 6.99E-01 | ||
| Total | 23 | 9.99E + 02 | |||
| Regresjonsanalyse | |||||
| koeffisienter | Standard feil | t Stat | P-verdi | ||
| Intercept | 1.74E + 00 | 8.23E-01 | 2.12E + 00 | 4.70E-02 | |
| BSA (%) | 7.82E-01 | 2.09E-02 | 3.74E + 01 | 5.49E-20 | |
| Glutaraldehyd (%) | 3.17E-01 </ Td> | 1.03E-01 | 3.09E + 00 | 5.71E-03 | |
| Solvent | 2.61E + 01 | 2.22E + 01 | 1.18E + 00 | 2.53E-01 | |
Supplement tabell 2. Statistisk analyse av prosenten av faste stoffer i BSA gummi. BSA og glutaraldehyd påvirkes i betydelig grad andelen av faste stoffer. Løsemiddelet ikke påvirke andelen av faste stoffer. Klikk her for å laste ned denne filen.
| ANOVA resultater | |||||
| df | SS | MS | F | betydning F | |
| regresjon | 3 | 3.06E + 05 | 1.02E + 05 | 1.18E + 01 | 4.00E-03 |
| residual | 7 | 6.07E + 04 | 8.67E + 03 | ||
| Total | 10 | 3.67E + 05 | |||
| Regresjonsanalyse | |||||
| koeffisienter | Standard feil | t Stat | P-verdi | ||
| Intercept | 6.50e + 02 | 4.25E + 01 | 1.53E + 01 | 1.23E-06 | |
| BSA (%) | 4.67E + 00 | 3.80E + 01 | 1.23E-01 | 9.06E-01 | |
| Solvent | 1.02E + 02 | 3.80E + 01 | 2.67E + 00 | 3.20E-02 | |
| Glutaraldehyd (%) | 1.16E + 02 | 5.70E + 01 | 2.03E + 00 | 8.21E-02 | |
Supplement Tabell 3. Statistiske analyser av elastisitetsmodulen i forbindelse med PBS-konsentrasjonen. PBS-konsentrasjonen påvirkes elastisitetsmodulen betydelig. Økningen av salter i løsemiddelet har medført en økning i elastisk modulus. Klikk her for å laste ned denne filen.
| ANOVA Resultat | |||||
| df | SS | MS | F | betydning F | |
| regresjon | 3 | 6.15E-15 | 2.05E-15 | 3.68E + 00 | 1.67E-02 |
| residual | 60 | 3.34E-14 | 5.57E-16 | ||
| Total | 63 | 3.96E-14 | |||
| Regresjonsanalyse | |||||
| koeffisienter | Standard feil | t Stat | P-verdi | ||
| Intercept | 3.74E-08 | 1.37E-08 | 2.74E + 00 8.03E-03 | ||
| BSA (%) | 3.89E-10 | 3.62E-10 | 1.07E + 00 | 2.88E-01 | |
| Glutaraldehyd (%) | -5.92E-09 | 1.83E-09 | -3.23E + 00 | 2.02E-03 | |
| Solvent | -6.78E-08 | 3.76E-07 | -1.80E-01 | 8.58E-01 | |
Supplement Tabell 4. Statistisk analyse av reaksjonshastigheten etter 15 timers enzym fordøyelsen. Den glutaraldehyd konsentrasjon betydelig påvirket reaksjonshastigheten for fordøyelsen av gummi ved å redusere ved høyere glutaraldehyd konsentrasjoner. Klikk her for å laste ned denne filen.
| ANOVA resultater | |||||
| df | SS | MS | F | betydning F | |
| regresjon | 3 | 7.36E-15 | 2.45E-15 | 3.62E + 01 | 1.21E-13 |
| residual | 62 | 4.20E-15 | 6.78E-17 | ||
| Total | 65 | 1.16E-14 | |||
| Regresjonsanalyse | |||||
| koeffisienter | Standard feil | t Stat | |||
| Intercept | 2.98E-08 | 4.77E-09 | 6.25E + 00 | 4.22E-08 | |
| BSA (%) | 4.56E-10 | 1.26E-10 | 3.62E + 00 | 6.03E-04 | |
| Glutaraldehyd (%) | -6.04E-09 | 6.15E-10 | -9.82E + 00 | 3.00E-14 | |
| Solvent | -6.57E-08 | 1.31E-07 | -5.02E-01 | 6.17E-01 | |
Supplement tabell 5. Statistisk analyse av reaksjonshastigheten etter 24 timer av enzymoppslutning. BSA og glutaraldehyd-konsentrasjonen påvirkes i betydelig grad reaksjonshastigheten av fordøyelsen av gummien. Ved høyere konsentrasjoner glutaraldehyd, er det en nedgang i than reaksjonshastighet. Ved høyere BSA konsentrasjoner, er det en økning i reaksjonshastigheten. Klikk her for å laste ned denne filen.
| ANOVA resultater | |||||
| df | SS | MS | F | betydning F | |
| regresjon | 3 | 3.10E-15 | 1.03E-15 | 2.74E + 01 | 1.64E-11 |
| residual | 64 | 2.42E-15 | 3.78E-17 | ||
| Total | 67 | 5.52E-15 | |||
| Regresjonsanalyse | |||||
| koeffisienter | Standard feil | t Stat | P-verdi | ||
| Intercept | 2.17E-08 | 3.50E-09 | 6.20E + 00 | 4.55E-08 | |
| BSA (%) | 2.13E-10 | 9.20E-11 | 2.31E + 00 | 2.39E-02 | |
| Glutaraldehyd (%) | -3.94E-09 | 4.53E-10 | -8.70E + 00 | 1.90E-12 | |
| Solvent | 3.04E-08 | 9.57E-08 | 3.18E-01 | 7.51E-01 | |
supplement Table6. Statistisk analyse av reaksjonshastigheten etter 48 timer av enzymoppslutning. BSA og glutaraldehyd-konsentrasjonen påvirkes i betydelig grad reaksjonshastigheten av fordøyelsen av gummien. Ved høyere glutaraldehyd konsentrasjoner, er det en nedgang i reaksjonshastigheten. Klikk her for å laste ned denne filen.
| ANOVA resultater | |||||
| df | SS | MS | F | betydning F | |
| regresjon | 3 | 2.19E-15 | 7.29E-16 | 3.05E + 01 | 3.56E-12 |
| residual | 61 | 1.46E-15 2.39E-17 | |||
| Total | 64 | 3.64E-15 | |||
| Regresjonsanalyse | |||||
| koeffisienter | Standard feil | t Stat | P-verdi | ||
| Intercept | 1.05E-08 | 2.84E-09 | 3.69E + 00 | 4.80E-04 | |
| BSA (%) | 3.61E-10 | 7.48E-11 | 4.83E + 00 | 9.48E-06 | |
| Glutaraldehyd (%) | -3.07E-09 | 3.69E-10 | -8.33E + 00 | 1.21E-11 | |
| Sålvent | 3.97E-08 | 7.80E-08 | 5.09E-01 | 6.12E-01 | |
Supplement Tabell 7. Statistisk analyse av reaksjonshastigheten etter 72 timer av enzymoppslutning. BSA og glutaraldehyd-konsentrasjonen påvirkes i betydelig grad reaksjonshastigheten av fordøyelsen av gummien. Ved høyere konsentrasjoner glutaraldehyd, er det en reduksjon i reaksjonshastigheten. Ved høyere BSA konsentrasjoner, er det en økning i reaksjonshastigheten. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biofabrication er en svært tverrfaglig felt der biologi og tekniske prinsipper flette å generere komplekse materialer som etterligner naturlig vev. For å oppnå dette, er det et behov for å utvikle teknikker som bruker informasjonen som er samlet fra in vivo vev, og oversette den til en in vitro stillaset. På denne måten kan en plattform være konstruert som ligner de arkitektoniske, funksjonelle og mekaniske egenskaper av in vivo vev. Den optimale stillasmateriell må ha visse egenskaper, slik som å være biokompatibel, etterligner de mekaniske egenskaper for vev av interesse, være istand til å kontrollert nedbrytning, i stand til å opprettholde cellenes levedyktighet, og i stand til å tillate vevsremodelleringen 2,3.
Et mangfold av fabrikasjonsteknikker er blitt utviklet for å generere levedyktige, tredimensjonale konstruksjoner. Disse teknologiene faller i to hovedkategorier: vanlig end avansert. De konvensjonelle teknikker inkluderer bruk av syntetiske og naturlige tradisjonelle materialer for å gjøre porøse strukturer. Noen eksempler er oppløsningsmiddelstøping, frysetørking, og smeltestøping. Ulemper av disse teknikkene inkluderer dårlig kontroll av porøsitet innenfor strukturen (pore størrelse og pore tilkoblinger) og problemer med å gjøre interne kanalene i stillasene. Avanserte teknikker inkluderer stereolithography, molding, 3D-utskrift, og electro, blant annet 1. Disse teknikkene har ulemper som manglende langtrekkende mikroarkitektur kanaler, valg av materiale for å gi optimal mekanisk styrke, men som samtidig er i stand til utlevering gjennom med liten diameter dyser, optimering avhengig av materialet, krever omfattende etterbehandling som kan være giftige, og begrensning i utformingen av inner arkitekturer i en in vitro-konstruksjon. En stor ulempe i 3D-utskrift er tilgjengeligheten av biomaterialer som er tilstrekkelige celle bærere, Samtidig som har de mekaniske egenskaper som er nødvendige for å opprettholde en definert arkitektonisk organisasjon 12. Teknologien som presenteres her omfatter både konvensjonelle og avanserte fabrikasjonsmetoder. Det beste fra begge verdener er avledet fra konvergens av automatisert produksjon for å opprette eller importere, ønsket arkitektur med utviklingen av et enzym-labilt gummi. Den rustfrie formene ble opprettet ved bruk av en fresemaskin, men deres fremstilling er ikke begrenset til denne teknikk. Ved hjelp av en 3D-skriver (f.eks MakerBot) ble de samme formene fremstilt av polymelkesyre (PLA). De negative formene ble malt ved hjelp av arkitektoniske direktiver utformet av CAD-program, som gir solide former som skaper en enkel og pålitelig overføring av funksjoner til ethvert materiale. Denne teknologien er viktig ved at den tillater ikke bare styring av ytre vev sammensetning, men også av meget kompleks intern arkitektur. Arbeidet presenteres herfokuserer primært på karakterisering av BSA gummi, som kan blandes homogent, er lett fordøyelig i en rimelig tid, var motstandsdyktig mot endringer i sin struktur, og er i stand til å etterligne minutt funksjoner, samtidig som du holder sin stabilitet under støpingen . Begrensningen av denne teknikken ble testet og offermaterialet vedtak kan opprettholde dimensjoner så små som 300 mikrometer i diameter. Imidlertid, figur 7 viser at kanalen er omgitt av et tynt lag av formslippmiddel. Ved hjelp av et mikroskop, er dette tilleggsområde klart atskilt fra og kan fjernes for å få den ønskede dimensjon. Dette biofabrication teknikken tillater replikasjon av et bredt utvalg av interne strukturer som varierer fra makro- til mikroskala.
Serum albumin er den mest tallrike protein i sirkulasjonssystemet. Siden proteinene er polyelektrolytter, ble oppløselighet bestemt ved elektrostatiske interaksjoner 15-17. Det har vist seg at ved lave saltkonsentrasjoner, er det en salting-i effekt på protein tilrettelegge dets oppløselighet 18. Glutaraldehyd er et kryssbindingsmiddel som fører til forandringer i egenskapene til albumin. Endringen farge ses i figur 1 er knyttet til dannelsen av de aldiminfor bindinger 19-21. Glutaraldehyd reagerer overveiende med BSA gjennom aminogrupper i lysin for å danne de intermolekylære kovalente bindinger 14. Data viser at økningen av salter forbedret elastisitet av gummi (fra 1 x PBS til 2x PBS). Jo høyere glutaraldehyd konsentrasjon produserer stivere geleer som satt tidligere i forhold til lave konsentrasjons seg. Men de er vanskeligere å dispensere, blande homogent, og de danner sprø geler. Å levere riktig mengde BSA gummi i formene, må alle deler av forsamlingen holdes kaldt fordi høyere temperaturer akselerere glutaraldehyd og BSA reaksjon.Det ideelle gummi (30% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS eller PBS 1x) oppfører seg som et viskoelastisk materiale som kan motstå laster uten permanent deformering. Dette blir svært viktig når du håndterer og avstøpning materiale rundt BSA gummi struktur.
Trypsin er en serin protease som hydrolyzes proteiner. Trypsin er en mye brukt enzym som har høy spesifisitet spaltning. Den spalter peptidkjeder hovedsakelig på karboksylsiden av aminosyrer lysin og arginin 22. BSA er lett oppløselig ved lave konsentrasjoner i vann, og den trypsin lett spaltet BSA gummi forlater kollagen intakt og forholdsvis uberørt. Materialet vil ikke ha noen kontakt med celler. Konstruksjonen ble testet for nærvær av fritt glutaraldehyd og det var ingen spor av dette bindemiddel. Dette demonstrerer effektiviteten av BSA gummi som et offermateriale for biofabrication. I denne protokollen, ble collagen anvendt som stillasmaterialet, men en hvilken som helst othennes materiale som er motstandsdyktig overfor trypsin fordøyelse kan benyttes.
Fremtidig arbeid vil være fokusert på rekonstituering vaskulære komponenter innenfor hydrogeler ved såing stillaset med endotelceller og fibroblast celler. En av utfordringene er å skape en jevn fordeling av celler i hele innsiden av kanalene som etterligner det opprinnelige 3D-fordeling. For å løse dette problemet, blir en strategi som er utviklet som gjør det mulig for forsegling eller tilstopping av kanalene og injeksjon av cellesuspensjonen. Materialet testes er Pluronic F127, som er en termoreversible gel, flytende ved 4 ° C og et faststoff over 30 ° C 23,24. En høy konsentrasjon av Pluronic var vellykket i å skape den nødvendige tidsmessige tetning. Etter at cellesuspensjonen er innenfor kanaler av stillaset, er enheten rotert i en viss tid inntil cellene holder seg til alle sider av 3D-strukturen. Innsiden kanalen vil ha tilstrekkelig media for å opprettholdecelle overlevelse. Pluronic opprettholder sin gel form, og er lett oppløselig i et vandig miljø. Når cellene holder seg, vil den hydrogel bli oversvømmet med media, og kan dyrkes i stasjonære eller strømningsforhold, avhengig av formålet med undersøkelsen. Denne metodikken vil bli ytterligere vurdert og vil bli oppfølgeren til denne publikasjonen. Den biofabrication teknikken beskrevet her blir nå brukt til å utvikle et stillas kopi av et menneske nyrearterien. Den samme metode kan gjøres med andre typer vev, så som hjerte-, for å utvide anvendbarheten av denne teknikken for en lang rekke kliniske applikasjoner.
Den biofabrication teknikk utviklet her er et skritt fremover i generering av in vitro stillasene som kan rekapitulere indre geometriske funksjoner raskt og pålitelig. En naturlig materiale, slik som kollagen, ble valgt fordi den gir optimal kjemiske og fysiske signaler til cellene enn syntetiske materialer. disse naturelle materialer kan anvendes for terapeutisk forskning, som in vitro modeller for utvikling, misdannelse, og sykdom vev, så vel som for utskifting av skadet vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen type I | Collagen extracted from calf hide | ||
| Hydrocloric Acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) | MP Biomedical | U5378 | 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS |
| Albumium from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Glutaraldehyde | Sigma -Aldrich | G5882 | Toxic |
| Lard | Fields | 3090 | |
| Stainless Steel Molds | Milled using Microlution Machine | ||
| Air Brush Kit | Central Pneumatic | 47791 | |
| Mixing Tip for double syringe | Medmix | ML2.5-16-LLM | Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med |
| Small O ring for double syringe | Medmix | PPB-X05-04-02SM | Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural |
| Double Syringe cap | Medmix | VLX002-SM | Cap, 4:1/10:1, PE brown, med |
| Big O ring for double syringe | Medmix | PPA-X05-04-02SM | Piston A, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe | Medmix | SDL X05-04-50M | Double syringe, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe Dispenser | Medmix | DL05-0400M | Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain |
| Laminim | 3.6 mg/ml - extracted USC lab | ||
| 20 ml Syringe Luer Lock Tip | BD | 302830 | |
| Luer Lock Caps | Fisher | JGTCBLLX | |
| HEPES | Sigma -Aldrich | H4034 | |
| Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) | Life Technologies | 1143-030 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 | |
| UV Crosslinker | Spectroline UV | XLE1000 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Fisher | S271-10 | To prepare Mosconas |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma -Aldrich | P5405-250 | To prepare Mosconas |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328-500 | To prepare Mosconas |
| Glucose | Sigma -Aldrich | G-8270 | To prepare Mosconas |
| Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S-7907 | To prepare Mosconas |
| Sterile Filter for syringes | Corning | 431224 |
References
- Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
- Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
- Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
- Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
- Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
- Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
- Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
- Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
- Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
- Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
- Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
- Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
- Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
- Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
- Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
- Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723 (2012).
- Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).
