Abstract
andaimes tecido desempenham um papel crucial no processo de regeneração do tecido. O andaime ideal deve cumprir vários requisitos, como ter composição adequada, o módulo alvo e características arquitectónicas bem definidas. Biomateriais que recapitulam a arquitectura intrínseca no tecido in vivo são essenciais para o estudo de doenças, bem como para facilitar a regeneração de tecidos moles e perdeu mal formado. Uma técnica biofabrication novo foi desenvolvido, que combina estado da arte de imagem, a impressão tridimensional (3D), e a actividade enzimática selectiva para criar uma nova geração de biomateriais para pesquisa e aplicações clínicas. O material desenvolvido, borracha de Albumina de Soro Bovino, é de reacção injectada num molde que mantém características geométricas específicas. Este material sacrificial permite a transferência adequada de elementos arquitectónicos a um material de andaime natural. O protótipo consiste em um andaime de colágeno 3D com 4 e 3 canais mm que reprESENT uma arquitetura ramificada. Este artigo destaca o uso desta técnica biofabrication para a geração de construções naturais. Este protocolo utiliza um software assistida por computador (CAD) para a fabricação de um molde sólido que vai ser injectado com borracha reacção de BSA, seguido pela digestão enzimática da borracha, deixando a sua arquitectura interior do material de andaime.
Introduction
No campo da engenharia de tecidos a capacidade de fabricar andaimes tecido é vital. Um andaime tecido adequado tem uma estrutura 3D, é composto de materiais biocompatíveis, e imita em arquitectura do tecido vivo para facilitar o crescimento e remodelação dos tecidos e células. Este andaime deve permitir o transporte de nutrientes ea remoção de resíduos 1-4. Um dos principais obstáculos para a produção destes suportes é a capacidade de recapitular características geométricas específicas para um material biocompatível. Diversas técnicas têm sido relatados biofabrication para controlar as características geométricas destes suportes, os exemplos são electrospinning 5-8, solvente de fundição 9, estereolitografia 10, e 3D-impressão 11, entre outros. Estas técnicas são insuficientes para proporcionar uma transferência relativamente fácil de características arquitectónicas internas e externas controláveis, são caros, são limitados pela sua resolução e capacidade de impressão (
Em muitos sistemas comerciais de fabrico, a criação de espaços vazios internos, canais e características é conseguido usando areia ou outros materiais removíveis ou sacrificiais adequados. A parte de metal ou plástico é formada em torno do molde de areia, e uma vez que é solidificado, a areia é removida. Em grande parte da mesma maneira, a próxima geração de biomateriais precisa o equivalente bioareia. Portanto, a borracha de BSA foi desenvolvido como um substituto para bioareia. A borracha é um material de BSA recém formulada que consiste em albumina de soro bovino reticulado com glutaraldeído. O objetivo final é recriar elementos arquitectónicos específicos em um andaime de colágeno biodegradável. As características do biorubber sacrificial que mantém uma fidelidade dimensional com o molde do tecido original são descritos.
in vivo a elasticidade do tecido e outras características do tecido de interesse.
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Protocol
1. Determinar a percentagem de sólidos no lote Collagen
- Extrai-se a colagénio seguindo um procedimento publicado anteriormente 13. Descongelar um mínimo de 20 ml de colagénio. Determinar a percentagem inicial de sólidos de colagénio do lote de modo a manipular a concentração de colagénio nos hidrogeles formados.
- Corte três pedaços de folha de alumínio (cerca de 6 x 6 cm) e moldar cada um como uma panela, utilizando o fundo de um copo de 25 ml. Grave o peso de cada panela.
- Adicionar uma pequena quantidade de colagénio para cada panela e registar o peso total da panela de alumínio e de colagénio. Adicionar 0,5-0,8 g de colagénio em cada recipiente de alumínio.
Nota: Após este passo, há três recipientes de folha de alumínio e cada um deve ter uma pequena quantidade de colagénio. Certifique-se de registar o peso de cada recipiente de alumínio (total de 3) e o peso vazio do recipiente após a adição do colagénio. - Calcule o peso do colagénio em cada bandeja usando o fepois fórmula:
peso colágeno = Pan e peso colágeno - peso Pan - Colocar os três cadinhos de alumínio que seguram o colagénio no forno a 100 ° C durante 24 h.
- Após 24 h, registar o peso de cada recipiente de alumínio e o colagénio desidratada.
- Calcule o peso do colagénio desidratada usando a seguinte equação:
peso desidratado colágeno = Pan e peso colágeno desidratado - peso Pan - Calcula-se a percentagem de sólidos para as três amostras para determinar a concentração de sólidos de colagénio utilizando a fórmula seguinte:
- Calcular o teor de sólidos de colagénio média do lote utilizando a percentagem de sólidos de colagénio para cada uma das três amostras.
Nota: O colágeno que será usado é o que resta do colágeno hidratado. Nenhum dos colagénio desidratada irá ser utilizado. - Depois de determinar a percentagem de colagénio sólido (Iconcentração de colágeno nitial) do lote, continuar a utilizar o colágeno hidratado restante. Usar um medidor de pH calibrado para ajustar o pH do lote de colagénio a 3.
- Adicionar pequenas quantidades (2-5 mL de cada vez), de 12 de ácido clorídrico (HCl). Manter em gelo em todos os momentos. Não adicionar o ácido clorídrico directamente para o colagénio - adicionar o ácido ao lado do tubo. Depois de adicionar o ácido, utilizar a espátula para empurrar o ácido para o colagénio rapidamente e agitar a mistura.
- Uma vez que se atinja um pH de 3, deixar que o colagénio sentar O / N a 4 ° C.
2. Preparação da borracha BSA
- Preparar a solução de Albumina de Soro Bovino (BSA) seguindo o procedimento abaixo.
- Preparar a solução de 2x tampão fosfato salino (PBS). Adicionar dois comprimidos de PBS a 100 ml de água para fazer uma solução 0,02 M de PBS.
- Combinar BSA com 2x PBS para criar uma solução de BSA a 30% usando o procedimento abaixo.
- Por exemplo, para fazer uma BSA de 30% com 30 ml de 2x PBS, usar 12,9 g de BSA. Adicione 1/3 do 2x PBS (por exemplo, 10 ml) a um frasco com uma barra de agitação. Adicione 1/2 do BSA (por exemplo, BSA 6,45 g) ao balão e usando uma espátula, molhar o soluto seco.
- Repetir este processo de adição de PBS e, em seguida, BSA até que todo o soluto e solvente está no frasco. Usar uma espátula para molhar toda a soluto. Será parecido com uma mistura de um pouco de líquido e aglomerados. Deixe descansar por cerca de 30 min.
- Em seguida, ligue o agitador em um ciclo de baixa e certifique-se de que não existem aglomerados ao redor da barra de agitação. Ele deve levar 90 minutos para chegar tudo em solução ou pode ser deixada em agitação O / N a 4 ° C. Depois de o soluto é dissolvido todo, colocar a solução em uma seringa de 20 mL e tapada com um filtro de seringa de 0,20? M. Pressionar o êmbolo para expelir líquido através do filtro e recolher a solução esterilizada em um novo tubo. Armazenar a 4 ° C.
- Prepare 3% soluti glutaraldeídopor diluição em solução de glutaraldeído a 25% com PBS estéril filtrada 2x. Por exemplo, para 10 ml de solução de glutaraldeído a 3%, utilizar 2 ml de 25% de glutaraldeído e 8 ml de 2x PBS. Armazenar a 4 ° C.
3. Moldes Tratamento
Nota: O protótipo descrito neste documento usa um feito de aço inoxidável Y peça de molde. O molde contém um fluxo de entrada e dois canais de escoamento de 4 e 3 mm, respectivamente. Em primeiro lugar, moldes limpos, pulverizá-los com banha insaturado e esterilizá-los. Prepare os moldes de acordo com o procedimento descrito abaixo.
- moldes de aço inoxidável limpo usando sonicator com uma frequência de 35 kHz. Coloque os moldes na sonicator e mergulhe-os com água e gelo. Manter os moldes frio em todos os momentos, enquanto o sonicator está em execução. Executar o sonicador durante 2 períodos de 90 min.
- Depois de cada período, usar uma agulha para se certificar de que não existe material no Luer Lock ou de aço inoxidável bconector de Rass. Use sabão e água para limpar toda a superfície de ambos os lados dos moldes. Verificar que não existe qualquer obstrução nos canais.
- Coloque a moldes, parafusos e conector de bloqueio Luer num saco de autoclave e esterilizar-lo.
- Encha a garrafa que atribui a um meio caminho pulverizador de ar com banha comercialmente disponível (agente de liberação de ácidos graxos misto). Recoloque a tampa com uma garrafa cap regular. Coloque-o em um saco de autoclave e esterilizar-lo.
Nota: A banha é utilizado para facilitar a libertação do material que vai ser injectado reacção mais tarde (borracha de BSA). Não coloque a tampa do frasco do pulverizador na autoclave- ele pode danificar o selo interno. - Aqueça a banha de 45 segundos ou até que o seu claro e líquido em um forno de microondas. Feche a tampa do pulverizador de ar para a garrafa de banha. Ligar a tampa com o pulverizador. Fixe o pulverizador para a fonte de ar na bancada do laboratório. Abrir a válvula de ar, e abrir o bico do pulverizador até que começa a molhar a superfíciede uma toalha de papel.
- Spray de banha perpendicular à superfície do molde até que a superfície está totalmente coberta. Depois de cada peça foi pulverizado, colocá-los em uma placa de Petri e selá-lo. Colocar os moldes a 4 ° C durante 2 h.
- Avance para esterilizar os moldes por exposição da superfície a luz UV durante 30 min. Colocá-los de volta a 4 ° C até que estejam prontos para ser a reação injetada.
4. Injecção de Reacção da borracha BSA
Nota: Todos os materiais e solução deve ser manter o frio até à sua utilização para evitar a solidificação prematura da borracha BSA nos passos seguintes.
- Prepare o distribuidor para a entrega da borracha BSA aos moldes de seguir estes passos.
- Esterilizar todos os componentes de mistura (dois S, anéis de tampa da seringa, a seringa dupla, misturar ponta, e 4: 1 dispensador) por expondo-os a luz UV durante 30 minutos na capa da reacção em cadeia da polimerase (PCR).
Nota: Um capuz de PCR foi utilizado porque to procedimento envolve fixadores. Estes produtos químicos não pode ser utilizada na capa de cultura de células / tecido, devido ao risco de exposição e a toxicidade para as células. Qualquer outra capa que contém uma luz UV vai ser adequado. - Coloque a tampa da ponta no suporte da solução.
- Realizar a mistura e injecção a uma proporção de 4: 1 de BSA: Glutaraldeído. Adicione o BSA 30% para a câmara de seringa dupla que irá entregar a maior quantidade de solução (Isso levará cerca de 4 ml para encher). Certifique-se de deixar espaço suficiente para colocar o anel de vedação, a fim de evitar a contaminação de transbordamento e da câmara adjacente.
- Adicionar solução de glutaraldeído a 3% para a outra câmara (vai demorar cerca de 1 ml para encher). Certifique-se de deixar espaço suficiente para colocar o anel de vedação para evitar a contaminação de transbordamento e da câmara adjacente.
- Coloque a seringa dupla no distribuidor. Incline a montagem vertical de modo que a tampa da seringa está no topo. Recoloque a tampa com a ponta de mistura.
- ScRew as duas peças do molde de aço inoxidável em conjunto.
- Coloque o conjunto dentro de um saco de autoclave.
- Para remover qualquer ar no distribuidor, segurá-la na posição vertical e rapidamente apertar a pega uma vez para libertar uma quantidade pequena do BSA misturado com o glutaraldeído. Em seguida, rapidamente anexar conector de bloqueio Luer do aço Y molde inoxidável para a ponta da seringa.
- Segure o molde de aço inoxidável Y com a mão esquerda e o distribuidor de mistura BSA-Glutaraldeído à direita. Alternativo corresponde a cada uma de escape esquerda e direita dos canais de escoamento, premindo o escape para os lados do saco de autoclave para garantir que os espaços vazios no interior são preenchidos com a solução. Em seguida, coloque os moldes horizontal e injetar novamente.
- Retire os moldes de dispensador e coloque em uma placa de Petri de 25 mm.
- Coloque Parafilm em torno do prato de Petri para evitar a desidratação da borracha.
- Coloque o molde no 4 ° C frigorífico O / N.
- Esterilizar todos os componentes de mistura (dois S, anéis de tampa da seringa, a seringa dupla, misturar ponta, e 4: 1 dispensador) por expondo-os a luz UV durante 30 minutos na capa da reacção em cadeia da polimerase (PCR).
Nota: O colagénio deve ser mantido em gelo durante todo o tempo do processo.
- Modificar a concentração de colágeno em função da percentagem de sólidos de colágeno.
- Adicione 10 ml de colagénio de 1,75%, ajustando a concentração de colagénio inicial com água fria.
- Utilizando um medidor de pH calibrado, ajustar o pH para 3 usando 12 N ácido clorídrico. Não adicionar o ácido clorídrico directamente para o colagénio adicionar o ácido ao lado do tubo. Depois de adicionar o ácido, utilizar a espátula para empurrar o ácido para o colagénio rapidamente e agitar a mistura.
- Pesar 4 g de colágeno em um tubo cônico separado.
- Centrifuga-se o colagénio para remover o ar, a 4 ° C e 9343 x g durante 20-30 minutos.
- UV esterilizar o capuz de cultura de células durante 30 min, e adicionar 14 ul de laminina para o colagénio de 4 ml. Isto irá resultar numa concentração final de 10 laminina ug / uL. Nota: A laminina s forneceintegridade tructural, adesão, e promove a várias respostas celulares.
- Vire a UV PCR luz por 20-30 minutos antes de usar a capa para a esterilização.
- Colocar a tampa de fecho Luer, para ligar a uma seringa de 20 ml, em etanol durante uma 2 horas. Em seguida, deixe-a secar e colocá-lo à luz UV.
- Gamma irradiar o colágeno por 8,6 min para chegar a 1.200 cGy.
Nota: O tempo dependerá do decaimento da fonte de césio. Ajustar o tempo para atingir a mesma dosagem.
6.Casting colágeno em BSA Rubber
- Para polimerizar o colagénio, utilizar a 8: 1: 1 (de colagénio: HEPES: MEM). O procedimento seguinte baseia-se numa 4 g inicial de colagénio acidificado (a partir do passo 5.1.8).
- Adicione uma solução 0,2 N de HEPES em água e ajustar o pH a 9 por adição de pequenas quantidades (1-5 ul) de solução 1-5 M de hidróxido de sódio (NaOH). Utilizando um medidor de pH calibrado, monitorar o pH da solução após cada adição. Armazenar a 4 ° C ou keep no gelo.
- Ligar a luz UV da capa de cultura de tecido por 20-30 min para esterilizar o capô.
- forceps autoclave, espátula, e bisturi para a esterilização.
- Misturar 1,5 ml de 0,2 N de HEPES (pH 9) e 1,5 ml de MEM de 10x utilizando o capuz de cultura de tecidos. Certifique-se de mantê-lo no gelo e vortex-lo por 5 segundos antes de usar. Armazenar a 4 ° C ou manter em gelo.
- Para esterilizar o capô PCR, ligar a luz UV por 30 min.
- Colocar uma placa de 12 poços e uma seringa de 20 ml em -20 ° C durante 10 minutos, ou até estar pronto para continuar. Nota: Mantenha todos os materiais fria até que esteja pronto para uso. O aumento da temperatura induz fibrilogénese prematura colagénio.
- Spray de todos os tubos e placas de poços que vão estar na capa com 70% de etanol e deixe-os secar para esterilização. Coloque uma seringa de 20 ml em gelo para arrefecer a uma utilização posterior.
- Na capa PCR, abrir os moldes de aço inoxidável para liberar a borracha BSA e usando um bisturi, cortar os canais de escape do BSA rmolde ubber.
- Sob a capa de PCR, abrir os tubos de colagénio estéreis e adicionar 1 ml de solução tampão HEPES-MEM (certificar-se de que antes de se extrair a solução de HEPES-MEM, que é bem misturado e não há depósitos sólidos).
- Utilizando a espátula esterilizada, homogeneiza-se a solução de colagénio e tampão.
- Feche e vortex-lo rapidamente para garantir um hidrogel bem misturado.
- Transfira para uma fria seringa de 20 ml.
- Com um lado, manter a borracha de BSA no interior do poço e, com a outra, dispensar metade da solução de colagénio de hidrogel para o fundo do poço.
- Usando a pinça estéreis, garantir que as extremidades de borracha de entrada e saída estão tocando as paredes do poço.
- Pour solução de colagénio no topo da borracha até que esteja completamente coberto.
- Assegure-se que a borracha BSA é suspenso no interior do colagénio e que não existem bolhas, especialmente perto das extremidades da borracha.
- Coloque a tampa e enrole em torno do Parafilmcircunferência do poço.
- Colocar na incubadora durante 1 h a 37 ° C. Mantenha a luz UV PCR diante.
- Após a polimerização do colagénio, UV reticular o hidrogel através do procedimento seguinte.
Nota: A reticulação do colagénio será feito utilizando um aparelho de reticulador de UV em que a quantidade de energia pode ser controlada.- Ligue o reticulador de UV e usar o ajuste de energia para irradiar a câmara vazia com 630.000 μJ / cm 2.
- Remover os geles da incubadora.
- Spray de mãos com etanol, e, no interior da câmara, remover a tampa tão rapidamente quanto possível.
- Feche a câmara e UV reticular os hidrogéis seleccionando a definição de energia e irradiação de 630.000 μJ / cm 2.
- Após o ciclo de reticulação, desligar a luz UV na capa PCR
- Spray de mãos com etanol e abrir a câmara, rapidamente colocar a tampa de volta na placa bem. Mova a placa depara a capa de PCR.
- Utilizando a espátula estéril, suavemente soltar e remover o gel a partir do poço. Virar os géis sob a capa para reticular o fundo do hidrogel. Repita o passo 6.2.3 e 6.2.4.
7. Digestão Enzimática da borracha BSA
- A fim de ter uma estrutura de suporte oca de colagénio, BSA remover borracha de uma forma que não afecta as dimensões incorporados no hidrogel. O procedimento é descrito a seguir.
- Ligar a luz UV durante 20-30 minutos para esterilizar o capuz de cultura de tecidos.
- Adicione 0,25% de solução de tripsina pH 7.8. Por exemplo, por 15 ml de água, adicionar 0,0376 g de tripsina em um tubo de 50 ml. Ajustar o pH para 7,8 por adição de pequenas quantidades (2-5 ul) de 1 M de NaCl. Coloque a solução numa seringa de 20 mL e tapada com um filtro de seringa de 0,20? M. Pressionar o êmbolo para expelir líquido através do filtro e recolher a solução estéril em um novo tubo.
- Ligar o banho de água e ajustar a temperatura a 30° C.
- Após 30 minutos, desligar a luz UV. Spray de etanol em todos os tubos e materiais que irão ser utilizados na capa.
- Transferir o hidrogel colágeno sob o capô e coloque no tubo cônico separado.
- Adicionar cerca de 3-5 ml (apenas o suficiente para cobrir os géis) de solução de tripsina a 0,25% com um pH de 7,8 a cada tubo.
- Selar os tubos com Parafilm e vortex levemente durante cerca de 1 min.
- Lugar no 30 ° C banho de água por 15-24 horas. Enquanto no banho de água, levemente vortex os geles com frequência até que a borracha de BSA foi digerido ou removido a partir do hidrogel.
Nota: A fim de determinar se a borracha de BSA foi removida, quer a borracha é flutuante na solução de tripsina ou existem pedaços quebrados de deslocamento. Não deve haver áreas escuras visuais dentro do hidrogel.
- Para assegurar que toda a borracha e BSA a tripsina foi removida a partir dos hidrogéis, lave-o, conforme descrito abaixo.
- Ligue o hoo PCRluz UV d por 20-30 min.
- Preparar a solução Mosconas. Combinar cloreto de potássio (KCl, 28,6 mM), (NaHCO3, 11,9 mM), glicose (9,4 mM) e (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) em água. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 M ou solução 12 M de HCl. Coloque a solução numa seringa de 20 ml e usar um filtro de seringa de 0,20 uM para esterilizar a solução.
- Spray de tudo com etanol antes de colocá-los na capa e permitir que o etanol para secar.
- Abrir o tubo de transferência e 5-10 ml de solução estéril Mosconas para um novo tubo de 50 ml.
- Transferir o hidrogel de colagénio ao tubo cónico que contém a solução de enzima. Certifique-se de que o hidrogel é completamente coberto com a solução. Deixar o tubo com o agitador no frigorífico a 4 ° C durante 30 min.
- Aspirar a solução Mosconas e repita o passo 7.2.5 duas vezes.
- Armazenar a 4 ° C.
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Representative Results
Os resultados demonstram que esta técnica biofabrication é eficiente na geração de suportes 3D que podem imitar o arranjo espacial visto no tecido in vivo. As características arquitectónicas são parâmetros vitais para a aplicação de engenharia de tecidos, que jogam um papel crucial na interação in vivo celular e funcionalidade do tecido.
A consistência e miscibilidade da borracha de BSA foi um parâmetro importante na produção de uma borracha de BSA que é homogénea e é capaz de manter a sua forma pretendida. A solubilidade das proteínas é determinada por efeitos intermoleculares, tais como a interacção proteína-proteína, e a interacção com o solvente, o que induz alterações no comportamento global da proteína. A condutividade da solução foi medido de BSA, o que é uma indicação da concentração de sal das soluções. A Tabela 1 lista o CombinComplementos de BSA, de solvente, e glutaraldeído testado. Como esperado, as amostras que continham a maior condutividade (2x PBS solvente) facilitou a solubilidade da BSA.
Outro parâmetro utilizado para determinar as condições apropriadas para o desenvolvimento deste material sacrificial foi a velocidade da reacção. O tempo de reacção da ASB diminuiu à medida que a concentração de glutaraldehyde aumentou, como esperado. O fixador reage com os grupos a-amino dos aminoácidos, o grupo amino do terminal N dos péptidos, e o grupo sulfidrilo da cisteína. O glutaraldeído reage predominantemente com a BSA através dos grupos amino da lisina, para formar as ligações covalentes intermoleculares (Figura 1A) 14. Após um período de incubação, as amostras apresentaram uma alteração de cor de amarelo claro para amarelo escuro e castanho, o aumento em intensidade com o aumento da concentração de glutaraldeído (Figura 1B). A 20%, 30%, umad 40% de BSA com 2% de glutaraldeído em água não formam uma borracha. A solução de BSA a 40%, devido à sua elevada viscosidade e do fixador altamente reactivo, resultou na intensidade variável ao longo do borracha. Este comportamento pode ser causado pela dificuldade de o glutaraldeído em penetrar as cadeias proteicas de forma homogénea. O solvente influenciada significativamente a solubilidade da proteína, bem como a sua reacção com o fixador. As soluções PBS 2x foram facilmente misturáveis. A solução de BSA com água era difícil de misturar. BSA a solubilidade é muito afectado pela condutividade do solvente (Tabela 2), causando alterações conformacionais na proteína. As amostras foram os mais promissores de BSA 30% com 3% de glutaraldeído em PBS 1x e 2x PBS.
Para assegurar que a borracha foi capaz de forças de carga sustentada, foi realizado um teste de compressão. As propriedades mecânicas das quatro amostras de borracha de BSA foram medidas: 30% de BSA a 3% em glutaraldeído2x PBS, 30% de BSA a 3% de glutaraldeído em PBS 1x, 20% de BSA a 3% de glutaraldeído em PBS 2x e 20% de BSA a 2% de glutaraldeído em PBS 1x. As ondas senoidais mostrou uma pequena mudança de fase entre as curvas de carga e deslocação (Suplemento Figura 2) que são transferidos para as curvas de tensão e deformação (Suplemento Figura 3). Com base nas curvas de tensão e deformação, as três primeiras amostras mostrou histerese entre a carga e descarga (Figura 2A-2C). Estas três amostras comportou-se como um material viscoelástico que contém as propriedades elásticas e viscosas, quando as forças foram aplicados. A 20% de BSA a 2% de glutaraldeído mostrou sinais de deformação permanente (Figura 2D). Os 30% BSA 3% de glutaraldeído em PBS 1x e 2x PBS mostrou um comportamento semelhante (Figura 2E -um carga e descarga ciclo). O módulo de elasticidade foi determinado a partir da porção linear destas quatro amostras (Figura 2F). A concentração do fosfatosolvente aumentou significativamente o módulo de elasticidade no intervalo testado (p = 0,03). A 20% de BSA a 2% de glutaraldeído em PBS 1x facilmente deformado, mostrando um menor módulo elástico.
Para avaliar a digestão enzimática da borracha, a velocidade da reacção foi calculada com base no desaparecimento da borracha de BSA, quando colocado em contacto com a enzima no ponto de tempo específico. O processo de digestão enzimática foi tratada como um reactor descontínuo. Uma comparação entre a concentração de borracha de partida antes do tratamento e a borracha esquerda depois de ser liofilizada foi feito para se obter a cinética da digestão. A Figura 3 mostra a velocidade de reacção para cada amostra em função da concentração de glutaraldeído e de BSA, de solvente, e o tempo de residência. Observou-se uma tendência clara entre as concentrações de reticulante e a velocidade de reacção da dissociação da entidade. A análise estatística foi realizada em cada ponto de tempo. Adiantee 15-hr ponto de tempo, a concentração de glutaraldeído afectou significativamente a taxa de reacção resultante em um valor de p de 0,02 (Suplemento Tabela 4). Após esse ponto de tempo, tanto o glutaraldeído e a concentração de BSA afectada significativamente a taxa (Suplemento Tabela 5-7). O factor mais influente geral foi a concentração de glutaraldeído, indicada por um valor mais significativa p. O aumento da concentração de glutaraldeído diminuiu a taxa de reacção da digestão da entidade de borracha.
A quantidade de proteína dissolvida pela tripsina foi determinada utilizando um ensaio BCA (Figura 4). Observou-se uma tendência comum: quanto menor for a concentração do fixador, mais proteína foi digerida a partir da borracha de BSA. Tripsina interagiu com a amostra de borracha por clivagem da BSA e as ligações covalentes recém-criadas formadas pelo glutaraldeído, dissolvendo assim a estrutura global ao longoTempo. Parece que com o PBS 1x há mais proteína solubilizada a um ponto de tempo em comparação com o anterior 2x PBS. Ao longo do tempo, existe um aumento de proteínas em solução a 15 h, o qual continuou a aumentar até 48 horas e depois diminuiu. Isto pode ser devido à tripsina constantemente clivar as proteínas e, assim, a criação de péptidos mais pequenos e aminoácidos. Ele também pode ser atribuída às limitações do ensaio, que apenas pode ler os péptidos que são compostos por três ou mais ácidos aminados. A análise estatística mostrou que a concentração de BSA e glutaraldeído afectou significativamente a libertação da proteína a partir da borracha de BSA (p <0,05). Um aumento da concentração de BSA provocou um aumento de proteína no sobrenadante, enquanto que um aumento em glutaraldeído causou uma diminuição da proteína dissolvida.
Para medir a dissociação deste material sacrificial, a borracha foi pesado (base úmida) antes de colocá-lo em Contact com a tripsina. O equivalente de peso seco da borracha colocada na solução de digestão enzimática foi determinada usando os valores apresentados na Figura 1. Suplemento A solução de enzima reagir com a borracha de BSA, e, assim, a proteína solubilizada. A borracha remanescente após o tratamento foi liofilizada O / N e pesadas. A Figura 5 mostra que o solvente influenciada a dissociação do borracha. Na mesma concentração de BSA e glutaraldeído, as borrachas de solventes 2x PBS reteve mais do seu material em comparação com o PBS 1x.
Três peças do molde sólidos foram fabricados: laço molde (Suplemento A Figura 4A), pedaço de Estabilidade (Suplemento A Figura 4B), e Y molde (Figura 6A, à esquerda). O aço inoxidável Y peça de molde foi criado usando a máquina Microlution (Figura 6A, à direita). Este molde foi injectado reacção com 30% de BSA e 3% glutaraldeHyde em 2x PBS (Figura 6B, esquerda). A borracha foi deixada reagir O / N a 4 ° C. A borracha foi escalado com colágeno (Figura 6B, centro) e, em seguida, enzima digerido (Figura 6B, à direita). Os dados preliminares sugerem que a um pH de 7,8 e uma temperatura de 30 ° C durante 15 h, a borracha de BSA pode ser digerido com impacto mínimo sobre o andaime de colagénio. Após 15 horas, a borracha é enfraquecida pela enzima e solto o suficiente para que ele deixa os canais sem afetar as características geométricas do colágeno. Um andaime de colagénio 3D foi criado que tem características geométricas específicas. A Figura 6B (direita) mostra um canal de 4 mm de diâmetro no interior de um hidrogel de colagénio após a digestão enzimática da borracha de BSA. O canal foi medido com um compasso de calibre de assegurar que a dimensão original foi mantida. Com efeito, o novo canal no hidrogel colagénio era de 4 mm. Os moldes de borracha BSA pode conter dimensões tão pequenas quanto 300 mm, que foi testado nosing estabilidade do molde (Figura 7). Estes andaimes foram testados para o glutaraldeído residual e encontramos nenhum resíduo após as lavagens Mosconas.
Figura 1. BSA reacção de borracha. (A) de borracha BSA. O glutaraldeído reticula o de BSA através da criação de ligações covalentes. (B) de borracha de BSA. Diferentes concentrações de BSA, as concentrações de glutaraldeído e tipo de solvente foram fundidos em placas de 24 poços e reagiu O / N a 4 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. curvas tensão-deformação de borrachas BSA. Curvas tensão-deformação de BSA ru bbers. (A) 30% de BSA a 3% de glutaraldeído em PBS 2x; (B) 30% de BSA a 3% de glutaraldeído em PBS 1x; (C) 20% de BSA a 3% de glutaraldeído em PBS 2x; e (D), 20% de BSA a 2% de glutaraldeído em PBS 1X (3 ciclos). As curvas AC mostram borrachas que têm algum hysteris, mas retornam à sua forma original. Amostra D mostra uma borracha com um módulo de elasticidade muito baixo que facilmente se deforma permanentemente durante os processos de carga e descarga. Amostra A e B mostrou um comportamento muito semelhante ao visto em um ciclo de carga e descarga no gráfico E (representante de um ciclo de cada amostra). A elasticidade foi influenciada pela concentração do fixador e do solvente utilizado (F). As amostras apresentaram um aumento significativo no módulo com um aumento de sais (** p <0,05). Uma concentração mais elevada fixador causou um aumento significativo na elasticidade das borrachas BSA (* p <0,05).arget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. a taxa de reacção da desintegração da borracha de BSA. Como fixador aumenta, a velocidade da reacção diminui para todas as amostras em 1x PBS (A), 2x PBS (B), e água (C). Os 40% BSA 2% de glutaraldeído em 2x PBS mostra uma das maiores taxas de reação. Isto é devido à dificuldade em fazer a proteína BSA homogénea. (azul: 20% BSA, roxo: 30% BSA, e vermelho: 40% BSA). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura quantifi 4. Proteína catiónica após a digestão enzimática. Como fixador aumenta, a proteína dissolvida dos borrachas diminui para todas as amostras em 1x PBS (A), 2x PBS (B), e água (C). (azul: 20% BSA, roxo: 30% BSA, e vermelho: 40% BSA). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. digestão de borracha. Foi determinada a quantidade de borracha digerido, comparando o início e término produtos de base seca. Nós obtivemos o mínimo de digestão na amostra glutaraldeído 6% e mais de 30% BSA glutaraldeído a 2% em 1x PBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. protótipo ramificada. (A) Representação da vasculatura ramo. Mostrada à esquerda é o sólido criado em Mastercam que foi convertido no Código G e fabricado utilizando a Microlution 363-S como pode ser visto no lado direito. A peça de molde de aço inoxidável representa um canal de entrada de 4 mm, com canais de escoamento de duas 3mm. Andaime de colágeno (B) 3D. Mostrada à esquerda é a borracha BSA feita usando o molde mostrado acima. O centro mostra a borracha incorporada no hidrogel colagénio. Mostrado à direita são os canais esquerdo dentro do andaime de colágeno após a borracha foi enzima digerido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 7. BSA canal. Um canal 300 uM de BSA foi removida da peça de molde a estabilidade. Existe uma camada fina de agente de libertação de molde em torno do canal. A área adicional seja claramente distinguido sob um microscópio e pode ser facilmente removido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| BSA (%) | Glutaraldeído (%) |
| 20 | 2 |
| 20 | 3 |
| 20 | 6 |
| 30 | 2 |
| 30 | 3 |
| 30 | 6 |
| 40 | 2 |
| 40 | 3 |
| 6 |
. Tabela 1. Parâmetros de borracha BSA BSA e fixador foram misturadas a uma proporção de 4: 1, usando três diferentes solventes.
| Amostra | Condutividade (mS / cm) | pH | |
| BSA (%) | Solvente | ||
| 30 | 2x PBS | 11,43 | 7,06 |
| 30 | 1x PBS | 6.35 | 7,05 |
| 30 | DI | 2.39 | 6,76 |
| 20 | 2x PBS | 13.00 | 6,92 |
| 20 | 1x PBS | 8,67 | 7,09 |
| 20 | DI | 2.08 | |
Tabela 2. condutividade e o pH das amostras de BSA. As condutividades e o pH das soluções de BSA foi medida na presença de diferentes solventes. Um aumento da condutividade é mostrada entre 2x e 1x PBS.
| BSA (%) | Glutaraldeído (%) | Solvente | observações | |||
| 20 | 2 | 1x PBS | material deformável macio, fácil | |||
| 20 | 3 | 1x PBS | Suave, mas mais resistente do que o glutaraldeído a 2% | |||
| 20 | 6 | 1x PBS | Stiff, um pouco frágil | |||
| 30 | 2 | 1x PBS | boa consistência | |||
| 30 | 3 | 1x PBS | boa consistência | |||
| 30 | 6 | 1x PBS | Frágil | |||
| 40 | 2 | 1x PBS | Muito inconsistente na criação de uma consistência de gel / borracha | |||
| 40 | 3 | 1x PBS | A consistência pode variar ao longo da amostra | |||
| 40 | 6 | 1x PBS | Frágil | |||
| 20 | 2 | 2x PBS | Macio, material deformável fácil, mas mais resistente do que a amostra 1x PBS | |||
| 20 | 3 | 2x PBS | Suave, mas mais dura do que a 2% | |||
| 20 | 6 | 2x PBS | boa consistência | |||
| 30 | 2 | 2x PBS | Boa consistência, mais do que studry com 1x PBS | |||
| 30 | 3 | 2x PBS | Boa consistência, mais do que studry com 1x PBS | |||
| 30 | 2x PBS | Boa mixability mas britle | ||||
| 40 | 2 | 2x PBS | A consistência pode variar ao longo da amostra | |||
| 40 | 3 | 2x PBS | A consistência pode variar ao longo da amostra | |||
| 40 | 6 | 2x PBS | A consistência pode variar ao longo da amostra e foi quebradiço | |||
| 20 | 2 | Água | não formar um material gel / borracha | |||
| 20 | 3 | Água | Formou um gel, mas parecem mais duro do que tele PBS 1x e 2x PBS, inconsistente | |||
| 20 | 6 | Água | Formou-se um gel, mas parecem mais duro do que o PBS 1x e 2x PBS, inconsistente | |||
| 30 | 2 | Água | não formar um material gel / borracha | |||
| 30 | 3 | Água | Formou-se um gel, mas parecem mais duro do que o PBS 1x e 2x PBS, inconsistente | |||
| 30 | 6 | Água | Formou-se um gel, mas parecem mais duro do que o PBS 1x e 2x PBS, inconsistente | |||
| 40 | 2 | Água | não formar um materi gel / borrachaal | |||
| 40 | 3 | Água | A consistência pode variar ao longo da amostra - mais rígida no topo | |||
| 40 | 6 | Água | A consistência pode variar ao longo da amostra - mais rígida no topo | |||
Tabela 3. borracha de BSA. Depois de a borracha de BSA reagiram S / N, um orifício de 8 mm de biópsia foi retirada a amostra. Esta tabela contém algumas observações visuais da consistência e aparência das amostras.
Suplemento Figura 1. Percentagem de sólido. A percentagem de sólidos de cada um de borracha foi determinado (peso seco / peso em húmido). O solvente não afetou as percentage de sólidos (p> 0,05). Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Suplemento Figura 2. onda senoidal de 30% BSA 3% glutaraldeído 2x PBS. A carga de compressão e deslocamento da amostra são mostrados como funções do tempo decorrido. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Figura 3. Suplemento onda seno de 30% de BSA a 3% glutaraldeído 2x PBS. A tensão e deformação da amostra foram calculados e representados graficamente como uma função do tempo decorrido. Há uma mudança de fase pequeno, indicative do comportamento viscoelástico da borracha. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Suplemento Figura 4. sólidos Mastercam. (A) loop e de estabilidade (B) peças. Depois de projetar esses usando Mastercam, o código G foi importado e um aço inoxidável ou latão peça usando a máquina Microlution ou um pedaço PLA usando o Makerbot 3D Replicator. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
| limites | min | Max | ||
| -17 | 3 | | ||
| Deslocamento (mm) | -1.5 | 0,3 | ||
| Onda | Nível 1 | Nível 2 | Frequência (Hz) | Ciclo |
| Seno | -15 | -3 | 1 | 5.000 |
| Aquisição de dados | ||||
| tempo de varredura | 1.008 | |||
| pontos de digitalização | 360 | |||
| Número de Scans </ Td> | 5 | |||
| digitalização subsequente | 1.008 sec entre varredura | |||
Suplemento Tabela 1. Parâmetros de testes de compressão. Usando uma onda senoidal, a relação entre a carga e deslocamento foi determinada para os quatro tipos de borracha. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
| Os resultados da ANOVA | |||||
| df | SS | SENHORA | F | significado F | |
| Regressão | 3 | 9.85E + 02 | 3.28E + 02 | 4.70E + 02 | 1.06E-18 |
| Residual | 20 | 1.40E + 01 | 6.99E-01 | ||
| Total | 23 | 9.99E + 02 | |||
| Análise de regressão | |||||
| coeficientes | Erro padrão | t Stat | P-valor | ||
| Interceptar | 1.74E + 00 | 8.23E-01 | 2.12E + 00 | 4.70E-02 | |
| BSA (%) | 7.82E-01 | 2.09E-02 | 3.74E + 01 | 5.49E-20 | |
| Glutaraldeído (%) | 3.17E-01 </ Td> | 1.03E-01 | 3.09E + 00 | 5.71E-03 | |
| Solvente | 2.61E + 01 | 2.22E + 01 | 1.18E + 00 | 2.53E-01 | |
Suplemento Tabela 2. A análise estatística da percentagem de sólidos na borracha de BSA. A BSA e glutaraldeído afectado significativamente a percentagem de sólidos. O solvente não influenciou a porcentagem de sólidos. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
| Os resultados da ANOVA | |||||
| df | SS | SENHORA | F | significado F | |
| Regressão | 3 | 3.06E + 05 | 1.02E + 05 | 1.18E + 01 | 4,00E-03 |
| Residual | 7 | 6.07E + 04 | 8.67E + 03 | ||
| Total | 10 | 3.67E + 05 | |||
| Análise de regressão | |||||
| coeficientes | Erro padrão | t Stat | P-valor | ||
| Interceptar | 6.50E + 02 | 4.25E + 01 | 1.53E + 01 | 1.23E-06 | |
| BSA (%) | 4.67E + 00 | 3.80E + 01 | 1.23E-01 | 9.06E-01 | |
| Solvente | 1.02E + 02 | 3.80E + 01 | 2.67E + 00 | 3.20E-02 | |
| Glutaraldeído (%) | 1.16E + 02 | 5.70E + 01 | 2.03E + 00 | 8.21E-02 | |
Suplemento Tabela 3. A análise estatística do módulo de elasticidade relacionada com a concentração de PBS. A concentração de PBS afectou significativamente o módulo de elasticidade. O aumento de sais no solvente causou um aumento no módulo de elasticidade. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
| Resultado ANOVA | |||||
| df | SS | SENHORA | F | significado F | |
| Regressão | 3 | 6.15E-15 | 2.05E-15 | 3.68E + 00 | 1.67E-02 |
| Residual | 60 | 3.34E-14 | 5.57E-16 | ||
| Total | 63 | 3.96E-14 | |||
| Análise de regressão | |||||
| coeficientes | Erro padrão | t Stat | P-valor | ||
| Interceptar | 3.74E-08 | 1.37E-08 | 2.74E + 00 8.03E-03 | ||
| BSA (%) | 3.89E-10 | 3.62E-10 | 1.07E + 00 | 2.88E-01 | |
| Glutaraldeído (%) | -5.92E-09 | 1.83E-09 | -3.23E + 00 | 2.02E-03 | |
| Solvente | -6.78E-08 | 3.76E-07 | -1.80E-01 | 8.58E-01 | |
Tabela Suplemento 4. A análise estatística da taxa de reação após 15 h de digestão enzimática. A concentração de glutaraldeído afectou significativamente a taxa de reacção da digestão da borracha, diminuindo em concentrações de glutaraldeído superiores. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
| Os resultados da ANOVA | |||||
| df | SS | SENHORA | F | significado F | |
| Regressão | 3 | 7.36E-15 | 2.45E-15 | 3.62E + 01 | 1.21E-13 |
| Residual | 62 | 4.20E-15 | 6.78E-17 | ||
| Total | 65 | 1.16E-14 | |||
| Análise de regressão | |||||
| coeficientes | Erro padrão | t Stat | |||
| Interceptar | 2.98E-08 | 4.77E-09 | 6.25E + 00 | 4.22E-08 | |
| BSA (%) | 4.56E-10 | 1.26E-10 | 3.62E + 00 | 6.03E-04 | |
| Glutaraldeído (%) | -6.04E-09 | 6.15E-10 | -9.82E + 00 | 3.00E-14 | |
| Solvente | -6.57E-08 | 1.31E-07 | -5.02E-01 | 6.17E-01 | |
Suplemento Tabela 5. Análise estatística da taxa de reacção após 24 h de digestão com enzimas. A concentração de BSA e glutaraldeído afectou significativamente a taxa da reacção da digestão da borracha. Em concentrações mais elevadas de glutaraldeído, há uma diminuição no Tque velocidade de reacção. Em concentrações mais elevadas BSA, há um aumento na taxa de reação. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
| Os resultados da ANOVA | |||||
| df | SS | SENHORA | F | significado F | |
| Regressão | 3 | 3.10E-15 | 1.03E-15 | 2.74E + 01 | 1.64E-11 |
| Residual | 64 | 2.42E-15 | 3.78E-17 | ||
| Total | 67 | 5.52E-15 | |||
| Análise de regressão | |||||
| coeficientes | Erro padrão | t Stat | P-valor | ||
| Interceptar | 2.17E-08 | 3.50E-09 | 6.20E + 00 | 4.55E-08 | |
| BSA (%) | 2.13E-10 | 9.20E-11 | 2.31E + 00 | 2.39E-02 | |
| Glutaraldeído (%) | -3.94E-09 | 4.53E-10 | -8.70E + 00 | 1.90E-12 | |
| Solvente | 3.04E-08 | 9.57E-08 | 3.18E-01 | 7.51E-01 | |
Tabela suplemento6. Análise estatística da taxa de reacção após 48 h de digestão com enzimas. A concentração de BSA e glutaraldeído afectou significativamente a taxa da reacção da digestão da borracha. Em concentrações mais elevadas de glutaraldeído, há uma diminuição na taxa de reação. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
| Os resultados da ANOVA | |||||
| df | SS | SENHORA | F | significado F | |
| Regressão | 3 | 2.19E-15 | 7.29E-16 | 3.05E + 01 | 3.56E-12 |
| Residual | 61 | 1.46E-15 2.39E-17 | |||
| Total | 64 | 3.64E-15 | |||
| Análise de regressão | |||||
| coeficientes | Erro padrão | t Stat | P-valor | ||
| Interceptar | 1.05E-08 | 2.84E-09 | 3.69E + 00 | 4.80E-04 | |
| BSA (%) | 3.61E-10 | 7.48E-11 | 4.83E + 00 | 9.48E-06 | |
| Glutaraldeído (%) | -3.07E-09 | 3.69E-10 | -8.33E + 00 | 1.21E-11 | |
| assimlvent | 3.97E-08 | 7.80E-08 | 5.09E-01 | 6.12E-01 | |
Suplemento Tabela 7. Análise estatística da taxa de reacção após 72 h de digestão com enzimas. A concentração de BSA e glutaraldeído afectou significativamente a taxa da reacção da digestão da borracha. Em concentrações mais elevadas de glutaraldeído, há uma diminuição da velocidade de reacção. Em concentrações mais elevadas BSA, há um aumento na taxa de reação. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
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Discussion
Biofabrication é um campo altamente multidisciplinar, na qual biologia e engenharia princípios fundem para gerar materiais complexos que imitam tecido nativo. A fim de alcançar este objectivo, existe uma necessidade de desenvolver técnicas que utilizam a informação recolhida a partir de tecido in vivo, e traduzi-la em um andaime in vitro. Deste modo, uma plataforma pode ser manipulada que se assemelha de perto as propriedades arquitectónicos, funcionais, e mecânicas do tecido in vivo. O material de andaimes óptima deve possuir certas propriedades, tais como ser biocompatível, imitar as propriedades mecânicas do tecido de interesse, seja capaz de degradação controlada, capaz de suportar a viabilidade das células, e capaz de permitir a remodelação tissular 2,3.
Um grande número de técnicas de fabricação foram desenvolvidos para gerar construções viáveis, tridimensionais. Essas tecnologias se enquadram em duas categorias principais: um convencionald avançado. As técnicas convencionais incluem a utilização de materiais tradicionais, naturais e sintéticas para fazer estruturas porosas. Alguns exemplos são solvente de vazamento, secagem por congelamento, e derreter moldagem. Desvantagens destas técnicas incluem mau controle da porosidade dentro da estrutura (tamanho dos poros e interconectividade dos poros) e dificuldade em fazer canais internos dentro dos andaimes. Técnicas avançadas incluem estereolitografia, ligas, impressão em 3D, e electrospinning, entre outros 1. Estas técnicas têm inconvenientes, tais como a falta de canais de micro-arquitetura de longo alcance, a selecção de material para proporcionar resistência mecânica óptima enquanto ser capaz de dispensar através de bocais de pequeno diâmetro, optimização dependente do material, exigem grande pós-processamento que pode ser tóxico, e restrição no design de interiores em arquitecturas uma construção in vitro. Uma grande desvantagem em impressão 3D é a disponibilidade de biomateriais que são portadores celulares adequadas, Tendo também as propriedades mecânicas necessárias para manter uma organização arquitetônica definida 12. A tecnologia aqui apresentado incorpora as duas técnicas de fabricação convencionais e avançadas. O melhor dos dois mundos é derivada da convergência de manufatura auxiliada por computador para criar, ou importação, a arquitetura desejada com o desenvolvimento de uma borracha enzima lábil. Os moldes de aço inoxidável foram criadas utilizando uma máquina de moagem, mas a sua fabricação não é limitada a esta técnica. Utilizando uma impressora 3D (por exemplo, Makerbot), os mesmos moldes foram fabricados a partir de ácido poliláctico (PLA). Os moldes negativos foram moídos utilizando directivas arquitetônico projetado pelo programa CAD, que fornece moldes sólidos, que criam uma transferência fácil e confiável de recursos para qualquer material. Esta tecnologia é significativo na medida em que permite não só o controlo da composição do tecido externo, mas também da arquitectura interna altamente complexo. O trabalho apresentado aquicentra-se principalmente sobre a caracterização da borracha de BSA, que podem ser misturados de forma homogénea, é facilmente digerida num período de tempo razoável, foi resistente a alterações na sua estrutura, e é capaz de imitar as características hora, enquanto mantém a sua estabilidade durante o processo de fundição . A limitação desta técnica foi testada e da resolução do material de sacrifício pode manter dimensões tão pequenas quanto 300 m de diâmetro. No entanto, a Figura 7 mostram que o canal é rodeado por uma camada fina de agente de libertação de molde. Utilizando um microscópio, esta área adicional é claramente distinto e pode ser removida para ter a dimensão desejada. Esta técnica biofabrication permite a replicação de uma grande variedade de estruturas internas que variam de macro para micro-escala.
A albumina do soro é a proteína mais abundante no sistema circulatório. Uma vez que as proteínas são polielectrólitos, a solubilidade foi determinada por interacções electrostáticas 15-17. Tem sido demonstrado que a baixas concentrações de sal, não é um efeito de salting-no na proteína facilitando a sua solubilidade 18. O glutaraldeído é um agente de reticulação que faz com que as alterações nas propriedades de albumina. A mudança de cor visto na Figura 1 é atribuído à formação das ligações aldimina 19-21. O glutaraldeído reage predominantemente com a BSA através dos grupos amino da lisina, para formar as ligações covalentes intermoleculares 14. Os dados indicam que o aumento de sais melhorou a elasticidade da borracha (de 1x PBS a 2x PBS). A concentração de glutaraldeído maior produz géis mais duras que definiu anteriormente em comparação com aqueles de baixa concentração. No entanto, elas são mais difíceis de distribuir, misturar de forma homogénea, e eles formam geles frágeis. Para fornecer a quantidade adequada de borracha BSA para os moldes, cada parte do conjunto deve ser mantido frio, porque temperaturas mais altas aceleram o glutaraldeído e reação BSA.A borracha ideal (30% BSA 3% de glutaraldeído em 2x PBS ou 1x PBS) se comporta como um material viscoelástico que pode suportar cargas sem deformar de forma permanente. Isto torna-se muito importante ao manusear e material de moldagem em torno da estrutura de borracha BSA.
A tripsina é uma serina-protease que hidrolisa proteínas. A tripsina é uma enzima muito usado que tem elevada especificidade de clivagem. Ela cliva as cadeias peptídicas principalmente no lado carboxilo dos aminoácidos lisina e arginina 22. A BSA é prontamente solúvel em baixas concentrações em água, e a tripsina facilmente digerido a borracha de BSA deixando o colagénio intacto e relativamente intacto. O material não terá nenhum contato com as células. A construção foi testada para a presença de glutaraldeído livre e não havia vestígios deste fixador. Isto demonstra a eficácia da borracha BSA como um material sacrificial para biofabrication. Neste protocolo, o colagénio foi utilizado como o material de andaime, mas qualquer OTseu material que é resistente à digestão com tripsina pode ser usada.
O trabalho futuro será focado na reconstituição dos componentes vasculares dentro dos hidrogéis semeando o andaime com células endoteliais e fibroblastos. Um dos desafios é para criar uma distribuição uniforme de células ao longo do interior dos canais de distribuição que imitam o 3D nativa. Para resolver este problema, uma estratégia está a ser desenvolvida que permite a selagem ou entupimento dos canais e a injecção da suspensão de células. O material testado é Pluronic F127, que é um gel termorreversível, líquido a 4 ° C e um sólido acima de 30 ° C 23,24. Uma alta concentração de Pluronic foi bem sucedido na criação da vedação temporais necessários. Depois a suspensão de células é dentro dos canais do andaime, a entidade é rodado por um período específico de tempo até que as células aderir a todos os lados da estrutura 3D. O canal interior terá meios adequados para a manutençãoa sobrevivência celular. Pluronic mantém a sua forma de gel e é facilmente solúvel num ambiente aquoso. Uma vez que as células aderem, o hidrogel será inundado com o suporte e podem ser cultivadas em condições estacionárias ou de fluxo, dependendo da finalidade do estudo. Esta metodologia será analisada mais e se tornará o seguimento a esta publicação. A técnica aqui descrita biofabrication está actualmente a ser usado para desenvolver um andaime réplica de um artéria renal humana. A mesma abordagem pode ser feita com outros tipos de tecidos, tais como cardíaca, para alargar a aplicabilidade desta técnica para uma ampla gama de aplicações clínicas.
A técnica biofabrication desenvolvido aqui é um passo em frente na geração de in vitro andaimes que podem recapitular características geométricas intrínsecas forma rápida e confiável. Um material natural, como o colágeno, foi selecionado porque ele oferece pistas físicas para as células mais materiais sintéticos química ideal e. estes ndturais materiais podem ser usados para a investigação terapêutica, como modelos in vitro de desenvolvimento, malformação, e doença do tecido, bem como para a substituição de tecido danificado.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen type I | Collagen extracted from calf hide | ||
| Hydrocloric Acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) | MP Biomedical | U5378 | 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS |
| Albumium from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Glutaraldehyde | Sigma -Aldrich | G5882 | Toxic |
| Lard | Fields | 3090 | |
| Stainless Steel Molds | Milled using Microlution Machine | ||
| Air Brush Kit | Central Pneumatic | 47791 | |
| Mixing Tip for double syringe | Medmix | ML2.5-16-LLM | Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med |
| Small O ring for double syringe | Medmix | PPB-X05-04-02SM | Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural |
| Double Syringe cap | Medmix | VLX002-SM | Cap, 4:1/10:1, PE brown, med |
| Big O ring for double syringe | Medmix | PPA-X05-04-02SM | Piston A, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe | Medmix | SDL X05-04-50M | Double syringe, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe Dispenser | Medmix | DL05-0400M | Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain |
| Laminim | 3.6 mg/ml - extracted USC lab | ||
| 20 ml Syringe Luer Lock Tip | BD | 302830 | |
| Luer Lock Caps | Fisher | JGTCBLLX | |
| HEPES | Sigma -Aldrich | H4034 | |
| Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) | Life Technologies | 1143-030 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 | |
| UV Crosslinker | Spectroline UV | XLE1000 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Fisher | S271-10 | To prepare Mosconas |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma -Aldrich | P5405-250 | To prepare Mosconas |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328-500 | To prepare Mosconas |
| Glucose | Sigma -Aldrich | G-8270 | To prepare Mosconas |
| Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S-7907 | To prepare Mosconas |
| Sterile Filter for syringes | Corning | 431224 |
References
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