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Bioengineering

Trois dimensions technologie biomimétique: Roman Biorubber Crée Défini micro et macro-échelle Architectures en collagène hydrogels

doi: 10.3791/53578 Published: February 12, 2016

Abstract

échafaudages tissulaires jouent un rôle crucial dans le processus de régénération des tissus. L'échafaudage idéal doit répondre à plusieurs exigences comme ayant une composition appropriée, module ciblé, et les caractéristiques architecturales bien définis. Biomatériaux qui récapitulent l'architecture intrinsèque des tissus in vivo sont vitales pour l'étude des maladies ainsi que pour faciliter la régénération des tissus mous perdus et mal formé. Une technique de biofabrication roman a été développé qui combine l'état de l'imagerie de l'art, l'impression en trois dimensions (3D), et l'activité enzymatique sélective pour créer une nouvelle génération de biomatériaux pour la recherche et l'application clinique. Le matériau développé, caoutchouc sérum-albumine bovine, est une réaction injectée dans un moule qui respecte les caractéristiques géométriques spécifiques. Ce matériau sacrificiel permet le transfert adéquat d'éléments architecturaux à un matériau d'échafaudage naturel. Le prototype se compose d'un échafaudage de collagène 3D avec 4 et 3 canaux mm que des reprESENT une architecture ramifiée. Ce document met l'accent sur l'utilisation de cette technique de biofabrication pour la production de produits d'assemblage physiques. Ce protocole utilise un logiciel assistée par ordinateur (CAO) pour fabriquer un moule solide qui sera injecté avec du caoutchouc réaction de BSA, suivi par la digestion enzymatique de la gomme, en laissant ses caractéristiques architecturales au sein du matériau d'échafaudage.

Introduction

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Dans le domaine de l'ingénierie tissulaire de la capacité de fabriquer des échafaudages tissulaires est essentiel. Un échafaudage pour tissu approprié présente une structure 3D, est composée de matériaux biocompatibles, et imite l'architecture tissulaire in vivo afin de faciliter la croissance et le remodelage cellulaire et tissulaire. Cet échafaudage doit permettre le transport des nutriments et l'élimination des déchets 1-4. L'un des principaux obstacles à la production de ces échafaudages est la capacité de récapituler les caractéristiques géométriques spécifiques dans un matériau biocompatible. Plusieurs techniques de Biofabrication ont été rapportés pour contrôler les caractéristiques géométriques de ces échafaudages, des exemples sont électrofilage 5-8, solvant sous pression 9, 10 stéréolithographie, et l'impression 3D-11, entre autres. Ces techniques ne répondent pas à fournir un transfert relativement facile de caractéristiques architecturales internes et externes contrôlables, sont coûteux, sont limités par leur résolution et l'imprimabilité ( 12.

Dans de nombreux systèmes de fabrication commerciale, la création de vides internes, des canaux et des caractéristiques est obtenue en utilisant du sable ou d'autres matériaux amovibles ou sacrificiels appropriés. La pièce métallique ou en matière plastique est formée autour du moule en sable, et une fois qu'elle est solidifiée, le sable est éliminé. De la même manière, la prochaine génération de biomatériaux a besoin de l'équivalent biosable. Par conséquent, le caoutchouc BSA a été développé comme un substitut à biosable. Le caoutchouc est un matériau BSA nouvelle formule qui consiste en l'albumine de sérum bovin réticulé avec du glutaraldéhyde. Le but ultime est de recréer les caractéristiques architecturales spécifiques dans un échafaudage de collagène biodégradable. Les caractéristiques du biorubber sacrificielle qui maintient fidélité dimensionnelle avec le moule d'origine du tissu sont décrits.

vivo dans des tissus et d'autres caractéristiques du tissu d'intérêt.

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Protocol

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1. Déterminer le pourcentage de solides dans le Lot collagène

  1. Extraire le collagène suivant une procédure déjà publié 13. Décongeler un minimum de 20 ml de collagène. Déterminer le pourcentage de matière sèche initiale de collagène dans le lot dans le but de manipuler la concentration de collagène dans les hydrogels formés.
    1. Couper trois morceaux de feuille d'aluminium (environ 6 x 6 cm) et la forme de chacun comme une casserole en utilisant le fond d'un bêcher de 25 ml. Noter le poids de chaque moule.
    2. Ajouter une petite quantité de collagène pour chaque moule et noter le poids total de la casserole d'aluminium et de collagène. Ajouter 0,5 à 0,8 g de collagène sur chaque pan de l'aluminium.
      Remarque: Après cette étape, il y a trois casseroles de feuille d'aluminium et chacun devrait avoir une petite quantité de collagène. Assurez-vous d'enregistrer le poids de chaque (total 3) en aluminium casserole vide et le poids de la casserole après l'addition de collagène.
    3. Calculer le poids du collagène dans chaque moule à l'aide du fuite à la formule:
      poids de collagène = Pan et le poids de collagène - poids Pan
    4. Placer trois des cuvettes en aluminium qui contiennent du collagène à l'étuve à 100 ° C pendant 24 heures.
    5. Après 24 heures, enregistrer le poids de chaque pan de l'aluminium et le collagène déshydraté.
    6. Calculer le poids du collagène déshydraté en utilisant l'équation suivante:
      Déshydraté poids de collagène = Pan et le poids de collagène déshydraté - poids Pan
    7. Calculer le pourcentage de solides pour les trois échantillons pour déterminer la concentration en matières solides de collagène en utilisant la formule ci-dessous:
      Equation 2
    8. Calculer la teneur en matières solides de collagène moyenne du lot en utilisant le pourcentage de matières solides de collagène pour chacun des trois échantillons.
      Remarque: Le collagène qui sera utilisé est ce qui reste du collagène hydraté. Aucune de ces collagène déshydraté est utilisé.
    9. Après avoir déterminé le pourcentage de collagène solide (ipréside d'abord la concentration de collagène) de la charge, continuer à utiliser le collagène hydraté restant. En utilisant un pH-mètre étalonné pour ajuster le pH du mélange de collagène à 3.
      1. Ajouter de petites quantités (2-5 pi à la fois) de 12 N d'acide chlorhydrique (HCl). Garder sur la glace en tout temps. Ne pas ajouter l'acide chlorhydrique directement au collagène - ajouter l'acide à la paroi du tube. Après addition de l'acide, en utilisant la spatule pour pousser l'acide au collagène et le mélange est agité rapidement.
    10. Une fois qu'il atteint un pH de 3, que le collagène asseoir O / N à 4 ° C.

2. Préparation de la BSA en caoutchouc

  1. Préparer la solution de sérum-albumine bovine (BSA) en suivant la procédure ci-dessous.
    1. Préparer la solution 2x tampon phosphate salin (PBS). Ajouter deux comprimés PBS à 100 ml d'eau pour faire 0,02 M solution PBS.
    2. Combiner avec 2x PBS BSA pour créer une solution de BSA à 30% en utilisant la procédure ci-dessous.
      1. Par exemple, pour effectuer une BSA de 30% par 30 ml de 2x PBS, en utilisant 12,9 g de BSA. Ajouter 1/3 de la 2x PBS (par exemple, 10 ml) dans un ballon avec une barre d'agitation. Ajouter 1/2 de la BSA (par exemple, BSA 6,45 g) dans le ballon et à l'aide d'une spatule, mouillant le soluté sec.
      2. Répéter ce procédé consistant à ajouter du PBS puis BSA jusqu'à ce que le soluté et le solvant est contenu dans le ballon. Utilisez la spatule pour mouiller tout le soluté. Il ressemble à un mélange d'un peu de liquide et de bouquets. Laisser reposer pendant environ 30 min.
      3. Ensuite, tourner l'agitateur sur un cycle bas et assurez-vous qu'il n'y a pas touffes autour de la barre d'agitation. Il devrait prendre 90 minutes pour arriver tout en solution ou il peut être laissé sous agitation O / N à 4 ° C. Après tout le soluté est dissous, placer la solution dans une seringue de 20 ml et coiffée d'un filtre à seringue de 0,20 um. Appuyez sur le piston pour expulser le liquide à travers le filtre et de recueillir la solution stérilisée dans un nouveau tube. Conserver à 4 ° C.
    3. Préparer 3% soluti de glutaraldéhydepar dilution de la solution de glutaraldéhyde à 25% à une filtration stérile PBS 2x. Par exemple, pour 10 ml de solution de glutaraldéhyde à 3%, en utilisant 2 ml de glutaraldéhyde à 25% et 8 ml de 2x PBS. Conserver à 4 ° C.

3. Traitement Moules

Remarque: Le prototype décrit dans ce document utilise un acier inoxydable Y pièce moulée sur mesure. Le moule contient une entrée et deux canaux d'écoulement de 4 mm et 3, respectivement. Tout d'abord, moules propres, les pulvériser avec du saindoux insaturé, et les stériliser. Préparer les moules suivant le mode opératoire décrit ci-dessous.

  1. Nettoyer les moules en acier inoxydable à l'aide de sonication à une fréquence de 35 kHz. Placer les moules dans l'appareil à ultrasons et les submerger avec de l'eau et de la glace. Gardez les moules à froid en tout temps pendant l'appareil à ultrasons est en marche. Exécutez le sonicateur pendant 2 périodes de 90 min.
    1. Après chaque période, utilisez une aiguille pour faire en sorte qu'il n'y a pas matière dans le luer lock acier inoxydable ou bconnecteur rass. Utilisez de l'eau et du savon pour nettoyer toute la surface des deux côtés des moules. Vérifiez qu'il n'y a pas d'obstruction dans les canaux.
  2. Placer le moule, les vis et le connecteur de verrouillage Luer dans un sac d'autoclave et on.
  3. Remplir la bouteille qui se fixe à un mi-chemin de pulvérisateur à air avec du saindoux disponible dans le commerce (acide gras libération de l'agent mixte). Remplacer le bouchon d'une bouteille de plafonnement régulière. Placez-le dans un sac en autoclave et elle.
    Remarque: Lard est utilisé pour faciliter la libération de la matière qui sera la réaction injecté plus tard (en caoutchouc BSA). Ne pas placer le couvercle pulvérisateur de la bouteille dans le un autoclave, il peut endommager le joint interne.
  4. Faire chauffer le saindoux pendant 45 secondes ou jusqu'à ce que son clair et liquide dans un micro-ondes. Vissez le couvercle du pulvérisateur d'air à la bouteille de saindoux. Branchez le couvercle avec le pulvérisateur. Attelez le pulvérisateur à la source d'air à la table de laboratoire. Ouvrez la vanne d'air, et d'ouvrir la buse du pulvérisateur jusqu'à ce qu'il commence mouillage de la surfaced'une serviette en papier.
  5. Pulvériser le saindoux perpendiculaire à la surface du moule jusqu'à ce que la surface est entièrement couverte. Après chaque morceau a été pulvérisé, les placer dans une boîte de Pétri et la scelle. Placer les moules à 4 ° C pendant 2 heures.
  6. Procéder à stériliser les moules en exposant la surface à la lumière UV pendant 30 minutes. Placez-les revenir à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être injecté réaction.

4. Reaction Injection de la BSA en caoutchouc

Remarque: Tous les matériaux et les solutions doivent être garder froid jusqu'au moment de servir pour éviter un durcissement prématuré du caoutchouc BSA dans les prochaines étapes.

  1. Préparer le distributeur pour fournir le caoutchouc BSA aux moules suivant ces étapes.
    1. Stériliser tous les composants de mélange (deux O de bagues, capuchon de la seringue, double seringue, pointe mélanger, et 4: 1 distributeur) en les exposant à la lumière UV pendant 30 min dans le capot de réaction en chaîne par polymérase (PCR).
      Remarque: Une hotte PCR a été utilisé parce que tsa procédure implique fixateurs. Ces produits ne peuvent être utilisés dans la cellule / tissu culture capot en raison du risque d'exposition et la toxicité pour les cellules. Toute autre capot qui contient une lumière UV sera adapté.
    2. Placez le capuchon sur le support de la solution.
    3. Effectuer le mélange et l'injection à un ratio de 4: 1 de BSA: Glutaraldéhyde. Ajouter 30% de BSA à la chambre de double seringue qui offrira la plus grande quantité de solution (Il faudra environ 4 ml à remplir). Assurez-vous de laisser suffisamment d'espace pour placer le joint torique afin d'éviter la contamination débordante et de la chambre adjacente.
    4. Ajouter une solution de glutaraldéhyde à 3% à l'autre chambre (il faudra environ 1 ml à remplir). Assurez-vous de laisser suffisamment d'espace pour placer le joint torique pour empêcher la contamination débordante et de la chambre adjacente.
    5. Placez la double seringue sur le distributeur. Inclinez l'ensemble verticalement de sorte que le capuchon de la seringue est sur le dessus. Remplacer le bouchon avec l'embout mélangeur.
    6. Caroline du SudRew les deux parties de moule en acier inoxydable ensemble.
    7. Placez l'ensemble à l'intérieur d'un sac en autoclave.
    8. Pour enlever l'air dans le distributeur, le maintenir en position verticale et rapidement appuyez sur la poignée d'un temps de libérer une petite quantité de la BSA mélangé avec le glutaraldéhyde. Ensuite, fixez rapidement Luer le connecteur de verrouillage de l'acier inoxydable Y moule à la pointe de la seringue.
    9. Tenez le moule inoxydable acier Y avec la main gauche et le mélange distributeur BSA-glutaraldéhyde sur la droite. Alternate couvrant chacun des gaz d'échappement à gauche et à droite des canaux d'écoulement en appuyant sur les gaz d'échappement sur les côtés du sac en autoclave pour assurer que les vides à l'intérieur sont remplis de solution. Ensuite, placez les moules horizontalement et injecter à nouveau.
    10. Détachez les moules de distributeur et placer dans un plat de 25 mm de Pétri.
    11. Parafilm placer autour de la boîte de Petri pour prévenir la déshydratation du caoutchouc.
    12. Placez le moule dans le 4 ° C réfrigérateur O / N.

Remarque: Le collagène doit être conservé dans la glace en tout temps au cours du processus.

  1. Modifier la concentration de collagène en utilisant le pourcentage de matières solides de collagène.
    1. Faire 10 ml de 1,75% de collagène en ajustant la concentration initiale de collagène avec de l'eau froide.
    2. En utilisant un pH-mètre étalonné, ajuster le pH à 3 en utilisant 12 de l'acide chlorhydrique. Ne pas ajouter l'acide chlorhydrique directement au collagène ajouter l'acide à la paroi du tube. Après addition de l'acide, utiliser la spatule pour pousser l'acide dans le collagène et rapidement agiter le mélange.
    3. Peser 4 g de collagène dans un tube conique séparée.
    4. Centrifuger le collagène pour éliminer l'air à 4 ° C et 9343 g pendant 20-30 min.
    5. UV stériliser la hotte de culture cellulaire pendant 30 minutes, et à 14 pi de laminine à 4 ml du collagène. Cela se traduira par une concentration en laminine finale de 10 ug / ul. Remarque: La laminine fournit sintégrité STRUCTURELS, l'adhésion et la promotion de diverses réponses cellulaires.
    6. Allumer la lumière UV PCR pendant 20-30 min avant d'utiliser le capot pour la stérilisation.
    7. Placez le capuchon de verrouillage Luer, à joindre à une seringue de 20 ml, dans de l'éthanol pour une heure 2. Ensuite, laisser sécher et le placer dans la lumière UV.
    8. Gamma irradier le collagène 8,6 min pour atteindre 1200 cGy.
      Remarque: La durée dépendra de la désintégration de la source de césium. Ajuster le temps pour atteindre le même dosage.

6.Casting collagène sur BSA Caoutchouc

  1. Pour polymériser le collagène, utiliser un 8: 1: 1 (collagène: HEPES: MEM). La procédure suivante est basée sur une première 4 g de collagène acidifié (de l'étape 5.1.8).
    1. Faire une solution 0,2 N HEPES dans l'eau et ajuster le pH à 9 en ajoutant de petites quantités (1-5 pi) de 1-5 M d'hydroxyde de sodium (NaOH). En utilisant un pH-mètre étalonné, contrôler le pH de la solution après chaque addition. Conserver à 4 ° C ou keep sur la glace.
    2. Allumez la lumière UV de la culture de tissus hotte pendant 20-30 min pour stériliser le capot.
    3. forceps autoclave, spatule, et un scalpel pour la stérilisation.
    4. Mélanger 1,5 ml de 0,2 N HEPES (pH 9) et 1,5 ml de MEM 10x en utilisant la hotte de culture tissulaire. Assurez-vous de garder sur la glace et vortex pour 5 sec avant de l'utiliser. Conserver à 4 ° C ou garder sur la glace.
    5. Pour stériliser le capot PCR, allumer la lumière UV pendant 30 min.
    6. Placer une plaque à 12 puits et une seringue de 20 ml à -20 ° C pendant 10 min, ou jusqu'à ce que prêt à continuer. Remarque: Conservez tous les matériaux à froid jusqu'au moment de servir. L'augmentation de la température provoque la fibrillogénèse du collagène prématurée.
    7. Pulvériser tous les tubes et les plaques à puits qui vont être dans le capot avec 70% d'éthanol et les laisser sécher pour la stérilisation. Placer une seringue de 20 ml sur de la glace pour refroidir pour une utilisation ultérieure.
    8. Dans la hotte PCR, ouvrir les moules en acier inoxydable pour libérer le caoutchouc de BSA et de l'aide d'un scalpel, couper les canaux d'échappement de la BSA rmoule ubber.
    9. Sous le capot PCR, ouvrir les tubes de collagène stériles et ajouter 1 ml de la solution HEPES-MEM (faire en sorte que, avant d'extraire la solution HEPES-MEM, qu'il est bien mélangé et il n'y a pas de dépôts solides).
    10. Aide de la spatule stérile, bien mélanger la solution de collagène et de tampon.
    11. Fermer et vortex rapidement pour assurer un hydrogel bien mélangé.
    12. Transférer dans un froid seringue de 20 ml.
    13. D'une main, maintenez la BSA caoutchouc à l'intérieur du puits et, en utilisant l'autre, passer la moitié de la solution de collagène d'hydrogel sur le fond du puits.
    14. À l'aide des pinces stériles, veiller à ce que les extrémités d'amenée et d'évacuation de caoutchouc sont en contact avec les parois du puits.
    15. Verser la solution de collagène sur le dessus de la gomme jusqu'à ce que soit complètement recouverte.
    16. Assurez-vous que le caoutchouc BSA est suspendu dans le collagène et qu'il n'y a pas de bulles, en particulier à proximité des extrémités du caoutchouc.
    17. Placez le couvercle et envelopper autour du Parafilmcirconférence du puits.
    18. Mettez dans l'incubateur pendant 1 heure à 37 ° C. Garder la lumière UV PCR sur.
  2. Après la polymérisation du collagène, UV réticuler l'hydrogel via la procédure suivante.
    Remarque: La réticulation du collagène est réalisée en utilisant un appareil de réticulation UV, dans lequel la quantité d'énergie peut être contrôlée.
    1. Allumez l'agent de réticulation UV et d'utiliser le réglage de l'énergie pour irradier la chambre vide avec 630.000 pJ / cm 2.
    2. Retirez les gels de l'incubateur.
    3. Pulvériser sur les mains avec de l'éthanol, et, à l'intérieur de la chambre, enlever le couvercle le plus rapidement possible.
    4. Fermer la chambre et UV réticulation des hydrogels en sélectionnant le réglage de l'énergie et l'irradiation 630.000 pJ / cm 2.
    5. Après le cycle de réticulation, éteindre la lumière UV sur le capot PCR
    6. Pulvériser sur les mains avec de l'éthanol et d'ouvrir la chambre, placer rapidement le couvercle sur la plaque bien. Déplacer la plaque de puitsau capot PCR.
    7. Aide de la spatule stérile, desserrer légèrement et retirer le gel du puits. Retourner les gels sous le capot pour réticuler le fond de l'hydrogel. Répétez l'étape 6.2.3 et 6.2.4.

7. Enzyme de digestion de la BSA en caoutchouc

  1. Afin d'avoir un échafaudage de collagène creux, retirez BSA caoutchouc d'une manière qui ne porte pas atteinte aux dimensions incorporés dans l'hydrogel. La procédure est décrite ci-dessous.
    1. Allumer la lumière UV pendant 20 à 30 mn pour stériliser la hotte de culture tissulaire.
    2. Assurez 0,25% solution de trypsine à pH 7,8. Par exemple, pour 15 ml d'eau, ajouter 0,0376 g de trypsine dans un tube conique de 50 ml. Ajuster le pH à 7,8 en ajoutant de petites quantités (2-5 ul) de 1 M de NaCl. Placer la solution dans une seringue de 20 ml et coiffée d'un filtre à seringue de 0,20 um. Appuyez sur le piston pour expulser le liquide à travers le filtre et de recueillir la solution stérile dans un nouveau tube.
    3. Allumez le bain d'eau et de régler la température à 30° C.
    4. Après 30 minutes, éteindre la lumière UV. Pulvériser l'éthanol sur l'ensemble des tubes et des matériaux qui seront utilisés dans la hotte.
    5. Transférer l'hydrogel de collagène sous le capot et le lieu dans le tube conique séparée.
    6. Ajouter environ 3-5 ml (juste assez pour couvrir les gels) de solution de trypsine à 0,25% avec un pH de 7,8 à chaque tube.
    7. Sceller les tubes avec du parafilm et vortex légèrement pendant environ 1 min.
    8. Place dans le bain d'eau à 30 ° C pendant 15-24 h. Tandis que dans le bain d'eau, vortex légèrement les gels fréquemment jusqu'à ce que le caoutchouc a été digéré BSA ou retirée de l'hydrogel.
      Remarque: Afin de déterminer si le caoutchouc BSA a été supprimé, soit le caoutchouc est flottant dans la solution de trypsine ou il y a des pièces en panne. Il doit y avoir pas de zones sombres visuels au sein de l'hydrogel.
  2. Faire en sorte que tout le caoutchouc de BSA et de la trypsine ont été retirés des hydrogels, rinçage comme décrit ci-dessous.
    1. Allumez le hoo PCRd lumière UV pendant 20-30 min.
    2. Préparer la solution Mosconas. Combiner du chlorure de potassium (KCl, 28,6 mM), (NaHCO 3, 11,9 mM), du glucose (9,4 mM) et (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) dans l'eau. Ajuster le pH à 7,4 avec du NaOH ou une solution d'HCl 12 M. Placer la solution dans une seringue de 20 ml et en utilisant un filtre à seringue de 0,20 pm pour stériliser la solution.
    3. tout avec de l'éthanol pulvériser avant de les placer sur le capot et laisser l'éthanol à sécher.
    4. Ouvrir le tube et transférer 5-10 ml de solution stérile Mosconas à un nouveau 50 ml tube conique.
    5. Transférer l'hydrogel de collagène dans le tube conique contenant la solution d'enzyme. Assurez-vous que l'hydrogel est entièrement recouvert de la solution. Laisser le tube dans le shaker dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 30 min.
    6. Aspirer la solution Mosconas et répétez l'étape 7.2.5 deux fois.
    7. Conserver à 4 ° C.

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Representative Results

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Les résultats montrent que cette technique de biofabrication est efficace pour générer des échafaudages 3D qui peuvent imiter l'arrangement spatial vu dans les tissus in vivo. Les caractéristiques architecturales sont des paramètres essentiels pour l'application de l'ingénierie tissulaire, qui jouent un rôle crucial dans l'interaction in vivo de cellules et la fonctionnalité du tissu.

La consistance et la miscibilité du caoutchouc BSA est un paramètre important dans la production d'un caoutchouc BSA qui est homogène et est capable de conserver sa forme prévue. La solubilité des protéines est déterminée par les effets intermoléculaires telles que l'interaction protéine-protéine, et l'interaction avec le solvant, ce qui induit des changements sur le comportement global de la protéine. La conductivité de la solution de SAB a été mesurée, ce qui est une indication de la concentration en sel des solutions. Le tableau 1 indique la Combinations de BSA, le solvant et le glutaraldéhyde tester. Comme prévu, les échantillons qui avaient la plus haute conductivité (2x solvants PBS) ont facilité la solubilité de la BSA.

Un autre paramètre utilisé pour déterminer l'état approprié pour le développement de ce matériau sacrificiel est la vitesse de réaction. Le temps de réaction de la BSA diminue lorsque la concentration de glutaraldéhyde augmenté, comme prévu. Le fixateur réagit avec les groupes alpha-amino des acides aminés, le groupe amino N-terminal des peptides, et le groupe sulfhydryle de la cystéine. Le glutaraldéhyde réagit principalement avec la BSA par l'intermédiaire des groupes amino de la lysine pour former des liaisons covalentes intermoléculaires (figure 1A) 14. Après une période d'incubation, les échantillons ont montré un changement de couleur du jaune pâle au brun et jaune foncé, ce qui augmente en intensité avec l'augmentation de la concentration de glutaraldéhyde (figure 1B). Les 20%, 30%, uned 40% de BSA à 2% de glutaraldéhyde dans l'eau ne forme pas un caoutchouc. La solution de BSA à 40%, en raison de sa viscosité élevée et le fixateur hautement réactif, a donné lieu à intensité variable le long du caoutchouc. Ce comportement peut être dû à la difficulté de la glutaraldéhyde en pénétrant dans les chaînes de protéines de façon homogène. Le solvant fortement influencé la solubilité de la protéine ainsi que sa réaction avec le fixateur. Les solutions 2x PBS étaient facilement miscibles. La solution BSA avec de l'eau était difficile à mélanger. BSA solubilité est fortement influencée par la conductivité du solvant (voir le tableau 2), ce qui provoque des changements conformationnels dans la protéine. Les échantillons les plus prometteurs ont été les BSA à 3% de glutaraldéhyde dans PBS 1x et 2x PBS 30%.

Faire en sorte que le caoutchouc est en mesure de forces de charge subies, un essai de compression a été effectuée. Les propriétés mécaniques des quatre échantillons de caoutchouc de BSA ont été mesurées: 30% de BSA 3% de glutaraldéhyde dans2x PBS, 30% de BSA 3% de glutaraldéhyde dans du PBS 1X, 20% de BSA 3% de glutaraldéhyde dans du PBS 2x et 20% de BSA 2% de glutaraldéhyde dans du PBS 1x. Les ondes sinusoïdales ont montré une très faible variation de phase entre les courbes de charge et de déplacement (Supplément figure 2) qui sont transférés aux contraintes et déformations des courbes (Supplément figure 3). Sur la base des courbes de contrainte et de déformation, les trois premiers échantillons présentaient une hystérésis entre le chargement et le déchargement (Figure 2A-2C). Ces trois échantillons se sont comportés comme un matériau viscoélastique qui contient des propriétés élastiques et visqueuses lorsque les forces sont appliquées. Le BSA 2% de glutaraldéhyde 20% ont montré des signes de déformation permanente (figure 2D). La BSA 3% de glutaraldéhyde à 30% dans du PBS 1x et 2x PBS a montré un comportement similaire (figure 2E -one chargement et de déchargement cycle). Le module d'élasticité a été déterminée à partir de la partie linéaire de ces quatre échantillons (Figure 2F). La concentration du phosphatesolvant a augmenté de manière significative le module d'élasticité à l'intervalle testé (p = 0,03). La BSA 2% de glutaraldéhyde à 20% dans du PBS 1x déforme facilement, présentant un module d'élasticité inférieur.

Pour évaluer la digestion enzymatique de la gomme, la vitesse de réaction a été calculé sur la disparition du caoutchouc BSA lorsqu'il est placé en contact avec l'enzyme au point de temps spécifique. Le procédé de digestion enzymatique a été traité comme un réacteur à fonctionnement discontinu. Une comparaison entre la concentration en caoutchouc de départ avant le traitement et le caoutchouc gauche après avoir été lyophilisée a été faite afin d'obtenir la cinétique de la digestion. La figure 3 montre la vitesse de réaction pour chaque échantillon par rapport à la concentration de glutaraldéhyde et de la BSA, du solvant, et le temps de séjour. Une tendance claire n'a été observée entre les concentrations de réticulation et la vitesse de dissociation de l'entité de réaction. L'analyse statistique a été effectuée à chaque point de temps. pour ee 15 h point de temps, la concentration de glutaraldéhyde affectée de manière significative la vitesse de réaction résultant dans une valeur p de 0,02 (Supplément tableau 4). Après ce point de temps, à la fois le glutaraldéhyde et la concentration de BSA affectés de manière significative le taux (Supplément Tableau 5-7). Le facteur le plus influent était dans l'ensemble de la concentration en glutaraldéhyde, indiquée par une valeur de p plus importante. L'augmentation de la concentration en glutaraldéhyde a diminué le taux de digestion de l'entité de caoutchouc de réaction.

La quantité de protéine dissoute par la trypsine a été déterminée en utilisant un dosage BCA (figure 4). Une tendance commune a été observée: plus la concentration du fixateur, le plus de protéines a été digéré à partir du caoutchouc de BSA. La trypsine a interagi avec l'échantillon de caoutchouc en clivant la BSA et les liaisons covalentes formées nouvellement créées par le glutaraldéhyde, pour ainsi dissoudre la structure globale plustemps. Il semble que le PBS 1x il y a plus de protéine solubilisée à un point dans le temps plus tôt par rapport à l'2x PBS. Au fil du temps, il y a une augmentation des protéines en solution à 15 h, ce qui a continué à augmenter jusqu'à 48 heures, puis il a diminué. Cela pourrait être dû à la trypsine cliver les protéines en permanence et, par conséquent, la création de petits peptides et des acides aminés. Il peut également être attribuée à des limites de l'analyse, qui ne peut lire peptides qui sont composées de trois ou plusieurs acides aminés. L'analyse statistique a montré que la concentration en BSA et le glutaraldéhyde affecté de manière significative la libération de la protéine à partir du caoutchouc de BSA (p <0,05). Une augmentation de la concentration de BSA a provoqué une augmentation de la protéine dans le surnageant, tandis qu'une augmentation dans le glutaraldéhyde a provoqué une diminution de la protéine dissoute.

Pour mesurer la dissociation de ce matériau sacrificiel, le caoutchouc a été pesé (base humide) avant de le placer dans contact à la trypsine. L'équivalent en poids sec du caoutchouc placé dans la solution de digestion enzymatique a été déterminée en utilisant les valeurs indiquées dans le Supplément Figure 1. La solution d'enzyme a réagi avec le caoutchouc de BSA, et par conséquent, solubilisé la protéine. La gomme restante après le traitement a été lyophilisé O / N et pesé. La figure 5 montre que le solvant a influencé la dissociation du caoutchouc. A la même concentration de BSA et le glutaraldéhyde, les caoutchoucs 2x PBS solvants retenus plus de leur matériau par rapport à la PBS 1x.

Trois pièces moulées solides ont été fabriqués: Boucle Mold (Supplément figure 4A), de stabilité Piece (Supplément figure 4B), et Y Mold (figure 6A, à gauche). Le Y pièce de moule en acier inoxydable a été créée à l'aide de la machine Microlution (figure 6A, à droite). Ce moule a été la réaction injecté avec 30% de BSA et 3% glutaraldehyde en 2x PBS (figure 6B, à gauche). Le caoutchouc a été laissé à réagir O / N à 4 ° C. Le caoutchouc a été coulé au collagène (figure 6B, centre), puis digéré enzyme (figure 6B, à droite). Les données préliminaires suggèrent que, à un pH de 7,8 et une température de 30 ° C pendant 15 heures, le caoutchouc BSA peut être digéré avec un impact minimal sur l'échafaud de collagène. Après 15 h, le caoutchouc est affaiblie par l'enzyme et assez qu'elle laisse les chaînes, sans affecter les caractéristiques géométriques du collagène lâche. Un échafaudage de collagène 3D a été créé qui a des caractéristiques géométriques particulières. La figure 6B (à droite) montre une chaîne de 4 mm de diamètre intérieur d'un hydrogel de collagène après digestion enzymatique de la gomme de BSA. Le canal a été mesurée avec un pied à coulisse pour s'assurer que la dimension initiale a été maintenue. En effet, le nouveau canal dans l'hydrogel de collagène était de 4 mm. Les moules en caoutchouc BSA peuvent contenir des dimensions aussi petites que 300 um, ce qui nous a été testément le moule de stabilité (figure 7). Ces échafaudages ont été testés pour le glutaraldéhyde résiduel et nous avons trouvé aucun résidu après les lavages Mosconas.

Figure 1
Figure 1. BSA réaction caoutchouc. (A) de caoutchouc de BSA. Le glutaraldéhyde réticule le BSA en créant des liaisons covalentes. (B) BSA caoutchouc. Différentes concentrations de BSA, les concentrations de glutaraldéhyde, et le type de solvant ont été coulés sur des plaques à 24 puits et on fait réagir O / N à 4 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. courbes de traction de caoutchoucs BSA. Courbes de traction de BSA ru bbers. (A) 30% de BSA 3% de glutaraldéhyde dans du PBS 2x; (B) 30% de BSA 3% de glutaraldéhyde dans du PBS 1x; (C) 20% de BSA 3% de glutaraldéhyde dans du PBS 2x; et (D) 20% de BSA 2% de glutaraldéhyde dans du PBS 1x (3 cycles). Les courbes montrent des caoutchoucs AC qui ont une certaine hysteris, mais reviennent à leur forme originale. L'échantillon D représente un caoutchouc ayant un module d'élasticité très faible qui se déforme aisément en permanence pendant les processus de chargement et de déchargement. Échantillon A et B ont montré un comportement très semblable à celui observé avec l'un cycle de chargement et de déchargement sur le graphe E (représentant un cycle de chaque échantillon). L'élasticité a été influencée par la concentration du fixateur et du solvant utilisé (F). Les échantillons ont montré une augmentation significative du module avec une augmentation de sels (** p <0,05). Une concentration plus élevée fixateur a provoqué une augmentation significative de l'élasticité des caoutchoucs BSA (* p <0,05).Arget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. La vitesse de réaction de la désintégration du caoutchouc BSA. Comme le fixateur augmente, la vitesse de réaction diminue pour tous les échantillons dans 1 x PBS (A), 2x PBS (B), et de l'eau (C). La BSA 2% de glutaraldéhyde à 40% dans du PBS 2x montre une des vitesses de réaction plus élevées. Cela est dû à la difficulté rencontrée dans la fabrication de la protéine BSA homogène. (bleu: 20% de BSA, violet: 30% de BSA, et rouge: 40% de BSA). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Protéine quantifi cation après digestion par enzyme. Comme le fixateur augmente, la protéine dissoute à partir des caoutchoucs diminue pour tous les échantillons dans 1 x PBS (A), 2x PBS (B), et de l'eau (C). (bleu: 20% de BSA, violet: 30% de BSA, et rouge: 40% de BSA). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. digestion caoutchouc. Nous avons déterminé la quantité de caoutchouc digéré en comparant le départ et à la fin des produits de base sèche. Nous avons obtenu le moins de la digestion de l'échantillon de glutaraldéhyde à 6% et au plus 30% de BSA 2% de glutaraldéhyde dans PBS 1x le. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 6
Figure 6. prototype ramifiée. (A) de la représentation de la branche vasculaire. Illustré sur la gauche est le solide créé en Mastercam qui a été converti en code G et fabriqué en utilisant la Microlution 363-S comme on le voit sur la droite. La pièce de moule en acier inoxydable représente un canal d'entrée 4 mm avec deux canaux d'écoulement-3mm. Échafaudage de collagène (B) 3D. Apparaît à gauche est le caoutchouc de BSA faite en utilisant le moule ci-dessus. Le centre montre le caoutchouc intégré dans l'hydrogel de collagène. Figurant à droite sont les canaux gauche au sein de l'échafaudage de collagène après le caoutchouc a été digéré enzyme. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
Figure 7. BSA canal. Un canal 300 um de BSA a été retiré du moule à la pièce de stabilité. Il y a une fine couche d'agent de démoulage autour du canal. La zone supplémentaire se distingue clairement sous un microscope et peut être facilement enlevé. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

BSA (%) Glutaraldéhyde (%)
20 2
20 3
20 6
30 2
30 3
30 6
40 2
40 3
6

. Tableau 1. Paramètres de caoutchouc BSA BSA et fixateur ont été mélangés à un rapport de 4: 1 en utilisant trois solvants différents.

Échantillon Conductivité (mS / cm) pH
BSA (%) Solvant
30 2x PBS 11,43 7.06
30 PBS 1x 6.35 7,05
30 DI 2.39 6,76
20 2x PBS 13.00 6,92
20 PBS 1x 8.67 7,09
20 DI 2.08

Tableau 2. La conductivité et le pH des échantillons de BSA. La conductivité et le pH des solutions de BSA a été mesurée en présence de différents solvants. Une augmentation de la conductivité est disponible entre 1x et 2x de PBS.

6
BSA (%) Glutaraldéhyde (%) Solvant observations
20 2 PBS 1x matériau déformable souple, facile
20 3 PBS 1x Douce mais plus solide que le glutaraldéhyde à 2%
20 6 PBS 1x Raide, un peu fragile
30 2 PBS 1x bonne consistance
30 3 PBS 1x bonne consistance
30 6 PBS 1x Fragile
40 2 PBS 1x Très incompatibles dans la création d'un gel / consistance caoutchouteuse
40 3 PBS 1x La consistance varie le long de l'échantillon
40 6 1x PBS Fragile
20 2 2x PBS Un matériau souple et déformable facile, mais plus solide que l'échantillon 1x PBS
20 3 2x PBS Doux, mais plus rigide que le 2%
20 6 2x PBS bonne consistance
30 2 2x PBS Bonne consistance, plus studry qu'avec PBS 1x
30 3 2x PBS Bonne consistance, plus studry qu'avec PBS 1x
30 2x PBS Bonne miscibilité mais britle
40 2 2x PBS La consistance varie le long de l'échantillon
40 3 2x PBS La consistance varie le long de l'échantillon
40 6 2x PBS La consistance varie le long de l'échantillon et il est fragile
20 2 Eau Ne forment pas un matériau de gel / caoutchouc
20 3 Eau Formé un gel, mais semble plus rigide que til PBS 1x et 2x PBS, incompatibles
20 6 Eau Formé un gel, mais semble plus rigide que le PBS 1x et 2x PBS, incompatibles
30 2 Eau Ne forment pas un matériau de gel / caoutchouc
30 3 Eau Formé un gel, mais semble plus rigide que le PBS 1x et 2x PBS, incompatibles
30 6 Eau Formé un gel, mais semble plus rigide que le PBS 1x et 2x PBS, incompatibles
40 2 Eau N'a pas former un gel / caoutchouc material
40 3 Eau La consistance varie le long de l'échantillon - rigide sur le dessus
40 6 Eau La consistance varie le long de l'échantillon - rigide sur le dessus

Tableau 3. caoutchouc BSA. Après le caoutchouc BSA réagi O / N, un trou biopsie poinçon de 8 mm de l'échantillon a été prélevé. Ce tableau contient des observations visuelles de la consistance et l'aspect des échantillons.

Figure 1 supplémentaire
Supplément Figure 1. pourcentage de solide. Le pourcentage de solides de chaque caoutchouc a été déterminé (poids sec / poids humide). Le solvant n'a pas affecté les pourcentage de matières solides (p> 0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 2 supplémentaire
Supplément Figure 2. sinusoïdal de 30% de BSA 3% de glutaraldéhyde 2x PBS. La charge de compression et le déplacement de l'échantillon sont présentées en fonction de la durée écoulée. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3
Supplément Figure 3. sinusoïdal de 30% de BSA 3% de glutaraldéhyde 2x PBS. Le stress et la fatigue de l'échantillon ont été calculés et tracés en fonction du temps écoulé. Il y a un petit décalage de phase, indicative du comportement viscoélastique du caoutchouc. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 4
Supplément Figure 4. solides Mastercam. (A) Loop et (B) la stabilité des pièces. Après la conception de ceux-ci en utilisant Mastercam, le code G a été importé et une pièce en acier inoxydable ou en laiton en utilisant la machine Microlution ou un morceau PLA utilisant le Makerbot 3D Replicator. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Limites min max
-17 3
Déplacement (mm) -1.5 0,3
Vague Niveau 1 Niveau 2 Fréquence (Hz) Cycle
Sinus -15 -3 1 5000
L'acquisition des données
temps de balayage 1.008
points de balayage 360
Nombre de balayages </ Td> 5
Après numérisation 1.008 sec entre scan

Supplément Tableau 1. paramètres de test de compression. L'utilisation d'une onde sinusoïdale, la relation entre la charge et le déplacement a été déterminée pour les quatre types de caoutchouc. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Résultats d'analyse de variance
df SS MME F importance F
Régression 3 9.85E + 02 3.28E + 02 4.70E + 02 1.06E-18
Résiduel 20 1.40E + 01 6.99E-01
Total 23 9.99E + 02
Analyse de régression
coefficients Erreur standard t Stat P-valeur
Intercepter 1.74E + 00 8.23E-01 2.12E + 00 4.70E-02
BSA (%) 7.82E-01 2.09E-02 3.74E + 01 5.49E-20
Glutaraldéhyde (%) 3.17E-01 </ Td> 1.03E-01 3.09E + 00 5.71E-03
Solvant 2.61E + 01 2.22E + 01 1.18E + 00 2.53E-01

Supplément Tableau 2. L'analyse statistique du pourcentage de matières solides dans le caoutchouc de BSA. Le BSA et le glutaraldéhyde affectées de manière significative le pourcentage de matières solides. Le solvant n'a pas influencé le pourcentage de matières solides. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Résultats d'analyse de variance
df SS MME F importance F
Régression 3 3.06E + 05 1.02E + 05 1.18E + 01 4.00E-03
Résiduel 7 6.07E + 04 8.67E + 03
Total dix 3.67E + 05
Analyse de régression
coefficients Erreur standard t Stat P-valeur
Intercepter 6.50E + 02 4.25E + 01 1.53E + 01 1,23e-06
BSA (%) 4.67E + 00 3.80E + 01 1.23E-01 9.06E-01
Solvant 1.02E + 02 3.80E + 01 2.67E + 00 3.20E-02
Glutaraldéhyde (%) 1.16E + 02 5.70E + 01 2.03E + 00 8.21E-02

Supplément Tableau 3. L'analyse statistique du module d'élasticité en rapport avec la concentration du PBS. La concentration du PBS affectée de manière significative le module d'élasticité. L'augmentation de sels dans le solvant a provoqué une augmentation du module d'élasticité. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

ANOVA Résultat
df SS MME F importance F
Régression 3 6.15E-15 2.05e-15 3.68E + 00 1.67E-02
Résiduel 60 3.34E-14 5.57E-16
Total 63 3.96E-14
Analyse de régression
coefficients Erreur standard t Stat P-valeur
Intercepter 3.74E-08 1.37E-08 2.74E + 00 8.03E-03
BSA (%) 3.89E-10 3.62E-10 1.07E + 00 2.88E-01
Glutaraldéhyde (%) -5.92E-09 1.83E-09 -3.23E + 00 2.02E-03
Solvant -6.78E-08 3.76E-07 -1.80E-01 8.58E-01

Supplément Tableau 4. L'analyse statistique de la vitesse de réaction après 15 heures de digestion enzymatique. La concentration de glutaraldéhyde affectée de manière significative le taux de la digestion du caoutchouc en diminuant à des concentrations plus élevées de glutaraldéhyde de réaction. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

P-valeur
Résultats d'analyse de variance
df SS MME F importance F
Régression 3 7.36E-15 2.45E-15 3.62E + 01 1.21E-13
Résiduel 62 4.20E-15 6.78E-17
Total 65 1.16E-14
Analyse de régression
coefficients Erreur standard t Stat
Intercepter 2.98E-08 4.77E-09 6.25E + 00 4.22E-08
BSA (%) 4.56E-10 1.26E-10 3.62E + 00 6.03E-04
Glutaraldéhyde (%) -6.04E-09 6.15E-10 -9.82E + 00 3.00E-14
Solvant -6.57E-08 1.31E-07 -5.02E-01 6.17E-01

Supplément Tableau 5. Analyse statistique de la vitesse de réaction, après 24 heures de digestion enzymatique. La concentration en BSA et le glutaraldéhyde affecté de manière significative la vitesse de digestion de la gomme de réaction. A des concentrations plus élevées de glutaraldéhyde, il y a une diminution de la til la vitesse de réaction. A des concentrations plus élevées de BSA, il y a une augmentation de la vitesse de réaction. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Résultats d'analyse de variance
df SS MME F importance F
Régression 3 3.10e-15 1.03E-15 2.74E + 01 1.64e-11
Résiduel 64 2.42E-15 3.78E-17
Total 67 5.52E-15
Analyse de régression
coefficients Erreur standard t Stat P-valeur
Intercepter 2.17E-08 3.50E-09 6.20E + 00 4.55E-08
BSA (%) 2.13E-10 9.20E-11 2,31E + 00 2.39E-02
Glutaraldéhyde (%) -3.94E-09 4.53E-10 -8.70E + 00 1.90E-12
Solvant 3.04E-08 9.57E-08 3.18E-01 7.51E-01

supplément Table6. L'analyse statistique de la vitesse de réaction après 48 heures de digestion enzymatique. La concentration de BSA et le glutaraldéhyde affecté de manière significative la vitesse de digestion de la gomme de réaction. A des concentrations de glutaraldéhyde plus élevés, il y a une diminution de la vitesse de réaction. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Résultats d'analyse de variance
df SS MME F importance F
Régression 3 2.19E-15 7.29E-16 3.05E + 01 3.56E-12
Résiduel 61 1.46E-15 2.39E-17
Total 64 3.64E-15
Analyse de régression
coefficients Erreur standard t Stat P-valeur
Intercepter 1.05E-08 2.84E-09 3.69E + 00 4.80E-04
BSA (%) 3.61E-10 7.48E-11 4.83E + 00 9.48E-06
Glutaraldéhyde (%) -3.07E-09 3.69E-10 -8.33E + 00 1.21E-11
Alorslvent 3.97E-08 7.80E-08 5.09E-01 6.12E-01

Supplément Tableau 7. Analyse statistique de la vitesse de réaction, après 72 heures de digestion enzymatique. La concentration en BSA et le glutaraldéhyde affecté de manière significative la vitesse de digestion de la gomme de réaction. A des concentrations plus élevées de glutaraldéhyde, il y a une diminution de la vitesse de réaction. A des concentrations plus élevées de BSA, il y a une augmentation de la vitesse de réaction. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

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Biofabrication est un domaine hautement multidisciplinaire dans laquelle les principes de la biologie et de l'ingénierie fusionnent pour générer des matériaux complexes qui imitent tissu natif. Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de développer des techniques qui utilisent les informations recueillies à partir de tissus in vivo et le traduire en un échafaudage in vitro. De cette manière, une plate-forme peut être modifiée génétiquement qui ressemble étroitement les propriétés architecturales, fonctionnelles et mécaniques du tissu in vivo. Le matériau d'échafaudage optimale doit posséder certaines propriétés, comme étant biocompatible, imitent les propriétés mécaniques du tissu d'intérêt, soit capable de dégradation contrôlée, en mesure de soutenir la viabilité des cellules, et capable de permettre le remodelage des tissus 2,3.

Une multitude de techniques de fabrication ont été développés pour produire viables constructions tridimensionnelles. Ces technologies se répartissent en deux grandes catégories: d'un classiqued avancé. Les techniques classiques comprennent l'utilisation de matériaux synthétiques et naturels traditionnels pour fabriquer des structures poreuses. Quelques exemples sont solvant sous pression, la lyophilisation, et le moulage par fusion. Les inconvénients de ces techniques comprennent un mauvais contrôle de la porosité dans la structure (taille des pores et pores interconnectivité) et la difficulté à faire des canaux internes dans les échafaudages. Techniques avancées incluent la stéréolithographie, le moulage, l'impression 3D, et électrofilage, entre autres 1. Ces techniques présentent des inconvénients tels que le manque de canaux de microarchitecture à long terme, la sélection des matériaux pour assurer une résistance mécanique optimale tout en étant capable de distribuer à travers des buses de petit diamètre, l'optimisation dépendant du matériau, nécessiter une post-traitement qui peuvent être toxiques, et restriction dans la conception des architectures internes dans une construction in vitro. Un inconvénient majeur de l'impression 3D représente la disponibilité des biomatériaux qui sont supports de cellules adéquates, Tout en ayant les propriétés mécaniques requises pour maintenir une organisation architecturale défini 12. La technologie présentée ici intègre à la fois des techniques de fabrication conventionnelles et avancées. Le meilleur des deux mondes est dérivé de la convergence de fabrication assistée par ordinateur pour créer, ou à l'importation, l'architecture souhaitée avec le développement d'un caoutchouc enzyme labile. Les moules en acier inoxydable ont été créés à l'aide d'une fraiseuse, mais leur fabrication ne sont pas limités à cette technique. Utilisation d'une imprimante 3D (par exemple, Makerbot), les mêmes moules ont été fabriqués à partir d'acide polylactique (PLA). Les moules négatifs ont été broyés en utilisant des directives architecturales conçues par le programme de CAO, qui fournit des moules solides qui créent un transfert facile et fiable de fonctionnalités pour tous les matériaux. Cette technologie est importante en ce qu'elle permet non seulement le contrôle de la composition des tissus externes, mais aussi de l'architecture interne très complexe. Le travail présenté icise concentre principalement sur la caractérisation de la gomme de BSA, qui peut être mélangé de manière homogène, est facile à digérer dans un laps de temps raisonnable, est résistante à des altérations de la structure, et est capable d'imiter les caractéristiques minute, tout en maintenant sa stabilité au cours du processus de coulée . La limitation de cette technique a été testée et la résolution du matériau sacrificiel peut conserver des dimensions aussi petites que 300 um de diamètre. Cependant, la figure 7 montre que le canal est entouré par une mince couche d'agent de démoulage. En utilisant un microscope, cette zone supplémentaire se distingue clairement et peut être enlevé pour avoir la dimension souhaitée. Cette technique permet de biofabrication la replication d'une large variété de structures internes qui vont de macro à micro-échelle.

albumine sérique est la protéine la plus abondante dans le système circulatoire. Etant donné que les protéines sont des polyélectrolytes, la solubilité a été déterminée par des interactions électrostatiques 15-17. Il a été démontré que de faibles concentrations de sels, il y a un effet de relargage de la protéine facilitant sa solubilité 18. Le glutaraldéhyde est un agent de réticulation qui provoque des changements dans les propriétés de l'albumine. Le changement de couleur montré sur la figure 1 est attribuée à la formation des liaisons aldimine 19-21. Le glutaraldéhyde réagit principalement avec la BSA par l'intermédiaire des groupes amino de la lysine pour former des liaisons covalentes intermoléculaires 14. Les données indiquent que l'augmentation de sels améliore l'élasticité du caoutchouc (à partir de 1 x PBS 2x PBS). La concentration de glutaraldéhyde plus élevée produit des gels sévères que définie précédemment par rapport à celles à faible concentration. Cependant, ils sont plus difficiles à passer, mélanger de façon homogène, et ils forment des gels cassants. Pour délivrer la quantité appropriée de caoutchouc BSA dans les moules, chaque partie de l'ensemble doit être conservé au froid en raison des températures plus élevées accélèrent le glutaraldéhyde et la réaction BSA.Le revêtement idéal (30% de BSA 3% de glutaraldéhyde dans du PBS 2x ou 1x PBS) se comporte comme un matériau visco-élastique qui peut résister à une charge sans déformation permanente. Cela devient très importante lors de la manipulation et de la matière coulée autour de la structure en caoutchouc BSA.

La trypsine est une serine protease qui hydrolyse les protéines. La trypsine est une enzyme largement utilisé qui a une grande spécificité de clivage. Elle clive les chaînes peptidiques principalement au niveau du côté carboxyle des acides aminés lysine et arginine 22. BSA est facilement soluble à de faibles concentrations dans l'eau, et de la trypsine facilement digéré le caoutchouc de BSA laissant le collagène intact et relativement intacte. Le matériau ne sera pas avoir de contact avec les cellules. La construction a été testé pour la présence de glutaraldéhyde libre et il n'y avait aucune trace de ce fixateur. Ceci démontre l'efficacité de la gomme de BSA en tant que matériau sacrificiel pour biofabrication. Dans ce protocole, le collagène a été utilisé en tant que matériau d'échafaudage, mais toute otson matériau qui est résistant à la digestion par la trypsine peut être utilisé.

Les travaux à venir sera axée sur la reconstitution des composants vasculaires dans les hydrogels en ensemençant l'échafaud avec des cellules endothéliales et fibroblastes. L'un des enjeux est de créer une répartition uniforme des cellules tout au long de l'intérieur des canaux qui reproduisent la distribution 3D native. Pour résoudre ce problème, une stratégie est en cours d'élaboration qui permet l'étanchéité ou de brancher des canaux et l'injection de la suspension cellulaire. Le matériau testé est Pluronic F127, qui est un gel réversible à la chaleur, liquides à 4 ° C et un solide au-dessus de 30 ° C 23,24. Une forte concentration de pluronic a réussi à créer le joint temporelle nécessaire. Après la suspension de cellules est dans les canaux de l'échafaud, l'entité est mis en rotation pour un montant spécifique de temps jusqu'à ce que les cellules adhèrent à toutes les parties de la structure 3D. Le canal à l'intérieur aura médias adéquate pour le maintienla survie des cellules. Pluronic conserve sa forme de gel et est facilement soluble dans un environnement aqueux. Une fois que les cellules adhèrent, l'hydrogel sera inondée de support, et peut être cultivé dans des conditions stationnaires ou de débit, en fonction du but de l'étude. Cette méthode sera évaluée et deviendra le suivi de cette publication. La technique de biofabrication décrit ici est actuellement utilisé pour développer une réplique de l'échafaudage d'une artère rénale humaine. La même approche pourrait être réalisé avec d'autres types de tissus, tels que cardiaque, afin d'élargir l'applicabilité de cette technique à un large éventail d'applications cliniques.

La technique de biofabrication développée ici est un pas en avant dans la production d'échafaudages in vitro qui peut récapituler caractéristiques géométriques intrinsèques rapidement et de manière fiable. Un matériau naturel, tel que le collagène, a été choisi parce qu'il offre des indices physiques à des cellules par rapport aux matériaux synthétiques et chimique optimale. ces naturels matériaux peuvent être utilisés pour la recherche thérapeutique, comme des modèles in vitro de développement, malformation, et le tissu de la maladie, ainsi que pour le remplacement d'un tissu endommagé.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I Collagen extracted from calf hide
Hydrocloric Acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) MP Biomedical U5378 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS
Albumium from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A9647
Glutaraldehyde Sigma -Aldrich G5882 Toxic
Lard Fields 3090
Stainless Steel Molds Milled using Microlution Machine
Air Brush Kit Central Pneumatic 47791
Mixing Tip for double syringe Medmix ML2.5-16-LLM Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med
Small O ring for double syringe Medmix PPB-X05-04-02SM Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural
Double Syringe cap  Medmix VLX002-SM Cap, 4:1/10:1, PE brown, med
Big O ring for double syringe Medmix PPA-X05-04-02SM Piston A, 5 ml, 4:1
Double Syringe Medmix SDL X05-04-50M Double syringe, 5 ml, 4:1
Double Syringe Dispenser Medmix DL05-0400M Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain
Laminim 3.6 mg/ml - extracted USC lab
20 ml Syringe Luer Lock Tip BD 302830
Luer Lock Caps Fisher JGTCBLLX
HEPES Sigma -Aldrich H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) Life Technologies 1143-030
Trypsin Life Technologies 27250-018
UV Crosslinker  Spectroline UV XLE1000
Sodium Cloride (NaCl) Fisher S271-10 To prepare Mosconas
Potassium chloride (KCl) Sigma -Aldrich P5405-250 To prepare Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328-500 To prepare Mosconas
Glucose Sigma -Aldrich G-8270 To prepare Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S-7907 To prepare Mosconas
Sterile Filter for syringes Corning 431224

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References

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Trois dimensions technologie biomimétique: Roman Biorubber Crée Défini micro et macro-échelle Architectures en collagène hydrogels
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Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).More

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