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Bioengineering

Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel

doi: 10.3791/53578 Published: February 12, 2016

Abstract

ponteggi tessuti giocano un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione dei tessuti. L'impalcatura ideale deve soddisfare alcuni requisiti, come avere la composizione corretta, il modulo di mira, e le caratteristiche architettoniche ben definiti. Biomaterials che ricapitolano l'architettura intrinseca del tessuto vivo sono essenziali per lo studio delle malattie e per facilitare la rigenerazione del tessuto molle perduto e valido. Una tecnica biofabrication romanzo è stato sviluppato che combina stato di imaging arte, stampa tridimensionale (3D), e l'attività enzimatica selettiva per creare una nuova generazione di biomateriali per la ricerca e l'applicazione clinica. Il materiale sviluppato, gomma Bovine Serum Albumin, è reazione iniettato in uno stampo che sostiene specifiche caratteristiche geometriche. Questo materiale sacrificale permette l'adeguato trasferimento di caratteristiche architettoniche di un materiale impalcatura naturale. Il prototipo è costituito da un ponteggio collagene 3D con 4 e 3 canali mm che ReprESENT un'architettura ramificata. Questo documento enfatizza l'uso di questa tecnica biofabrication per la generazione di costrutti naturali. Questo protocollo utilizza un software per computer (CAD) per produrre uno stampo solido che sarà reazione iniettato con gomma BSA seguita dalla digestione enzimatica della gomma, lasciando le sue caratteristiche architettoniche all'interno del materiale scaffold.

Introduction

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Nel campo dell'ingegneria dei tessuti la capacità di fabbricare scaffold tessuto è vitale. Un ponteggio tessuto adatto ha una struttura 3D, è composto da materiali biocompatibili, e mima dell'architettura tessuto vivo per facilitare cellule e tessuti crescita e rimodellamento. Questo ponteggio deve consentire il trasporto delle sostanze nutritive e la rimozione dei rifiuti 1-4. Uno dei principali ostacoli nella produzione di questi scaffold è la capacità di ricapitolare specifiche caratteristiche geometriche in un materiale biocompatibile. Diverse tecniche biofabrication sono stati segnalati per controllare le caratteristiche geometriche di questi ponteggi, esempi sono electrospinning 5-8, solvente colata 9, stereolitografia 10, e 3D-stampa 11, tra gli altri. Queste tecniche sono inferiori nel fornire una relativamente facile trasferimento di controllabili elementi architettonici interni ed esterni, sono costosi, sono limitati dalla risoluzione e la stampabilità ( 12.

In molti sistemi di fabbricazione commerciali, la creazione di vuoti interni, canali e caratteristiche si ottiene utilizzando sabbia o altri materiali rimovibili o sacrificali adatti. La parte metallica o plastica è formata intorno allo stampo di sabbia, e una volta solidificato, la sabbia viene rimosso. Più o meno allo stesso modo, la prossima generazione di biomateriali ha bisogno della BioSand equivalente. Pertanto, la gomma BSA è stato sviluppato come un sostituto per BioSand. La gomma BSA è un materiale di nuova formulazione che consiste di albumina di siero bovino reticolata con glutaraldeide. L'obiettivo finale è quello di ricreare specifiche caratteristiche architettoniche in una impalcatura di collagene biodegradabile. Le caratteristiche del biorubber sacrificale che mantiene la fedeltà dimensionale con lo stampo del tessuto originale vengono descritti.

vivo elasticità dei tessuti e altre caratteristiche del tessuto di interesse.

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Protocol

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1. Determinare la percentuale di solidi in batch Collagene

  1. Estrarre il collagene seguito di una procedura precedentemente pubblicato 13. Scongelare un minimo di 20 ml di collagene. Determinare la percentuale iniziale di solidi collagene nel batch per manipolare la concentrazione collagene nel idrogel formati.
    1. Tagliare tre pezzi di foglio di alluminio (circa 6 x 6 cm) e la forma ciascuno come una vaschetta utilizzando il fondo di un bicchiere 25 ml. Registrare il peso di ciascun piatto.
    2. Aggiungere una piccola quantità di collagene per ogni vaschetta e registrare il peso totale della vaschetta di alluminio e collagene. Aggiungere 0,5 - 0,8 g di collagene su ogni vaschetta di alluminio.
      Nota: Dopo questo passo, ci sono tre vaschette foglio di alluminio e ognuno dovrebbero avere una piccola quantità di collagene. Assicurarsi di registrare il peso di ciascuna (totale 3) vaschetta di alluminio vuota e il peso della padella dopo l'aggiunta di collagene.
    3. Calcolare il peso del collagene in ciascuna vaschetta usando l'fopo formula:
      peso Collagene = Pan e peso collagene - peso Pan
    4. Posizionare i tre pentole in alluminio che trattengono il collagene in forno a 100 ° C per 24 ore.
    5. Dopo 24 ore, registrare il peso di ciascuna vaschetta di alluminio e il collagene disidratato.
    6. Calcolare il peso del collagene disidratato mediante la seguente equazione:
      Disidratata peso collagene = Pan e peso collagene disidratato - peso Pan
    7. Calcolare la percentuale di solido per i tre campioni per determinare la concentrazione di solidi collagene utilizzando la seguente formula:
      Equazione 2
    8. Calcolare il contenuto medio collagene solida del batch utilizzando la percentuale di solidi collagene per ciascuno dei tre campioni.
      Nota: Il collagene che verrà utilizzato è ciò che resta del collagene idratato. sarà utilizzato Nessuno di collagene disidratato.
    9. Dopo la determinazione della percentuale di collagene solido (ila concentrazione di collagene nitial) del lotto, continuare a utilizzare il collagene idratato rimanente. Utilizzare un pHmetro calibrato per regolare il pH del lotto collagene per 3.
      1. Aggiungere piccole quantità (2-5 ml per volta) di 12 N acido cloridrico (HCl). Tenere in ghiaccio in ogni momento. Non aggiungere cloridrico direttamente al collagene - aggiungere l'acido al lato del tubo. Dopo aver aggiunto l'acido, utilizzare la spatola per spingere l'acido al collagene e rapidamente mescolare.
    10. Una volta raggiunto un pH di 3, lasciate riposare il collagene O / N a 4 ° C.

2. Preparazione del BSA gomma

  1. Preparare la soluzione di albumina sierica bovina (BSA) seguendo la procedura di seguito elencati.
    1. Preparare la soluzione 2x tampone fosfato (PBS). Aggiungere due compresse PBS a 100 ml di acqua per fare 0,02 soluzione M PBS.
    2. Combinare BSA con 2x PBS per creare una soluzione di BSA 30% utilizzando la procedura di seguito elencati.
      1. Ad esempio, per effettuare una BSA 30% con 30 ml di PBS 2x, utilizzare 12,9 g di BSA. Aggiungere 1/3 del 2x PBS (ad esempio, 10 ml) in un pallone con un ancoretta. Aggiungere 1/2 della BSA (ad esempio, 6,45 g BSA) al pallone e con una spatola, bagnare il soluto secca.
      2. Ripetere questo processo di aggiunta di PBS e BSA finché tutto il soluto e solvente è nel pallone. Utilizzare la spatola per bagnare tutto il soluto. Si sarà simile a una miscela di un liquido e grumi. Lasciate riposare per circa 30 minuti.
      3. Quindi, accendere l'agitatore su un ciclo basso e fare in modo che non ci siano grumi di tutto il ancoretta. Si dovrebbero prendere 90 minuti per ottenere tutto in soluzione o può essere lasciata mescolando O / N a 4 ° C. Dopo il soluto è tutto dissolto, porre la soluzione in una siringa da 20 ml e ricoperto con un filtro a siringa 0.20 micron. Premere il pistone per espellere liquido attraverso il filtro e raccogliere la soluzione sterilizzata in una nuova provetta. Conservare a 4 ° C.
    3. Preparare 3% soluti glutaraldeideil diluendo soluzione di glutaraldeide al 25% con sterile filtrata 2x PBS. Ad esempio, per 10 ml di soluzione di glutaraldeide al 3%, usare 2 ml di 25% glutaraldeide e 8 ml di PBS 2x. Conservare a 4 ° C.

3. Trattamento Stampi

Nota: Il prototipo descritto in questo articolo utilizza un acciaio inox Y pezzo stampo su misura. Lo stampo contiene un afflusso e due canali di deflusso di 4 e 3 mm, rispettivamente. In primo luogo, stampi puliti, spruzzarli con lo strutto insaturi, e sterilizzare. Preparare gli stampi seguendo la procedura descritta di seguito.

  1. Pulire stampi in acciaio inox con sonicatore ad una frequenza di 35 kHz. Mettere gli stampi nel sonicatore e sommergere con acqua e ghiaccio. Mantenere gli stampi a freddo in ogni momento durante il sonicatore è in funzione. Eseguire il sonicatore per 2 periodi di 90 min.
    1. Dopo ogni periodo, utilizzare un ago per assicurarsi che non vi sia materiale nel Luer Lock acciaio inossidabile o bConnettore Rass. Usare acqua e sapone per pulire l'intera superficie dei due lati degli stampi. Verificare che non vi siano ostruzioni nei canali.
  2. Posizionare la stampi, viti, e connettore Luer lock in un sacchetto autoclave e si.
  3. Riempire la bottiglia che si attacca a un a metà strada spruzzatore d'aria con lardo disponibile in commercio (misto distaccante di acidi grassi). Sostituire il tappo con una bottiglia tappo normale. Mettere in un sacchetto di autoclave e metterla in esso.
    Nota: lardo viene utilizzato per facilitare il rilascio del materiale che sarà reazione iniettato successivamente (gomma BSA). Non posizionare il coperchio della bottiglia spruzzatore in autoclave- può danneggiare la tenuta interna.
  4. Riscaldare il lardo per 45 secondi o fino a quando il suo chiaro e liquido in un forno a microonde. Avvitare il coperchio spruzzatore d'aria alla bottiglia lardo. Collegare il coperchio con lo spruzzatore. Collegare lo spruzzatore alla fonte di aria al banco di laboratorio. Aprire la valvola dell'aria, e aprire l'ugello dello spruzzatore fino a quando non inizia a bagnare la superficiedi un tovagliolo di carta.
  5. Spray lardo perpendicolare alla superficie dello stampo fino a quando la superficie è completamente coperta. Dopo che ogni pezzo è stato spruzzato, metterli in una capsula di Petri e sigillarla. Posizionare gli stampi a 4 ° C per 2 ore.
  6. Procedere per sterilizzare gli stampi esponendo la superficie di luce UV per 30 min. Riposizionarle a 4 ° C fino a quando non sono pronti per essere iniettato reazione.

4. Reazione iniezione della gomma BSA

Nota: Tutti i materiali e le soluzioni devono essere tenere freddo fino al momento dell'uso per impedire l'impostazione prematura della gomma BSA nei passaggi successivi.

  1. Preparare il dispenser per la distribuzione la gomma BSA agli stampi di seguito questi passaggi.
    1. Sterilizzare tutti i componenti di miscelazione (due O ring, cap siringa, doppia siringa, miscelare punta e 4: 1 dispenser) esponendoli a luce UV per 30 minuti nella cappa reazione a catena della polimerasi (PCR).
      Nota: Una cappa PCR è stata utilizzata perché tla procedura prevede fissativi. Questi prodotti chimici non possono essere utilizzati nel cofano coltura cellulare / tissutale a causa del rischio di esposizione e tossicità per le cellule. Qualsiasi altra cappa che contiene una luce UV sarà adatto.
    2. Posizionare il cappuccio punta sul supporto soluzione.
    3. Eseguire la miscelazione e l'iniezione in un rapporto di 4: 1 di BSA: glutaraldeide. Aggiungere la BSA 30% alla camera doppia siringa, che consegnerà la più alta quantità di soluzione (Ci vorranno circa 4 ml per riempire). Assicurarsi di lasciare sufficiente spazio per posizionare l'O-ring, al fine di prevenire la contaminazione traboccante e della camera adiacente.
    4. Aggiungere la soluzione di glutaraldeide al 3% per l'altra camera (ci vorranno circa 1 ml per riempire). Assicurarsi di lasciare sufficiente spazio per posizionare l'O-ring per prevenire la contaminazione traboccante e della camera adiacente.
    5. Posizionare la doppia siringa sul dispenser. Inclinare il gruppo verticalmente in modo che il tappo della siringa è in cima. Sostituire il tappo con la punta di miscelazione.
    6. ScRew i due pezzi dello stampo in acciaio inox insieme.
    7. Posizionare il gruppo all'interno di un sacchetto di autoclave.
    8. Per rimuovere eventuale aria nel distributore, tenerlo in posizione verticale e rapidamente stringere il manico una volta per rilasciare una piccola quantità di BSA mescolato con la glutaraldeide. Poi rapidamente collegare il connettore Luer lock di acciaio inox Y dello stampo per la punta della siringa.
    9. Tenere stampo in acciaio inox Y con la mano sinistra e l'erogatore miscela di BSA-glutaraldeide sulla destra. copre Alternate ciascuno di scarico sinistro e destro dei canali di deflusso premendo scarico ai lati della borsa autoclave per assicurarsi che i vuoti all'interno sono pieni di soluzione. Poi, posizionare gli stampi in orizzontale e iniettare di nuovo.
    10. Staccare gli stampi dal distributore e mettere in un piatto 25 millimetri Petri.
    11. Posizionare Parafilm intorno alla piastra di Petri per prevenire la disidratazione della gomma.
    12. Mettere lo stampo in 4 ° C frigo O / N.

Nota: Il collagene deve essere tenuta in ghiaccio in ogni momento durante il processo.

  1. Modificare la concentrazione di collagene utilizzando la percentuale di solidi di collagene.
    1. Rendere 10 ml di 1,75% collagene, regolando la concentrazione di collagene iniziale con acqua fredda.
    2. Utilizzando un pHmetro calibrato, regolare il pH a 3 con 12 N di acido cloridrico. Non aggiungere cloridrico direttamente al collagen- aggiungere acido al lato del tubo. Dopo aver aggiunto l'acido, utilizzare la spatola per spingere l'acido in collagene e rapidamente mescolare.
    3. Pesare 4 g di collagene in una provetta conica separata.
    4. Centrifugare il collagene per rimuovere aria a 4 ° C e 9.343 xg per 20-30 min.
    5. UV sterilizzare la cappa di coltura cellulare per 30 min, e aggiungere 14 ml di laminina al collagene 4 ml. Questo si tradurrà in una concentrazione laminina finale di 10 mg / mL. Nota: Laminina fornisce sintegrità STRUTTURALI, adesione, e promuove varie risposte cellulari.
    6. Ruotare la PCR UV luce accesa per 20-30 minuti prima di utilizzare il cappuccio per la sterilizzazione.
    7. Posizionare il tappo Luer lock, per collegare ad una siringa da 20 ml, in etanolo per 2 ore. Poi, lasciare asciugare e mettere in luce UV.
    8. Gamma irradiare il collagene per 8.6 minuti per raggiungere 1.200 cGy.
      Nota: Il tempo dipenderà il decadimento della sorgente cesio. Regolare il tempo per raggiungere lo stesso dosaggio.

6.Casting collagene su BSA gomma

  1. Per polimerizzare il collagene, utilizzare un 8: 1 ratio: 1 (collagene: HEPES: MEM). La procedura che segue si basa su un primo 4 g di collagene acidificato (dal punto 5.1.8).
    1. Fare una soluzione 0,2 N HEPES in acqua, e regolare il pH a 9 con l'aggiunta di piccole quantità (1-5 microlitri) di M di idrossido di sodio 1-5 (NaOH). Utilizzando un pHmetro calibrato, controllare il pH della soluzione dopo ogni aggiunta. Conservare a 4 ° C o keep su ghiaccio.
    2. Accendere la luce UV della cappa coltura tissutale per 20-30 min per sterilizzare la cappa.
    3. forcipe autoclave, spatola, e bisturi per la sterilizzazione.
    4. Mescolare 1,5 ml di 0,2 N HEPES (pH 9) e 1,5 ml di MEM 10x utilizzando la cappa coltura tissutale. Assicurati di tenerlo in ghiaccio e vortex per 5 secondi prima dell'uso. Conservare a 4 ° C o tenere in ghiaccio.
    5. Per sterilizzare il cofano PCR, accendere la luce UV per 30 min.
    6. Posizionare una piastra 12 pozzetti e una siringa da 20 ml in -20 ° C per 10 minuti, o fino al momento di continuare. Nota: Conservare tutto il materiale freddo fino al momento dell'uso. L'aumento della temperatura induce prematura fibrillogenesi collagene.
    7. Spruzzare tutti i tubi e le piastre così che stanno per essere nella cappa con il 70% di etanolo e lasciare asciugare per la sterilizzazione. Posizionare una siringa da 20 ml in ghiaccio per raffreddare per un uso successivo.
    8. Nella cappa PCR, aprire gli stampi in acciaio inox per rilasciare la gomma BSA e utilizzando un bisturi, tagliare i canali di scarico del BSA rmuffa ubber.
    9. Sotto il cofano della PCR, aprire i tubi di collagene sterili e aggiungere 1 ml di soluzione HEPES-MEM (fare in modo che prima di estrarre la soluzione HEPES-MEM, che è ben amalgamato e non ci sono depositi solidi).
    10. Utilizzando la spatola sterile, mescolare bene la soluzione di collagene e di buffer.
    11. Chiudere e vortex rapidamente per garantire un idrogel ben miscelato.
    12. Trasferire in un fredda siringa da 20 ml.
    13. Con una mano, tenere il BSA gomma all'interno del pozzo e, con l'altra, dispensare metà della soluzione collagene idrogel sul fondo del pozzo.
    14. Utilizzando le pinzette sterili, in modo che le estremità di afflusso e deflusso di gomma tocchino i lati del pozzo.
    15. Versare soluzione di collagene sulla cima della gomma fino è completamente coperto.
    16. Assicurarsi che la gomma BSA è sospesa all'interno del collagene e che non vi siano bolle, soprattutto in prossimità delle estremità della gomma.
    17. Mettere il coperchio e avvolgere intorno al Parafilmcirconferenza del pozzo.
    18. Mettere in incubatrice per 1 ora a 37 ° C. Tenere la luce UV PCR su.
  2. Dopo la polimerizzazione del collagene, UV reticolare il idrogel mediante la seguente procedura.
    Nota: La reticolazione del collagene sarà effettuata utilizzando un'apparecchiatura reticolante UV in cui la quantità di energia può essere controllata.
    1. Accendere il reticolante UV e utilizzare l'impostazione energia per irradiare la camera vuota con 630.000 μJ / cm 2.
    2. Rimuovere il gel dal termostato.
    3. Spruzzare mani con etanolo, e, all'interno della camera, rimuovere il coperchio più rapidamente possibile.
    4. Chiudere la camera e UV reticolare idrogel selezionando l'impostazione di energia e irradiando 630.000 μJ / cm 2.
    5. Dopo il ciclo di reticolazione, spegnere la luce UV sul cofano PCR
    6. Spruzzare le mani con etanolo e aprire la camera, mettendo rapidamente il coperchio sulla piastra bene. Spostare la piastra benalla cappa PCR.
    7. Utilizzando la spatola sterile, allentare delicatamente e rimuovere il gel dal pozzo. Capovolgere il gel sotto il cofano per reticolare il fondo della idrogel. Ripetere il passaggio 6.2.3 e 6.2.4.

7. Digestione enzimatica della BSA in gomma

  1. Per avere un ponteggio collagene cava, rimuovere BSA gomma in modo che non influenza le dimensioni incorporati nel idrogel. La procedura è descritta di seguito.
    1. Accendere la luce UV per 20-30 minuti per sterilizzare il cofano coltura di tessuti.
    2. Fare 0,25% tripsina soluzione a pH 7.8. Ad esempio, per 15 ml di acqua, aggiungere 0,0376 g di tripsina in una provetta conica da 50 ml. Aggiustare il pH a 7,8 con l'aggiunta di piccole quantità (2-5 microlitri) di 1 M NaCl. Posizionare la soluzione in una siringa da 20 ml e ricoperto con un filtro a siringa 0.20 micron. Premere il pistone per espellere liquido attraverso il filtro e raccogliere la soluzione sterile in una nuova provetta.
    3. Accendere il bagnomaria e impostare la temperatura a 30° C.
    4. Dopo 30 minuti, spegnere la luce UV. Spruzzare etanolo su tutti i tubi e materiali che verranno utilizzati nella cappa.
    5. Trasferire l'idrogel di collagene sotto il cofano e il luogo in tubo conico separata.
    6. Aggiungere circa 3-5 ml (appena sufficiente a coprire i gel) di soluzione tripsina 0,25% con un pH di 7,8 a ciascuna provetta.
    7. Sigillare i tubi con Parafilm e vortex leggermente per circa 1 minuto.
    8. Posto nella 30 ° C bagnomaria per 15-24 ore. Mentre nel bagnomaria, leggermente vortice i gel spesso fino alla gomma BSA è stato digerito o rimosso dal idrogel.
      Nota: Per determinare se la gomma BSA è stato rimosso, sia la gomma fluttua nella soluzione tripsina o ci sono parti panne. Non ci devono essere zone scure visivi all'interno della idrogel.
  2. Per garantire che tutta la gomma BSA e tripsina è stata rimossa dai idrogel, risciacquo come descritto di seguito.
    1. Accendere il hoo PCRd luce UV per 20-30 minuti.
    2. Preparare la soluzione Mosconas. Combinare cloruro di potassio (KCl, 28,6 mM), (NaHCO 3, 11,9 mM), glucosio (9,4 mM) e (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) in acqua. Aggiustare il pH a 7,4 con 1 M NaOH o 12 soluzione M HCl. Posizionare la soluzione in una siringa da 20 ml e utilizzare un filtro a siringa da 0,20 micron per sterilizzare la soluzione.
    3. Spruzzare il tutto con etanolo prima della loro immissione sul cofano e consentire l'etanolo si asciughi.
    4. Aprire la provetta e trasferire 5-10 ml di soluzione sterile Mosconas in un tubo da 50 ml.
    5. Trasferire il idrogel collagene per tubo conico che contiene la soluzione enzimatica. Assicurarsi che l'idrogel è completamente coperto con la soluzione. Lasciare il tubo nella shaker in frigorifero a 4 ° C per 30 min.
    6. Aspirare la soluzione Mosconas e ripetere il passo 7.2.5 per due volte.
    7. Conservare a 4 ° C.

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Representative Results

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I risultati dimostrano che questa tecnica biofabrication è efficiente nel generare scaffold 3D che possono mimare la disposizione spaziale visto in vivo tessuto. Le caratteristiche architettoniche sono parametri vitali per l'applicazione ingegneria tissutale, che giocano un ruolo cruciale nell'interazione delle cellule in vivo e la funzionalità del tessuto.

La consistenza e miscibilità della gomma BSA era un parametro importante nel produrre una gomma BSA che è omogenea ed è in grado di mantenere la sua forma desiderata. La solubilità delle proteine ​​è determinata da effetti intermolecolari, quali l'interazione proteina-proteina, e l'interazione con il solvente, che induce cambiamenti nel comportamento complessivo proteine. La conducibilità della soluzione di BSA è stata misurata, che è un'indicazione della concentrazione salina delle soluzioni. Tabella 1 elenca i Combinations di BSA, solventi, e glutaraldeide testati. Come previsto, i campioni che avevano la più alta conducibilità (2x PBS solvente) facilitato la solubilità della BSA.

Un altro parametro utilizzato per determinare la condizione appropriata per lo sviluppo di questo materiale sacrificale era la velocità di reazione. Il tempo di reazione della BSA diminuito la concentrazione di glutaraldeide aumentata, come previsto. Il fissativo reagisce con i gruppi alfa-ammino degli amminoacidi, il gruppo amminico N-terminale dei peptidi, e il gruppo sulfidrilici di cisteina. La glutaraldeide reagisce principalmente con BSA attraverso i gruppi amminici della lisina per formare legami covalenti intermolecolari (Figura 1A) 14. Dopo un periodo di incubazione, i campioni hanno mostrato un cambiamento di colore da giallo chiaro a giallo scuro e marrone, aumentando in intensità con maggiore concentrazione di glutaraldeide (Figura 1B). Il 20%, 30%, und 40% BSA con 2% glutaraldeide in acqua non formano una gomma. La soluzione BSA 40%, a causa della sua elevata viscosità e fissativo altamente reattivo, determinato varia intensità lungo la gomma. Questo comportamento può essere causato dalla difficoltà della glutaraldeide a penetrare le catene proteiche omogeneo. Il solvente fortemente influenzato la solubilità della proteina così come la sua reazione con il fissativo. Le soluzioni 2x PBS erano facilmente miscelabili. La soluzione BSA con l'acqua era difficile da mescolare. BSA solubilità è fortemente influenzata dalla conducibilità del solvente (Tabella 2), causando cambiamenti conformazionali nella proteina. I campioni più promettenti erano BSA 30% 3% glutaraldeide in PBS 1x e 2x PBS.

Per garantire che la gomma è riuscito a forze di carico subite, una prova di compressione è stata eseguita. Le proprietà meccaniche dei quattro campioni di gomma BSA sono stati misurati: 30% BSA 3% glutaraldeide in2x PBS, 30% BSA 3% glutaraldeide in PBS 1x, 20% BSA 3% glutaraldeide in PBS 2x e 20% BSA 2% glutaraldeide in PBS 1x. Le onde sinusoidali hanno mostrato un piccolo cambiamento di fase tra le curve di carico e spostamento (Supplemento Figura 2) che vengono trasferite alle curve sforzo e di deformazione (Supplemento Figura 3). Sulla base delle curve di sforzo e di deformazione, le prime tre campioni hanno mostrato isteresi tra carico e scarico (Figura 2A-2C). Questi tre esemplari comportavano come materiale viscoelastico che contiene le proprietà elastiche e viscose quando sono state applicate forze. La BSA 2% di glutaraldeide al 20% ha mostrato segni di deformazione permanente (Figura 2D). La BSA 3% di glutaraldeide al 30% in PBS 1x e 2x PBS mostrato un comportamento simile (Figura 2E -one carico e scarico ciclo). Il modulo elastico è stato determinato dalla porzione lineare di questi quattro campioni (Figura 2F). La concentrazione di fosfatosolvente significativamente aumentato il modulo elastico alla gamma testata (p = 0,03). La BSA 2% glutaraldeide al 20% in PBS 1x deformato facilmente, mostrando un basso modulo elastico.

Per valutare la digestione enzimatica della gomma, la velocità di reazione è stato calcolato sulla base della scomparsa della gomma BSA quando posto a contatto con l'enzima al dato momento. Il processo di digestione enzimatica è stata trattata come un reattore batch. Un confronto tra la concentrazione di gomma iniziare prima del trattamento e la gomma sinistra dopo essere liofilizzato è stato fatto per ottenere la cinetica di digestione. La Figura 3 mostra la velocità di reazione per ciascun campione in funzione della concentrazione di glutaraldeide e BSA, solvente e il tempo di permanenza. Una chiara tendenza è stata osservata tra le concentrazioni reticolante e la velocità di reazione di dissociazione del soggetto. L'analisi statistica è stata effettuata in ogni punto. per esimoe punto di tempo di 15 ore, la concentrazione di glutaraldeide significativamente influenzato la velocità di reazione risultante in un valore di p 0,02 (Supplement Tabella 4). Dopo questo punto di tempo, sia la glutaraldeide e la concentrazione BSA significativamente influenzato la velocità (supplemento Tabella 5-7). Il fattore più influente generale era la concentrazione di glutaraldeide, indicato da un valore più significativo p. L'aumento della concentrazione di glutaraldeide diminuita la velocità di reazione di digestione dell'entità gomma.

La quantità di proteine ​​disciolta dalla tripsina è stata determinata usando un test BCA (Figura 4). È stata osservata una tendenza comune: più bassa è la concentrazione del fissativo, la proteina è stato digerito dalla gomma BSA. Tripsina interagito con il campione di gomma con l'adesione della BSA e legami covalenti appena creati formate dalla glutaraldeide, dissolvendo così la struttura complessiva overtempo. Sembra che il PBS 1x c'è più proteina solubilizzata in un punto temporale precedente rispetto alla 2x PBS. Nel corso del tempo, vi è un aumento di proteine ​​in soluzione al 15 hr, che ha continuato ad aumentare fino a 48 ore e poi è diminuita. Questo potrebbe essere dovuto alla tripsina fendere costantemente le proteine ​​e, quindi, la creazione piccoli peptidi e aminoacidi. Può anche essere attribuito a limitazioni del test, che può leggere solo peptidi che sono costituiti da tre o più aminoacidi. L'analisi statistica ha dimostrato che la concentrazione di BSA e glutaraldeide significativamente influenzato il rilascio della proteina dalla gomma BSA (p <0.05). Un aumento della concentrazione di BSA ha provocato un aumento della proteina nel supernatante, mentre un aumento in glutaraldeide causato una diminuzione di proteine ​​disciolto.

Per misurare la dissociazione di questo materiale sacrificale, la gomma è stata pesata (umido) prima di inserirlo nella contact con la tripsina. L'equivalente di peso secco della gomma poste nella soluzione di digestione enzimatica è stata determinata utilizzando i valori indicati nella Supplemento Figura 1. La soluzione enzimatica ha reagito con la gomma BSA, e quindi, solubilizzati proteina. La gomma rimanente dopo il trattamento è stato liofilizzato O / N e pesato. La Figura 5 mostra che il solvente influenzato la dissociazione della gomma. Alla stessa concentrazione di BSA e glutaraldeide, gomme solvente 2x PBS mantenuto più del loro materiale rispetto al PBS 1x.

Tre pezzi di stampo solidi sono stati fabbricati: Loop Mold (supplemento figura 4A), Stabilità pezzo (supplemento figura 4B), e Y stampo (figura 6A, a sinistra). Il pezzo muffa Y in acciaio inox è stata creata usando la macchina Microlution (Figura 6A, a destra). Questo stampo è stato iniettato con reazione 30% BSA e 3% glutaraldeHyde a 2x PBS (Figura 6B, a sinistra). La gomma è stato permesso di reagire O / N a 4 ° C. La gomma è stato casted con il collagene (Figura 6B, al centro) e poi enzima digerito (Figura 6B, a destra). Dati preliminari suggeriscono che a pH 7,8 ed una temperatura di 30 ° C per 15 h, la gomma BSA può essere digerito con un impatto minimo sulla scaffold di collagene. Dopo 15 ore, la gomma è indebolita dall'enzima e abbastanza che lascia i canali senza influenzare le caratteristiche geometriche del collagene sciolti. Un'impalcatura di collagene 3D è stato creato, che ha specifiche caratteristiche geometriche. Figura 6B (a destra) mostra un canale 4 mm di diametro all'interno di un idrogel di collagene dopo la digestione enzimatica della gomma BSA. Il canale è stato misurato con un calibro per assicurare che la dimensione originale è stata mantenuta. Infatti, il nuovo canale nella idrogel collagene era di 4 mm. Gli stampi in gomma BSA può contenere dimensioni piccoli come 300 micron, che ci è stato testatoing stampo stabilità (Figura 7). Queste impalcature sono stati testati per la glutaraldeide residue e abbiamo trovato nessun residuo dopo i lavaggi Mosconas.

Figura 1
Figura 1. BSA reazione in gomma. (A) in gomma BSA. La glutaraldeide reticola BSA con la creazione di legami covalenti. (B) BSA gomma. Diverse concentrazioni di BSA, le concentrazioni di glutaraldeide, e tipo di solvente sono stati colate su piastre da 24 pozzetti e hanno reagito O / N a 4 ° C. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. curve sforzo-deformazione di gomme BSA. Curve sforzo-deformazione di BSA ru bbers. (A) 30% BSA 3% glutaraldeide in PBS 2x; (B) 30% BSA 3% glutaraldeide in PBS 1x; (C) 20% BSA 3% glutaraldeide in PBS 2x; e (D) 20% BSA 2% glutaraldeide in PBS 1x (3 cicli). Le curve mostrano AC gomme che hanno qualche isteresi, ma tornano alla loro forma originale. Esempio D mostra una gomma con un basso modulo elastico che deforma facilmente permanentemente durante le operazioni di carico e scarico. Esempio A e B hanno mostrato un comportamento molto simile come visto in un ciclo di carico e scarico sul grafico E (rappresentativo di un ciclo di ciascun campione). L'elasticità è stata influenzata dalla concentrazione del fissativo e il solvente impiegato (F). I campioni mostravano una notevole aumento del modulo con un incremento di sali (** p <0.05). Una concentrazione più elevata fissativo causato un significativo aumento della elasticità delle gomme BSA (* p <0,05).Arget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Velocità di reazione della disintegrazione della gomma BSA. All'aumentare fissativi, la velocità di reazione diminuisce per tutti i campioni in 1x PBS (A), 2x PBS (B), e acqua (C). La BSA 2% glutaraldeide 40% 2x PBS mostra uno dei più alti tassi di reazione. Ciò è dovuto alla difficoltà incontrate nel rendere la proteina BSA omogenea. (blu: 20% di BSA, viola: il 30% di BSA e rosso: 40% BSA). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Proteine ​​quantifi cazione dopo digestione enzimatica. All'aumentare fissativi, la proteina disciolta dalle gomme diminuisce per tutti i campioni in 1x PBS (A), 2x PBS (B), e acqua (C). (blu: 20% di BSA, viola: il 30% di BSA e rosso: 40% BSA). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. gomma digestione. Abbiamo determinato la quantità di gomma digerita confrontando l'inizio e la fine dei prodotti base secca. Abbiamo ottenuto il minor numero di digestione sul campione glutaraldeide 6% e il più del 30% di BSA 2% glutaraldeide in PBS 1x. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 6
Figura 6. prototipo ramificati. (A) Rappresentazione del ramo vascolare. Indicato a sinistra è il solido creata in Mastercam che è stato convertito in codice G e fabbricato utilizzando il Microlution 363-S come si vede sulla destra. Il pezzo stampo in acciaio inox rappresenta un canale di afflusso 4 millimetri con i canali di scarico a due 3mm. Collagene impalcatura (B) 3D. Mostrato sulla sinistra è la gomma BSA effettuate utilizzando lo stampo mostrato sopra. Il centro mostra la gomma incorporato nel idrogel collagene. Mostrato a destra sono i canali di sinistra all'interno del patibolo collagene dopo la gomma è stata enzima digerito. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 7. BSA canale. Un canale 300 micron BSA è stato rimosso dallo stampo piece stabilità. Vi è un sottile strato di agente di distacco dallo stampo attorno al canale. La superficie aggiuntiva è chiaramente distinta sotto un microscopio e può essere facilmente rimosso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

BSA (%) Glutaldehyde (%)
20 2
20 3
20 6
30 2
30 3
30 6
40 2
40 3
6

. Tabella 1. Parametri di gomma BSA BSA e fissativo sono stati mescolati in un rapporto di 4: 1 utilizzando tre diversi solventi.

Campione Conducibilità (mS / cm) pH
BSA (%) Solvente
30 2x PBS 11.43 7.06
30 1x PBS 6.35 7.05
30 DI 2.39 6.76
20 2x PBS 13.00 6.92
20 1x PBS 8.67 7.09
20 DI 2.08

Tabella 2. conducibilità e pH dei campioni BSA. Le conducibilità e pH delle soluzioni BSA è stata misurata in presenza di solventi differenti. Un aumento della conducibilità è mostrato tra 2x e 1x PBS.

6
BSA (%) Glutaraldeide (%) Solvente osservazioni
20 2 1x PBS Morbido, materiale deformabile facile
20 3 1x PBS Morbido ma più robusto rispetto alla glutaraldeide 2%
20 6 1x PBS Rigida, un po 'fragili
30 2 1x PBS buona consistenza
30 3 1x PBS buona consistenza
30 6 1x PBS Fragile
40 2 1x PBS Molto incoerente nella creazione di un gel / consistenza della gomma
40 3 1x PBS La consistenza varia lungo il campione
40 6 1x PBS Fragile
20 2 2x PBS Morbido, materiale deformabile facile, ma più robusto rispetto al campione 1x PBS
20 3 2x PBS Morbido ma più rigido del 2%
20 6 2x PBS buona consistenza
30 2 2x PBS Buona consistenza, più studry che con PBS 1x
30 3 2x PBS Buona consistenza, più studry che con PBS 1x
30 2x PBS Buona miscibilità ma britle
40 2 2x PBS La consistenza varia lungo il campione
40 3 2x PBS La consistenza varia lungo il campione
40 6 2x PBS La consistenza varia lungo il campione ed era friabile
20 2 Acqua Non formare un materiale di gel / gomma
20 3 Acqua Formata un gel ma sembrano più rigido tegli PBS 1X e 2x PBS, incoerente
20 6 Acqua Formata un gel ma sembrano più rigido del PBS 1x e 2x PBS, incoerente
30 2 Acqua Non formare un materiale di gel / gomma
30 3 Acqua Formata un gel ma sembrano più rigido del PBS 1x e 2x PBS, incoerente
30 6 Acqua Formata un gel ma sembrano più rigido del PBS 1x e 2x PBS, incoerente
40 2 Acqua Non formare un gel / materi di gommaal
40 3 Acqua La consistenza varia lungo il campione - più rigido sulla parte superiore
40 6 Acqua La consistenza varia lungo il campione - più rigido sulla parte superiore

Tabella 3. gomma BSA. Dopo la gomma BSA ha reagito O / N, a 8 mm Foro biopsia pugno del campione è stata presa. Questa tabella contiene alcune osservazioni visive della consistenza e l'aspetto dei campioni.

Supplementare Figura 1
Supplemento Figura 1. percentuale di solido. La percentuale di solidi da ciascuna gomma è stata determinata (peso secco / peso umido). Il solvente non ha influenzato la Percentage di solidi (p> 0,05). Clicca qui per scaricare il file.

Supplemental Figura 2
Supplemento Figura 2. sinusoidale del 30% BSA 3% glutaraldeide 2x PBS. Il carico di compressione e lo spostamento del campione sono mostrati come funzioni del tempo trascorso. Clicca qui per scaricare questo file.

Supplemental Figura 3
Supplemento Figura 3. sinusoidale del 30% BSA 3% glutaraldeide 2x PBS. La sollecitazione e deformazione del campione sono stati calcolati e riportati in grafico in funzione del tempo trascorso. C'è un piccolo sfasamento, indicative del comportamento viscoelastico della gomma. Cliccate qui per scaricare questo file.

Supplemental Figura 4
Supplemento Figura 4. solidi Mastercam. Pezzi (A) Loop e (B) di stabilità. Dopo la progettazione di questi utilizzando Mastercam, il codice G è stato importato e un pezzo in acciaio inossidabile o in ottone di utilizzare la macchina Microlution o un pezzo PLA utilizzando il 3D Replicator Makerbot. Clicca qui per scaricare questo file.

limiti Min Max
-17 3
Spostamento (mm) -1.5 0.3
Onda Livello 1 Livello 2 Frequenza (Hz) Ciclo
seno -15 -3 1 5.000
Acquisizione dei dati
tempo di scansione 1.008
punti di scansione 360
Numero di scansioni </ Td> 5
scansione successiva 1.008 sec tra scansione

Supplemento Tabella 1. parametri di prova di compressione. Utilizzando una sinusoide, il rapporto tra il carico e lo spostamento è stato determinato per i quattro tipi di gomma. Clicca qui per scaricare questo file.

ANOVA Risultati
df SS SIGNORINA F significato F
Regressione 3 9.85E + 02 3.28E + 02 4.70E + 02 1.06E-18
Residuo 20 1.40E + 01 6.99E-01
Totale 23 9.99E + 02
Analisi di regressione
coefficienti Errore standard t Stat P-value
Intercettare 1.74E + 00 8.23E-01 2.12e + 00 4.70E-02
BSA (%) 7.82E-01 2.09E-02 3.74E + 01 5.49E-20
Glutaraldeide (%) 3.17E-01 </ Td> 1.03e-01 3.09E + 00 5.71E-03
Solvente 2.61E + 01 2.22E + 01 1.18E + 00 2.53E-01

Supplemento Tabella 2. L'analisi statistica della percentuale di solidi nella gomma BSA. La BSA e glutaraldeide influenzato significativamente la percentuale di solidi. Il solvente non ha influenzato la percentuale di solidi. Clicca qui per scaricare questo file.

ANOVA Risultati
df SS SIGNORINA F significato F
Regressione 3 3.06E + 05 1.02E + 05 1.18E + 01 4.00E-03
Residuo 7 6.07E + 04 8.67E + 03
Totale 10 3.67E + 05
Analisi di regressione
coefficienti Errore standard t Stat P-value
Intercettare 6.50E + 02 4.25E + 01 1.53E + 01 1.23E-06
BSA (%) 4.67E + 00 3.80e + 01 1.23E-01 9.06E-01
Solvente 1.02E + 02 3.80e + 01 2.67E + 00 3.20E-02
Glutaraldeide (%) 1.16E + 02 5.70E + 01 2.03E + 00 8.21E-02

Supplemento Tabella 3. Analisi statistica del modulo elastico correlata alla concentrazione PBS. La concentrazione PBS influenzato significativamente il modulo elastico. L'aumento dei sali nel solvente ha provocato un aumento del modulo elastico. Clicca qui per scaricare questo file.

ANOVA Risultato
df SS SIGNORINA F significato F
Regressione 3 6.15E-15 2.05E-15 3.68E + 00 1.67E-02
Residuo 60 3.34E-14 5.57E-16
Totale 63 3.96E-14
Analisi di regressione
coefficienti Errore standard t Stat P-value
Intercettare 3.74E-08 1.37E-08 2.74E + 00 8.03E-03
BSA (%) 3.89E-10 3.62E-10 1.07E + 00 2.88E-01
Glutaraldeide (%) -5.92E-09 1.83E-09 -3.23E + 00 2.02E-03
Solvente -6.78E-08 3.76E-07 -1.80E-01 8.58E-01

Supplemento Tabella 4. Analisi statistica della velocità di reazione dopo 15 ore di digestione enzimatica. La concentrazione di glutaraldeide influenzato in modo significativo la velocità di reazione della digestione della gomma diminuendo a concentrazioni più elevate glutaraldeide. Cliccate qui per scaricare questo file.

P-value
ANOVA Risultati
df SS SIGNORINA F significato F
Regressione 3 7.36E-15 2.45E-15 3.62E + 01 1.21E-13
Residuo 62 4.20E-15 6.78E-17
Totale 65 1.16E-14
Analisi di regressione
coefficienti Errore standard t Stat
Intercettare 2.98E-08 4.77E-09 6.25E + 00 4.22E-08
BSA (%) 4.56E-10 1.26E-10 3.62E + 00 6.03E-04
Glutaraldeide (%) -6.04E-09 6.15E-10 -9.82E + 00 3.00E-14
Solvente -6.57E-08 1.31E-07 -5.02E-01 6.17E-01

Supplemento Tabella 5. Analisi statistica della velocità di reazione dopo 24 ore di digestione enzimatica. La concentrazione di BSA e glutaraldeide significativamente influenzato la velocità di reazione di digestione della gomma. A concentrazioni più elevate glutaraldeide, vi è una diminuzione in tha velocità di reazione. A concentrazioni più elevate BSA, vi è un aumento della velocità di reazione. Si prega di cliccare qui per scaricare questo file.

ANOVA Risultati
df SS SIGNORINA F significato F
Regressione 3 3.10E-15 1.03e-15 2.74E + 01 1.64E-11
Residuo 64 2.42E-15 3.78E-17
Totale 67 5.52E-15
Analisi di regressione
coefficienti Errore standard t Stat P-value
Intercettare 2.17E-08 3.50E-09 6.20E + 00 4.55E-08
BSA (%) 2.13e-10 9.20E-11 2.31E + 00 2.39E-02
Glutaraldeide (%) -3.94E-09 4.53E-10 -8.70E + 00 1.90E-12
Solvente 3.04E-08 9.57E-08 3.18E-01 7.51E-01

Tabella Supplemento6. L'analisi statistica della velocità di reazione dopo 48 h di digestione enzimatica. La concentrazione di BSA e glutaraldeide significativamente influenzato la velocità di reazione di digestione della gomma. A concentrazioni più elevate glutaraldeide, vi è una diminuzione della velocità di reazione. Si prega di cliccare qui per scaricare questo file.

ANOVA Risultati
df SS SIGNORINA F significato F
Regressione 3 2.19E-15 7.29E-16 3.05E + 01 3.56E-12
Residuo 61 1.46E-15 2.39E-17
Totale 64 3.64E-15
Analisi di regressione
coefficienti Errore standard t Stat P-value
Intercettare 1.05E-08 2.84E-09 3.69E + 00 4.80E-04
BSA (%) 3.61E-10 7.48E-11 4.83E + 00 9.48E-06
Glutaraldeide (%) -3.07E-09 3.69E-10 -8.33E + 00 1.21E-11
Cosìlvent 3.97E-08 7.80E-08 5.09E-01 6.12E-01

Supplemento Tabella 7. L'analisi statistica della velocità di reazione dopo 72 h di digestione enzimatica. La concentrazione di BSA e glutaraldeide significativamente influenzato la velocità di reazione di digestione della gomma. A concentrazioni più elevate glutaraldeide, vi è una diminuzione della velocità di reazione. A concentrazioni più elevate BSA, vi è un aumento della velocità di reazione. Si prega di cliccare qui per scaricare questo file.

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Discussion

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Biofabrication è un settore altamente multidisciplinare in cui i principi biologia e ingegneria si fondono per generare materiali complessi che imitano il tessuto nativo. Per realizzare questo, vi è la necessità di sviluppare tecniche che utilizzano le informazioni raccolte dal tessuto in vivo e tradurlo in un scaffold in vitro. In questo modo, una piattaforma può essere progettato che ricorda da vicino le proprietà architettonici, funzionali e meccaniche del tessuto in vivo. Il materiale ottimale ponteggio deve possedere certe proprietà, come essere biocompatibile, imitano le proprietà meccaniche del tessuto di interesse, sia in grado di degradazione controllata, in grado di supportare la vitalità cellulare, e in grado di consentire rimodellamento tissutale 2,3.

Un gran numero di tecniche di fabbricazione sono stati sviluppati per generare vitali, costrutti tridimensionali. Queste tecnologie si dividono in due categorie principali: un convenzionaled avanzata. Le tecniche convenzionali includono l'utilizzo di materiali tradizionali sintetici e naturali per rendere strutture porose. Alcuni esempi sono solventi casting, liofilizzazione, e si fondono stampaggio. Gli svantaggi di queste tecniche includono uno scarso controllo di porosità all'interno della struttura (dimensione dei pori e pori interconnettività) e difficoltà a fare canali interni all'interno dei ponteggi. Tecniche avanzate includono stereolitografia, stampaggio, la stampa 3D, e electrospinning, tra gli altri 1. Queste tecniche presentano degli inconvenienti, quali la mancanza di canali microarchitettura a lungo raggio, selezione dei materiali per fornire resistenza meccanica ottimale pur essendo in grado di erogare attraverso ugelli di piccolo diametro, ottimizzazione dipende dal materiale, richiedono particolari post-elaborazione che possono essere tossici, e limitazione nella progettazione di architetture interne in un costrutto in vitro. Un importante inconveniente di stampa 3D è la disponibilità di biomateriali che sono vettori cellulari adeguateE, contemporaneamente, le proprietà meccaniche necessarie per mantenere una organizzazione architettonica definito 12. La tecnologia qui presentata incorpora entrambe le tecniche di fabbricazione convenzionali e avanzate. Il meglio dei due mondi deriva dalla convergenza di produzione automatizzata per creare, o importare, l'architettura desiderata con lo sviluppo di una gomma enzima-labile. Gli stampi in acciaio inossidabile sono stati creati utilizzando una fresatrice, ma la loro realizzazione non è limitata a questa tecnica. Utilizzo di una stampante 3D (ad esempio, Makerbot), gli stessi stampi sono stati fabbricati da acido polilattico (PLA). Gli stampi negativi sono stati fresati con le direttive architettoniche disegnate dal programma CAD, che prevede stampi solidi che creano un trasferimento semplice e affidabile di funzioni per qualsiasi materiale. Questa tecnologia è significativa in quanto permette non solo il controllo della composizione dei tessuti esterni, ma anche altamente complessa architettura interna. Il lavoro qui presentatosi concentra principalmente sulla caratterizzazione della gomma BSA, che può essere miscelato omogeneamente, è facilmente digeribile in un ragionevole lasso di tempo, sia resistente alle alterazioni nella sua struttura, ed è in grado di mimare tratti minuti, mantenendo la sua stabilità durante il processo di colata . Il limite di questa tecnica è stata testata e la risoluzione del materiale sacrificale può mantenere dimensioni piccole come 300 micron di diametro. Tuttavia, la Figura 7 mostra che il canale è circondato da un sottile strato di distaccante. Utilizzando un microscopio, questa zona supplementare è chiaramente distinta e può essere rimosso per avere la dimensione desiderata. Questa tecnica biofabrication consente la replicazione di un'ampia varietà di strutture interne che vanno dal macro al micro-scala.

albumina sierica è la proteina più abbondante nel sistema circolatorio. Poiché le proteine ​​sono polielettroliti, solubilità è stata determinata mediante interazioni elettrostatiche 15-17. È stato dimostrato che a basse concentrazioni saline, c'è una salatura-in effetto sulla proteina facilitando la sua solubilità 18. La glutaraldeide è un agente reticolante che provoca cambiamenti nelle proprietà di albumina. Il cambiamento di colore visibile in figura 1 è attribuito alla formazione di legami aldimine 19-21. La glutaraldeide reagisce principalmente con BSA attraverso i gruppi amminici della lisina per formare legami covalenti intermolecolari 14. I dati indicano che l'aumento dei sali migliorata l'elasticità della gomma (da 1x PBS a 2x PBS). La concentrazione più elevata glutaraldeide produce gel più rigide che impostate in precedenza rispetto a quelli a bassa concentrazione. Tuttavia, essi sono più difficili da erogare, miscelare omogeneamente, e formano gel fragili. Per fornire la quantità appropriata di gomma BSA negli stampi, ogni parte del gruppo deve essere mantenuto freddo perché temperature più elevate accelerano la glutaraldeide e reazione BSA.La gomma ideale (30% BSA 3% glutaraldeide in 2x PBS o PBS 1x) si comporta come un materiale viscoelastico che può sopportare caricamento senza deformazione permanente. Questo diventa molto importante durante la manipolazione e colata materiale intorno alla struttura di gomma BSA.

Tripsina è una serina proteasi che idrolizza proteine. La tripsina è un enzima ampiamente utilizzato che ha alta specificità scissione. Fende le catene peptidiche principalmente sul lato carbossilico del amminoacidi lisina e arginina 22. BSA è prontamente solubile a basse concentrazioni in acqua, e la tripsina facilmente digerito gomma BSA lasciando intatta e relativamente intatto il collagene. Il materiale non avrà alcun contatto con le cellule. Il costrutto è stato testato per la presenza di glutaraldeide libera e non vi erano tracce di questo fissativo. Ciò dimostra l'efficacia della gomma BSA come materiale sacrificale per biofabrication. In questo protocollo, il collagene è stato usato come materiale scaffold, ma qualsiasi otsuo materiale che è resistente alla digestione tripsina potrebbe essere utilizzato.

Il lavoro futuro sarà focalizzato sulla ricostituzione dei componenti vascolari nei idrogeli seminando patibolo con le cellule endoteliali e fibroblasti. Una delle sfide è quello di creare una distribuzione uniforme delle cellule in tutto l'interno dei canali che imitano la distribuzione 3D nativo. Per risolvere questo problema, una strategia è in fase di sviluppo che permette la chiusura o di collegare dei canali e l'iniezione di sospensione cellulare. Il materiale esaminato è F127 Pluronic, che è un gel termoreversibile, liquido a 4 ° C e un solido superiore ai 30 ° C 23,24. Un'elevata concentrazione di Pluronic ha avuto successo nel creare il sigillo temporale necessaria. Dopo la sospensione cellulare è all'interno dei canali del ponteggio, l'entità viene ruotata per un determinato periodo di tempo fino a quando le cellule aderiscono a tutti i lati della struttura 3D. Il canale interno avrà un adeguato supporto per il mantenimentola sopravvivenza delle cellule. Pluronic mantiene la sua forma di gel ed è facilmente solubile in ambiente acquoso. Una volta che le cellule aderiscono, l'idrogel sarà invaso da media, e può essere coltivato in condizioni stazionarie o portata, a seconda dello scopo dello studio. Questa metodologia sarà ulteriormente valutata e sarà il follow-up di questa pubblicazione. La tecnica biofabrication qui descritta è attualmente utilizzato per sviluppare una replica impalcatura di un dell'arteria renale umano. Lo stesso approccio potrebbe essere fatto con altri tipi di tessuti, come cardiaca, per ampliare l'applicabilità di questa tecnica per una vasta gamma di applicazioni cliniche.

La tecnica sviluppata biofabrication qui è un passo avanti nella generazione di ponteggi in vitro che possono ricapitolare caratteristiche geometriche intrinseche modo rapido e affidabile. Un materiale naturale, come il collagene, è stato scelto perché offre chimica ottimale e segnali fisici alle cellule oltre materiali sintetici. questi namateriali strutturali possono essere utilizzati per la ricerca terapeutica, come modelli in vitro di sviluppo, malformazioni e tessuto malattia, così come per la sostituzione del tessuto danneggiato.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I Collagen extracted from calf hide
Hydrocloric Acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) MP Biomedical U5378 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS
Albumium from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A9647
Glutaraldehyde Sigma -Aldrich G5882 Toxic
Lard Fields 3090
Stainless Steel Molds Milled using Microlution Machine
Air Brush Kit Central Pneumatic 47791
Mixing Tip for double syringe Medmix ML2.5-16-LLM Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med
Small O ring for double syringe Medmix PPB-X05-04-02SM Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural
Double Syringe cap  Medmix VLX002-SM Cap, 4:1/10:1, PE brown, med
Big O ring for double syringe Medmix PPA-X05-04-02SM Piston A, 5 ml, 4:1
Double Syringe Medmix SDL X05-04-50M Double syringe, 5 ml, 4:1
Double Syringe Dispenser Medmix DL05-0400M Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain
Laminim 3.6 mg/ml - extracted USC lab
20 ml Syringe Luer Lock Tip BD 302830
Luer Lock Caps Fisher JGTCBLLX
HEPES Sigma -Aldrich H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) Life Technologies 1143-030
Trypsin Life Technologies 27250-018
UV Crosslinker  Spectroline UV XLE1000
Sodium Cloride (NaCl) Fisher S271-10 To prepare Mosconas
Potassium chloride (KCl) Sigma -Aldrich P5405-250 To prepare Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328-500 To prepare Mosconas
Glucose Sigma -Aldrich G-8270 To prepare Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S-7907 To prepare Mosconas
Sterile Filter for syringes Corning 431224

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References

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Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel
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Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).More

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).

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