Summary
يصف بروتوكول طريقة جديدة لتفصيل الأنسجة البشرية وخلق ذاتي الطعوم الدقيقة التي، جنبا إلى جنب مع الإسفنج الكولاجين، وتؤدي إلى الحيوي المجمعات البشرية جاهزة للاستخدام في علاج آفات الجلد. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النظام يحافظ على بقاء الخلية الطعوم الدقيقة في أوقات مختلفة بعد التقسيم الميكانيكية.
Abstract
وقد وضعت عدة أساليب جديدة في مجال التكنولوجيا الحيوية للحصول على تعليق الخلوية ذاتي أثناء الجراحة، من أجل توفير العلاجات خطوة واحدة للآفات الجلدية الحادة والمزمنة. وعلاوة على ذلك، فإن إدارة الجروح الحادة المزمنة ولكن أيضا الناجم عن الصدمات النفسية، ومرض السكري والالتهابات وأسباب أخرى، لا يزال تحديا. في هذه الدراسة وصفنا طريقة جديدة لخلق ذاتي الطعوم الصغيرة من الأنسجة الجلدية للمريض واحد وتطبيقاتها السريرية. وعلاوة على ذلك، كما أجريت في المختبر توصيف البيولوجي للأنسجة الجلدية المستمدة من الجلد، والأدمة-epidermized دي (ديد) والأدمة متعددة الجهاز و / أو الجهات المانحة متعددة الأنسجة. تم تصنيف جميع الأنسجة هذا البروتوكول الجديد، مما يتيح لنا الحصول قابلة للتطبيق الطعوم الدقيقة. على وجه الخصوص، وذكرت أن هذا البروتوكول مبتكرة قادرة على إنشاء المجمعات الحيوية ألحان ذاتي الطعوم الدقيقة والإسفنج الكولاجين جاهزة ليتم تطبيقها على الآفات الجلدية. وكلينيوذكرت تطبيق كال من ذاتي المجمعات الحيوية على آفة الساق أيضا، أظهرت حدوث تحسن في كل عملية إعادة epitalization ونعومة الآفة. بالإضافة إلى ذلك، أظهر لنا في المختبر النموذج الذي بقاء الخلية بعد التقسيم الميكانيكية مع هذا النظام هو الحفاظ على مر الزمن لمدة تصل إلى سبعة (7) أيام من الثقافة. لاحظنا أيضا، من خلال تحليل التدفق الخلوي، الذي يتكون من مجموعة من الخلايا التي تم الحصول عليها من تصنيف العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية الوسيطة، التي تمارس دورا رئيسيا في عمليات تجديد الأنسجة وإصلاحها، لإمكانات التجدد العالية. وأخيرا، أثبتنا في المختبر أن هذا الإجراء يحافظ على عقم الطعوم الدقيقة عندما مثقف في أطباق أجار. وباختصار، فإننا نستنتج أن هذا النهج التجديدي الجديد يمكن أن يكون أداة واعدة بالنسبة للأطباء للحصول على في خطوة واحدة قابلة للحياة، معقمة وجاهزة للاستخدام الطعوم الدقيقة التي يمكن تطبيقها وحدها أو بالاشتراك مع معظم scaffo البيولوجية المشتركةلدس.
Introduction
في السنوات الأخيرة، وقد وضعت عدة أساليب جديدة في مجال التكنولوجيا الحيوية للحصول على تعليق الخلوية ذاتي أثناء الجراحة من أجل تقديم العلاج خطوة واحدة للآفات الجلدية الحادة والمزمنة. وعلاوة على ذلك، فإن إدارة الجروح الحادة ولكن المزمنة أساسا الناجمة عن الصدمات النفسية، ومرض السكري، والالتهابات، وغيرها من الأسباب، لا يزال تحديا. وهناك أدلة متزايدة على أن الجروح المزمنة أصبحت مشكلة صحية عالمية خطيرة، مما تسبب عبئا ماليا هائلا على أنظمة الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم 1.
لزيادة نسبة النجاح في علاج آفات الجلد، وعدم وجود تلاعب واسعة النطاق (بما في ذلك تعزيز الخلوي) والحفاظ على ظروف معقمة ضرورية، من أجل خلق تعليق الخلوية التي يمكن تطبيقها على الفور على المنطقة المتضررة من المرضى، وبالتالي تجنب تجهيز أطول في غرف الأبحاث مثل مصانع الخلية. شارعarting من خزعات الجلد الصغيرة، والطحن، الطرد المركزي وطرق الفصل أخرى (على سبيل المثال، الأنزيمية أو الميكانيكية)، كثيرا ما تستخدم للحصول على تعليق الخلوية، التي يمكن تربيتها في وسط النمو. كل من هذه الأساليب تحتاج عادة إلى فترة طويلة من التنفيذ، مشددا على هياكل الخلية، ويؤدي إلى الحد من بقاء الخلية. الجانب المهم الآخر هو الحصول على تعليق الخلوي الذاتي على استعداد لاستخدامها من قبل الأطباء، على سبيل المثال، لإصلاح المناطق المتضررة. وعلاوة على ذلك، فإنه من الثابت أيضا أن ترقيع الأنسجة ذاتي البقاء على قيد الحياة إجراءات نقل البقاء على قيد الحياة في نهاية المطاف في موقع المتلقي بمبادئ الاستقراء والتوصيل 2 و 3. وينبغي أن تكون الأنسجة الكسب غير المشروع مثالية متاحة بسهولة ويكون منخفض استضداد والجهات المانحة موقع الاعتلال 4.
على أساس هذه الأدلة، كان الهدف الأول من هذه الدراسة هو خلق ذاتي المجمعات الحيوية المناسبة لالتطبيق السريري في إصلاح الأنسجة. لهذا الغرض، ونحن تصف طريقة جديدة للحصول على ذاتي الطعوم الدقيقة بدءا من الأنسجة الجلدية التي كانت مصنفة حسب هذا البروتوكول. كما يوصف عرض القضية هنا بمثابة التطبيق السريري لذاتي الطعوم الدقيقة التي حصلت عليها هذا البروتوكول في تركيبة مع الإسفنج الكولاجين. وقد سبق وذكرت هذا النهج لتكون فعالة في تصنيف الميكانيكي للأنسجة البشرية 5 و تم استخدامه سريريا لترقيع وتجديد الأنسجة الجلدية 6،7 فضلا عن علاجات التجدد الأنسجة الضامة في جراحة الفم-الفكين 8-10 .
وبالإضافة إلى ذلك، كان الهدف الثاني من هذه الدراسة توصيف البيولوجي للأنسجة الجلدية بعد التقسيم من خلال هذا البروتوكول. لهذا الغرض، وعينات مثلي مختلفة من الأنسجة الجلدية المستمدة من منطقة جذع مختلف الأعضاء المتعددةوتمت معالجة / أو الجهات المانحة متعددة الأنسجة التالية قوانين الوطنية على حصاد ومعالجة وتوزيع الأنسجة للزرع (CNT 2013) في بنك الجلد إميليا رومانيا الإقليمي.
حالة عرض تقديمي:
وقد اعترف المريضة البالغة من العمر 35 عاما تظهر الصدمة معقدة بسبب حادث سيارة إلى وحدة العناية المركزة في مستشفى أنكونا. أظهر المريض التهاب في الساق بسبب جرح مفتوح وكسر مركب استقر مع تثبيت خارجي. تم تنفيذ اثنين التنضير جذري وعندما أصبح الجرح نظيفة بعد العلاج الضغط السلبي (العلاج VAC) والسمحاق ظهر صحية، وتطبيق البروتوكول بعد شهرين من الانتعاش. بعد التقسيم مع هذا النظام، تم استخدام الطعوم الدقيقة التي تم الحصول عليها لإنشاء المجمعات الحيوية مع اسفنجة الكولاجين التي تم زرعها في وقت لاحق من أجل تحقيق فعاليتها على إصلاح الآفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: منذ التطبيق السريري البروتوكول يتطلب استخدام الأنسجة ذاتي الجلدية للمريض، وإجراء توصيف في المختبر قبل الاستخدام السريري في الأنسجة الجلدية مثلي في بنك الجلد إميليا رومانيا الإقليمي فقا للمبادئ التوجيهية للقوانين الوطنية على التجميع و التصنيع وتوزيع الأنسجة للزرع (CNT 2013).
1. بناء السيرة الذاتية المعقدة لتطبيق السريرية
ملاحظة: يستند هذا البروتوكول سريريا على استخدام Rigeneracons (اختلال والأنسجة) وآلة Rigenera (انسجة الجهاز اختلال) (الشكل 1A). واختلال والأنسجة هو اختلال والطبي البيولوجي للأنسجة البشرية قادرة على تعطيل قطع صغيرة من الأنسجة باستخدام شبكة تقدمها شفرات سداسية الخلايا وتصفية ومكونات المصفوفة خارج الخلية مع قطع من حوالي 50 ميكرون.
- جمع skinsamples للمريض من خلال ثنائيةopsy لكمة (الشكل 1B) وتفصيلها بإضافة 1 مل من محلول ملحي لكل قطعة الحصول ذاتي-الطعوم الدقيقة 6،7،9 (أو راجع الخطوة 2.1).
- ضع 1 مل من الطعوم الدقيقة على الإسفنج الكولاجين (الشكل 1C) toform المجمعات الحيوية لاستخدامها في التطبيق السريري.
- ثقافة أخرى 1 مل من الطعوم الدقيقة على الإسفنج الكولاجين في وجود 6 مل من المتوسط DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 جو مرطب.
- بعد 3 أيام من الثقافة، وتحديد المجمعات الحيوية مع 0.3٪ امتصاص العرق لمدة 10 دقيقة في RT. صب البارافين مع موزع معين مباشرة على العينة. الحصول على شرائح مع مشراح مع سمك من 5 ميكرون وضعت مباشرة في الزجاج الشرائح.
- تزج شرائح البارافين من 5 ميكرون في كوب لتحليل النسيجي، تحتوي على 15 - 20 مل الزيلين (متوفرة تجاريا - مزيج من م-زيلين (40 - 65٪)، ف زيلين (20٪)، الزيلين (20٪ ) وETHالبنزين YL (6-20٪) وآثار التولوين والبنزين ثلاثي، الفينول، ثيوفين، البيريدين وكبريتيد الهيدروجين) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
- تزج الشرائح في خفض درجات (100٪ إلى 70٪) من الإيثانول (الإيثانول بنسبة 100٪ ل1HR، 95٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة، 80٪ من الإيثانول ل1HR، 70٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة) والماء ثم منزوع الأيونات لإزالة paraffinizing والمضادة للجفاف الفروع.
- وصمة عار على أقسام مع 1-2 مل من 1G / L Ematoxylin 1 - 2 دقيقة وبعد ذلك يشطف في الماء لإزالة أي فائض Ematoxylin.
- وصمة عار على الأبواب ل4-5 دقيقة مع يوزين Y حل الكحولية بنسبة 1٪ من تركيز مختلطة مع الايثانول 70٪ والمخفف في الماء.
- استخدام 1-2 مل من يوزين Y لكل قسم الشرائح وشطف تحت ماء الحنفية.
- تزج المقاطع في زيادة درجات من الإيثانول (راجع الخطوة 1.6)، وأخيرا، وبعد مرور في الزيلين ل1H، ساترة مع تركيب أساس mediumand مراقبة تحت المجهر في ضوء التكبير 100X (1D الشكل). </ رأ>
- باستخدام جلدي، واتخاذ الأنسجة مستقلة الجلد، وحليمي الأدمة-epidermized دي بدبي أو الأدمة الشبكية (الأدمة) على التوالي من 0.6 ملم، 1 مم أو 2 مم في السمك من منطقة جذع 4 مختلف الأعضاء المتعددة و / أو متعددة الجهات المانحة الأنسجة في نطاق 40-55 عاما، بعد قوانين وطنية حول حصاد ومعالجة وتوزيع الأنسجة للزرع (CNT 2013).
- شطف بلطف جميع العينات في 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم وضعها في طبق على شاكر المداري لمدة 5 دقائق.
- عن طريق خزعة لكمة 5 ملم، وخلق عينات التي تكون موحدة في قطر من أنسجة الجلد، ديد والأدمة وتزن كل عينات الأنسجة قبل التقسيم.
- إدراج ثمانية، ثلاثة أو أربعة نماذج موحدة للأنسجة الجلد، ديد أو الأدمة على التوالي، في اختلال والأنسجة، مضيفا 1.5 مل من محلول ملحي للتصنيف.
- أداء مختلفةأوقات تفصيل لجميع عينات الأنسجة كما هو مبين في الجدول رقم 1.
- استخدام عدد مراسل الخزعات لكمة المستمدة من عينات أنسجة سليمة والضوابط.
- بعد التقسيم الميكانيكية، ونضح محلول ملحي يحتوي على الطعوم الدقيقة ومكان منفصل كل عينة في بئر واحدة من لوحة ال 12 أيضا. تنفيذ نفس بروتوكول لالخزعات لكمة سيطرة سليمة.
- إضافة 1ml من المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) والمضادات الحيوية على كل عينة.
- تقييم بقاء الخلية على الفور. إلى كل منها يحتوي أيضا على الكسب غير المشروع الصغير (تم الحصول عليها من قبل التفصيل في وقت واحد من ثمانية، ثلاثة أو أربعة نماذج موحدة للأنسجة الجلد، ديد أو الأدمة على التوالي) إضافة 1ml من المتوسط تحتوي على 0.5 ملغ / مل من الإنتقالي العسكري (3- [4،5- dimethylthiazol-2-YL] -2،5 diphenyltetrazolium بروميد) حل واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2 / الهواء. تنفيذ نفس بروتوكول للسيطرة على حالهالكمة خزعات.
- بعد الحضانة، وإزالة كافة المتوسطة التي تحتوي على الإنتقالي العسكري وإضافة إلى كل عينة 1 مل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمدة 10 دقيقة.
- نقل كل عينة وDMSO في كفيت وقراءة في الكثافة الضوئية (OD) في 570 نانومتر باستخدام مطياف. حساب بقاء الخلية على أنها نسبة الامتصاصية في 570 نانومتر، والوزن في غرام (غرام) من الأنسجة المستخدمة قبل التقسيم. تنفيذ نفس بروتوكول لالخزعات لكمة سيطرة سليمة.
- بعد التقسيم الميكانيكية، ونضح محلول ملحي يحتوي على الكسب غير المشروع الصغير المشتقة من أنسجة الجلد، ديد والأدمة عينات من متبرع واحد.
- وضع على حدة كل عينة في بئر واحدة من لوحة 12-جيدا أو في قارورة الثقافة لاختبار سلامة الخلية والتحليل الصرفي على التوالي.
- ثقافة الصغيرة الطعوم بإضافة 1 مل (لوحة 12 أيضا) أو 5 مل (الثقافة قارورة) من المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2 / منظمة العفو الدوليةص 24 ساعة أو 7 أيام.
- تقييم بقاء الخلية بعد 24 ساعة أو 7 أيام (كرر الخطوات 2.1.8-2.1.10).
- أداء التحليل الصرفي تقييم وجود تعليق الخلية بواسطة المجهر الضوئي بعد 24 ساعة و 7 أيام الثقافة في قارورة.
- تحليل عينات من الأدمة بالفيروس إلى الوسيطة وعلامات الخلية المكونة للدم، بما في ذلك CD146، CD34 CD45 والمضادات عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية 6.
- تحت الصفحي تدفق البذور غطاء محرك السيارة كل الكسب غير المشروع الصغير (تم الحصول عليها من قبل التفصيل في وقت واحد من ثمانية، ثلاثة أو أربعة نماذج موحدة للأنسجة الجلد، ديد أو الأدمة على التوالي) ومراسل جزء صغير من كل عينة الأنسجة عدم تفصيل تماما (> 50 ميكرون في الحجم بعد عملية التقسيم) على لوحة أجار كولومبيا تحتوي على 5٪ الدم الأغنام مرق 100 ميكرولتر.
- احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام وإجراء تحليل الميكروبيولوجي في كولومبيا لوحة آغار من أجل تقييم العقم 11.
2. جمع وتبويب وتحليل في المختبر من الأنسجة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة الأولية، وكان الهدف الأول للتحقيق في قدرة ذاتي الطعوم الدقيقة الإنسان جنبا إلى جنب مع دعم البيولوجي، مثل الكولاجين، لإنتاج المجمعات الحيوية جاهزة للاستخدام. تم زرع هذه المجمعات الحيوية في المريض مع آفة الساق الناجم عن حادث سيارة (الشكل 2A)، واستكمال إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري المرتبطة إصلاح الأنسجة بعد 30 يوما (الشكل 2B) لوحظ. وعلاوة على ذلك، أظهرت السريرية متابعة جيدة الملمس والنعومة من المنطقة المتضررة بعد 5 أشهر (الشكل 2C). وبالتوازي مع التطبيق السريري، وقد أجريت في المختبر الدراسات أيضا إلى تقييم الجدوى الخلايا والأنسجة الجلدية المختلفة مثل أنسجة الجلد دائرة التنمية الاقتصادية والأدمة قبل وبعد تصنيفها حسب هذا النظام. على وجه الخصوص، مع الأخذ بعين الاعتبار سماكة مختلفة من كل نوع من الأنسجة، وعتبة الثمانية،أربعة وثلاثة الخزعات التي يمكن معالجتها في خطوة واحدة لأنسجة الجلد، ديد والأدمة، على التوالي، وقد تم تأسيسها. ثم تم تفصيل عدد أنشئت من الخزعات في أربعة أوقات مختلفة كما هو مبين في الجدول رقم 1، وفقا لخصائص البيولوجية من أجل تحديد الظروف المثلى من التفصيل للحفاظ على بقاء الخلية جيدة.
على الرغم من أن معالجة الأنسجة نفسها التي يسببها حتما وجود انخفاض في بقاء الخلية مقارنة مع أنسجة سليمة، وتفصيل الميكانيكية يؤديها مع هذا النظام يبدو للحفاظ على القيمة المتوسطة للبقاء الخلية من 30٪ في جميع عينات من الجلد، والأدمة ديد تقييم في أوقات مختلفة (الشكل 3A)، فيما يتعلق أنسجة سليمة (الشكل 3B) (يعني من 92 OD / غرام للأنسجة الجلد سليمة و29 OD / غرام بعد التقسيم، في الفترة من 22 OD / غرام إلى 7 OD / غرام FOص دائرة التنمية الاقتصادية سليمة فيما يتعلق بتصنيف وأخيرا من 16 OD / غرام إلى 2.7 OD / غرام لالأدمة سليمة فيما يتعلق تجزئتها). وهكذا، تظهر هذه النتائج الأولية إلى أن هذا النظام قادر على الحفاظ على مستويات ملموسة من بقاء الخلية بعد تفصيل فوري. تم دراسة تأثير التقسيم على بقاء الخلية أيضا على عينات من الأنسجة مثقف لمدة 24 ساعة أو 7 أيام ونتائج متباينة لوحظت. على وجه الخصوص، وقد لوحظ عدم وجود اختلاف كبير في بقاء الخلية في عينات أنسجة الجلد بشكل مستقل من قبل وقت التجانس والثقافة بالمقارنة مع بدء الوقت (T 0) (الشكل 4A). من ناحية أخرى، وانخفاض الجدوى من عينات ديد بعد أن لاحظ ولكن من المدهش أعيد بقاء الخلية بعد 7 أيام من ثقافة (الشكل 4B) 24 ساعة من ثقافة مقارنة ابتداء من الساعة (T 0). ولوحظت نتائج مماثلة أيضا لعينات من الأدمة (الشكل 4C). تم تقييم كل عينة في مكررة والقيم المبلغ عنها في الجدول 2.
على أساس هذه النتائج، حددنا الوقت المناسب من التفصيل للحفاظ على بقاء الخلية لثلاثة أنواع من الأنسجة الجلدية كما ورد في الجدول 3. بالإضافة إلى بقاء الخلية، وأيضا تقييم الجانب الصرفي تعليق الخلوي مثقف، وتحديد الخلايا وحيدة بعد 24 ساعة من تصنيف الأنسجة، بينما لوحظت بعد 7 أيام هناك بقايا من الألياف في كل أنسجة الجلد وعينات ديد / الأدمة (الشكل 5 AB). وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء توصيف الخلية عن طريق تحليل التدفق الخلوي في عينة من الأدمة بعد التجانس لها: تم تحديد تجمع غير متجانس من الخلايا تتكون من عدة أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة (الشكل 6). وعلاوة على ذلك، تم التعرف على غياب نمو البكتيريا ط ن جميع العينات المصنفة المصنفة في الوقت المناسب على أطباق أجار، التي تثبت عقم إجراء التجارب (الشكل 7).
الشكل 1. بيو بناء المجمعات الأنسجة نظام تعطيل (A) ومجموعة من قطعة صغيرة من ديرما من منطقة آفة من المريض الذي كان المصنفة في وقت لاحق مع تسبب اختلال والأنسجة. وقد تم الحصول على المجمعات الحيوية الجمع بين الطعوم الدقيقة على الإسفنج الكولاجين للحصول على بقع الإنسان جاهزة للاستخدام لإصلاح الآفة (C) (D) الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ ممثل الحيوي معقدة مثقف لمدة ثلاثة أيام في DMEM المتوسطة والتي لوحظ المجهري الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
طبقت الشكل تطبيق 2. بيو المجمعات على الساق الآفة والمجمعات الحيوية تتألف من الكولاجين والطعوم الدقيقة التي تم الحصول عليها من المريض على آفة الساق (A) وجرى تقييم الجرح بعد 30 يوما (ب) و 5 أشهر (C ). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. C الذراع الجدوى مباشرة بعد تصنيفها في أوقات مختلفة من ثلاثة أنواع من الأنسجة الجلدية (أ) فيما يتعلق الجلدي الأنسجة السليمة (B). بالبشرة، تم تفصيل ديد والأدمة الأنسجة المستمدة من أربع جهات مانحة مختلفة مع disru الأنسجةptors كما تبين في القسم المناسب في النص. تم تقييم قابلية الخلية عن طريق اختبار MTT أجريت في مكررة لكل عينة الأنسجة. الرسم البياني هو ممثل أربع تجارب مختلفة أجريت في مكررة لكل عينة. يتم التعبير عن النتائج على النحو نسبة بين الكثافة الضوئية (OD) وغرام (غرام) من الأنسجة. تم حساب الانحراف المعياري على النسبة بين الكثافة الضوئية (OD) وغرام (غرام) من الأنسجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مستويات الشكل 4. C الذراع الجدوى من عينة موزعة حسب نوع من الأنسجة الجلد (A)، ديد (ب) والأدمة (C) إلى البدء الوقت (T 0) وبعد ثقافة ثانوية لمدة 24 ساعة و 7 أيام. والمتجانس الأنسجة مع النسيج اختلال كما إنديكاالشركة المصرية للاتصالات في القسم المناسب في النص. وكانت عينات مصنفة في وقت لاحق تربيتها لمدة 24 ساعة و 7 أيام بعد التقسيم وحافظت في المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والمضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 / الهواء. تم تقييم سلامة الخلية التي كتبها الإنتقالي العسكري كما هو موضح سابقا. الرسم البياني هو ممثل تجربة أجريت في مكررة لكل عينة من أنسجة الجلد، ديد والأدمة المستمدة من متبرع واحد. يتم التعبير عن النتائج على النحو النسبة بين الكثافة الضوئية (OD) وغرام (غرام) من الأنسجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. التحليل الصرفي للالمصنفة أنسجة الجلد (A) وديد / الأدمة (B) بعد 24 ساعة و 7 أيام عبادة لدى عودتهم. تم إجراء التحليل الصرفي باستخدام المجهر الضوئي بعد 24 ساعة و 7 أيام للثقافة في وجود RPMI المتوسطة على أنسجة الجلد وديد / الأدمة الأنسجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. توصيف خلية من تحليل التدفق الخلوي. وبعد تفصيل الميكانيكية، وضعت الطعوم الدقيقة التي حصلت عليها الأدمة في الثقافة وبعد أن حلل 7 أيام بالفيروس إلى الوسيطة وعلامة الخلية المكونة للدم، بما في ذلك CD146، CD34 CD45 والمستضدات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ليه / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg "/>
والمصنف رقم 7. تحليل الميكروبيولوجية من نسيج الجلد المصنفة دائرة التنمية الاقتصادية والأدمة العينات. شظايا صغيرة من عينات الأنسجة مفصلة عن كولومبيا أجار وأضاف من 5٪ الأغنام الدم (شركة BIOMERIEUX) تحت غطاء تدفق الصفحي وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام ل إجراء تحليل الميكروبيولوجي وتقييم العقم الداخلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عينات الأنسجة | تصنيف TIMES (ثانية / دقيقة) |
| بشرة | 30 ثانية |
| 1 دقيقة | |
| 2 دقيقة | |
| 5 دقيقة | |
| دائرة التنمية الاقتصادية | 1 دقيقة |
| 2 دقيقة | |
| 5 دقيقة | |
| 10 دقائق | |
| أدمة باطن الجلد | 1 دقيقة |
| 2 دقيقة | |
| 5 دقيقة | |
| 10 دقائق |
الجدول 1. التمثيل التخطيطي لأربعة اوقات مختلفة تستخدم لتصنيفها من الجلد، ديد والأدمة. ثمانية، أربعة وثلاثة الخزعات لكمة من الجلد، ديد والأدمة ومصنفة على التوالي في أربع أوقات مختلفة، وفقا لخصائص البيولوجية.
| أنسجة الجلد | |||||
| إلى | 24 ساعة | 7 أيام | |||
| 2 ' | 5 " | 2 ' | 5 " | 2 ' | 5 " |
| 37.1 | 41.07143 | 41.07143 | 65.78571 | 41.14286 | 37.42857 |
| 35.8 | 43.82143 | 36.60714 | 66.5 | 41.46429 | 38.67857 |
| دائرة التنمية الاقتصادية | |||||
| T 0 | 24 ساعة | 7 أيام | |||
| 5 " | 10 ' | 5 " | 10 ' | 5 " 10 ' | |
| 6،649485 | 8.237113 | 5.463918 | 5.731959 | 7.835052 | 7.85567 |
| 6،845361 | 8،360825 | 5.257732 | 5.989691 | 8 | 7.938144 |
| أدمة باطن الجلد | |||||
| إلى | 24 ساعة | 7 أيام | |||
| 10 ' | 5 " | 10 ' | 5 " | 10 ' | |
| 1.690909 | 2.77193 | 0.293898 | 0.786704 | 2.880952 | 2.869048 |
| 1.736364 | 2.830409 | 0.306351 | 0.814404 | 2.940476 2.928571 | |
الجدول 2. مجموعة من القيم أعرب في OD / غرام لأحد البيولوجية نسخ متماثل. قيم بقاء الخلية من أنسجة الجلد، والأدمة ديد تقييم لوقت البدء وبعد تفصيل الميكانيكية إلى العصور المشار إليها. وقد عبرت النتائج عن تجربة واحدة أجريت في مكررة ويعبر عنه النسبة بين الكثافة الضوئية (OD) وغرام (غرام) من الأنسجة.
| عينة | تفصيل الوقت |
| أنسجة الجلد | 5 دقيقة |
| دائرة التنمية الاقتصادية | 1 دقيقة |
| ديرما | 2 دقيقة |
الجدول 3. التمثيل التخطيطي لأفضل وقت لعملية توزيع للحفاظ على بقاء الخلية الجيدة في احالإقليم الشمالي الأنسجة عينات. بالبشرة دائرة التنمية الاقتصادية وعينات الأنسجة الأدمة تظهر بقاء الخلية المثلى بعد 5، 1 و 2 دقيقة من التفصيل، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وأظهرت هذه الدراسة الأولية أن الطعوم الدقيقة التي حصلت عليها هذا البروتوكول يمكن الجمع مع الإسفنج الكولاجين، كما سبق أن ذكرت في التطبيقات السريرية الأخرى، لتحسين فعالية زرع الجزئي الطعوم 9 و 10. وعلى وجه الخصوص، وذكرت هذه الدراسة قدرة الحيوية -complexes، مكونة من الطعوم الدقيقة والإسفنج الكولاجين، إلى مساعد التئام الجروح من آفة الساق بعد 30 يوما من التطبيق السريري. وعلاوة على ذلك، توفر في المختبر النتائج من الأدلة حول فعالية هذا البروتوكول لتفصيل ثلاثة الأنسجة الجلدية المختلفة، والمحافظة على بقاء الخلية ملموسة سواء مباشرة بعد تفصيل الميكانيكية وأيضا بعد 24 ساعة و 7 أيام الثقافة.
الحفاظ على بقاء الخلية بعد هذا النوع من التجانس تسمح للحصول في خطوة واحدة فقط العقيمة ذاتي الطعوم الدقيقة، وتجنب التلاعب واسعة النطاق. وهذه الأدلة في اتفاقمع أوراق الأخيرة الأخرى التي تم اختبار فعالية هذا البروتوكول في المختبر أيضا في نوع آخر من الأنسجة، بما في ذلك السمحاق، خزعة من الأذينين القلب والعضلات المستقيمة الجانبية من مقلة العين 5. على وجه الخصوص، لاحظنا في عينات ديد والأدمة زيادة قابلية الخلية بعد 7 أيام من الثقافة، وربما يرجع ذلك إلى استخدام وسيلة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني.
بالإضافة إلى المحافظة على بقاء الخلية، وهذا النظام هو آمنة وسهلة الاستخدام وفي بضع دقائق غير قادرة على تفصيل ميكانيكيا أنواع مختلفة من الأنسجة منع اختلال هياكل الخلية، فيما يتعلق بأساليب تقليدية من العزلة الخلية، مثل الأنزيمية الهضم التي تتطلب وقتا أطول للتنفيذ. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النظام قادرا على تحديد الخلايا مع قطع من 50 ميكرون وهذا الجانب مهم جدا في النظر في نجاح حقن الطعوم الدقيقة، لأن هذا النطاق يشمل الخلايا الاولية قادرة على التفريق في العديد من أنواع الخلايا ومن ثم تحسين إصلاح الآفة. هذا البروتوكول يسمح لنا ليس فقط للحصول قابلة للحياة ولكن أيضا ذاتي الطعوم الدقيقة، نظرا إلى أن هذا الموضوع المانحة هو أيضا متقبل هذه-الطعوم الدقيقة. وذكر خصوصا قدرة هذا النظام للحصول على ذاتي الطعوم الدقيقة في مجال طب الأسنان حيث تبين أن زرع الخلايا الجذعية ذاتي لب الأسنان (DPSCs) في عدم الواردة ساهم عيب تحت العظم لإصلاح اللثة وتجديد ضامر الفك العلوي 5،6. وذكرت أيضا قدرة هذه-الطعوم الدقيقة لتحسين عملية التئام الجروح في وقت سابق في إدارة الجروح المعقدة بعد التدخلات الجراحية أو مضاعفات 4.
ميزة أخرى لاستخدام ذاتي وجاهزة للاستخدام الطعوم الصغيرة هي بالتأكيد مسك ظروف معقمة في ضوء الزرع في وقت لاحق على الآفات الجلدية.
"jove_content">
في الختام، أظهر بروتوكول وصفها في هذه الورقة القدرة على خلق الأنسجة الدقيقة الكسب غير المشروع الإنسان جاهزة للاستخدام في التدخل السريري لتحسين التئام الجروح المزمنة / حادة الجلد، مثل تلك المشار إليها في هذه الدراسة. في المختبر النتائج على إمكانية كما تم الإبلاغ عن إنشاء قابلة للحياة الطعوم الدقيقة وهذه المعلمة هو بالتأكيد كبير إلى زيادة نسبة النجاح في إصلاح الأنسجة. مجتمعة، أظهرت البيانات أن هذا النظام الجديد يمكن اعتباره أداة واعدة بالنسبة للأطباء الذين هم في حاجة الى أداة سريعة وآمنة في إدارة الجروح الجلدية.
في الوقت الراهن، ليست هناك تعديلات معينة أو حدود للبروتوكول في هذا التطبيق المحدد، نظرا إلى أن الجلد يمثل الأنسجة سهلة الاستخدام وفي دراسات أخرى أبلغنا فعالية من نفس البروتوكول في مختلف الآفات الجلدية 6،7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلف أنطونيو غرازيانو هو المدير العلمي لدماغ الإنسان موجة المسلسل التي تنتج وتسوق للنظام Rigenera. المؤلف يتيسيا Trovato هو متعاون قسم العلمي من الدماغ البشري موجة SRL
Acknowledgments
الكتاب نود أن شكر الدكتور فيديريكا Zanzottera للمساهمة في دراسة أداء تحليل التدفق الخلوي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rigenera Machine | Human Brain Wave | 79210R | |
| Rigeneracons | Human Brain Wave | 79450S | |
| MTT | Roche Diagnostic GmbH | 11465007001 | |
| RPMI medium | PBI International | 733-2292 | |
| DMEM medium | PBI International | F 0415 | |
| Antibiotics | Biological Industries PBI | 03-038-1 | |
| Antibodies for FACS Analysis | eBiosciences | code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349 for CD34-APC | |
| Columbia agar | BioMerieux Company | 43041 | |
| Condress® | Abiogen Pharma | collagen sponge used for bio-complexes | |
| DMSO | Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL | ||
| NaCl solution | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany | ||
| Xylene | Carlo Erba |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
- Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
- Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
- Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18 (2), 59-70 (2001).
- Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. , (2015).
- Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4 (4), 268-274 (2014).
- Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1 (3), 3 (2014).
- Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34 (3), s27-s33 (2014).
- Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1 (2), 20 (2013).
- Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17 (5), 644-647 (2013).
- Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).
