Summary
Протокол описывает новый метод дезагрегации тканей человека и создать аутологичных микро-трансплантаты, которые, в сочетании с коллагеном губок, порождающие человека био-комплексов, готовых к использованию в лечении поражений кожи. Кроме того, эта система сохраняет жизнеспособность клеток микро-трансплантатов в разное время после механической дезагрегации.
Abstract
Несколько новых методов были разработаны в области биотехнологии для получения аутологичных клеточных суспензий во время операции, с тем чтобы обеспечить еще один этап лечения острых и хронических кожных поражений. Кроме того, управление хронических, но и острых ран в результате травмы, диабета, инфекций и других причин, остается сложной. В этом исследовании мы описываем новый метод для создания аутологичных микро-трансплантаты из кожной ткани одного пациента и их клинического применения. Кроме того, в пробирке биологическая характеристика кожной ткани , полученной из кожи, де-epidermized дермы (DED) и дермы полиорганной и / или доноров нескольких тканей также была проведена. Все ткани были разбиты по этим новым протоколом, что позволяет нам получить жизнеспособные микро-трансплантатов. В частности, мы сообщали, что этот инновационный протокол способен создать био-комплексы, составленные аутологичных микро-трансплантатов и коллагеновых губок, готовых наносить на кожных поражений. Клиникал применение аутологичных биологических комплексов на поражения ног также сообщалось, показывая улучшение как процесса повторного epitalization и мягкости поражения. Кроме того, наша модель в пробирке показали , что жизнеспособность клеток после механического разукрупнения с этой системой поддерживается в течение долгого времени до семи (7) дней культуры. Мы также наблюдали, с помощью проточной цитометрии, что пул клеток, полученных из дезагрегации состоит из нескольких типов клеток, в том числе мезенхимальные стволовые клетки, которые оказывают ключевую роль в процессах регенерации и восстановления тканей, для их высокой регенеративного потенциала. Наконец, мы продемонстрировали в пробирке , что эта процедура сохраняет стерильность микро-трансплантатов при культивировании в чашки с агаром. Таким образом, мы приходим к выводу, что этот новый регенеративный подход может быть перспективным инструментом для врачей, чтобы получить в одну стадию жизнеспособного, стерильный и готов к использованию микро-трансплантаты, которые могут быть применены по отдельности или в сочетании с наиболее распространенным биологическим scaffoLDS.
Introduction
В последние годы несколько новых методов были разработаны в области биотехнологии для получения аутологичных клеточных суспензий во время операции, с тем чтобы обеспечить один шаг лечения острых и хронических кожных поражений. Кроме того, управление острыми, но в основном хронических ран в результате травмы, диабета, инфекций и других причин, остается сложной. Существует свидетельств того, что хронические раны стали серьезной глобальной проблемой здравоохранения, в результате чего огромное финансовое бремя на системы здравоохранения во всем мире 1.
Чтобы увеличить скорость успеха в лечении поражений кожи, отсутствие обширной манипуляции (в том числе сотовой усиления) и поддержание стерильных условий необходимы для того, чтобы создать клеточную суспензию, которую может быть выполнено немедленно на поврежденный участок пациентов, что позволит избежать более длительного обработки в чистых помещениях, таких как мобильные заводы. улицаarting из небольших биопсий кожи, шлифовка, центрифугирования и других методов разделения (например, ферментативным или механические), которые часто используются для получения суспензии клеток, которые могут быть выращены в среде для роста. Все эти методы обычно требуют длительного времени выполнения, подчеркивая клеточных структур, а также приводит к снижению жизнеспособности клеток. Другим важным аспектом является получение аутологичных клеточной суспензии готов к использованию клиницистами, например, для ремонта поврежденных участков. Кроме того, хорошо известно , что трансплантаты аутологичных ткани выживают процедуры передачи , чтобы в конечном итоге выжить в месте реципиента принципами индукции и проводимости 2, 3. Идеальная трансплантат ткани должны быть легко доступны и имеют низкую антигенность и доноров сайта заболеваемости 4.
На основании этих доказательств, первая цель данного исследования состояла в том, чтобы создать аутологичных био-комплексы, пригодные дляклиническое применение в восстановлении тканей. Для этой цели мы описываем новый метод для получения аутологичных микро-трансплантаты, начиная от кожных тканей, которые были с разбивкой по этому протоколу. Случай презентации также описано здесь в качестве клинического применения аутологичных микро-трансплантатов, полученных этим протоколом в сочетании с коллагеном губок. Такой подход уже сообщалось , чтобы быть эффективными в механической дезагрегации тканей человека 5 и он был использован в клинике для трансплантатов и регенерации тканей дермы 6,7, а также для регенеративной терапии соединительной ткани в полости рта челюстно - лицевой хирургии 8-10 ,
Кроме того, второй целью данного исследования было биологическая характеристика кожных тканей после того, как их дезагрегации по этому протоколу. С этой целью различные гомологичные образцы кожной ткани происходит от области ствола различных полиорганнойи / или доноры нескольких тканей были обработаны в соответствии с национальными правилами по заготовке, переработке и распределению тканей для трансплантации (НСТ 2013) на Эмилия-Романья Региональный Skin Bank.
История болезни:
A 35-летний пациентка показывает сложную травму из-за автомобильной аварии был принят в отделении интенсивной терапии больницы Анконы. Пациент показал инфекцию на ноге из-за открытой раны и сложный перелом, стабилизированный внешней фиксации. Два радикала санацию были выполнены и когда рана стала чистой после отрицательной Прессотерапия (VAC терапия) и надкостницы выглядели здоровыми, мы применили протокол по истечении двух месяцев с момента восстановления. После дезагрегации с этой системой, микро-трансплантаты, полученные были использованы для создания био-комплексы с коллагеновой губки, которые впоследствии были имплантированы для того, чтобы исследовать их эффективность по ремонту повреждений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: так как клиническое применение протокола требует использования кожным аутогенной ткани пациента, его характеристика в пробирке проводили до клинического применения на гомологичной кожной ткани в Эмилия - Романья Региональный банк кожи с соблюдением требований национальных правил по заготовке, переработке и распределение тканей для трансплантации (НСТ 2013).
1. Био-комплекс здания для клинического применения
Примечание: Этот протокол клинически основанный на использовании Rigeneracons (ткань дезинтегратор) и Rigenera Machine (тканевой системы дезинтегратор) (Рис . 1А) Дезинтегратор ткани представляет собой биологический медицинский разрушитель человеческих тканей, способных нарушить небольшие кусочки тканей с использованием сетки, представленную шестиугольными лезвиями и фильтрующих элементов и компонентов внеклеточного матрикса с отсечкой около 50 микрон.
- Соберите skinsamples пациента через биopsy пуансон (Фиг.1В) и дезагрегации добавлением 1 мл физиологического раствора для каждой части , чтобы получить аутогенные трансплантаты микро-6,7,9 (или см шаг 2.1).
- Поместите 1 мл микро-трансплантатов на коллагеновых губок (Рисунок 1C) toform био-комплексы использовать для клинического применения.
- Культура еще 1 мл микро-трансплантатов на коллагене губок в присутствии 6 мл DMEM среде , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 увлажненной атмосфере.
- После 3-х дней культивирования фиксируют био-комплексы с 0,3% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Налейте парафин с конкретным дозатором непосредственно на образце. Получают срезы с помощью микротома толщиной 5 мкм и поместить непосредственно в стеклянном салазкам.
- Погружают парафиновые срезы 5 мкм в стакане для гистологического анализа, содержащий 15 - 20 мл ксилола (имеющийся в продаже - смесь м-ксилол (40 - 65%), п-ксилол (20%), о-ксилол (20% ) и ETHил бензола (6 - 20%) и следы толуола, триметилбензол, фенол, тиофен, пиридин и сероводород) в течение 3 минут каждый.
- Погружают ломтики в убывающем сортов (100% до 70%) этанола (100% этаноле в течение 1 ч, 95% этанола в течение 1 ч, 80% этанола в течение 1 часа, 70% этанола в течение 1 ч), а затем деионизированной воды для де-paraffinizing и регидратации секции.
- Пятно разделы с 1 - 2 мл 1 г / л Ematoxylin за 1 - 2 мин, а затем промыть в воде, чтобы удалить любые излишки Ematoxylin.
- Пятно секции для 4 - 5 мин с спиртовым раствором эозин Y при 1% концентрации в смеси с этанолом 70% и разводят в воде.
- Используйте 1 - 2 мл эозина Y для каждой секции слайдов и промыть под проточной водой.
- Погрузитесь секции в увеличении сортов этанола (см шаг 1.6) и , наконец, после прохождения в ксилоле в течение 1 ч, покровное с основанным монтажа mediumand наблюдать под световым микроскопом при 100 - кратном увеличении (рис 1D). </ Ол>
- С помощью дерматома, принимать независимые ткани кожи, папиллярной де-epidermized дермы (DED) или ретикулярной дермы (дермы), соответственно, на 0,6 мм, 1 мм или 2 мм толщиной от области ствола 4-х различных полиорганной и / или многоканальные доноров тканей в диапазоне от 40 до 55 лет, в соответствии с национальными правилами по заготовке, переработке и распространении тканей для трансплантации (CNT 2013).
- Аккуратно промойте все образцы в 0,9% растворе NaCl положить их в блюдо на орбитальном шейкере в течение 5 мин.
- Используя трепанобиопсия 5-мм, создавать образцы, которые являются однородными в диаметре от кожной ткани, DED и дермы и взвесьте все образцы тканей перед дезагрегации.
- Вставка, восемь трех или четырех однородных образцов ткани кожи, DED или дермы соответственно, в дезинтегратор ткани, добавлением 1,5 мл физиологического раствора для дезагрегации.
- Выполните разныевремена дезагрегации для всех образцов ткани , как указано в таблице 1.
- Используйте соотвествующее число перфорационных биопсий, полученных из образцов неповрежденной ткани в качестве контрольных.
- После механической дезагрегации, аспирация солевой раствор, содержащий микро-трансплантатов и поместить отдельно каждый образец в отдельную лунку 12-луночного планшета. Выполните тот же протокол для управления неповрежденными пробивных биопсий.
- Добавить 1 мл RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики для каждого образца.
- Оценка жизнеспособности клеток немедленно. В каждую лунку, содержащую микро-трансплантат (полученный путем одновременного дезагрегации, восьми трех или четырех однородных образцах ткани кожи, DED или дермы соответственно) добавляют 1 мл среды, содержащей 0,5 мг / мл МТТ (3- [4,5- диметилтиазол-2-ил]) раствор бромида -2,5 дифенилтетразолийбромид и инкубировать в течение 3 ч при 37 ° с в атмосфере 5% СО 2 / воздух. Выполните тот же протокол для интактного контроляпробивать биопсию.
- После инкубации, удалить всю среду, содержащую МТТ, и добавляют к каждому образцу 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 10 мин.
- Передача каждого образца и ДМСО в кювете и считывали при оптической плотности (OD) при 570 нм с использованием спектрофотометра. Рассчитать жизнеспособность клеток как отношение оптической плотности при длине волны 570 нм и вес в граммах (гр) ткани, использованными перед дезагрегации. Выполните тот же протокол для управления неповрежденными пробивных биопсий.
- После механической дезагрегации, аспирация солевой раствор, содержащий микро-трансплантат, полученный из тканей кожи, DED и дермы образцы одного донора.
- Поместите отдельно каждую пробу в отдельную лунку 12-луночного планшета или в культуральной колбе для испытания жизнеспособности клеток и морфологического анализа соответственно.
- Культура микро-трансплантаты прибавлением 1 мл (12-луночный планшет) и 5 мл (культуральный флакон) в среде RPMI 1640 , дополненной 10% FBS и антибиотиков при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 / AIг в течение 24 часов или 7 дней.
- Оценка жизнеспособности клеток через 24 часа или 7 дней (повторите шаги 2.1.8-2.1.10).
- Выполните морфологический анализ оценки присутствия суспензии клеток с помощью световой микроскопии после 24 часов и 7 дней культивирования в колбе.
- Анализируют образцы дермы для позитивности к мезенхимальных и маркеры гемопоэтических клеток, в том числе CD146, CD34 и CD45 антигенов с помощью анализа FACS 6.
- Под ламинарного потока семян капот каждый микро-трансплантат (полученный путем одновременного дезагрегации, восьми трех или четырех однородных образцах ткани кожи, Дедом или дермы соответственно) и корреспондентскому небольшой фрагмент каждого образца ткани не полностью детализированном (> 50 мкм по размеру после того, как процесс дезагрегирования) на колумбийского агара, пластину, содержащую 5% овечьей крови отвар по 100 мкл.
- Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение трех дней , а также выполнять микробиологического анализа на колумбийского агара пластины с целью оценки стерильности 11,
2. Сбор, Разбивка и экстракорпоральное Анализ тканей
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом предварительном исследовании, первая цель состояла в том, чтобы исследовать способность человека аутологичных микро-трансплантатов в сочетании с биологической поддержки, таких как коллаген, для производства био-комплексов, готовых к использованию. Эти био-комплексы были имплантированы у пациента с поражением ног , вызванного дорожно - транспортного происшествия (рис 2А) и полной повторной эпителизации , связанного с восстановлением тканей после 30 дней (Фигура 2В) наблюдалась. Кроме того, клиническое наблюдение показало хорошую текстуру и мягкость поврежденной области после того, как 5 месяцев (фиг.2с). Параллельно с клинического применения, в пробирке исследования также были проведены для оценки жизнеспособности клеток различных кожных тканей , таких как ткани кожи , Ded и дермы до и после дезагрегации с помощью этой системы. В частности, принимая во внимание различную толщину каждого типа ткани, порог восьми,четыре и три биопсий, которые могут быть обработаны в одной стадии для ткани кожи, DED и дерме, соответственно, была создана. Установленное число биопсий затем были разбиты на четыре разные моменты времени , как указано в таблице 1, в соответствии с их биологическими характеристиками , с тем чтобы определить оптимальные условия разукрупнения для поддержания хорошей жизнеспособности клеток.
Хотя обработка ткани сама по себе неизбежно индуцировали ухудшение жизнеспособности клеток по сравнению с интактной ткани, механическое дезагрегации выполняется с помощью этой системы, кажется, поддерживать среднее значение жизнеспособности клеток на 30% во всех образцах кожи, DED и дермы оценивается в разное время (рис 3А), по отношению к неповрежденной ткани (рис 3B) (среднее значение 92 OD / г для неповрежденной кожной ткани и 29 OD / г после разукрупнения, от 22 OD / г до 7 OD / г FOг нетронутыми Ded относительно разукрупнения и, наконец, от 16 OD / г до 2,7 OD / г для неповрежденных дермы по отношению к дезагрегации). Таким образом, эти предварительные результаты показывают, что эта система способна поддерживать заметное количество жизнеспособности клеток после немедленного дезагрегации. Влияние дезагрегации на жизнеспособность клеток также была исследована на образцах тканей, культивированных в течение 24 ч или 7 дней и переменные результаты наблюдались. В частности, не наблюдалось существенного изменения жизнеспособности клеток в образцах ткани кожи независимо друг от друга в зависимости от времени гомогенизации и культуры по сравнению с начального времени (Т 0) (рис 4A). С другой стороны, пониженная жизнеспособность образцов DED после 24 ч культуры по сравнению с началом времени (T 0) наблюдалось , но на удивление жизнеспособность клеток была восстановлена после 7 дней культивирования (фиг.4В). Аналогичные результаты наблюдались также для образцов дермы (рис 4C). Каждый образец оценивали в двух экземплярах и значений , представленных в таблице 2.
На основании этих результатов, мы определили подходящее время дезагрегации для поддержания жизнеспособности клеток для трех типов кожной ткани , как показано в Таблице 3. В дополнение к жизнеспособности клеток, морфологический аспект культивируемой клеточной суспензии также оценивали, идентификации отдельных клеток после 24 ч от дезагрегации ткани, в то время как после того, как были обнаружены 7 дней там остатки волокон в ткани кожи как и образцы Ded / дерме (рис 5 AB). Кроме того, характеристика клеток с помощью проточной цитометрии проводили в образце дермы после того, как его гомогенизацию: гетерогенный пул клеток , составленных несколькими сотовыми типов, в том числе эндотелиальные клетки и мезенхимальные стволовые клетки были идентифицированы (рисунок 6). Кроме того, отсутствие роста бактерий был идентифицирован I п все дезагрегированные образцы подходяще высевали на чашки с агаром, что свидетельствует о стерильности экспериментальной процедуры (рисунок 7).
Рисунок 1. Био-комплексов Строительство тканей срыве системы (А) и Коллекция небольшой кусочек Derma от поражения Район пациента , который впоследствии был Дезагрегированный с тканью разрушители. Био-комплексы были получены объединением микро-трансплантатов на коллагеновых губок чтобы получить человеческие патчи готовый к использованию для ремонта повреждений (с). (D) гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание представителем био-комплекс культивировали в течение трех дней в DMEM среде и наблюдали микроскопии Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.
Рисунок 2. Био-комплексы Применение на ноге заболеваний кожи био-комплексы , составленные коллагена и микро-трансплантатов , полученных от пациента , наносили на поражение ног (A) , и рана оценивали через 30 дней (В) и 5 месяцев (С ). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. C ELL Жизнеспособность Сразу после дезагрегации в разное время три типа кожных тканей (А) по отношению к интактным кожных тканей (B). Кожа, DED и дерме ткани , полученные из четырех различных доноров были разбиты с disru тканиptors как указать в соответствующем разделе в тексте. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью теста МТТ дублировались для каждого образца ткани. График является представителем четырех различных экспериментов, выполненных в двух повторностях для каждого образца. Результаты выражали как отношение оптической плотности (OD) и г (гр) ткани; стандартное отклонение рассчитывали по соотношению оптической плотности (OD) и г (гр) ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. C ELL Жизнеспособность Уровни дезагрегированном образца ткани кожи (A), Ded (B) и дермы (С) Время включения (T 0) и после того, как субкультуры в течение 24 часов и 7 дней. Ткани гомогенизируют с тканью разрушители как индикит.е в соответствующем разделе в тексте. Дезагрегированные образцы были впоследствии культивировали в течение 24 часов и 7 дней после дезагрегации и поддерживали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков при 37 ° С в атмосфере 5% СО2 / воздух. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ, как описано ранее. График является представителем эксперимента, выполненного в двух экземплярах для каждого образца ткани кожи, DED и дермы, полученный от одного донора. Результаты выражены как отношение оптической плотности (OD) и г (гр) ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. морфологический анализ дезагрегированных кожной ткани (А) и Ded / Дерма (B) после того, как 24 часа в сутки и 7 дней Cult Юр. Морфологический анализ проводили с использованием световой микроскопии через 24 часа и 7 дней культивирования в присутствии RPMI среды на ткани кожи и ПСД / дермы тканей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Определение характеристик ячеек с помощью проточной цитометрии. После механической дезагрегации, микро-трансплантаты , полученные дермы были введены в культуру и через 7 дней были проанализированы на позитивности к мезенхимальных и гемопоэтических клеток маркера, в том числе CD146, CD34 и CD45 антигенов. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенной версии этой фигуры.
ле / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg "/>
Рисунок 7. Микробиологический анализ Дезагрегированные ткань кожи, DED и дермы образцов. Небольшие фрагменты образцов детализированных ткани были высеяны на Колумбийский агар добавили 5% овечьей крови (BioMerieux Company) под колпаком с ламинарным потоком и инкубировали при 37 ° С в течение трех дней выполнить микробиологического анализа и оценки стерильность процедуры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| ОБРАЗЦЫ ТКАНИ | ДЕЗАГРЕГИРОВАНИЯ (сек / мин) |
| кожа | 30 сек |
| 1 мин | |
| 2 мин | |
| 5 мин | |
| Ded | 1 мин |
| 2 мин | |
| 5 мин | |
| 10 минут | |
| дерма | 1 мин |
| 2 мин | |
| 5 мин | |
| 10 минут |
Таблица 1. Схематическое представление четырех различных времен использовали для дезагрегации кожи, Ded и дермы. Восемь, четыре и три удара биопсию кожи, Ded и дермы , соответственно , были разбиты на четыре разные моменты времени, в соответствии с их биологическими характеристиками.
| ткань кожи | |||||
| к | 24 часа в сутки | 7 дней | |||
| 2 ' | 5 ' | 2 ' | 5 ' | 2 ' | 5 ' |
| 37,1 | 41,07143 | 41,07143 | 65,78571 | 41,14286 | 37,42857 |
| 35,8 | 43,82143 | 36,60714 | 66,5 | 41,46429 | 38,67857 |
| Ded | |||||
| T 0 | 24 часа в сутки | 7 дней | |||
| 5 ' | 10 ' | 5 ' | 10 ' | 5 ' 10 ' | |
| 6,649485 | 8.237113 | 5.463918 | 5.731959 | 7.835052 | 7,85567 |
| 6,845361 | 8,360825 | 5.257732 | 5.989691 | 8 | 7.938144 |
| дерма | |||||
| к | 24 часа в сутки | 7 дней | |||
| 10 ' | 5 ' | 10 ' | 5 ' | 10 ' | |
| 1.690909 | 2,77193 | 0.293898 | 0.786704 | 2.880952 | 2.869048 |
| 1.736364 | 2.830409 | 0.306351 | 0.814404 | 2.940476 2.928571 | |
Таблица 2. Диапазон значений экспрессируется в OD / г для одной биологической Реплицировать. Значения жизнеспособности клеток из кожной ткани, Ded и дермы оценивали на время начала и после механического разукрупнения в указанное время. Результаты являются репрезентативными для одного эксперимента, выполненного в двух экземплярах и выражали в виде соотношения между оптической плотности (OD) и г (гр) ткани.
| образчик | Разбивка Время |
| ткань кожи | 5 мин |
| Ded | 1 мин |
| дерма | 2 мин |
Таблица 3. Схематическое изображение Лучшее время дезагрегации для поддержания хорошего Жизнеспособность клеток в Differeнт образцов тканей. Кожа, DED и образцы тканей дермы показывают оптимальную жизнеспособность клеток после того, как 5, 1 и 2 мин дезагрегации, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это предварительное исследование показало , что микро-трансплантаты , полученные с помощью этого протокола можно комбинировать с коллагеновыми губками, как уже сообщалось в других клинических применениях, для оптимизации эффективности микро-трансплантаты имплантатов 9, 10. В частности, это исследование показало , способность био -комплексы, состоящими из микро-трансплантатов и коллагеновых губок, адъювантной заживлению раны поражения ног после 30 дней от клинического применения. Кроме того, в пробирке результаты свидетельствуют об эффективности этого протокола детализировать три различных кожных тканей, сохраняя значительную жизнеспособность клеток как непосредственно после механической дезагрегации , а также через 24 часа и 7 дней культивирования.
Поддержание жизнеспособности клеток после такого рода гомогенизации позволяет получить в один шаг стерильных аутологичных микро-трансплантатов, избегая масштабной манипуляции. Это свидетельство согласуетсяс другими недавних работ , в которых был испытан и в другом типе тканей, в том числе надкостницы, биопсии сердца предсердием и латеральной прямой мышцы глазного яблока 5 Действенность этого протокола в пробирке. В частности, мы наблюдали в DED и дермы образцах повышенную жизнеспособность клеток через 7 дней культивирования, вероятно, из-за использования среды, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки.
В дополнение к поддержанию жизнеспособности клеток, эта система безопасна и проста в использовании и в течение нескольких минут в состоянии механически разъединять различные типы тканей, предотвращающих разрушение клеточных структур, по отношению к традиционным методам выделения клеток, таких как ферментативные пищеварения, которые требуют больше времени выполнения. Кроме того, эта система может выбирать клетки с отсечкой 50 мкм, и этот аспект очень важен при рассмотрении успеха инъекционные микро-трансплантатов, потому что этот диапазон включает в себяклетки-предшественники способны дифференцироваться во многих типах клеток, а затем улучшить ремонт поражения. Этот протокол позволяет не только получить жизнеспособные, но и аутологичных микро-трансплантатов, при условии, что субъект донор также акцептором этих микро-трансплантатов. Пропускная способность этой системы для получения аутологичных микро-трансплантатов была особенно сообщалось в области стоматологии, где было показано, что трансплантация аутологичных стволовых клеток пульпы зуба (DPSCs) в не содержали infrabony дефект способствовало восстановления и регенерации атрофического периодонта МахШаге 5,6. Способность этих микро-трансплантатов для улучшения процесса заживления ран также сообщалось ранее в управлении сложными ран после хирургических вмешательств или осложнений 4.
Еще одно преимущество на использовании аутологичных и готов к использованию микро-трансплантаты, безусловно, хранение стерильных условиях с учетом их последующей имплантации на поражения кожи.
В заключение, протокол , описанный в этой статье , показал способность создавать человеческие микро-трансплантат ткани , пригодной для использования в клинической интервенции для улучшения заживления острых / хронических ран кожи, таких как те , которые указаны в данном исследовании. В пробирке результаты о возможности Создание жизнеспособных микро-трансплантаты также сообщалось, и этот параметр, конечно, значительное увеличение процента успеха в восстановлении тканей. Взятые вместе, данные показали, что эта новая система может рассматриваться как перспективный инструмент для врачей, которые нуждаются в быстром и надежном инструменте в управлении кожных ран.
На данный момент, нет особых модификаций или ограничения для протокола в этой конкретной области применения, при условии , что кожа представляет собой ткань , простой в использовании и в других исследованиях , мы сообщали об эффективности того же протокола в различных поражений кожи 6,7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор Антонио Грациано является научным директором мозга человека Wave SRL, которая производит и продает системы Rigenera. Автор Летиция Trovato является сотрудником научного отдела мозга человека Wave SRL
Acknowledgments
Авторы выражают благодарности доктору Федерика Zanzottera за вклад в исследования, выполняющего проточной цитометрии анализа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rigenera Machine | Human Brain Wave | 79210R | |
| Rigeneracons | Human Brain Wave | 79450S | |
| MTT | Roche Diagnostic GmbH | 11465007001 | |
| RPMI medium | PBI International | 733-2292 | |
| DMEM medium | PBI International | F 0415 | |
| Antibiotics | Biological Industries PBI | 03-038-1 | |
| Antibodies for FACS Analysis | eBiosciences | code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349 for CD34-APC | |
| Columbia agar | BioMerieux Company | 43041 | |
| Condress® | Abiogen Pharma | collagen sponge used for bio-complexes | |
| DMSO | Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL | ||
| NaCl solution | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany | ||
| Xylene | Carlo Erba |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
- Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
- Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
- Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18 (2), 59-70 (2001).
- Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. , (2015).
- Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4 (4), 268-274 (2014).
- Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1 (3), 3 (2014).
- Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34 (3), s27-s33 (2014).
- Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1 (2), 20 (2013).
- Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17 (5), 644-647 (2013).
- Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).
