Summary
该协议描述了一种新的方法来分解人体组织和创建自体微移植，与胶原蛋白海绵相结合，引起人体生物复合物准备皮损的治疗使用。另外，该系统保持在机械解聚后不同时间的微移植物的细胞生存力。
Abstract
几种新的方法，已经开发了生物技术在手术过程中，得到的自体细胞的悬浮液的领域中，为了对急性和慢性皮肤损害提供一个步骤的治疗方法。而且，从创伤，糖尿病，感染和其他原因引起的慢性而且急性伤口的管理，仍然具有挑战性。在这项研究中，我们描述了一个新的方法来创建从单个患者的皮肤组织及其临床应用自体微移植。此外，还进行体外皮肤，去epidermized真皮（DED）和多器官和/或多组织捐助者的真皮源性皮肤组织的生物学特性。所有组织被这个新协议分类的，使我们能够得到可行的微移植物。特别是，我们报道了这一创新协议是能够创建自体微移植物和胶原海绵准备上皮损要施加由生物复合物。在克里尼上的腿病变自体生物复合物的校准应用也有报告，表示再epitalization过程和病变的柔软性两者的改进。此外，我们的体外模型表明，该系统机械解聚后的细胞活力保持在一段时间内培养可达七（7）天。我们还观察到，通过流式细胞术分析，从解聚获得的细胞的池是由几个细胞类型，包括间质干细胞，即施加在组织再生和修复的方法中的一个关键的作用，对它们的高的再生潜力。最后，我们表现出体外 ，在琼脂培养的菜时，此过程中保持微移植的不育。总之，我们的结论是这种新的再生方法可以是一个有希望的工具，临床医师在一个步骤上可行，无菌的，并且准备使用，可以单独或组合使用最常见的生物scaffo施加微移植物获得LDS。
Introduction
在过去的几年中，一些新的方法，已经开发了生物技术在手术过程中，得到的自体细胞的悬浮液的领域中，以治疗急性和慢性皮肤损伤提供一步法治疗。而且，从创伤，糖尿病，感染和其他原因造成的急性，但主要是慢性伤口的管理，仍然具有挑战性。有越来越多的证据表明，慢性伤口已成为严重的全球性健康问题，引起全世界对1的医疗保健系统巨大的财政负担。
为了增加在皮肤损伤的治疗成功率，缺乏广泛操纵（包括蜂窝增强）和无菌条件下的维护是必要的，以创建可以在的受损区域被立即施加一个细胞悬浮液患者中，从而避免在洁净室较长的处理，如细胞工厂。圣从小皮肤活检，研磨，离心等分离方法（ 例如，酶或机械）arting，经常用于获得一个细胞悬浮液，其可在生长培养基中培养。所有的这些方法通常需要执行的很长一段时间，强调细胞结构，并导致降低细胞生存力的。另一个显著方面是获得准备好由临床医师可使用自体的细胞悬浮液，例如，以修复受损的区域。此外，众所周知，自体组织移植物存活的过户手续于通过感应和传导2,3的原则接收站点，最终生存下来。理想的移植组织应该随时可用并具有低抗原性和供区的发病率4。
这些证据的基础上，本研究的第一个目的是创建适合自体生物复合物在组织修复的临床应用。为此，我们描述了一个新的方法，以从被这个协议分类的皮肤组织开始自体微移植。案例呈现在本文中也描述为临床应用该协议结合胶原蛋白海绵获得自体微移植。这种方法已被报道为在人组织5的机械分解效率，并已用于临床移植物和真皮组织6,7的再生以及用于在口腔颌面外科8-10结缔组织再生疗法。
此外，本研究的第二个目的是皮肤组织的本协议其分解后的生物学特性。为此目的，皮肤组织的不同的同源样品来自不同的多器官的躯干区衍生和/或多组织捐赠者进行了处理上的收获，加工下列国家的规则和分配在艾米利亚 - 罗马涅地区的皮肤银行移植组织（CNT 2013年）。
病例报告：
显示由于车祸复杂外伤35岁的女病人被送往医院安科纳的重症监护病房。病人表现的腿感染，由于一个开放的伤口，并用外固定稳定复合骨折。两个病灶清除，实施时间与伤口成为负压治疗（VAC疗法）后的清洁和骨膜出现了健康，我们就从恢复两个月后，应用的协议。这个系统分解后，得到了微移植物被用来创建生物复合物胶原海绵这些建议后来为了植入，调查其对病灶修复功效。
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Protocol
伦理陈述：自协议的临床应用程序需要使用患者的皮肤自体组织，其在体外表征同源皮肤组织在艾米利亚-罗马涅地区的皮肤银行下列国家规定的采伐，加工指引临床使用之前进行和分发用于移植的组织（CNT 2013）。
1.临床应用生物综合楼
注：该协议是基于临床的使用Rigeneracons（组织干扰物）和Rigenera机（组织干扰物系统）（ 图1A）。组织破坏剂是能够扰乱小片使用由六角形刀片和过滤的细胞和细胞外基质的成分具有约50微米的截止提供一网格组织的人体组织的生物医学干扰物。
- 通过双向收集患者的skinsamplesOPSY冲头（ 图1B）和分解加入1ml生理盐水，每件以获得自体微移植物6,7,9（或见步骤2.1）。
- 放置1毫升胶原海绵的微移植物的（ 图1C）toform生物复合物用于临床应用。
- 培养另一1毫升上在6ml补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中的存在胶原海绵的微移植物的在37℃在5％CO 2的潮湿气氛中。
- 以下培养3天后，固定生物复合物用0.3％多聚甲醛在室温10分钟。倾直接特定分配器到样品的石蜡。得到的切片用厚度为5μm的切片，并在玻璃载玻片放直接。
- 浸泡5微米石蜡切片中用于组织学分析的玻璃，含有15 - 20毫升二甲苯（市售 - 间 - 二甲苯（40混合 - 65％），对二甲苯（20％），邻二甲苯（20％ ）和ETH基苯（6 - 20％）和甲苯，三甲基苯，苯酚，噻吩，吡啶和硫化氢）的每个3分钟的痕迹。
- 沉浸在降低等级的乙醇的切片（100％至70％）（100％乙醇1小时，95％的乙醇1小时后，80％的乙醇1小时，70％的乙醇进行1小时），然后去离子水进行去paraffinizing和再水化的章节。
- 染色切片与1 - 2毫升1克/ L Ematoxylin为1 - 2分钟，随后在水中漂洗，以除去任何Ematoxylin盈余。
- 染色为4的部分 - 与曙红Y醇溶液5分钟，在浓度与70％乙醇混合的1％，而在用水稀释。
- 使用1 - 2毫升曙红Y为每张幻灯片部分和流动自来水下冲洗。
- 浸入部分中增加的乙醇等级（见步骤1.6），最后，在二甲苯中的通道1小时，盖玻片与基于安装mediumand放大100倍（ 图1D）在光学显微镜下观察之后。 </ OL>
- 分别为0.6毫米1毫米或2毫米的4种不同的多器官和/或多的行李箱区域的厚度用皮，走自主皮肤组织，乳头去epidermized真皮（DED）或真皮网状层（真皮）从40到55年的范围内组织的捐助者，下面就采收，加工和销售用于移植组织国家规则（CNT 2013年）。
- 轻轻冲洗在0.9％NaCl溶液的所有样品将它们在培养皿中在轨道摇动器5分钟。
- 使用5毫米活检穿孔，创建样品它是均匀的，从皮肤组织，扣减和真皮直径和分解之前称重所有组织标本。
- 插入皮肤组织，扣减或分别真皮，在组织破坏剂八个，三个或四个均匀样品，加入1.5毫升的解聚盐溶液。
- 执行不同对于所有组织样品解聚的时间在表1中所指示的。
- 使用从完整的组织样本作为对照衍生冲床活检的相应数字。
- 机械解聚后，吸含有微移植物和地点分别在一个12孔板的单个孔的每个样品的盐溶液。为进行完整控制冲床活检相同的协议。
- 添加补充有10％胎牛血清（FBS）和抗生素，以每个样品的RPMI 1640培养基1ml中。
- 立即评估细胞生存力。到每个孔中含有微移植物（分别由皮肤组织，扣减或真皮八个，三个或四个均匀样品同时分解获得）添加含有0.5毫克/毫升的MTT（3- [介质1毫升4,5-二甲基吡啶-2-基] -2,5-二苯基溴化）溶液，并在5％CO 2 /空气的气氛中，在37℃孵育3小时。为进行完整控制相同的协议冲床活检。
- 温育后，除去所有含培养基的MTT，并添加到每个样品1毫升二甲基亚砜（DMSO）中10分钟。
- 转移的每个样品和DMSO在反应杯并使用分光光度计在570纳米处光密度（OD）读取。计算细胞存活率作为吸光度在570nm和该比在解聚之前使用组织的克数（克）的重量。为进行完整控制冲床活检相同的协议。
- 机械分解后，吸出含有皮肤组织，单个供体的扣减和真皮样品衍生微移植盐溶液。
- 分别将每个样品中的12孔平板的单个孔或在用于分别细胞活力测试和形态分析的培养烧瓶中。
- 培养微移植物加入1ml（12孔板）或5毫升（培养瓶）的RPMI补充有10％FBS的1640培养基和抗生素在37℃在5％CO 2 / Al的气氛r表示24小时或7天。
- 后24小时或7天（重复步骤2.1.8-2.1.10）评估细胞活力。
- 24小时后，并在烧瓶中培养7天后用光学显微镜进行形态分析评估细胞悬浮液的存在。
- 分析真皮的样品阳性的间质和造血细胞标志物，包括CD146，CD34和CD45抗原通过FACS分析6。
- 在层流罩种子每个微接枝和各组织样本的相应小片段不完全分解的（由皮肤组织，分别扣减或真皮八个，三个或四个均匀样品同时分解获得）（> 50微米的尺寸后在含有5％羊血肉汤100μl的哥伦比亚琼脂平板分解处理）。
- 孵育在37℃的板三天，以评估不育上哥伦比亚琼脂板上进行微生物分析11。
2.收集，解体并在组织的体外分析
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Representative Results
在这个初步研究，第一个目的是探讨人类自体微移植与生物支持相结合，如胶原蛋白的生产生物复合物准备使用的能力。这些生物复合物在患者中植入 引起的车祸中（ 图2A）腿部病变和30天后（ 图2B）的组织修复相关的完整的再上皮中观察到。此外，临床随访上升5个月（ 图2C）后显示出已损坏的区域的良好的质地和柔软度，在平行于临床应用，还进行体外研究，以评估不同的皮肤组织的细胞生存力，如皮肤组织的，扣减和真皮前，由该系统分解后。特别是，考虑到每个类型的组织的不同的厚度，八阈值，可以在对皮肤组织，扣减和真皮单一步骤进行处理四加三活检，分别成立。活检的既定数目然后在四个不同的时间分列如表1所示，根据以查明解聚的最佳条件，以维持良好的细胞生存力的生物学特性。
虽然组织处理本身必然诱导相比完整的组织细胞活力的损害，与此系统进行机械解聚似乎皮肤，扣减和真皮的所有样品中，以保持30％的细胞存活率的平均值 在不同的时间（ 图3A），相对于完整的组织（ 图3B）评价（平均92 OD /克为完整皮肤组织和29的OD /克分解后的;从22 OD /克至7 OD /克FOř完好DED相对于分解并最终从16 OD /克至2.7的OD /克用于相对于分解完整真皮）。 因此，这些初步结果表明，该系统能够立即分解后维持细胞活力的可观的水平。解聚对细胞存活率的影响也被研究了24小时或7天及可变结果培养观察组织样本。特别是，细胞活力的皮肤组织样品中没有实质性的变化是由比较起始时间（T 0）（ 图4A）均质化和培养的时间独立地观察到。另一方面，扣减样本的降低存活率后培养24小时相比，起始时间（T 0）被观察到，但令人惊讶的细胞存活率后7天培养的（ 图4B）恢复。类似的结果也被用于真皮的样品观察到的（ 图4C）。每个样品一式两份，并在表2中报道的值进行评价。
在这些结果的基础上，我们确定了分解维持三种皮肤组织的细胞生存力的合适的时间如报道于表3除了细胞活力，培养的细胞悬浮液的形态方面也评价，识别单个细胞之后，从组织分解24小时，同时观察7天有两种皮肤组织和扣减/真皮样品纤维残渣后（ 图5 AB）。另外，通过流式细胞术分析细胞表征真皮的样品中其均化后进行的：由几个细胞类型，包括内皮细胞和间质干细胞组成的细胞的异质池被鉴定（ 图6）。此外，由于没有细菌生长的鉴定我 n的所有样本分类巧接种于琼脂菜，证明实验步骤（ 图7）的无菌。
图1.生物复合 组织 建设 扰乱系统（A）和收集从患者的皮损区超凡的一小块，这是与组织干扰物随后进行分类。获得胶原蛋白海绵结合微移植物的生物复合物以获得人的补丁直接用于病变的修复（C）（D）苏木伊红（H＆E）染色的代表性生物复杂，在DMEM培养基中培养3天，观察到镜检请点击这里查看大图这个数字。
被应用在腿病变（A）的 图上腿病变由胶原和从患者获得的微移植物组成的生物复合2.生物复合物的应用和后30天（B）和5个月伤口进行评价（℃ ）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 有 丝可行性立即在三个类型皮肤组织（A）的不同时间相对完整的皮肤组织（B），皮肤解体后 ，从四个不同的供体的扣减和真皮组织与组织disru分类ptors如表示在文本中的相应部分。细胞活力，一式两份每个组织样本进行MTT检测评估。该图是代表以双份对于各样品进行四种不同的实验。该结果表示为光密度（OD）和组织的克数（克）之间的比率;标准偏差计算对组织的光密度（OD）和克（GR）之间的比率。 请点击此处查看该图的放大版本。
皮肤组织（A）的分列样品 图4. 有 丝生存能力水平，扣减（B）和真皮（三）开始时间（T 0）和继代培养24小时，7天之后，该组织与组织匀浆作为干扰籼TE在文本中的相应部分。在分类样品随后培养解聚24小时后和7天，并保持在RPMI 1640培养基中，在5％CO 2 /空气的气氛中补充有10％胎牛血清和抗生素的，在37℃。如前所述细胞活力通过MTT评估。该图是代表一式两份对皮肤组织，扣减和真皮从单个供体衍生的各样品进行的实验的。结果表现为组织的光密度（OD）和克（GR）之间的比值。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 分门别类的皮肤组织形态分析（A）和后扣减/真皮（B）24小时和邪教的7天 URE。使用后24小时，在RPMI介质对皮肤组织和扣减/真皮组织中存在培养7天后光镜下进行形态分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.通过流式细胞仪分析细胞特征。机械解体后，获得的真皮微移植物放在文化和后7天进行分析，积极为间质细胞和造血细胞标记物，包括CD146，CD34和CD45抗原。 请点击此处查看该图的放大版本。
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分门别类皮肤组织，扣减和真皮样品的分类组织样品的小片段图7. 微生物分析。接种于哥伦比亚琼脂加入下层流罩5％羊血（生物梅里埃公司），在37℃下培养三天进行微生物分析和评估过程的无菌。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 组织样本 | 分解时间（秒/分） |
| 皮肤 | 30秒 |
| 1分钟 | |
| 2分钟 | |
| 5分钟 | |
| 扣减 | 1分钟 |
| 2分钟 | |
| 5分钟 | |
| 10分钟 | |
| 真皮 | 1分钟 |
| 2分钟 | |
| 5分钟 | |
| 10分钟 |
表1.用于皮肤的解体四个不同时代的示意图，扣减和真皮八 ，四，三皮打孔活检，扣减和真皮分别在四个不同的时间分类，根据其生物学特性。
| 皮肤组织 | |||||
| 至 | 24小时 | 7天 | |||
| 2 >“ | 5' | 2' | 5' | 2' | 5' |
| 37.1 | 41.07143 | 41.07143 | 65.78571 | 41.14286 | 37.42857 |
| 35.8 | 43.82143 | 36.60714 | 66.5 | 41.46429 | 38.67857 |
| 扣减 | |||||
| T 0的 | 24小时 | 7天 | |||
| 5' | 10' | 5' | 10' | 5' 10' | |
| 6,649485 | 8.237113 | 5.463918 | 5.731959 | 7.835052 | 7.85567 |
| 6,845361 | 8,360825 | 5.257732 | 5.989691 | 8 | 7.938144 |
| 真皮 | |||||
| 至 | 24小时 | 7天 | |||
| 10' | 5' | 10' | 5' | 10' | |
| 1.690909 | 2.77193 | 0.293898 | 0.786704 | 2.880952 | 2.869048 |
| 1.736364 | 2.830409 | 0.306351 | 0.814404 | 2.940476 2.928571 | |
表2.在范围OD /克表达了一种生物复制价值观。从皮肤组织细胞活力的价值观，扣减和真皮评估，起始时间和机械分解到指定的时间后。结果代表一式两份进行，并表示为组织的光密度（OD）和克（克）之比一个实验的。
| 标本 | 解体时间 |
| 皮肤组织 | 5分钟 |
| 扣减 | 1分钟 |
| 真皮 | 2分钟 |
表3.解体的最佳时机的示意图，以保持各色中一个良好的细胞活力nt的组织样本。之后分别分解的5,1和2分钟，皮肤，扣减和真皮组织样本显示的最佳细胞活力。
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Discussion
这一初步研究表明，通过该协议得到微移植物可与胶原海绵结合，如已经报道了其它临床应用中，以优化微移植物的植入物9的效力，10，特别是，本研究中报道的生物的能力-complexes，通过微移植物和胶原海绵构成的，之后，从临床应用30天佐剂的腿病变的伤口愈合。此外， 在体外结果提供的证据有关此协议的有效性来分解三个不同的皮肤组织，保持可观的细胞存活率都机械解聚后，立即并24小时后和7天培养的。
细胞生存力的这种均化后的维持允许获得仅在一个步骤无菌自体微移植物，避免了大量的操纵。这个证据是一致最近其他文件中，该协议在体外的功效也测试了其他类型的组织，包括骨膜，心脏心房和眼球5直肌的活检。特别是，我们扣减和真皮样品中观察到增加的细胞存活率培养7天之后，可能是由于使用补充有10％胎牛血清的培养基。
除了维持细胞活力的，该系统是安全的，容易使用，并在几分钟内能够以机械地分解不同类型的组织防止细胞结构的破坏，对于细胞分离的传统的方法，如酶需要执行较长的时间消化。此外，该系统能够选择具有50微米的截止细胞和这方面是在考虑可注射微移植物的成功的非常重要的，因为该范围包含祖细胞能够在许多细胞类型的分化，然后改善病变的修复。该协议允许我们不仅获得可行的，但也自体微移植物，因为施主主题也是这些微移植物的受体。这种系统的获得自体微移植物的能力在它已经在非显示出的自体牙髓干细胞的该移植（牙髓干细胞）的牙科领域进行了特别报告所载infrabony缺陷造成牙周修理和萎缩的再生颌骨5,6。这些微移植物的改善的伤口愈合过程的能力也被预先在复杂的伤口手术干预或并发症4后的管理报告。
关于使用自体，并准备使用的微移植物的另一个优点当然是在无菌条件鉴于上皮损它们随后植入物的保存。
总之，本文描述的协议表明创建人微移植组织准备在临床干预用来改善急性/慢性皮肤伤口，例如那些在本研究表明愈合的能力。 在体外结果的可能性，以建立可行的微移植物也有报道并且该参数是肯定显著以增加组织修复成功的百分比。两者合计，该数据表明，这种新的系统，可考虑临床医生谁需要在皮肤伤口的管理的快速和安全仪器的一个有希望的工具。
此刻，没有特别的变更或限制为在此特定的应用的协议，因为皮肤表示的组织很容易使用和在其它研究中，我们报道了不同皮损6,7-相同的协议的功效
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Disclosures
作者安东尼奥·格拉齐亚诺是人类脑电波SRL，生产和市场Rigenera系统的科学主任。笔者莱蒂齐亚已找到是人类脑电波SRL科学分部的合作者
Acknowledgments
作者要感谢费德里卡Zanzottera博士对促进执行流式细胞分析研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rigenera Machine | Human Brain Wave | 79210R | |
| Rigeneracons | Human Brain Wave | 79450S | |
| MTT | Roche Diagnostic GmbH | 11465007001 | |
| RPMI medium | PBI International | 733-2292 | |
| DMEM medium | PBI International | F 0415 | |
| Antibiotics | Biological Industries PBI | 03-038-1 | |
| Antibodies for FACS Analysis | eBiosciences | code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349 for CD34-APC | |
| Columbia agar | BioMerieux Company | 43041 | |
| Condress® | Abiogen Pharma | collagen sponge used for bio-complexes | |
| DMSO | Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL | ||
| NaCl solution | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany | ||
| Xylene | Carlo Erba |
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