Summary
El protocolo describe un nuevo método para desagregar los tejidos humanos y para crear autólogas micro-injertos que, combinado con esponjas de colágeno, dan lugar a complejos biológicos humanos listos para su uso en el tratamiento de lesiones de la piel. Además, este sistema preserva la viabilidad celular de micro-injertos en diferentes momentos después de la disgregación mecánica.
Abstract
Varios de los nuevos métodos han sido desarrollados en el campo de la biotecnología para obtener suspensiones celulares autólogas durante la cirugía, con el fin de proporcionar uno tratamientos paso para lesiones de la piel agudas y crónicas. Por otra parte, el tratamiento de las heridas agudas crónicas, sino también como resultado de un traumatismo, diabetes, infecciones y otras causas, sigue siendo un reto. En este estudio se describe un nuevo método para crear autólogas micro-injertos de tejido cutáneo de un solo paciente y su aplicación clínica. Por otra parte, también se llevó a cabo la caracterización biológica in vitro de tejido cutáneo derivadas de la piel, la dermis de-epidermized (DED) y la dermis de múltiples órganos y / o donantes de múltiples tejidos. Todos los tejidos se desagregan por este nuevo protocolo, que nos permite obtener micro-injertos viables. En particular, se informó de que este innovador protocolo es capaz de crear bio-complejos compuestos por autólogas micro-injertos y esponjas de colágeno lista para ser aplicada sobre lesiones en la piel. el CliniTambién se informó de aplicación cal de autólogas bio-complejos en una lesión de la pierna, mostrando una mejora tanto de proceso de re-epitalization y suavidad de la lesión. Además, nuestro modelo in vitro mostraron que la viabilidad celular después de la disgregación mecánica con este sistema se mantiene en el tiempo para un máximo de siete (7) días de cultivo. También se observó, por citometría de flujo análisis, que el grupo de células obtenidas de desagregación se compone de varios tipos de células, incluyendo células madre mesenquimales, que ejercen un papel clave en los procesos de regeneración y reparación de tejidos, por su alto potencial de regeneración. Por último, hemos demostrado in vitro que este procedimiento mantiene la esterilidad del micro-injertos cuando se cultiva en placas de agar. En resumen, se concluye que este nuevo enfoque regenerativo puede ser una herramienta prometedora para los médicos para obtener en un solo paso viable, estéril y listo para usar micro-injertos que se pueden aplicar solos o en combinación con más Scaffo biológica comúnLDS.
Introduction
En los últimos años, varios métodos nuevos han sido desarrollados en el campo de la biotecnología para obtener suspensiones celulares autólogas durante la cirugía con el fin de proporcionar tratamientos de un solo paso para lesiones de la piel agudas y crónicas. Por otra parte, el tratamiento de las heridas agudas pero sobre todo crónicas que resultan de un traumatismo, diabetes, infecciones y otras causas, sigue siendo un reto. Hay una creciente evidencia de que las heridas crónicas se han convertido en un grave problema de salud mundial, provocando una enorme carga financiera para los sistemas sanitarios en todo el mundo 1.
Para aumentar la tasa de éxito en el tratamiento de lesiones de la piel, la ausencia de manipulación extensa (incluyendo la mejora celular) y el mantenimiento de condiciones estériles son esenciales, con el fin de crear una suspensión celular que se puede aplicar inmediatamente sobre el área dañada de la los pacientes, evitando de ese modo un procesamiento más largo en salas limpias, como fábricas celulares. StArting de pequeñas biopsias de piel, molienda, centrifugación y otros métodos de separación (por ejemplo, enzimática o mecánica), se utilizan con frecuencia para obtener una suspensión celular, que pueden ser cultivadas en un medio de crecimiento. Todos estos métodos generalmente requieren mucho tiempo de ejecución, haciendo hincapié en las estructuras de las células, y que conduce a una reducción de la viabilidad celular. Otro aspecto importante es el de obtener una suspensión celular autólogo listo para ser utilizado por los médicos, por ejemplo, para reparar las áreas dañadas. Por otra parte, es bien sabido que los injertos de tejidos autólogos sobreviven los procedimientos de transferencia de sobrevivir el tiempo en el sitio receptor por los principios de la inducción y conducción 2, 3. El injerto de tejido ideal debe estar fácilmente disponible y tienen una baja antigenicidad y donantes morbilidad del sitio 4.
Sobre la base de estas evidencias, el primer objetivo de este estudio fue la creación de bio-complejos autólogos adecuados paraaplicación clínica en la reparación de tejidos. Para este fin, se describe un nuevo método para obtener autólogas micro-injertos a partir de los tejidos cutáneos que fueron desglosados por este protocolo. Presentación de un caso en el presente documento también se describe como una aplicación clínica de micro-injertos autólogos obtenidos mediante este protocolo en combinación con esponjas de colágeno. Este enfoque ya se ha informado que ser eficiente en la disgregación mecánica de los tejidos humanos 5 y se ha utilizado clínicamente para injertos y regeneración de los tejidos dérmicos 6,7, así como para terapias regenerativas de los tejidos conectivos en la cirugía oral y maxilofacial 8-10 .
Además, el segundo objetivo de este estudio fue la caracterización biológica de los tejidos cutáneos después de su desagregación por este protocolo. Para este fin, las diferentes muestras de tejido cutáneo homólogas derivan de la zona del tronco de diferentes multiorgánicay / o donantes múltiples tejidos fueron procesadas siguiendo las normas nacionales sobre la recolección, procesamiento y distribución de tejidos para trasplante (CNT 2013) en la piel de Emilia Romagna regional del Banco.
PRESENTACIÓN DEL CASO:
Una paciente de 35 años de edad, que muestra un trauma complejo debido a accidente de coche fue ingresado en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Ancona. El paciente presentó una infección en la pierna debido a una herida abierta y una fractura estabilizada con fijación externa. Dos desbridamiento radical y se llevaron a cabo cuando la herida se limpia después de la terapia de presión negativa (VAC) y el periostio parecían sanos, se les aplicó el protocolo después de dos meses de recuperación. Después de la disgregación con este sistema, se utilizaron los micro-injertos obtenidos para crear bio-complejos con una esponja de colágeno que se implanta posteriormente con el fin de investigar su eficacia en la reparación de la lesión.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaración de la ética: desde la aplicación clínica del protocolo requiere el uso de tejido autólogo cutánea del paciente, su caracterización in vitro se realizó antes de su uso clínico en el tejido cutáneo homóloga en el Bank Emilia Romagna Regional de la piel siguiendo las directrices de las normas nacionales sobre la recolección, procesamiento y distribución de tejidos para trasplante (CNT 2013).
1. Edificio Bio-complejo para la aplicación clínica
NOTA: Este protocolo se basa en el uso clínico de Rigeneracons (disruptores tejido) y la máquina Rigenera (sistema disruptor de tejidos) (Figura 1A). El disruptor de tejidos es un disruptor médica biológica de los tejidos humanos capaces de interrumpir pequeños trozos de tejidos usando una rejilla proporcionada por cuchillas hexagonales y células de filtrado y componentes de matriz extracelular con un punto de corte de alrededor de 50 micras.
- Recoger skinsamples del paciente a través de un biopsy punzón (Figura 1B) y desagregar la adición de 1 ml de solución salina para cada pieza para obtener autólogas micro-injertos 6,7,9 (o véase el paso 2.1).
- Colocar 1 ml de micro-injertos en esponjas de colágeno (Figura 1C) toform bio-complejos a utilizar para la aplicación clínica.
- Cultura otro 1 ml de micro-injertos en esponjas de colágeno en presencia de 6 ml de medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% humidificada.
- Después de 3 días de cultivo, fijar los bio-complejos con 0,3% de paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente. Verter la parafina con un dispensador específico directamente sobre la muestra. Obtener rodajas con un micrótomo con un espesor de 5 micras y poner directamente en un vaso-deslizante.
- Sumergir las rebanadas de parafina de 5 micras en un vaso para análisis histológicos, que contiene 15 - 20 ml de xileno (disponible en el mercado - una mezcla de m-xileno (40 - 65%), p-xileno (20%), o-xileno (20% ) y ETHbenceno il (6-20%) y trazas de tolueno, benceno trimetil, fenol, tiofeno, piridina y sulfuro de hidrógeno) durante 3 min cada uno.
- Sumergir las rebanadas en la disminución de los grados (100% a 70%) de etanol (100% de etanol durante 1 hora, 95% de etanol durante 1 hr, 80% de etanol durante 1 hora, 70% de etanol durante 1 hr) y agua entonces desionizada para de-paraffinizing y rehidratación de las secciones.
- Manchar las secciones con 1 - 2 ml de 1 g / L Ematoxylin por 1 - 2 min y posteriormente enjuague con agua para eliminar cualquier excedente Ematoxylin.
- Tinción de las secciones de 4-5 min con solución alcohólica de eosina Y al 1% de la concentración se mezcla con etanol 70% y se diluyeron en agua.
- Utilice 1 - 2 ml de eosina Y para cada sección portaobjetos y enjuagar con agua corriente.
- Sumergir las secciones en el aumento de los grados de etanol (véase el paso 1.6) y finalmente, después de un pasaje en xileno durante 1 hora, cubreobjetos con un montaje basado mediumand observar bajo un microscopio óptico a 100X aumentos (Figura 1D). </ Ol>
- El uso de un dermatoma, tomar tejido independiente de la piel, dermis papilar de-epidermized (DED) o dermis reticular (dermis), respectivamente, de 0,6 mm, 1 mm o 2 mm de espesor de la zona del tronco de 4 diferente de múltiples órganos y / o multi- donantes de tejidos en un intervalo de 40 a 55 años, siguiendo las normas nacionales sobre la recolección, procesamiento y distribución de tejidos para trasplante (CNT de 2013).
- Enjuague suavemente todas las muestras en solución de NaCl al 0,9% ponerlos en un plato en un agitador orbital durante 5 min.
- Utilizando el punzón de biopsia de 5 mm, crear muestras que son uniformes en diámetro desde el tejido de la piel, Ded y dermis y pesan todas las muestras de tejido antes de la disgregación.
- Inserte ocho, tres o cuatro muestras uniformes de tejido de la piel, Ded o Dermis respectivamente, en el disruptor de tejidos, la adición de 1,5 ml de solución salina para la desagregación.
- realizar diferentestiempos de disgregación para todas las muestras de tejido como se indica en la Tabla 1.
- Utilice un número correspondiente de biopsias obtenidas a partir de muestras de tejido intacto como controles.
- Después de desagregación mecánica, aspirar la solución salina que contiene micro-injertos y lugar por separado cada muestra en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos. Realice el mismo protocolo para biopsias por punción de control intacto.
- Añadir 1 ml de RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos para cada muestra.
- Evaluar la viabilidad de las células inmediatamente. A cada pocillo que contiene un micro-injerto (obtenido por la desagregación simultánea de ocho, tres o cuatro muestras uniformes de tejido de la piel, Ded o Dermis respectivamente) añadir 1 ml de medio que contenía 0,5 mg / ml de MTT (3- [4,5- dimetiltiazol-2-il] bromuro) solución 2,5 difeniltetrazolio y se incuba durante 3 horas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 / aire. Realizar el mismo protocolo para el control intactobiopsias por punción.
- Después de la incubación, retirar todo medio que contenía MTT y añadir a cada muestra 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) durante 10 min.
- Transferir cada muestra y DMSO en una cubeta y se leyó a densidad óptica (DO) a 570 nm usando un espectrofotómetro. Calcular la viabilidad celular como la relación de la absorbancia a 570 nm y el peso en gramos (gr) de tejido utilizados antes de desagregación. Realice el mismo protocolo para biopsias por punción de control intacto.
- Después de desagregación mecánica, aspirar la solución salina que contiene micro-injerto procedentes de tejidos de la piel, las muestras Ded y la dermis de un solo donante.
- Colocar cada muestra por separado en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos o en un frasco de cultivo para el ensayo de viabilidad celular y análisis morfológico respectivamente.
- Cultura micro-injertos adición de 1 ml (placa de 12 pocillos) o 5 ml (frasco de cultivo) de RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB y antibióticos a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 / air durante 24 horas o 7 días.
- Evaluar la viabilidad de las células después de 24 horas o 7 días (repita los pasos 2.1.8-2.1.10).
- Realizar análisis morfológico evaluar la presencia de suspensión celular por microscopía de luz después de 24 horas y 7 días de cultivo en matraz.
- Analizar las muestras de la dermis para la positividad a la mesenquimales y marcadores de células hematopoyéticas, incluyendo antígenos CD146, CD34 y CD45 por FACS análisis 6.
- Bajo semilla campana de flujo laminar cada micro-injerto (obtenido por la desagregación simultánea de ocho, tres o cuatro muestras uniformes de tejido de la piel, Ded o Dermis respectivamente) y un corresponsal pequeño fragmento de cada muestra de tejido no totalmente desagregado (> 50 micras de tamaño después del proceso de desagregación) en la placa de agar Columbia que contiene 5% de sangre de oveja caldo de 100 l.
- Incubar la placa a 37 ° C durante tres días y realizar análisis microbiológico en Columbia placa de agar con el fin de evaluar la esterilidad 11.
2. Recolección, el desglose y análisis in vitro de los tejidos
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este estudio preliminar, el primer objetivo fue investigar la capacidad de las micro-injertos autólogos humanos combinados con un soporte biológico, como el colágeno, para producir bio-complejos listos para usar. Estos bio-complejos fueron implantados en un paciente con una lesión de la pierna causada por un accidente de coche (Figura 2A) y una reepitelización completa asociada con la reparación de tejidos después de 30 días (Figura 2B) se observó. Además, el seguimiento clínico mostró una buena textura y suavidad de la zona dañada después de 5 meses (Figura 2C). En paralelo a la aplicación clínica, también se llevaron a cabo estudios in vitro para evaluar la viabilidad de las células de diferentes tejidos cutáneos tales como tejido de la piel , Ded y dermis antes y después de la desagregación por este sistema. En particular, teniendo en cuenta el diferente grosor de cada tipo de tejido, el umbral de ocho,cuatro y tres biopsias que se pueden procesar en un solo paso para el tejido de la piel, Ded y dermis, respectivamente, se estableció. Entonces se desagrega el número establecido de biopsias en cuatro momentos diferentes, como se indica en la tabla 1, de acuerdo con sus características biológicas a fin de identificar la condición óptima de desagregación para mantener una buena viabilidad celular.
Aunque el procesamiento de tejido en sí inevitablemente indujo un deterioro de la viabilidad celular en comparación con el tejido intacto, la desagregación mecánica realizado con este sistema parece mantener un valor medio de la viabilidad celular de 30% en todas las muestras de piel, dermis y Ded evaluado en diferentes momentos (figura 3A), con respecto al tejido intacto (Figura 3B) (media de 92 OD / gr de tejido de la piel intacta y 29 OD / gr después de desagregación; de 22 OD / gr a 7 OD / gr for intacta Ded con respecto a la desagregación y, finalmente, del 16 OD / gr a 2,7 OD / gr para la dermis intactas con respecto a la desagregación). Por lo tanto, estos resultados preliminares muestran que este sistema es capaz de mantener niveles apreciables de la viabilidad celular después de la disgregación inmediata. El efecto de desagregación sobre la viabilidad celular fue también investigada en muestras de tejido cultivado durante 24 horas o 7 días y los resultados se observaron variables. En particular, no se observó ninguna variación sustancial de la viabilidad celular en las muestras de tejido de la piel de forma independiente por el tiempo de la homogeneización y la cultura comparación con el tiempo de inicio (T 0) (Figura 4A). Por otro lado, una reducción de la viabilidad de las muestras Ded después de 24 horas de cultivo en comparación con el tiempo de inicio (T 0) se observó, pero sorprendentemente la viabilidad celular fue restaurada después de 7 días de cultivo (Figura 4B). También se observaron resultados similares para muestras de la dermis (Figura 4C). Cada muestra se evaluó por duplicado y los valores reportados en la Tabla 2.
Sobre la base de estos resultados, hemos identificado el momento adecuado de desagregación para mantener la viabilidad celular para tres tipos de tejido cutáneo como se informa en la Tabla 3. Además de la viabilidad celular, también se evaluó el aspecto morfológico de la suspensión celular cultivada, la identificación de células individuales después de 24 horas a partir de desagregación tisular, mientras que se observaron después de 7 días allí restos de fibras, tanto en tejidos de la piel y las muestras Ded / dermis (Figura 5 AB). Además, una caracterización de células por citometría de flujo análisis se realizó en una muestra de dermis después de su homogeneización: una piscina heterogénea de células compuestas por varios tipos celulares, incluyendo las células endoteliales y las células madre mesenquimales se identificó (Figura 6). Además, se identificó la ausencia de crecimiento bacteriano i n todas las muestras desglosados oportunamente sembraron en placas de agar, que evidencia la esterilidad del procedimiento experimental (Figura 7).
Figura 1. Bio-Tissue complejos Building System Disrupting (A) y percepción de un pequeño trozo de Derma desde el área de la lesión del paciente que posteriormente fue desglosada con Disruptores de tejidos. Se obtuvieron los bio-complejos de la combinación de los micro-injertos en esponjas de colágeno para obtener los parches humanos listo para usar para la reparación de la lesión (C). (D) hematoxilina y eosina (H & e) tinción de un representante de bio-complejo se cultivaron durante tres días en medio DMEM y se observa al microscopio Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Aplicación Bio-complejos en la pierna Lesión Los bio-complejos compuestos por colágeno y micro-injertos obtenidos del paciente se han aplicado sobre la lesión de la pierna (A) y se evaluó la herida después de 30 días (B) y 5 meses (C ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. C ell Viabilidad Inmediatamente después de la desagregación en diferentes momentos del tipo tres de los tejidos cutáneos (A) con respecto a los tejidos cutáneos intactos (B). La piel, los tejidos y la dermis Ded derivados de cuatro donantes diferentes grupos de análisis con el tejido disruptors como indican en la sección correspondiente en el texto. La viabilidad celular se evaluó mediante la prueba de MTT realizado por duplicado para cada muestra de tejido. La gráfica es representativa de cuatro experimentos diferentes realizados por duplicado para cada muestra. Los resultados se expresan como una relación entre la densidad óptica (OD) y gramos (gr) de tejido; la desviación estándar se calculó sobre la relación entre la densidad óptica (DO) y gramos (gr) de tejido. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Niveles C ell viabilidad de una muestra de tejido de la piel desagregados (A), Ded (B) y la dermis (C) al tiempo (t 0) Inicio y después del subcultivo durante 24 horas y 7 días. Los tejidos se homogeneizaron con el tejido disruptores como indicate en la sección correspondiente en el texto. Las muestras fueron desagregados posteriormente se cultivaron durante 24 hr y 7 días después de la desagregación y se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10% y antibióticos a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 / aire. La viabilidad celular se evaluó mediante MTT como se describió anteriormente. El gráfico es representativo de un experimento llevado a cabo por duplicado para cada muestra de tejido de la piel, Ded y dermis derivada de un solo donante. Los resultados se expresan como la relación entre la densidad óptica (DO) y gramos (gr) de tejido. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Análisis morfológico de los tejidos de la piel desglosados (A) y Ded / Dermis (B) después de 24 horas y 7 días de Culto Ure. El análisis morfológico se realizó mediante microscopía de luz después de 24 horas y 7 días de cultivo en presencia de medio RPMI el tejido de la piel y de los tejidos de la dermis / Ded. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Caracterización de la célula por el análisis de citometría de flujo. Después de desagregación mecánica, micro-injertos obtenidos por la dermis se pusieron en cultivo y después de 7 días se analizaron para determinar la positividad mesenquimal y el marcador de células hematopoyéticas, incluyendo antígenos CD146, CD34 y CD45. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Les / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg "/>
Figura 7. Análisis microbiológico del tejido de la piel desagregados, Ded muestras y la dermis. Pequeños fragmentos de muestras de tejido desagregados se sembraron en agar Columbia adicional de 5% de sangre de oveja (BioMérieux Company) bajo campana de flujo laminar y se incuba a 37 ° C durante tres días para realizar el análisis microbiológico y evaluar la esterilidad del procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Las muestras de tejido | DESGLOSE El TIMES (seg / min) |
| Piel | 30 segundos |
| 1 minuto | |
| 2 minutos | |
| 5 minutos | |
| Ded | 1 minuto |
| 2 minutos | |
| 5 minutos | |
| 10 minutos | |
| Dermis | 1 minuto |
| 2 minutos | |
| 5 minutos | |
| 10 minutos |
Tabla 1. Representación esquemática de los cuatro momentos diferentes usado para la disgregación de la piel, y la dermis. Ded ocho, cuatro y tres biopsias por punción de la piel, Ded y dermis, respectivamente, se desagrega en cuatro momentos diferentes, en función de sus características biológicas.
| tejido de la piel | |||||
| A | 24 hr | 7 días | |||
| 2 ' | 5 ' | 2 ' | 5 ' | 2 ' | 5 ' |
| 37.1 | 41.07143 | 41.07143 | 65.78571 | 41.14286 | 37.42857 |
| 35.8 | 43.82143 | 36.60714 | 66.5 | 41.46429 | 38.67857 |
| Ded | |||||
| T 0 | 24 hr | 7 días | |||
| 5 ' | 10 ' | 5 ' | 10 ' | 5 ' 10 ' | |
| 6,649485 | 8.237113 | 5.463918 | 5.731959 | 7.835052 | 7.85567 |
| 6,845361 | 8,360825 | 5.257732 | 5.989691 | 8 | 7.938144 |
| Dermis | |||||
| A | 24 hr | 7 días | |||
| 10 ' | 5 ' | 10 ' | 5 ' | 10 ' | |
| 1.690909 | 2.77193 | 0.293898 | 0.786704 | 2.880952 | 2.869048 |
| 1.736364 | 2.830409 | 0.306351 | 0.814404 | 2.940476 2.928571 | |
Tabla 2. Rango de valores expresados en OD / gr de un replicar Biológica. Los valores de viabilidad celular del tejido de la piel, la dermis y Ded evaluada al momento de arranque y después de la disgregación mecánica a los tiempos indicados. Los resultados son representativos de un experimento realizado por duplicado y se expresó como relación entre la densidad óptica (OD) y en gramos (gr) de tejido.
| Muestra | Tiempo de desagregación |
| tejido de la piel | 5 minutos |
| Ded | 1 minuto |
| Derma | 2 minutos |
Tabla 3. Representación esquemática de la mejor experiencia de desagregación para mantener una buena viabilidad celular en Different Las muestras de tejido. Piel, Ded y muestras de tejidos dermis muestran la viabilidad celular óptimo después de 5, 1 y 2 min de desagregación, respectivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este estudio preliminar demostró que micro-injertos obtenidos por este protocolo se pueden combinar con esponjas de colágeno, como ya se ha informado en otras aplicaciones clínicas, para optimizar la eficacia de los implantes de micro-injertos 9, 10. En particular, este estudio informó de la capacidad de bio -complexes, constituido por micro-injertos y esponjas de colágeno, el tratamiento adyuvante de la cicatrización de la herida de una lesión de la pierna después de 30 días a partir de la aplicación clínica. Por otra parte, los resultados in vitro proporcionan evidencia sobre la eficacia de este protocolo para desglosar tres diferentes tejidos cutáneos, manteniendo una viabilidad celular apreciable tanto inmediatamente después de la disgregación mecánica y también después de 24 horas y 7 días de cultivo.
El mantenimiento de la viabilidad de las células después de este tipo de homogeneización permite obtener en micro-injertos autólogos sólo un paso estériles, evitando extensa manipulación. Esta evidencia está de acuerdocon otros trabajos recientes en los que se puso a prueba la eficacia de este protocolo in vitro también en otro tipo de tejidos, incluyendo el periostio, la biopsia de la aurícula cardíaca y músculo recto lateral del globo ocular 5. En particular, se observó en las muestras de Ded y la dermis un aumento de la viabilidad de las células después de 7 días de cultivo, probablemente debido a la utilización de un medio suplementado con suero bovino fetal 10%.
Además del mantenimiento de la viabilidad celular, este sistema es seguro y fácil de usar y en unos pocos minutos es capaz de desagregar mecánicamente los diferentes tipos de tejidos que impiden la interrupción de las estructuras celulares, con respecto a los métodos tradicionales de aislamiento de células, tales como enzimática digestión que requieren más tiempo de ejecución. Además, este sistema es capaz de seleccionar las células con un punto de corte de 50 micras y este aspecto es muy importante en la consideración del éxito de inyectables micro-injertos, ya que esta gama incluyecélulas progenitoras capaces de diferenciarse en muchos tipos de células y luego mejorar la reparación de la lesión. Este protocolo nos permite no sólo para obtener micro-injertos autólogos viables sino también, dado que el tema de los donantes es también el aceptor de estos micro-injertos. La capacidad de este sistema para obtener autólogas micro-injertos se informó en especial en el campo de la odontología, donde se ha demostrado que el trasplante autólogo de células madre de pulpa dental (DPSCs) en un país que no contenía defecto infraóseo contribuyó a la reparación y regeneración de atrófica periodontal maxila 5,6. La capacidad de estos micro-injertos para mejorar el proceso de cicatrización de heridas También se informó previamente en el tratamiento de las heridas después de intervenciones quirúrgicas complejas o complicaciones 4.
Otra ventaja en el uso de autólogo y listo para usar micro-injertos es sin duda el mantenimiento de condiciones estériles en vista de su posterior implante en las lesiones de la piel.
En conclusión, el protocolo descrito en este trabajo demostró la capacidad de crear el tejido de micro-injerto humano listo para usar en la intervención clínica para mejorar la cicatrización de heridas cutáneas agudas / crónicas, como las que se indican en este estudio. Los resultados in vitro sobre la posibilidad de crear micro-injertos viables también se han reportado y este parámetro es ciertamente importante para aumentar el porcentaje de éxito en la reparación de los tejidos. Tomados en conjunto, los datos mostraron que este nuevo sistema podría ser considerada como una herramienta prometedora para los médicos que están en necesidad de un instrumento rápido y seguro en el tratamiento de heridas de la piel.
Por el momento, no hay modificaciones o limitaciones particulares para el protocolo en esta aplicación específica, dado que la piel representa un tejido fácil de usar y en otros estudios que informó de la eficacia del mismo protocolo en diferentes lesiones de la piel 6,7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
El autor Antonio Graziano es el director científico del cerebro humano de la onda srl que produce y comercializa el sistema Rigenera. El autor Letizia Trovato es un colaborador de la División Científica de Human Brain Wave srl
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Dra Federica Zanzottera para contribuir a la realización de estudios de análisis de citometría de flujo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rigenera Machine | Human Brain Wave | 79210R | |
| Rigeneracons | Human Brain Wave | 79450S | |
| MTT | Roche Diagnostic GmbH | 11465007001 | |
| RPMI medium | PBI International | 733-2292 | |
| DMEM medium | PBI International | F 0415 | |
| Antibiotics | Biological Industries PBI | 03-038-1 | |
| Antibodies for FACS Analysis | eBiosciences | code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349 for CD34-APC | |
| Columbia agar | BioMerieux Company | 43041 | |
| Condress® | Abiogen Pharma | collagen sponge used for bio-complexes | |
| DMSO | Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL | ||
| NaCl solution | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany | ||
| Xylene | Carlo Erba |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
- Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
- Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
- Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18 (2), 59-70 (2001).
- Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. , (2015).
- Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4 (4), 268-274 (2014).
- Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1 (3), 3 (2014).
- Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34 (3), s27-s33 (2014).
- Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1 (2), 20 (2013).
- Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17 (5), 644-647 (2013).
- Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).
