Abstract
الجينوم تحرير الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) يوفر منصة التحكم وراثيا وذات الصلة سريريا من خلاله فهم التنمية البشرية وتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للمرض. من خلال توظيف nucleases في مواقع محددة (أرقام الضمان الاجتماعي) لتحرير الجينوم، والاشتقاق السريع للخطوط hPSC جديدة إيواء تغيرات جينية محددة في بيئة إسوي خلاف ذلك يصبح ممكنا. إصبع الزنك nucleases (ZFNs)، النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs) وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / Cas9 هي أرقام الضمان الاجتماعي الأكثر استخداما. كل هذه nucleases تعمل عن طريق إدخال كسر DNA مزدوج الجديلة في موقع محدد، وبالتالي تعزيز تحرير الجين الدقيق في مكان الجيني. SSN التأمل تحرير الجينوم يستغل اثنين من آليات الخلية الذاتية إصلاح الحمض النووي، ونهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ) وتناظر إصلاح موجهة (HDR)، إما لتقديم الإدراج / طفرات الحذف أو بديلإيه الجينوم باستخدام قالب إصلاح مثلي في موقع كسر مزدوج الجديلة. Electroporation للمن hPSCs هو وسيلة فعالة لtransfecting أرقام الضمان الاجتماعي والقوالب إصلاح التي تضم الجينات المحورة مثل صحفيين الفلورسنت وأشرطة المقاومة للمضادات الحيوية. بعد Electroporation لل، فمن الممكن لعزل فقط تلك hPSCs التي أدرجت بناء إصلاح عن طريق اختيار لمقاومة المضادات الحيوية. فصل ميكانيكيا المستعمرات hPSC ويؤكد التكامل السليم في الموقع المستهدف من خلال التنميط الجيني يسمح لعزل خطوط الخلايا المستهدفة بشكل صحيح ومتجانسة وراثيا. ويتضح من صحة هذا البروتوكول هنا باستخدام كل المنابر SSN ثلاثة لدمج EGFP والمقاومة بوروميسين بناء في AAVS1 آمن مكان الميناء في الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان.
Introduction
وتكنولوجيات تحرير الجينوم يتطور بسرعة إلى الأدوات القياسية لالجزيئي والخلوي علم الأحياء 1. الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) هي ذات أهمية خاصة باعتبارها تمثل hPSCs مصدر تجديد الذات من خلايا الإنسان الأساسية سليمة وراثيا. يمكن أن تكون متباينة hPSCs إلى أنواع الخلايا المختلفة لنمذجة مرض أو كمصدر لعلاجات زرع 2،3. تظاهر هنا هو بروتوكول التي تستخدم ثلاثة أنواع مختلفة من nucleases في مواقع محددة (أرقام الضمان الاجتماعي) بالتعاون مع آليات إصلاح الحمض النووي الذاتية للتكامل المستهدفة من بناء مراسل في موضع AAVS1. بعد ترنسفكأيشن من أرقام الضمان الاجتماعي إلى hPSCs، نحن لشرح كيفية عزل السكان خلية إسوي إيواء مراسل.
القدرة على التعامل مع العوامل الوراثية، وتحديدا المحفزة وقف جينوم الخلية، وذلك باستخدام أرقام الضمان الاجتماعي ليست ظاهرة جديدة وفائدة nucleases إصبع الزنك (ZFNs) والنسخ activatوقد تجلى nucleases المستجيب أو مثل (TALENs) لتحرير الجين عدة سنوات قبل 10/4. ومع ذلك، مع ظهور S. المقيحة كريسبر / تكنولوجيا Cas9 11-13، أصبح التحرير الجينات يمكن الوصول إليها على نطاق واسع (14). جميع أرقام الضمان الاجتماعي إدخال مزدوج كسر DNA الذين تقطعت بهم السبل (DSB) في موقع الهدف المحدد 1،4،5،11 أن يتم إصلاحه من قبل الآليات الخلوية المحلية باستخدام إما غير مثلي إصلاح (NHEJ)، الانضمام إلى نهاية أو تناظر الموجهة (HDR) 15. NHEJ هو عرضة للخطأ ويمكن أن يعرض إطار الطفرات التحول مما أدى إلى فقدان وظيفة الجين، بينما HDR يسمح لعناصر جديدة إلى أن قدم من خلال التعاون ترنسفكأيشن من قالب إصلاح مع SSN. في حين يعتقد أن المبادئ الأساسية لإصلاح الحمض النووي التي تسهل التحرير الجينات أن يكون في حد ذاته لكل SSN، ويمكن ملاحظة بعض الاختلافات بين الأنظمة الأساسية. دي نوفو تصميم ZFNs يسمح المرونة ونوكلياز الأمثل 16، إلا أن استخدام علنامكتبات التجمع المتاحة وأدوات الفحص لتصميم ZFNs الفردية يمكن أن يكون مضيعة للوقت. مرة واحدة يتم تحديد مكان المطلوب لاستهداف ZFN بوساطة، أزواج ZFN يمكن تصميم مع شبكة الإنترنت أداة ZiFit 17. بعد تصميم، ZFNs يمكن تجميعها مجزأة من خلال عدة جولات من البلازميد الاستنساخ 18. بدلا من ذلك، هناك العديد من، ZFNs المصادق عليها مسبقا ومتوفرة تجاريا 19. ويمكن أيضا nucleases حكاية أن تصمم باستخدام أدوات الإنترنت والمكونات المتوفرة علنا 17،20. على سبيل المثال، TALENs يمكن تجميعها بسرعة من كتل خمسة يكرر حكاية، من خلال FLASH تجميع 21 أو باستخدام PCR أساس هرمي جولدن جيت التجمع 22. سهولة تصميم SSN وسرعة البناء باستخدام كريسبر / Cas9 جعلت الجينوم تحرير أداة يمكن الوصول إليها على نطاق واسع. دليل قصيرة بوساطة RNA استهداف كريسبر / Cas9 كما يسمح لمضاعفة من الرنا دليل لاستهداف عدة مواضع مع بناء واحد 14. التصميممن Cas9 لتحرير الجين يتطلب فقط التعرف على عزر المجاور protospacer (PAM؛ وثلاثي النوكليوتيد NGG لS. المقيحة Cas9) الأقرب إلى مكان الهدف. من خلال إدخال قليل النوكليوتيد الموافق 20 أزواج قاعدة 5 'من حزب الأصالة والمعاصرة في البلازميد px330 14، وبناء يمكن تجميعها في خطوة الاستنساخ واحد. بالإضافة إلى S. المقيحة Cas9، Cas9 من N. السحائية (NmCas9) أن يعترف 5'-NNNNGATT-3 "(PAM) وقد تبين للسماح للكفاءة الجينات التحرير في hPSCs 23.
بالإضافة إلى الاختلافات في سهولة تصميم SSN، كل منصة لديه خصائص معينة. على سبيل المثال، ZFNs وTALENs استخدام المجال نوكلياز FokI، الذي يولد أربعة النوكليوتيدات 5 'عبء 24 في حين يعتقد Cas9 لتوليد معظمهم فظة DSBs العضوية. ZFNs، TALENs، وCas9 تختلف في بثبات البروتين، ومعدل على الخروج على DNA الهدف، وطريقة المسح DNA، والتي جولد ينتج نظريا في الفروق الصغيرة في نتائج التحرير 1. في حين سيتم حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم كامل للعواقب هذه الخلافات، ونحن هنا وصف البروتوكول الذي هو قوي للغاية في جميع المنصات الثلاث، ويمكن استخدامها لتوليد بسهولة hPSCs المعدلة وراثيا.
بغض النظر عن اختيار SSN، Electroporation للهو إجراء قوي ل transfect أرقام الضمان الاجتماعي والقوالب إصلاح تناظر في hPSCs 25. عدد الباقين على قيد الحياة المستعمرات بعد اختيار المقاومة للمضادات الحيوية يعتمد على المعلمات مكان محدد واستراتيجية التحرير (على سبيل المثال، حجم إدراج المعدلة وراثيا وطريقة اختيار). بروتوكول الموصوفة هنا النتائج عادة في حوالي 150-400 المستعمرات وحيدة الخلية مشتقة.
وقد سبق أن استخدمت في موضع AAVS1 باستخدام هذا البروتوكول والتعديل الجيني لإثبات فعالية أرقام الضمان الاجتماعي 4،5. يستخدم قالب إصلاح AAV-CAGGS-EGFP فخ الجين شارعategy للتشاور المقاومة بوروميسين بطريقة محددة موضع. لفترة وجيزة، القالب الإصلاح يحتوي موقع متقبل لصق المنبع من كاسيت promoterless المقاومة بوروميسين. على الاندماج الصحيح في إنترون الأول من هذا الجين PPP1R12C في موضع AAVS1، وأعرب عن الكاسيت المقاومة من مروج الجين تحريرها و. متانة هذا الاختبار AAVS1 محددة تسمح لنا لمقارنة كفاءة كل منصة SSN.
التحرير الجينات باستخدام أرقام الضمان الاجتماعي هي قوية نظرا لقدرتها على تعطيل و / أو تعديل نظريا أي الجينات. تطبيق هذه الاستراتيجية إلى hPSCs يوفر براعة كما hPSCs يمكن أن تكون متباينة في وقت لاحق إلى العديد من أنواع الخلايا البشرية مثل الخلايا العصبية 26، 27 خلايا الكبد، والعضلية 28. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام يسببها الخلايا الجذعية المحفزة المشتقة من المريض يسمح للإصلاح أو إدخال تعرف الطفرات المسببة للأمراض في الخلفية الوراثية المريض محددة 29 30. باختصار، تحرير الجين في hPSCs هو نهج فعال وتنوعا للتحقيق في البيولوجيا الأساسية للتنمية البشرية ومرض 31.
Protocol
وتم استعراض الإجراءات الموضحة في هذه المخطوطة التي وافقت عليها لجنة الرقابة بحوث جامعة كاليفورنيا في بيركلي الخلايا الجذعية.
1. إعداد الخلايا الجذعية للتحرير
- النمو والخلايا الجذعية المحفزة ثقافة الإنسان (hPSCs) على طبق من 6 جيدا تحتوي على 2.4 × 10 6 خلايا / لوحة الماوس المعطل C-ميتوميسين الليفية الجنينية (MEF) مغذيات نمت على الجيلاتين 32. الحفاظ على hPSCs في 3 مل من وسائل الإعلام الجنينية الجذعية البشرية في الخلية بشكل جيد (وسائل الإعلام HESC) وتنمو في 37 ° C حاضنة مع 3٪ O 2/5٪ CO 2.
ملاحظة: للحصول على نجاح هذا البروتوكول، فإنه ليس من الضروري للحفاظ على hPSCs في حاضنة منخفضة الأوكسجين. لكن من المهم أن نلاحظ أن hPSCs تتكاثر أسرع في ارتفاع O 2 البيئة، لذلك مرات وأعداد الخلايا يجب أن تعدل وفقا لذلك. كما تجدر الإشارة إلى أن hPSCs الاحتفاظ بها في انخفاض الأكسجين لديهم معدلات أقل من التمايز عفوية 33.- تس جعل وسائل الإعلام 500 مل HESC الجمع بين 380 مل DMEM / F12، 75 مل مصل بقري جنيني (FBS)، 25 مل خروج المغلوب المصل استبدال (KSR). إضافة الجلوتامين (1 ملم التركيز النهائي)، 5 مل 100X الأحماض الأمينية غير الأساسية، 100 وحدة / مل البنسلين، الستربتوميسين (P / S)، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) (4 نانوغرام / مل تركيز النهائي)، و2- المركابتويثانول (5.5 ميكرومتر تركيز النهائي).
- تغيير وسائل الاعلام عن طريق إزالة كامل حجم وسائل الإعلام (3 مل) باستخدام ماصة الزجاج والفراغ. استبدال مع وسائل الاعلام HESC 3 مل الدافئ باستخدام ماصة المصلية. وسائل الإعلام كرر تتغير كل يوم حتى hPSCs ما يقرب من 50٪ متموجة (يوم -1).
- قبل يوم واحد استهدفت (يوم -1)، وتغيير وسائل الاعلام HESC، وإزالة وسائل الإعلام القديمة وإضافة وسائل الإعلام HESC الدافئة تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632.
- أيضا في يوم -1، وإعداد 1-2 6-جيدا أو 10 سم لوحات من مقاومة الخلايا المغذية MEF المخدرات من DR4 الفئران (2.4 × 10 6 خلايا / لوحة) 34.
ملاحظة: بشكل عام، 6 لوحات جيدة هي إعلانvantageous أكثر من 10 سم لوحات، لأنها تستوعب المزيد من وسائل الاعلام. 6 لوحات جيدة أيضا التأكد من أن الحيوانات المستنسخة مختلفة من آبار مختلفة مستقلة. ومع ذلك، فإن 10 سم لوحة تسمح أسهل قطف، اعتمادا على المجهر المتاحة لهذه العملية.
2. تحرير الخلايا الجذعية المحفزة
- إعداد الحلول ترنسفكأيشن من قبل pipetting 5 ميكروغرام لكل من ZFN 1 و 2، TALEN 1 و 2، أو 15 ميكروغرام من كريسبر / Cas9 ترميز px330 البلازميد (الشكل 1) في أنبوب 1.5 مل. ماصة 30 ميكروغرام من البلازميد إصلاح في هذا الأنبوب كذلك. وأخيرا، ماصة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب لتبرزي حجم ما يصل الى 300 ميكرولتر.
ملاحظة: إعداد البلازميدات باعتباره midiprep (أي مجموعة مناسبة) مع الحد الأدنى من تركيز 300 نانوغرام / ميكرولتر من اجل الحفاظ على الحجم الكلي للالحل ترنسفكأيشن أقل من 300 ميكرولتر. ليس من الضروري لأداء استخراج الفينول / الكلوروفورم، ليصبح خطي البلازميد، أو لاستخدام endotoشين البلازميد مجانا طقم الإعدادية. - إزالة وسائل الاعلام من hPSCs باستخدام ماصة الزجاج والفراغ. ماصة 2 مل دافئ برنامج تلفزيوني 1X في كل بئر لغسل الخلايا.
- إزالة PBS فورا باستخدام ماصة الزجاج والفراغ. إضافة 0.5 مل 0.25٪ التربسين-EDTA الحل مباشرة على الخلايا في كل بئر. وضع في الحاضنة (37 ° C / 5 CO٪ 03/02٪ O 2) لحوالي 10 دقيقة. أو حتى تبدأ طبقة المغذية لرفع قبالة لوحة.
- إضافة 2 مل سائل الإعلام دافئ esWash (470 مل DMEM / F12، 25 مل FBS، 100 وحدة / مل P / S) إلى كل بئر لوقف رد الفعل التربسين.
- تأكد من أن الخلايا المغذية تؤتي ثمارها كما ورقة. ماصة محتويات كل بئر في واحد 50 مل أنبوب مخروطي، والجمع بين جميع الآبار. الخلايا يسحن باستخدام 10 مل ماصة المصلية. ليس من الضروري لتفتيت الطبقة المغذية. سيأتي hPSCs الخروج من طبقة المغذية التي كتبها سحن لطيف. ينبغي أن يكون هناك حوالي 15 مل من تعليق الخلية.
- إضافة 25 مل من وسائل الإعلام esWash إلى أنبوب لجلب voluلي ما يصل الى 40 مل المجموع. السماح قطع المغذية كبيرة ليستقر في الجزء السفلي من الأنبوب لمدة 1-2 دقيقة. إزالة طاف (~ 38 مل) من الأنبوب باستخدام ماصة المصلية والودائع إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
- تدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 190 ز س. إزالة طاف من الأنبوب باستخدام ماصة الزجاج والفراغ. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه الخلية. resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر 1X PBS. تتحد مع حل البلازميد ترنسفكأيشن أعدت في وقت سابق. عدد الخلايا في هذه الخطوة. استخدام 5-10٬000٬000 الخلايا في Electroporation لل.
- ماصة بأكمله تعليق 800 ميكرولتر إلى 4 ملم كفيت electroporation، ضع على الجليد لمدة 3-5 دقيقة. خلايا Electroporate باستخدام برنامج الأسي على النظام Electroporation للمع المعلمات التالية: 250 V، 500 μF، ∞ المقاومة، و4 مم حجم كفيت. بعد Electroporation لل، ضع كفيت مرة أخرى على الجليد لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: لاحظ وقت ثابت من Electroporation للفي نظام Electroporation لل. ثابت الوقتيختلف مع عدد الخلايا ونقاء DNA. transfections الناجح عادة ما يكون لها وقت ثابت بين 10-14 مللي ثانية عند استخدام الشروط المذكورة وبولسير جين II. يمكن أن يحدث الكفاءة Electroporation للانخفاض عندما تختلف ثوابت الوقت من هذه القيم. - الخلايا resuspend electroporated في 18 مل تستكمل دافئ HESC وسائل الإعلام مع 10 ميكرومتر Y-27632. لوحة 3 مل من هذا تعليق خلية واحدة في كل بئر من لوحة 6 جيدا مع الخلايا المغذية DR4. العودة إلى الحاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2/3٪ O 2).
3. اختيار المستعمرات الإيجابية
- يوم 2، إزالة كافة وسائل الإعلام باستخدام ماصة الزجاج والفراغ. استبدال 3 مل من وسائل الاعلام HESC الدافئة تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632. يوم 3، وإزالة كافة وسائل الإعلام باستخدام ماصة الزجاج والفراغ. استبدال 3 مل من وسائل الاعلام HESC الحار دون بما في ذلك Y-27632. اليوم 4، وإزالة كافة وسائل الإعلام باستخدام ماصة الزجاج والفراغ. استبدال 3 مل سائل الإعلام HESC الدافئة تستكمل مع المضادات الحيوية لselectiعلى. العودة إلى الحاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2/3٪ O 2).
ملاحظة: نوع من المضادات الحيوية المستخدمة سيعتمد على كاسيت مقاومة المدرجة في قالب الإصلاح. عند العمل مع WIBR # 3 hPSCs (التسجيل NIH 0079)، و 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين، 70 ميكروغرام / مل G418 (geneticin)، و 35 ميكروغرام / مل هيغروميسين استخدمت بنجاح. وينبغي تحديد تركيزات لاختيار تجريبيا من خلال إنشاء تركيز الحد الأدنى من المضادات الحيوية اللازمة لقتل الخلايا من النوع البري غضون ما يقرب من أسبوع واحد. - أيام 5-12، وتغيير وسائل الإعلام يوميا، لتحل محل وسائل الإعلام القديمة في كل مرة مع وسائل الاعلام HESC الدافئة تستكمل مع المضادات الحيوية.
ملاحظة: توقع كمية كبيرة من موت الخلايا. سوف المستعمرات الفردية تصبح واضحة حول يوم 10/8. وسائل الاعلام HESC منتظم دون المضادات الحيوية يمكن استخدامها بعد 12-14 يوما من اختيار مستمرة. إذا كثافة الخلية مرتفعة أو موت الخلايا بطيئة، وينبغي تجنب تحمض وسائل الإعلام، وأنه قد يكون من الضروري زيادة volu وسائل الإعلاملي (4-5 مل) خلال الأيام القليلة الأولى من الاختيار.
4. اختيار المستعمرات مختارة (يوم 14/12)
- مراقبة المستعمرات في يوم 12-14. مراقبة المستعمرات التي هي على استعداد لالتقاط على المجهر تشريح والتأكد من أنها لا تحتوي على خلايا التي بدأت في التفريق. يجب أن يكون حجم تقريبي 800-1،200 ميكرومتر. إذا مستعمرات تصل إلى هذا الحجم قبل يوم 12، فمن المستحسن أنه ينبغي أن ينتبه ذلك الحين.
ملاحظة: للحصول على كل تجربة استهداف، واختيار العديد من المستعمرات عند الضرورة لضمان عزل النمط الجيني المطلوب. وكمثال على ذلك، فقد أظهرت AAVS1 التحرير مع القالب إصلاح AAV-CAGGS-EGFP التكامل القوي باستمرار، ويتطلب فقط 12-24 المستعمرات ويمكن الحصول عليها للحصول على ما يقرب من 5-10 استنساخ المستهدفة heterozygously. تجارب أخرى تستهدف قد تحتاج إلى مزيد من المستعمرات ويمكن الحصول عليها (الجدول 1). وتيرة الأحداث استهداف الصحيحة يعتمد على عوامل مثل كفاءة SSN لإدخال جهاز تسوية المنازعات، وحجم إدراج، واستراتيجية الاختيار. في حالة النهج فخ الجيني لمكان AAVS1 المعروضة هنا، وأعرب عن علامة الاختيار فقط عند دمجها بشكل صحيح في الموقع المستهدف، والحد من عدد من المستعمرات المطلوبة للحصول على استنساخ المستهدفة بشكل صحيح. - قبل يوم واحد اختيار وإعداد لوحات 12-جيدا من MEFS (2.4 × 10 6 خلايا / لوحة، وسيتم استخدام بئر واحدة لكل مستعمرة التقطت).
- في يوم قطف، وإزالة جميع وسائل الإعلام من 12 لوحات MEF جيدا باستخدام ماصة الزجاج والفراغ واستبدالها مع 1 مل سائل الإعلام HESC. أيضا في يوم من قطف، تغيير HESC وسائل الإعلام على لوحات 6 جيدا أن تسير ويمكن الحصول عليها.
- سحب الماصات الزجاجية لتفارق الميكانيكية من المستعمرات الفردية من الطبقة المغذية. خفض ماصات فوق موقد بنزن في غطاء محرك السيارة وخففت عند نقطة التوسع حتى الزجاج القابل للطرق. إزالة بسرعة من اللهب وسحب ماصة خلق عدا نقطة الزاوي. كسرنشير حوالي 2 سم من المحور عازمة، وترك قناة ضيقة. تلميع نهاية القناة من خلال تعريض للهب لمدة 1-2 ثانية.
ملاحظة: اختياريا اختيار المستعمرات الماصة طرف P20، ولكن هذا قد يقلل من قابلية التنسيل للثقافة، كما غيض مملة قد طرد كميات أكبر من الخلايا من كل مستعمرة في وسائل الإعلام، ويحتمل أن تلوث فضلات اللاحقة. - تجميع اختيار الجهاز عن طريق أخذ ماصة الفلتر P1000 وربط لمبة الشفط لنهاية الضيقة. إدراج ماصة الزجاج انسحبت في نهاية واسعة.
- وضع لوحة 6 جيدا من hPSCs ويمكن الحصول عليها على مسرح المجهر تشريح شنت في نسيج الثقافة هود. ضغط لمبة الجهاز قطف واستئصال بلطف وقطع مستعمرة الفردية إلى 10-20 قطعة متساوية الحجم، مع الحرص على عدم الافراج عن القطع في وسائل الإعلام. اتخاذ رفعه قطع hPSC للمستعمرة في ماصة عن طريق الإفراج عن لمبة. في محاولة لاتخاذ وسائل الإعلام أقل قدر ممكن أثناء نقل.
- Transfإيه مستعمرة الفردية لبئر واحدة من لوحة MEF 12-جيدا، وضغط لمبة مرة أخرى مباشرة في البئر، والإفراج عن مستعمرة كسر الآن. تسمية كل بئر للسماح للهوية فريدة من حيدة الخلية المستنسخة المشتقة. تكرار لأكبر عدد ممكن من المستعمرات عند الضرورة، وتغيير ماصة الزجاج في كل مرة.
ملاحظة: المستعمرات الإلتقاط قد يستغرق بعض الوقت للتعلم. فمن المستحسن أن ممارسة مجرب على بعض الخلايا السيطرة قبل محاولة عزل المستعمرات المستهدفة. - عودة 12 لوحات جيدة إلى الحاضنة (37 ° C / 3 O٪ 05/02٪ CO 2)، هزاز بلطف لوحة أولا لتجنب تراكم الخلايا في وسط كل بئر.
- في اليوم التالي وكل يوم لاحق، وإزالة حجم كامل من وسائل الإعلام باستخدام ماصة الزجاج والفراغ واستبدالها مع 1.5 مل من وسائل الاعلام HESC دافئ حتى الخلايا هي حوالي 50٪ متموجة (هذا عادة ما يستغرق 10-12 يوما).
- بعد 10-12 يوما، واختيار 1-2 المستعمرات من كل بئر ونقل إلى 12 جيدا لوحات MEF الجديدة إعادةpeating الخطوات 4،1-4،8 لتوليد طبق الاصل.
- استخراج الحمض النووي (انظر أدناه) من المستعمرات المتبقية في كل بئر من لوحات MEF الأصلية.
- إزالة وسائل الاعلام من جميع الآبار باستخدام ماصة الزجاج والفراغ. ماصة 1 مل 1X PBS على كل بئر لغسل الخلايا. إزالة PBS باستخدام ماصة الزجاج والفراغ. ماصة 250 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية (تركيزات النهائي في H 2 O: 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، 5 ملي EDTA، 0.2٪ SDS، 200 ملي كلوريد الصوديوم، 0.08 ملغ / مل بروتين-K) على كل بئر. مكان في الحاضنة (37 ° C / 3٪ O 2/5٪ CO 2) O / N.
- في اليوم التالي، محتويات ماصة من كل بئر إلى الفردية 1.5 مل أنابيب. ماصة 250 ميكرولتر من ايزوبروبيل في كل أنبوب لترسيب الحمض النووي. هز أنبوب بقوة. وينبغي أن يكون راسب أبيض مرئية.
- تدور كل أنبوب أسفل لمدة 3 دقائق في 13000 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول. بعد تدور باستمرار، ونبذ طاف بواسطة الصب في النفايات السائلة. ينبغي أن يظل بيليه DNA صغيرة عالقة إلى أسفلانبوب. ماصة 250 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في كل أنبوب لغسل بيليه DNA. هزة بقوة. تدور كل أنبوب أسفل لمدة 3 دقائق في 13000 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول.
- بعد الغزل إلى أسفل، تجاهل طاف بواسطة الصب في النفايات السائلة. ينبغي أن يظل بيليه DNA صغيرة عالقة إلى أسفل الأنبوب. ماصة ما تبقى من طاف لذلك ليس هناك يسار السائل في الأنبوب. ترك أنبوب مفتوح لتجف على الفوق لمدة 5-10 دقيقة. بعد التجفيف، و resuspend الحمض النووي في 250 ميكرولتر TE العازلة. وضع عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات للسماح DNA إلى حل.
- التركيب الوراثي كل عينة باستخدام استراتيجية ما قبل الأمثل PCR أو جنوب لطخة.
ملاحظة: للحصول على AAVS1 استهداف باستخدام قالب إصلاح AAV-CAGGS-EGFP، واستراتيجية جنوب لطخة يمكن العثور عليها في Hockemeyer وآخرون، 2009 4 بروتوكول شامل النشاف الجنوبي يمكن العثور عليه في جنوب 2006 35 لمتعدد PCR التنميط الجيني ل. نفس التجربة، الاشعال والظروف يمكن أن يكونوجدت في الجدول 2 36. - تجاهل الآبار التي لا تستهدف بشكل صحيح ومواصلة تغيير وسائل الاعلام HESC على الخلايا المستهدفة بشكل صحيح كل يوم. تجميد أسفل الخلايا عندما تكون حوالي 50٪ متموجة، انظر أدناه للحصول على تجميد البروتوكول.
- يوم واحد قبل التجميد، وتغيير وسائل الاعلام HESC، وإزالة وسائل الإعلام القديمة وإضافة وسائل الإعلام HESC الدافئة تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632.
- في يوم من تجميد إعداد 0.5 مل من محلول كل ألف وحل B لكل بئر من لوحة ال 12 أيضا أن يتم تجميد بانخفاض في اثنين من أنابيب مخروطية 15 مل. حلول مكان على الجليد. حل A: 50٪ سائل الإعلام HESC و 50٪ FBS. الحل B: 80٪ FBS و 20٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO).
- فصل المستعمرات hPSC إلى الخلايا وحيدة قبل التجميد. اتبع الخطوات 2،2-2،8 للقيام بذلك، وتوسيع نطاق أحجام وفقا لذلك. بيليه الخلايا و resuspend تماما في 0.5 مل من محلول A.
- إضافة 0.5 مل من محلول B إلى تعليق خلية، ماصة صعودا ونزولا لجعل التعليق خلية متجانسة. تاكه الحجم الكلي للتعليق الخلية (~ 1 مل) والودائع إلى 2 مل cryotube. المسمار غطاء محكم.
- مكان cryotube في الفريزر -80 درجة مئوية O / N. اليوم بعد تجميد، وإزالة الخلايا المجمدة من الفريزر -80 درجة مئوية ومكان على الفور في خزان النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
Representative Results
نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول متوافق مع ثلاث منصات SSN مختلفة لإنشاء خطوط hPSC المعدلة وراثيا. استهدفنا WIBR # 3 خلايا جذعية جنينية بشرية في موضع AAVS1 باستخدام ZFNs المنشورة سابقا 4، 5 TALENs وكريسبر / Cas9s 37 باستخدام قالب إصلاح الذي يقدم مراسل EGFP وكاسيت المقاومة بوروميسين 4.
نحن لدينا مثقف hPSCs على MEFS لسير عمل خلية ثقافة تسمح صيانة وتوسيع hPSCs غير متمايزة (الشكل 2)، وهذا هو أيضا فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير. إذا نمت الخلايا أطول من اللازم وجود خطر ازدياد التمايز، والحد من عدد الخلايا المحفزة التي و transfected وبالتالي عدد المستعمرات hPSC المستهدفة بشكل صحيح تم الحصول عليها.
نحن electroporated 5.0 × 10 6 خلايا في منصة SSN ومطلي الخلايا من كل تستهدف على واحدة 6 لوحة جيدا من DR4 MEFS. بعد الاختيار، وأدت كل منصة في المستعمرات EGFP الإيجابي (الشكل 3) ومجموعة من الحيوانات المستنسخة غير مستهدفة، مستهدفة homozygously واستهدفت heterozygously (الشكل 4A، B، الجدول 3). وفقا للشروط الواردة هنا، نجد أن AAVS1 TALENs أسفر عن معظم الحيوانات المستنسخة EGFP إيجابية. القالب إصلاح المستخدمة في هذه التجربة يتكون من موقع متقبل لصق المنبع من EGFP مراسل والمقاومة بوروميسين الكاسيت. باستخدام هذه الاستراتيجية "الجينات فخ" (الشكل 1)، ينبغي للبناء إدخاله في إنترون الأول من موضع AAVS1، وذلك باستخدام المروج الذاتية لدفع التعبير عن كاسيت بوروميسين المقاومة. عدم وجود مروج القيادة التعبير عن الجينات المقاومة بوروميسين داخل القالب إصلاح يجب منع التعبير في حالة التكامل عشوائي.
ولذلك، فإننا نتوقع أن جميع الحيوانات المستنسخة مقاومة للبوروميسين سيكون مستهدفا في موقع AAVS1. وتجدر الإشارة إلى أن مجموعة فرعية من الحيوانات المستنسخة تحمل التكامل الشاذة في موضع AAVS1 التي كشفها بواسطة وصمة عار الجنوبية باستخدام تحقيق داخلي، ولكن ليس من قبل معظم استراتيجيات PCR (الشكل 1؛ الشكل 4C) 4. هي على الأرجح هذه الأحداث التكامل نتيجة الأحداث التي تستهدف مغاير مما يؤدي إلى التكامل متعددة من البلازميد المانحة 4. اخترنا 24 المستعمرات من كل تجربة SSN، ووجدت أن جميع المنابر كان الكفاءات استهداف عالية جدا وأظهرت سوى الحد الأدنى من الخلافات. كما استجوابه من قبل PCR، أسفرت كريسبر / Cas9 على الأكثر استهدافا بشكل صحيح الحيوانات المستنسخة في حين أن منصة TALEN استنساخ المستهدفة الأكثر homozygously (الجدول 3).
/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg "العرض =" 700 "/>
الشكل 1. رسم تخطيطي للجينات تحريرها AAVS1 مكان باستخدام قالب إصلاح AAV-CAGGS-EGFP. معدلة من Hockemeyer وآخرون، 2009. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المستعمرات من WIBR # 3 خلايا. الصور الحقل مشرق التمثيلية للمستعمرات WIBR # 3 خلايا الجذعية الجنينية البشرية قبل الاستهداف. لاحظ عدم وجود التمايز والفصل الواضح من الطبقة المغذية في مستعمرة مثالية (يسار) في مقابل واحد غير المثالي (يمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. EGFP إيجابي WIBR # 3 خلايا. صور الممثل WIBR # 3 خلايا المستهدفة مع قالب إصلاح، معربا عن EGFP في موضع AAVS1. صور من المستعمرات تمثيلية تحريرها مع ZFNs، يتم عرض TALENs وكريسبر / Cas9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. استراتيجيات التنميط الجيني لتأكيد الاستهداف الصحيح. (A) الممثل PCR النتائج التنميط الجيني تظهر الحيوانات المستنسخة غير مستهدفة، متخالف ومتماثل المستهدفة عبر منصات SSN الثلاثة. WT CTL = من النوع البري السيطرة. (B) ممثلى أعضاءsentative النتائج صمة عار الجنوبية تظهر متخالف المستهدفة استنساخ واستنساخ المستهدفة متماثل الكشف عن التحقيق مع 3 'خارجي. أحجام جزء: WT-6.5 كيلوبايت، تحريره 6.9 كيلوبايت. (C) نتائج طخة الجنوبية الممثل تظهر استنساخ تحريرها بشكل صحيح واستنساخ متخالف مع غير عشوائي المزدوج التكامل. أحجام جزء:. تحريره 6.9 صحيح كيلوبايت، إضافي الشاذة الاندماج 5 كيلو بايت الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| دراسة | الجينات المستهدفة | منصة | إصلاح نوع القالب | # من الحيوانات المستنسخة التقطت | كفاءة استهداف |
| قندلفت وآخرون، 2014 | TPP1 | ZFN | GFP-بورو غير المبلغ عنها | غير المبلغ عنها | |
| قندلفت وآخرون، 2014 | TERT | ZFN | هيغروميسين | غير المبلغ عنها | غير المبلغ عنها |
| Hockemeyer وآخرون، 2009 | POU5F1 | ZFN | GFP-بورو | 31 | 39.0٪ |
| Hockemeyer وآخرون، 2009 | PITX3 | ZFN | GFP-بورو | 74 | 14.9٪ |
| Hockemeyer وآخرون، 2011 | POU5F1 | TALEN | GFP-بورو | 68 | 91.0٪ |
| Hockemeyer وآخرون، 2011 | PITX3 | TALEN | GFP-بورو | 96 | 13.0٪ |
| ميركيل وآخرون، 2015 | VASA | Cas9 | مراسل Geneticin | 139 | 94.0٪ |
| ميركيل وآخرون. </ م>، 2015 | CRH | Cas9 | مراسل Geneticin | 30 | 93.0٪ |
| ميركيل وآخرون، 2015 | HCRT | Cas9 | مراسل Geneticin | 154 | 92.0٪ |
| ميركيل وآخرون، 2015 | HMX2 | Cas9 | مراسل Geneticin | 11 | 45.0٪ |
| فورستر وآخرون، 2014 | LRG5-Nterm | ZFN | GFP-بورو | غير المبلغ عنها | 30.0٪ |
| فورستر وآخرون، 2014 | LRG5-Cterm | ZFN | GFP-بورو | غير المبلغ عنها | 14.0٪ |
| Soldner وآخرون، 2011 | SNCA | ZFN | بورو | 96 | 1.0٪ |
الجدول 1. وصف الجينات الأخرى المستهدفة باستخدام هذه الطريقة، مع كورsponding استهداف الكفاءات المأخوذة من الدراسات التي نشرت سابقا. 4،5،38-41
| مكان | تسلسل | ملاحظات |
| AAVS1-F التمهيدي | CTCTAACGCTGCCGTCTCTC | شروط PCR: T م = 57 ° C، 35 دورات |
| AAVS1-WT-R التمهيدي | GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG | WT الفرقة: 1273 سنة مضت |
| AAVS1-المستهدفة-R التمهيدي | CGTCACCGCATGTTAGAAGA | الفرقة المستهدفة: 992 شركة بريتيش بتروليوم |
| T2-Cas9 المرشد | GGGCCACTAGGGACAGGAT | من مالي وآخرون، 2013 |
| AAVS1-ZFN اليمين | TAGGGACAGGAT | من Hockemeyer وآخرون، 2009 |
| AAVS1-ZFN اليسار | TGGGGTGTCACC | من Hockemeyer وآخرون، 2009 |
| AAVS1-TALEN اليمين | TCCTAACCACTGTCTTT | من Hockemeyer وآخرون، 2011 |
| AAVS1-TALEN اليسار | CCCCTCCACCCCACAGT | من Hockemeyer وآخرون، 2011 |
الجدول 2. قائمة الاشعال وSSN متواليات الاستهداف.
| استهداف بانشاء | عدد EGFP + المستعمرات | استهداف استنساخ اختار (التحقق PCR) | السابقة ذكرت كفاءة الاستهداف الصحيح (لطخة الجنوبية) |
| ZFN | 150 | 86.9٪ (73.9٪ هيت / وطي 13.0٪) | 56٪ (50٪ هيت / 6 وطي٪) |
| TALEN | 412 | 91.3٪ (47.8٪ هيت / وطي 39.1٪) | 47٪ (37.5٪ هيت / وطي 9.3٪) |
| كريسبر-Cas9 | 235 | 95.7٪ (69.5٪ هيت / 2وطي 6.3٪) | غير المبلغ عنها |
الجدول 3. أرقام المقارنة للEGFP إيجابية واستهدفت TALEN، ZFN وكريسبر / Cas9 مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية. PCR التحقق من التكامل في موضع AAVS1 لهذه التجربة ومقارنة صمة عار الجنوبية التحقق من التكامل واحدة سليمة في التجارب السابقة 4،5.
Discussion
الطريقة المعروضة هنا لعزل السكان متجانسة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في تحرير الجين هو طريقة فعالة لتوليد خطوط hPSC إسوي التي تختلف فقط في موضع المستهدفة. هذه الخلايا هي النظام المثالي لبحث آليات التمايز الخلوي البشري والتنمية وكذلك لفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض أحادية المنشأ في وضع الجيني للرقابة. كما هو موضح هنا، فإنه من الممكن استخدام ثلاث استراتيجيات تصميم SSN المستقلة (ZFNs، TALENs، وكريسبر / Cas9) لتحقيق التكامل المستهدفة في موضع AAVS1. كل هذه المنهجيات مزاياه وعيوبه. وهناك ميزة محتملة من ZFNs و، إلى حد ما، TALENs هو مرونة تصميمها، والذي يسمح الهندسة متكررة من أجل تحسين DNA مجالات nucleases الفردية 42 ملزمة. هذا التحسين نوكلياز يمكن أن يزيد من خصوصية ZFNs وTALENs أبعد ما يمكن تحقيقه مع CRIنظام SPR / Cas9. قد تكون مثل هذه الانتقائية المهم للتطبيقات السريرية التي تتطلب درجة عالية من الدقة الهدف. والميزة الرئيسية لنظام كريسبر / Cas9 هو سهولة استخدامه. رغم ما بذل مجموعات بناء TALEN وZFN متاحة للجمهور (أي من خلال Addgene 21)، كريسبر / أرقام الضمان الاجتماعي القائمة على Cas9-هي أسهل بكثير لبناء، حيث أن التخصيص الضروري الوحيد هو 20 قاعدة الزوج قليل النوكليوتيد (عند استخدام البلازميد px330 تصميم 14). هذه البساطة يبرهن على أن تكون مفيدة للمختبرات الأبحاث تبحث لتشمل تحرير الجينوم في دراستهم.
هناك تقنيات ترنسفكأيشن البديلة، بما في ذلك nucleofection 43، لإنشاء خطوط hPSC تحرره الجينات. ومع ذلك فقد تبين Electroporation للأن تكون 4،5،25 فعالة بما يتفق والتكلفة. Nucleofection يمكن استخدامها ل transfect مباشرة Cas9-دليل المجمعات بروتين نووي ريبوزي RNA داخل النواة، وزيادة كفاءة وSSNد الاخلاص 44. تزايد hPSCs على MEFS هو وسيلة قوية وغير مكلفة للحفاظ على hPSCs في حالة المحفزة دون تمايز المفرط. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح لعزل سهلة المستعمرات متطابقة وراثيا. بدلا من ذلك، فمن الممكن أن hPSCs ثقافة دون MEFS، ولكن هذه الظروف والثقافة يمكن أن يكون أكثر تكلفة من الثقافات على أساس التغذية. وعلاوة على ذلك، والعملية برمتها هي قابلة للتطوير، مما يتيح لعزل أحداث التحرير نادرة جدا أو توليد العديد من خطوط الخلايا المتميزة في موازية التجارب التحرير.
بروتوكول الموصوفة هنا هو القوي. ولكن هناك العديد من الخطوات الرئيسية التي تؤثر على الكفاءة التي استنساخ تحريرها بشكل صحيح يمكن الحصول عليها. العنصر الأكثر أهمية لهذا الأسلوب هو وجود MEFS ذات جودة عالية وMEFS DR4 المقاوم للأدوية. بقاء hPSCs واحدة هي واهية، وسوف MEFS ذات الجودة المنخفضة تعيق عزل خطوط hPSC غير متمايزة. ثانيا، استخدام Y-27632 أيضامفتاح للسماح للبقاء خلية واحدة دون توليد الضغط الانتقائي للخلايا مع النمط النووي الشاذ 45. ثالثا، اختيار المستعمرات متباعدة بشكل جيد يضمن التجانس الوراثي للخطوط الخلايا المشتقة. وأخيرا، من المهم إعداد الماصات الزجاجية بحيث تكون الفتحة صغيرة بما يكفي لكسر مستعمرة إلى العديد من القطع الصغيرة، وضمان أن مستعمرات متعددة سينمو في البئر الجديد. هذا يسمح للقطف من subclones متباعدة بشكل جيد لوحة طبق الأصل أن يكون في الثقافة، وترك لوحة أصلية للمستعمرات معزولة عن التنميط الجيني. جزء تحديا في هذا البروتوكول هو دليل سحب من الماصات الزجاج؛ هذا ينبغي أن يمارس مسبقا. وتجدر الإشارة إلى أن هناك تقنيات متعددة من استنساخ قطف التي لا تتطلب ماصة الزجاج. ويتم تشجيع المجربون للعثور على أحد أن يعمل على نحو أفضل بالنسبة لهم.
هناك قيود على هذا البروتوكول والتي يمكن التغلب عليها تعديلات بسيطة. تجربة تهدف إلى ستعطيل نلي موضع الاهتمام دون إصلاح أو الذين إصلاح القالب لا يحتوي على شريط التحديد، يجب استخدام طريقة أخرى لإثراء للخلايا التي تم تحريرها واحدة. لاحظ أن عدد المستعمرات التي يجب أن تكون التقطت للعثور على استنساخ إيجابي يزيد بشكل كبير في غياب التحديد. استراتيجية واحدة لتحسين كفاءة للمشاركة في transfect البلازميد غير إدماج التي تعبر عن بروتين فلوري. بعد السماح للخلايا لاسترداد لمدة يومين، والخلايا المستهدفة يمكن فرزها في مضان الإيجابي باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز وreplated 29. هذه العملية تغني عن الخلايا التي تم مع transfected البلازميدات بواسطة الصعق الكهربائي ويزيد من احتمال حدوث الحدث التحرير المتزامن في الخلية وبالتالي.
الأساليب المذكورة هنا يمكن أن تمتد إلى استخدام الرنا دليل متعددة في وقت واحد لاستهداف عدة مواضع 14،46،47. وقد أنشئت العديد من البروتوكولات للتمييز hPSCsإلى أنواع الخلايا متميزة، مما يتيح التلاعب الجيني مختلفة في أنواع الخلايا التي تهم 30. عموما، لقد أثبتنا إمكانية تحرير الجينوم كفاءة في hPSCs بغض النظر عن اختيار SSN. نقترح أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها لإنشاء خطوط hPSC إسوي التي تم تحريرها الجينات في أي مكان الجيني.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة البذور مؤسسة أبحاث الدماغ (BRFSG-2014-02) إلى هيلين Bateup. ديرك Hockemeyer هو الباحث العلمي الجديد في الشيخوخة من مؤسسة إليسون الطبية وبدعم من مؤسسة جلين فضلا عن وShurl ومؤسسة كاي كورسي ليودع. ويدعم DH أيضا منحة المعاهد الوطنية للصحة 1R01CA196884-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
| Fibroblast Growth Factor - basic | Life Technologies | PHG0261 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
| 6-well plates | Corning | 3506 | |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 4 mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
| X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| 10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
| Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
| Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
| TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6 (2014).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila. Genetics. 182 (3), 641-651 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jasin, M. Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases. Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool. Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).
- Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases. Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).
- Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), e82 (2011).
- Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).
- Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Podhajska, A. J., Szybalski, W. Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites. Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).
- Costa, M., et al. A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation. Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
- Soldner, F., et al. Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).
- Chiba, K., Hockemeyer, D. Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases. Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Southern, E. Southern blotting. Nat Protoc. 1 (2), 518-525 (2006).
- Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol. BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Sexton, A. N., et al. Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation. Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).
- Merkle, F. T., et al. Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Forster, R., et al. Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).
- Miller, J. C., et al. Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire. Nat Methods. , (2015).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4, 5400 (2014).
- Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
