Abstract
Genom-redigering av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) gir en genetisk styrt og klinisk relevant plattform for å forstå menneskelig utvikling og undersøke patofysiologien ved sykdom. Ved å ansette stedsspesifikke nukleaser (ssns) for genom redigering, blir den raske avledning av nye hPSC linjene skjuler spesifikke genetiske endringer i en ellers isogen innstilling mulig. Sink finger nukleaser (ZFNs), transkripsjons aktivator lignende effektorfunksjoner nukleaser (Talens) og gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas9 er de mest brukte ssns. Alle disse nukleaser fungerer ved å innføre en dobbelttrådet DNA pause på et spesifisert område, for derved å fremme nøyaktig gen redigering på en genomiske lokuset. SSN-mediterte genom redigering utnytter to av cellens endogene DNA reparasjonsmekanismer, ikke-homolog ende bli med (NHEJ) og homologi rettet reparasjon (HDR), enten innføre innsetting / sletting mutasjoner eller alter genomet ved hjelp av en homolog reparasjon mal på stedet av den doble strandet pause. Electroporation av hPSCs er et effektivt middel for trans ssns og reparasjon maler som inneholder transgener som fluorescerende reportere og antibiotikaresistens kassetter. Etter elektroporering, er det mulig å isolere bare de hPSCs at innlemmet reparasjon konstruksjon ved å velge for antibiotikaresistens. Mekanisk separering hPSC kolonier og bekrefte riktig integrering på målstedet gjennom genotyping muliggjør isolering av korrekt målrettet genetisk homogene og cellelinjer. Gyldigheten av denne protokollen er demonstrert her ved å bruke alle tre SSN plattformer for å innlemme EGFP og en puromycin motstand konstruere inn i AAVS1 trygg havn locus i humane pluripotente stamceller.
Introduction
Genome redigering teknologier er raskt utvikler seg til standard verktøy for molekylær- og cellebiologi 1. Genteknologi av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) er av spesiell interesse som hPSCs representerer en selvfornyende kilde til genetisk intakte primære humane celler. hPSCs kan være differensiert i ulike celletyper for sykdom modellering eller som en kilde for transplantasjon terapi 2,3. Her demonstreres er en protokoll som benytter tre forskjellige typer av stedsspesifikke nukleaser (ssns) i forbindelse med endogene DNA reparasjonsmekanismer for målrettet integrering av en reporter konstruere på AAVS1 locus. Etter transfeksjon av ssns inn hPSCs viser vi hvordan å isolere isogene celle populasjoner husing reporteren.
Evnen til å manipulere genomer, spesielt pluripotente stamcelle genomer, er å ikke bruke ssns et nytt fenomen som nytten av sink finger nukleaser (ZFNs) og transkripsjon aktivergsanordningeller lignende effektorfunksjoner nukleaser (Talens) for genet redigering ble demonstrert for flere år siden 4-10. Men med bruk av S. pyogenes CRISPR / Cas9 teknologi 11-13, har genet redigering blitt allment tilgjengelig 14. Alle ssns innføre en dobbelttrådet DNA pause (DSB) på angitt målområde 1,4,5,11 som er reparert av endogene cellulære mekanismene ved hjelp av enten ikke-homolog end-sammenføyning (NHEJ) eller homologi rettet reparasjon (HDR) 15. NHEJ er utsatt for feil og kan innføre rammeskift mutasjoner som resulterer i tap av genfunksjon, mens HDR åpner for nye elementer som skal innføres gjennom ko-transfeksjon av en reparasjon malen med SSN. Selv om de underliggende prinsipper for DNA-reparasjon som letter gen redigering antas å være stort sett den samme for hver SSN, kan noen forskjeller mellom plattformene bli notert. De novo utforming av ZFNs gir fleksibilitet og nuklease optimalisering 16, men ved bruk av offentligtilgjengelige montering biblioteker og screening verktøy for å designe individuelle ZFNs kan være tidkrevende. Når ønsket locus for ZFN-mediert målretting er bestemt, kan ZFN parene være utformet med den elektroniske verktøyet ZiFit 17. Etter design, kan ZFNs bli modulært samlet gjennom flere runder med plasmid kloning 18. Alternativt finnes det mange kommersielt tilgjengelige, pre-validert ZFNs 19. Tale nukleaser kan også være utformet ved hjelp av elektroniske verktøy og offentlig tilgjengelige komponenter 17,20. For eksempel kan Talens være raskt satt sammen av blokker av fem Tale gjentar, gjennom FLASH montering 21 eller ved bruk av PCR baserte hierarkisk Golden Gate montering 22. Brukervennlighet SSN design og hastigheten på konstruksjonen med CRISPR / Cas9 har gjort genom redigerer en allment tilgjengelig verktøy. Den miniguide RNA-mediert målretting av CRISPR / Cas9 gir også mulighet for multipleksing av guide RNA å målrette flere loci med en enkel konstruksjon 14. Designetav Cas9 for genet redigering krever bare identifikasjonen av en protospacer tilstøtende motiv (PAM; en NGG trinukleotidet for S. pyrogenes Cas9) proksimalt til målet locus. Ved å sette inn et oligonukleotid som tilsvarer de 20 basepar 5 'i PAM inn i px330 plasmid 14, kan konstruksjonen settes sammen i en kloningstrinn. I tillegg til S. pyogenes Cas9, Cas9 fra N. meningitidis (NmCas9) som gjenkjenner en 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) har vist seg å muliggjøre effektiv gen-redigering i hPSCs 23.
I tillegg til forskjellene i enkel SSN utforming, har hver plattform spesifikke egenskaper. For eksempel ZFNs og Talens utnytte FoKI nukleasen domene, som genererer en fire nucleotide 5 'overheng 24 mens Cas9 er antatt å generere mest buttendede DSB sin. ZFNs, Talens, og Cas9 varierer i sine proteinstabilitet, on-off rate på mål-DNA, og DNA-scanning modus, som alle cOuld teoretisk føre til små forskjeller i redigerings utfallet en. Mens videre studier vil være nødvendig for å forstå konsekvensene av disse forskjellene, beskriver vi her en protokoll som er svært robust på tvers av alle tre plattformer, og kan brukes til lett generere genmodifiserte hPSCs.
Uavhengig av SSN valg, er elektroporering en robust prosedyre for å transfektere ssns og homologi reparasjon maler inn hPSCs 25. Antall overlevende kolonier etter valget for antibiotikaresistens avhenger locus spesifikke parametre og redigerings strategi (for eksempel størrelsen på transgen innsats og virke utvalg). Protokollen er beskrevet her resulterer vanligvis i omtrent 150-400 enkelt-celle avledet kolonier.
Gene-redigering på AAVS1 locus bruker denne protokollen har tidligere blitt brukt til å demonstrere effektiviteten av ssns 4,5. AAV-CAGGS-EGFP reparasjon mal bruker et gen felle strategy å konferere puromycin motstand i et locus bestemt måte. Kort fortalt inneholder reparasjons malen et spleise-akseptorsete oppstrøms for promoterless puromycin motstand kassett. Ved korrekte integrering inn i det første intron av PPP1R12C genet ved AAVS1 locus, er motstanden kassetten uttrykt fra det redigerte genets promotor. Robustheten denne spesifikke AAVS1 analysen gir oss mulighet til å sammenligne effektiviteten til hver SSN plattform.
Gene redigering bruker ssns er kraftig, får muligheten til å forstyrre og / eller endre teoretisk noen gen. Anvende denne strategien for å hPSCs gir allsidighet som hPSCs kan senere differensiert i et mangfold av humane celletyper som nevroner 26, leverceller 27, og kardiomyocytter 28. I tillegg tillater bruken av pasientavledet induserte pluripotente stamceller reparasjon eller innføring av kjente sykdomsfremkallende mutasjoner i en pasient-spesifikke genetiske bakgrunn 29 30. Oppsummert genet redigering i hPSCs er en effektiv og allsidig tilnærming for å undersøke grunnleggende biologi av menneskelig utvikling og sykdom 31.
Protocol
Prosedyrene som er beskrevet i dette manuskriptet ble gjennomgått og godkjent av UC Berkeley Stem Cell Research Sight Committee.
1. Forbered stamceller for redigering
- Vokse og kultur menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) på en seks-brønns plate som inneholder 2,4 × 10 6 celler / plate av mitomycin C-inaktivert mus embryonale fibroblast (MEF) matere dyrket på gelatin 32. Oppretthold hPSCs i 3 ml av humane embryonale stamceller media per brønn (hESC media) og vokse i en 37 ° C inkubator med 3% O 2/5% CO2.
Merk: For å lykkes med denne protokollen, er det ikke nødvendig å opprettholde hPSCs i en lav-oksygen kuvøse; men det er viktig å merke seg at hPSCs sprer seg raskere i en høy O to miljø, så ganger, og celletall bør justeres tilsvarende. Det bør også nevnes at hPSCs opprettholdes i lavt oksygen har lavere forekomst av spontan differensiering 33.- To lage 500 ml hESC media kombinere 380 ml DMEM / F12, 75 ml Fetal Bovine Serum (FBS), 25 ml KnockOut Serum Replacement (KSR). Legg glutamin (1 mM sluttkonsentrasjon), 5 ml 100 x ikke-essensielle aminosyrer, 100 enheter / ml penicillin-streptomycin (P / S), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) (4 ng / ml sluttkonsentrasjon), og 2- merkaptoetanol (5,5 pM sluttkonsentrasjon).
- Endre media ved å fjerne hele volumet av medie (3 ml) ved anvendelse av en glasspipette og vakuum. Erstatt med 3 ml varm hESC medier med en serologisk pipette. Gjenta media endres hver dag frem til hPSCs er ca 50% sammenflytende (dag -1).
- En dag før targeting (Dag -1), endre hESC media, fjerne de gamle mediene og legge varme hESC media supplert med 10 mm Y-27632.
- Også på dag -1, forberede en til to seks-brønns eller 10 cm plater av legemiddelresistente MEF mater celler fra DR4 mus (2,4 × 10 6 celler / plate) 34.
Merk: Generelt 6 brønners plater er annonsenaktig over 10 cm plater, som de plass til flere medier. 6 brønners plater også sikre at ulike kloner fra ulike brønner er uavhengige. Imidlertid vil en 10 cm plate tillate enklere plukking, avhengig av mikroskop for denne prosessen.
2. Redigering Pluripotent stamceller
- Forbered transfeksjon løsninger ved å pipettere 5 pg hver av ZFN 1 og 2, TALEN 1 og 2, eller 15 ug av det CRISPR / Cas9 px330 koding plasmid (figur 1) i et 1,5 ml rør. Pipetter 30 ug av reparasjons plasmidet inn i dette røret i tillegg. Til slutt, pipette 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) inn i røret for å bringe volumet opp til 300 mL.
Merk: Forbered plasmider som en midiprep (en hvilken som helst kit er passende) med en minimumskonsentrasjon på 300 ng / mL for å holde det totale volum av transfeksjon løsningen under 300 ul. Det er ikke nødvendig å utføre fenol / kloroform-ekstraksjon, for å linearisere plasmidet, eller å bruke en endotoxin gratis plasmid prep kit. - Fjern media fra hPSCs bruker et glass pipette og vakuum. Pipettes 2 ml varm 1 x PBS i hver brønn for å vaske cellene.
- Fjern PBS straks ved hjelp av en glasspipette og vakuum. Tilsett 0,5 ml 0,25% Trypsin-EDTA-løsning direkte på cellene i hver brønn. Plasser i inkubatoren (37 ° C / 5% CO 2/3% O 2) i omtrent 10 min. eller inntil mater lag begynner å løfte av platen.
- Tilsett 2 ml varm esWash media (470 ml DMEM / F12, 25 ml FBS, 100 enheter / ml P / S) til hver brønn for å stoppe trypsin-reaksjonen.
- Sikre at mateceller faller av som et ark. Pipette innholdet av hver brønn i et enkelt 50 ml konisk rør, som kombinerer alle brønner. Triturer celler ved anvendelse av en 10 ml serologisk pipette. Det er ikke nødvendig å bryte opp materen laget; hPSCs vil komme ut av materen lag ved forsiktig utgnidning. Det bør være ca. 15 ml av cellesuspensjonen.
- Legg 25 ml esWash media til røret for å bringe volumeg opp til 40 ml totalt. La store mater biter til å slå seg ned på bunnen av røret i 1-2 min. Fjern supernatanten (~ 38 ml) fra røret ved hjelp av en serologisk pipette og innskudd til en ny 50 ml konisk tube.
- Spinne ned i 5 minutter ved 190 x g. Fjern supernatanten fra røret ved hjelp av en glasspipette og vakuum. Pass på å ikke forstyrre cellen pellet. Suspender cellene i 500 pl 1 x PBS. Kombiner med plasmid transfeksjon løsning forberedt tidligere. Telle celler på dette trinnet. Bruke 5-10 millioner celler per elektroporering.
- Pipette hele 800 mL suspensjon i en 4 mm elektroporeringskyvette, plasser på is i 3-5 min. Electroporate celler ved hjelp av eksponensiell programmet på electroporation system med de følgende parametere: 250 V, 500 uF, ∞ motstand, og 4 mm kyvette størrelse. Etter elektroporering, plasserer cuvette tilbake på is i 3 min.
Merk: Vær oppmerksom tiden konstant av elektroporering på elektroporering system. Tidskonstantenvarierer med mobilnummer og DNA renhet. Vellykkede trans vanligvis har en tidskonstant mellom 10-14 msek ved bruk av de nevnte tilstander og en Gene Pulser II. Lavere electroporation effektivitet kan oppstå når tidskonstanter varierer fra disse verdiene. - Suspender elektroporerte celler i 18 ml supplert med 10 mm Y-27632 varm hESC Media. Plate 3 ml av denne enkelt cellesuspensjon til hver brønn i en 6-brønners plate med DR4 feeder-celler. Returner til inkubator (37 ° C / 5% CO 2/3% O 2).
3. Valg av positive kolonier
- Dag to, fjern alle medier med et glass pipette og vakuum. Erstatt med 3 ml varme hESC media supplert med 10 mm Y-27632. Dag 3, fjerner alle medier med et glass pipette og vakuum. Erstatt med 3 ml varm hESC media uten å inkludere Y-27632. Dag 4, fjerner alle medier med et glass pipette og vakuum. Erstatt med 3 ml varme hESC media supplert med antibiotika for selectipå. Returner til inkubator (37 ° C / 5% CO 2/3% O 2).
Merk: type antibiotika som brukes vil være avhengig av motstanden kassetten inngår i reparasjons malen. Når du arbeider med WIBR # 3 hPSCs (NIH register 0079), 0,5 mg / ml puromycin, 70 mikrogram / ml G418 (Geneticin) og 35 mikrogram / ml hygromycin har vært brukt med hell. Konsentrasjoner for seleksjon må bestemmes empirisk ved å etablere den minimale konsentrasjon av antibiotikum som trengs for å drepe vill-type-celler i løpet av omtrent en uke. - Dager 5-12, endre media daglig, og erstatte gamle mediene hver gang med varme hESC media supplert med antibiotika.
Merk: Forvent en stor mengde av celledød. Individuelle kolonier vil fremgå rundt dag 8-10. Vanlig hESC medium uten antibiotika kan brukes etter 12-14 dager med kontinuerlig markering. Hvis celletetthet er høy eller celledød er langsom, bør surgjøring av mediet unngås, og det kan være nødvendig å øke media volumeg (opp til 4-5 ml) i løpet av de første dagene av utvalget.
4. Plukke utvalgte kolonier (dag 12-14)
- Observere kolonier på dag 12-14. Observere koloniene som er klar til å plukke på en disseksjon mikroskop og sørge for at de ikke inneholder celler som begynner å differensiere. Omtrentlig størrelse bør være 800-1,200 mikrometer. Hvis kolonier nå denne størrelsen før dag 12, anbefales det at de bør bli plukket da.
Merk: For hver målgruppe eksperiment, plukke så mange kolonier som er nødvendig for å sikre ønsket genotype er isolert. Som et eksempel AAVS1 redigering med AAV-CAGGS-EGFP reparasjon mal har vist, konsekvent robust integrasjon, og krever bare 12-24 kolonier å bli plukket ut til å få ca 5-10 heterozygously målrettede kloner. Andre rettet eksperimenter kan kreve flere kolonier på å bli plukket (tabell 1). Hyppigheten av korrekte målretting hendelser, avhenger av faktorer som effektiviteten av SSN for å innføre et DSB, størrelsen på innsatsen, og valget strategi. I tilfellet av genet felle tilnærming for det AAVS1 locus presentert her, er seleksjonsmarkøren uttrykt bare når korrekt integrert ved målsetet, redusere antall kolonier som kreves for å oppnå en riktig målrettet klon. - En dag før plukking, fremstille 12-brønners plater med MEFs (2,4 x 10 6 celler / plate, vil man gjerne brukes for hver koloni valgt).
- På dagen for plukking fjerne alle medier fra 12 godt MEF platene ved hjelp av et glass pipette og vakuum og erstatte med 1 ml hESC media. Også på dagen av plukking, endre hESC media på seks brønns plater som kommer til å bli plukket.
- Trekk glass pipetter for mekanisk dissosiasjon av individuelle kolonier fra materen lag. Senk pipetter over en in-hette bunsenbrenner og myknet ved ekspansjonspunkt til glasset er formbare. Raskt fjerne fra flammen og trekke pipetten hverandre skaper en vinkelpunkt. Brytpunkt omtrent 2 cm fra den bøyde akse, og etterlater en smal kanal. Polerer enden av kanalen ved å utsette for flamme i 1-2 sek.
Merk: Eventuelt plukke kolonier et p20 pipettespiss, kan imidlertid dette redusere klonalitet av kulturen, som kjedelig Spissen kan løsne større mengder av celler fra hver koloni i mediet, potensielt forurensende følgende bytter. - Monter plukke enhet ved å ta en P1000 filter pipettespissen og feste en sugekilden til den smale enden. Sett trukket glass pipetten i den vide enden.
- Plasser en seks-brønns plate av hPSCs å bli plukket på scenen av en disseksjon mikroskop montert i en vev kultur hette. Komprimere pære av plukking enheten og forsiktig skjære og kutte en individuell koloni i 10-20 like store stykker, tar seg ikke å slippe brikker i media. Ta skåret hPSC stykker av kolonien inn i pipetten ved å slippe pære. Prøv å ta så lite media som mulig ved overføring.
- Overfer den enkelte kolonien til en enkelt brønn av en 12-brønns plate MEF, komprimere pæren igjen direkte inn i brønnen, og slipper nå brutt kolonien. Merke hver brønn for å tillate unik identifikasjon av enkeltcellekloner avledet. Gjenta for så mange kolonier som nødvendig, endre glass pipette hver gang.
Merk: Plukke kolonier kan ta litt tid å lære. Det anbefales at eksperimentator praksis på noen kontrollcellene før du prøver å isolere målrettede kolonier. - Returnere 12 brønners plater til inkubatoren (37 ° C / 3% O 2/5% CO2), forsiktig vugging av platen først for å unngå akkumulering av celler i midten av hver brønn.
- Den neste dag, og hver påfølgende dag, fjerne hele volumet av mediet ved hjelp av en glasspipette og vakuum og erstatte med 1,5 ml varmt hESC media inntil cellene er omtrent 50% sammenflytende (dette tar vanligvis 10-12 dager).
- Etter 10-12 dager, plukke en til to kolonier fra hver brønn og overføre til nye 12-brønns MEF plater repeating skritt 04.01 til 04.08 for å generere en kopi plate.
- Ekstrahere DNA (se nedenfor) fra de gjenværende kolonier i hver brønn av den opprinnelige MEF platene.
- Fjern media fra alle brønnene ved hjelp av et glass pipette og vakuum. Pipette 1 ml 1x PBS bort på hver brønn for å vaske celler. Fjern PBS ved bruk av glass-pipette og vakuum. Pipetter 250 ul av cellelyseringsbuffer (sluttkonsentrasjoner i H 2 O: 10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl, 0,08 mg / ml proteinase-K) ut mot hver brønn. Plass i inkubator (37 ° C / 3% O 2/5% CO 2) O / N.
- Den neste dag, pipettes innholdet av hver brønn i individuelle 1,5 ml rør. Pipetter 250 mL av isopropylalkohol til hvert rør for å utfelle DNA. Rist rør kraftig. Et hvitt bunnfall skal være synlig.
- Spinn hvert rør ned i 3 minutter ved 13 000 rpm i en bordsentrifuge. Etter spin ned, kast supernatanten ved dekantering til flytende avfall. En liten DNA-pelleten bør forbli fast til bunnen avT-banen. Pipetter 250 ul av 70% etanol i hvert rør for å vaske DNA-pelleten. Rist kraftig. Spinn hvert rør ned i 3 minutter ved 13 000 rpm i en bordsentrifuge.
- Etter spinningen ned, kast supernatanten ved dekantering til flytende avfall. En liten DNA-pelleten bør forbli fast til bunnen av røret. Pipetter ut resten av supernatanten slik at det ikke er noe væske igjen i røret. La tube åpent til tørk på benkeplate Bøk i 5-10 min. Etter tørking resuspender DNA i 250 ul TE-buffer. Plasser ved 37 ° C i 6 timer for å tillate DNA for å oppløse.
- Genotype hver prøve å bruke en pre-optimalisert PCR eller sørlige blot strategi.
Merk:.. For AAVS1 målretting bruker AAV-CAGGS-EGFP reparasjon mal, kan den sørlige blot strategien bli funnet i Hockemeyer et al, kan 2009 4 En omfattende sørlige blotting protokollen bli funnet i Sør 2006 35 For multipleks PCR genotyping av. det samme eksperimentet, kan primere og forhold værefinnes i tabell 2. 36. - Kast brønner som ikke er riktig målrettet og fortsette å endre hESC medier på riktig målrettede celler hver dag. Fryse ned cellene når de er ca 50% sammenflytende, se nedenfor for frysing protokollen.
- En dag før frysing, endre hESC media, fjerne de gamle mediene og legge varme hESC media supplert med 10 mm Y-27632.
- På dagen for frysing fremstille 0,5 ml hver av oppløsning A og oppløsning B per brønn i en 12-brønns plate som blir frosset ned i to 15 ml koniske rør. Plasser løsninger på is. Løsning A: 50% hESC media og 50% FBS; Løsning B: 80% FBS og 20% dimetylsulfoksid (DMSO).
- Distansere hPSC kolonier i enkeltceller før frysing. Følg trinn 2,2-2,8 å gjøre dette, skalering volum tilsvarende. Fullt resuspender cellepelleten i 0,5 ml av løsning A.
- Tilsett 0,5 ml løsning B til cellesuspensjonen, pipette opp og ned for å gjøre cellesuspensjon homogen. Take det totale volum av cellesuspensjonen (~ 1 ml) og innskudd inn i en 2 ml kryorør. Skru lokket godt på.
- Plasser kryorør i en -80 ° C fryser O / N. Dagen etter frysing, fjerne frosne celler fra -80 ° C fryser og umiddelbart plassere i flytende nitrogen tank for langtidslagring.
Representative Results
Her viser vi en protokoll kompatibel med tre forskjellige SSN plattformer for å lage genmodifiserte hPSC linjer. Vi målrettet WIBR # 3 humane embryonale stamceller ved AAVS1 locus hjelp tidligere publiserte ZFNs 4, Talens 5 og CRISPR / Cas9s 37 ved hjelp av en reparasjon mal som introduserer en EGFP reporter og en puromycin motstand kassett 4.
Vi dyrket våre hPSCs på MEFs for en arbeidsflyt cellekultur tillater vedlikehold og utvidelse av udifferensierte hPSCs (figur 2), som også er kostnadseffektiv og skalerbar. Dersom celler dyrkes lenger enn nødvendig er det en risiko for økt differensiering, redusere antall pluripotente celler som er transfektert, og følgelig antall korrekt rettet hPSC kolonier ble oppnådd.
Vi electropinndampes ved 5,0 x 10 6 celler per SSN plattform og belagt cellene fra hver målgruppe på en enkelt 6 brønn plate av DR4 MEFs. Etter valget, resulterte hver plattform i EGFP-positive kolonier (figur 3) og en kombinasjon av vilkårlige, homozygously målrettede og heterozygously målrettede kloner (Figur 4A, B; Tabell 3). Under betingelsene som presenteres her, finner vi at AAVS1 Talens resulterte i de fleste EGFP-positive kloner. Reparasjonen mal som brukes for dette eksperimentet består av en spleiseakseptor område oppstrøms for EGFP reporter og puromycin motstand kassett. Ved hjelp av denne "gen-trap" strategi (figur 1), bør konstruksjonen settes inn i den første intron av AAVS1 locus, ved hjelp av den endogene promoter for å drive ekspresjon av puromycin-motstand kassett. Mangelen på en promoter som driver ekspresjonen av puromycin resistensgenet i reparasjon malen bør forhindre ekspresjon i Ved tilfeldig integrering.
Derfor forventer vi at alle puromycin-resistente kloner ville bli rettet mot AAVS1 nettstedet. Det bør bemerkes at et undersett av klonene bære avvikintegrasjoner i AAVS1 locus som er detekterbare ved Southern blot ved anvendelse av en probe internt, men ikke av de fleste PCR-strategier (figur 1. Figur 4C) 4. Disse integrering hendelser er mest sannsynlig et resultat av heterologe rettet mot hendelser som fører til flere integrasjoner av donor plasmid fire. Vi plukket 24 kolonier fra hver SSN eksperiment og funnet ut at alle plattformer hadde svært høye målretting effektivitet og viste bare minimale forskjeller. Som avhørt av PCR, CRISPR / Cas9 gitt de mest korrekt målrettet kloner mens TALEN plattformen hadde mest homozygously målrettede kloner (Tabell 3).
/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 1. Skjematisk av genet redigert AAVS1 locus med AAV-CAGGS-EGFP reparasjon mal. Modifisert fra Hockemeyer et al., 2009. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kolonier av WIBR # 3 celler. Representative lyse feltet bilder av kolonier av WIBR # 3 humane embryonale stamceller før målretting. Legg merke til mangelen på differensiering og klart skille fra materen lag i en ideell koloni (til venstre) i motsetning til en ikke-ideell en (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. EGFP-positive WIBR # 3 celler. Representative bilder av WIBR # 3 celler målrettet med en EGFP-uttrykk reparasjon mal på AAVS1 locus. Bilder av representative kolonier redigert med ZFNs, Talens og CRISPR / Cas9 vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. genotyping strategier for å bekrefte riktig målgruppe. (A) Representant PCR genotyping resultater som viser ikke-målrettede, heterozygote og homozygote målrettede kloner på tvers av de tre SSN plattformer. WT CTL = vill-type kontroll. (B) Reprerepresentanten Southern blot resultater som viser en heterozygot målrettet klone og en homozygot målrettet klone oppdaget med en 3 'ekstern probe. Fragmentstørrelser: WT-6,5 kb, redigert-6,9 kb. (C) Representative Southern blot resultater som viser en korrekt klon redigert og en heterozygot klon med et ikke-randomisert dobbelt-integrasjon. Fragment størrelser:. Riktig redigert-6,9 kb, avvik ytterligere integrering-5 kb Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Studere | Gene Målrettet | Plattform | Reparasjon maltype | # Av kloner plukket | Effektivitet målretting |
| Sexton et al., 2014 | TPP1 | ZFN | GFP-Puro urapportert | urapportert | |
| Sexton et al., 2014 | TERT | ZFN | Hygromycin | urapportert | urapportert |
| Hockemeyer et al., 2009 | POU5F1 | ZFN | GFP-Puro | 31 | 39,0% |
| Hockemeyer et al., 2009 | PITX3 | ZFN | GFP-Puro | 74 | 14,9% |
| Hockemeyer et al., 2011 | POU5F1 | TALEN | GFP-Puro | 68 | 91,0% |
| Hockemeyer et al., 2011 | PITX3 | TALEN | GFP-Puro | 96 | 13,0% |
| Merkle et al., 2015 | VASA | Cas9 | Reporter-Geneticin | 139 | 94,0% |
| Merkle et al. </ em>, 2015 | CRH | Cas9 | Reporter-Geneticin | 30 | 93,0% |
| Merkle et al., 2015 | HCRT | Cas9 | Reporter-Geneticin | 154 | 92,0% |
| Merkle et al., 2015 | HMX2 | Cas9 | Reporter-Geneticin | 11 | 45,0% |
| Forster et al., 2014 | LRG5-Nterm | ZFN | GFP-Puro | urapportert | 30,0% |
| Forster et al., 2014 | LRG5-Cterm | ZFN | GFP-Puro | urapportert | 14,0% |
| Soldner et al. 2011 | SNCA | ZFN | Puro | 96 | 1,0% |
Tabell 1. Beskrivelse av andre gener målrettet bruk av denne metoden, med correende målretting effektivitet hentet fra tidligere publiserte studier. 4,5,38-41
| Locus | Sekvens | Notater |
| AAVS1-F primer | CTCTAACGCTGCCGTCTCTC | PCR vilkår: T m = 57 ° C, 35 sykluser |
| AAVS1-WT-R primer | GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG | WT bandet: 1273 bp |
| AAVS1-Målrettet-R primer | CGTCACCGCATGTTAGAAGA | Målrettet bandet: 992 bp |
| T2-Cas9-guide | GGGCCACTAGGGACAGGAT | Fra Mali et al. 2013 |
| AAVS1-ZFN-Høyre | TAGGGACAGGAT | Fra Hockemeyer et al., 2009 |
| AAVS1-ZFN-Venstre | TGGGGTGTCACC | Fra Hockemeyer et al., 2009 |
| AAVS1-TALEN-Høyre | TCCTAACCACTGTCTTT | Fra Hockemeyer et al. 2011 |
| AAVS1-TALEN-Venstre | CCCCTCCACCCCACAGT | Fra Hockemeyer et al. 2011 |
Tabell 2. Liste over primere og SSN rettet sekvenser.
| Målretting Konstruer | Antall EGFP + Colonies | Målrettede plukket kloner (PCR bekreftet) | Forrige Rapportert Effektivitet Riktig Targeting (ved Southern blot) |
| ZFN | 150 | 86,9% (73,9% het / 13,0% homo) | 56% (50% het / 6% homo) |
| TALEN | 412 | 91,3% (47,8% het / 39,1% homo) | 47% (37,5% het / 9,3% homo) |
| CRISPR-Cas9 | 235 | 95,7% (69,5% het / 26,3% homo) | urapportert |
Tabell 3. Sammen antall EGFP-positive og målrettede TALEN, ZFN og CRISPR / Cas9 menneskelige stamcelle kolonier. PCR bekreftet integrasjoner på AAVS1 locus for dette eksperimentet er i forhold til Southern blot bekreftet riktig enkeltsintegrasjoner i tidligere eksperimenter 4,5.
Discussion
Metoden som presenteres her for å isolere homogene populasjoner av redigert gen-menneskelige pluripotente stamceller er en kraftig tilnærming for å generere isogene hPSC linjer som skiller seg bare ved målrettede locus. Disse cellene er et ideelt system for sondering mekanismene for human cellulær differensiering og utvikling samt for forståelsen av patofysiologien monogene sykdommer i en kontrollert genetisk innstilling. Som vist her, er det mulig å bruke tre uavhengige SSN design strategier (ZFNs, Talens, og CRISPR / Cas9) for å oppnå målrettet integrering på AAVS1 locus. Hver av disse metoder har sine egne fordeler og ulemper. En mulig fordel med ZFNs og, til en viss grad, er Talens deres design fleksibilitet, noe som gjør det mulig for iterativ teknikk for å forbedre den DNA-bindende domener av de enkelte 42 nukleaser. Dette nukleasefritt optimalisering kan øke spesifisiteten ZFNs og Talens utover det som er oppnåelig med CRISPR / Cas9 system. Slik selektivitet kan være viktig for kliniske applikasjoner som krever en høy grad av target spesifisitet. Den primære fordelen av CRISPR / Cas9 system er dens brukervennlighet. Selv Talen og ZFN lego har blitt gjort tilgjengelig for allmennheten (dvs. gjennom Addgene 21), CRISPR / Cas9-baserte ssns er betydelig enklere å konstruere, som den eneste nødvendig tilpasning er en 20 basepar oligonukleotid (når du bruker px330 plasmid Motivet 14). Denne enkelheten viser seg å være en fordel for forskningslaboratorier som ønsker å inkludere genom redigering i sine studier.
Det finnes alternative transfeksjonsteknikker, inkludert nucleofection 43, for å skape redigert gen-hPSC linjer; imidlertid elektroporering har vist seg å være konsistent og kostnadseffektiv 4,5,25. Nucleofection kan brukes til direkte transfektere Cas9-guide RNA ribonukleoproteinpartikler komplekser inn i kjernen, øker SSN effektivitet end fidelity 44. Økende hPSCs på MEFs er en robust og billig metode for å opprettholde hPSCs i en pluripotent tilstand uten overdreven differensiering. Dessuten gir det mulighet for lett isolering av genetisk identiske kolonier. Alternativt er det mulig å dyrke hPSCs uten MEFs, men disse dyrkningsbetingelser kan være dyrere enn mate basert kulturer. Videre er hele prosessen skalerbar, slik at for isolering av meget sjeldne redigerings hendelser eller generering av mange forskjellige cellelinjer i parallelle redigering eksperimenter.
Protokollen er beskrevet her er robust; men det er flere viktige skritt som påvirker effektiviteten som korrekt redigerte kloner kan skaffes. Den mest kritiske komponenten for denne metoden er å ha høy kvalitet MEFs og medikamentresistente DR4 MEFs. Overlevelsen av enkelt hPSCs er tynn, og lav kvalitet MEFs vil hindre isolering av udifferensierte hPSC linjer. For det andre er også anvendelsen av Y-27632Nøkkelen til å tillate enkel celle overlevelse uten å generere et seleksjonspress for celler med unormal karyotype 45. Tredje, plukke god avstand kolonier sikrer genetisk homogenitet av avledet cellelinjer. Til slutt er det viktig å fremstille glass pipetter slik at åpningen er liten nok til å bryte kolonien i mange mindre stykker, slik at flere kolonier vil vokse i den nye brønnen. Dette tillater plukking av god avstand subkloner for en replika plate å ha i kultur, slik at den opprinnelige plate av isolerte kolonier for genotyping. En utfordrende delen i denne protokollen er manuell trekking av glass pipetter; Dette skal praktiseres på forhånd. Det bør bemerkes at det finnes flere teknikker for å klone plukking som ikke krever et glass pipette. Forskere oppfordres til å finne det som fungerer best for dem.
Det er begrensninger i denne protokoll som kan overvinnes ved enkle modifikasjoner. Et eksperiment ment å oare forstyrre locus av interesse uten reparasjon eller en plutselig reparasjon templat ikke inneholder et utvalg kassett må bruke en annen fremgangsmåte for å anrike for celler som ble redigert. Legg merke til at antall kolonier som må tas ut for å finne en positiv klon øker i stor grad i fravær av seleksjon. En strategi for å forbedre effektiviteten er å ko-transfektere en ikke-integrert plasmid som uttrykker et fluorescerende protein. Etter at cellene til å gjenopprette i to dager, kan målrettede celler sorteres på positiv fluorescens ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering og på ny sådd ut 29. Denne prosessen beriker for celler som har blitt transfektert med plasmidene ved elektroporering, og øker dermed sannsynligheten for at en samtidig redigering hendelse i cellen.
Teknikkene som er beskrevet her kan bli utvidet til å bruke flere guide RNA samtidig målrette flere loci 14,46,47. Mange protokoller er etablert for å skille hPSCsinn i forskjellige celletyper, slik at ulike genetiske manipulasjoner i celletyper av interesse 30. Totalt sett har vi demonstrert potensialet for effektiv genom redigering i hPSCs uavhengig av SSN valg. Vi foreslår at denne teknikken kan tilpasses for å skape hPSC isogene linjer som er gen-redigert helst genomiske locus.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Brain Research Foundation Seed Grant (BRFSG-2014-02) til Helen Bateup. Dirk Hockemeyer er en New Scholar i Aldring av Ellison Medical Foundation og er støttet av Glenn Foundation samt The Shurl og Kay Curci Foundation. DH er også støttet av NIH stipend 1R01CA196884-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
| Fibroblast Growth Factor - basic | Life Technologies | PHG0261 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
| 6-well plates | Corning | 3506 | |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 4 mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
| X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| 10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
| Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
| Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
| TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6 (2014).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila. Genetics. 182 (3), 641-651 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jasin, M. Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases. Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool. Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).
- Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases. Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).
- Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), e82 (2011).
- Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).
- Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Podhajska, A. J., Szybalski, W. Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites. Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).
- Costa, M., et al. A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation. Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
- Soldner, F., et al. Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).
- Chiba, K., Hockemeyer, D. Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases. Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Southern, E. Southern blotting. Nat Protoc. 1 (2), 518-525 (2006).
- Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol. BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Sexton, A. N., et al. Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation. Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).
- Merkle, F. T., et al. Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Forster, R., et al. Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).
- Miller, J. C., et al. Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire. Nat Methods. , (2015).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4, 5400 (2014).
- Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
