Summary
支配CD4效应T细胞的间质动力在炎症部位的机制比较陌生。我们提出了一种非侵入性的方式来可视化和体外 -primed CD4T细胞操纵在发炎耳朵真皮，允许这些细胞在原位的动态行为的研究。
Abstract
CD4 + T细胞进行的效应子功能的能力取决于通过一个尚未未定义机制这些细胞在发炎外周组织的迅速和有效的迁移。多光子显微镜对免疫系统的研究中的应用提供了测量的完整组织内的免疫应答的动力学的工具。这里，我们提出在发炎的小鼠耳真皮的CD4 T细胞的非侵入性活体多光子成像的协议。使用定制成像平台和静脉导管允许的CD4 T细胞动力学在真皮间质的可视化，通过加入阻断抗体中涉及能动性关键分子组分来询问这些细胞中的实时的能力。该系统提供了在体外模型和微创手术成像程序既有优势。了解的CD4 T细胞的活力所使用的途径，最终可能提供洞察到基CD4 + T细胞的C函数以及自身免疫性疾病的慢性感染的发病机制和病理。
Protocol
所有涉及小鼠的程序是由罗切斯特大学的机构动物护理和使用委员会批准，并严格按照动物福利法和人文关怀和实验动物的使用公共卫生服务政策由国家机构管理的实施卫生，实验室动物福利办公室。
1.效应CD4 + T细胞的制备
注：特异性识别从鸡蛋卵清蛋白（：ISQAVHAAHAEINEAGR POVA）肽BALB / c小鼠TCR转基因小鼠DO11.10。其他TCR转基因系统可以被取代，使用适当的同源肽代替POVA的指示的位置。
- 净化幼稚CD4 + T细胞
- 通过暴露于2升安乐死6-8周龄的雌性DO11.10 BALB / c小鼠/分的 CO 2，直至鼠标示出没有运动或呼吸1分钟的迹象，颈椎脱位，或根据当地机构动物护理和使用委员会的指导方针。喷用70％的乙醇溶液中的小鼠，并在从小鼠的下巴皮肤上的大约7厘米的切口，以的方式向下腹部2/3。从在朝向后脚腹部切口的端部使2-3厘米的皮肤切口。小心不要切入腹膜。
- 用钳子轻轻拉动小心地从腹膜皮肤分开。腹股沟淋巴结位于后腿与主体的连接点附近的皮肤。通过抓住并在8ml的HBSS补充有2％新生小牛血清（NCS）用钳子和地点拉动除去。
- 抓住并用钳子轻轻拉动收获从鼠标腋窝及肱淋巴结。在HBSS + 2％NCS放置与腹股沟淋巴结。
- 收获位于鼠标与旧约镊子和地方在HBSS + 2％NCS颈部深，浅颈部淋巴结肿大她的淋巴结。
- 轻轻切成腹膜，小心不要切断进入肠道。抓住盲肠和结肠钳和揭露那些刚刚沿结肠位于肠系膜淋巴结。小心地用钳子取出肠系膜淋巴结，并与其他的淋巴结放置。
- 找到脾在腹腔内，小心地取出它，用钳子固定和用一双手术剪切割结缔组织路程。放置脾脏与淋巴结。
- 通过将含有脾脏和淋巴结成放置在一个60×15毫米的培养皿的金属过滤器的HBSS + 2％NCS制备单细胞悬浮液。通过与从10毫升注射器到HBSS + 2％NCS柱塞金属滤网轻轻捣碎脾和淋巴结。
- 使用移液管，将细胞悬浮液到一个干净的50ml离心管中。冲洗金属过滤器和培养皿用另外的10ml HBSS + 2％NCS的，U唱吸管，并将该溶液在相同的50ml离心管作为细胞悬浮液。
- 旋转细胞在600×g离心5分钟以轻轻吹打使细胞沉淀重悬在10ml的HBSS + 2％NCS。除非另有规定，所有的离心应在600×g离心5分钟进行。
- 稀释10微升细胞悬浮液在PBS中90微升0.1％台盼蓝的为1:10稀释。放置10微升在台盼蓝的细胞到血球通过在血细胞计数器的边缘吹打溶液进入凹槽。计数白血细胞的血细胞计数仪的中心格，忽略如略显得更小的红细胞，圆形，红色调细胞和蓝色死/将死的细胞。乘以10 4计数的细胞数，稀释倍数（10），并且通过将细胞（10毫升）的体积，以确定在50ml离心管中收集的细胞的总数量。
- 以丰富的CD4 + T细胞，离心细胞沉淀，并重新悬浮于2×10 7个细胞/ ml的细胞中的溶液含有约1微克/毫升抗CD8（克隆3.155），1微克/毫升抗MHC II类（克隆M5 / 114），和1微克/在HBSS + 2％NCS ml抗CD24（克隆J11d）抗体轻轻吹打。
注意：在这个步骤中使用的抗体是在内部衍生自杂交瘤细胞系和浓度近似。这些抗体的理想的补体裂解的浓度和体积凭经验确定，并将实验室之间变化。可替代地，几种市售试剂盒可用于幼稚的CD4 T细胞的纯化和可取代的补体裂解和CD62L +纯化过程在这里表示。如果使用另一种方法来净化幼稚的CD4 T细胞，这种协议可以从步骤1.2继续。 - 在冰上孵育30分钟。在该温育结束时，迅速地通过在37℃的水溶液B放置解冻豚鼠补ATH约2分钟。通过直接吹打的补入细胞悬浮液中添加100μl的补体每1毫升该抗体溶液的细胞组成。孵育在37℃水浴中的细胞30分钟。
- 添加HBSS + 2％NCS带来的细胞的20毫升离心管中的总体积。层在8ml RT密度离心培养基（密度1.086克/ ml）的细胞下面。立即离心细胞在1400 xg离心在RT用离心机制动器关闭15分钟。
- 收集使用血清吸管和转移的细胞到新的50ml离心管中在界面处的细胞。通过使体积在离心管至50ml用HBSS + 2％NCS和离心洗细胞。
- 重悬在MACS缓冲液将细胞轻轻吹打和如先前计数，在步骤1.1.10（PBS补充有2％NCS和2mM EDTA）中。
- 富集幼稚的CD4 T细胞，重悬在2×10 7个细胞/ ml的细胞中的溶液在MACS缓冲液2.5微克/毫升生物素标记的抗CD62L抗体，是根据在步骤1.1.16计数的数目。孵育在冰上30分钟。
- 通过加入10ml MACS缓冲液，然后离心分离细胞洗细胞。重悬的细胞以10 7个细胞/ 100微升在MACS缓冲液和在1:10稀释直接添加链霉抗缀合磁选珠的细胞。在冰上孵育20分钟。
- 如前清洗细胞，在步骤1.1.17，并在MACS缓冲液2×10 8个细胞/ ml重悬细胞，在500微升的最小体积。
- 放置在磁体保持器的磁性分离柱，并通过让3毫升MACS缓冲液流动通过冲洗柱子。应用该细胞用吸管的列。
- 洗柱吹打3毫升MACS缓冲液上柱并允许MACS缓冲液流过，并重复3次以除去未通过磁列结合的细胞。丢弃通过分数的流动。
- 祛瘀E从磁力架柱及抱过来一个新的50ml离心管中。吸管5毫升MACS缓冲液中到柱上，并使用附带的柱柱塞推MACS缓冲液通过该柱以释放列结合的细胞，并收集流过包含富集幼稚的CD4 T细胞。
- 离心机在10ml RPMI的细胞，并重新悬浮在补充有10％胎儿小牛血清（FCS），100国际单位/毫升青霉素，100微克/ ml链霉素，2mM的L-谷氨酰胺和50μM2-巯基乙醇（RPMI-10）。作为前计数细胞，在步骤1.1.10。
- 调节幼稚的CD4 T细胞对6×10 5 / ml的在RPMI-10的最终浓度。
- 净化T细胞耗竭脾装甲运兵车
- 安乐死6-8周龄的雌性野生型BALB / c小鼠按步骤1.1.1。
- 喷鼠标用70％的乙醇溶液，并通过在小鼠的abdome左侧作出大约3厘米的切口暴露出脾ñ。切开腹膜层，并用钳子轻轻地抓住它，并用手术剪刀剪远离底层的连接组织取出脾脏。
- 将脾为8毫升HBSS + 2％NCS的。
- 由捣碎脾准备单细胞悬液，洗涤和细胞计数和以前一样，在步骤1.1.7-1.1.10
- 耗尽T细胞在600 xg离心纺丝细胞5分钟以沉淀，并轻轻吹打重悬的细胞以2×10 7中的大约1微克/毫升抗Thy1.2抗体（J1J克隆）的溶液中。在冰上孵育细胞30分钟。
注意：此抗体进行内部衍生自杂交瘤细胞系和concentraton近似。这种抗体的理想的补体裂解的浓度和体积凭经验确定，并将实验室之间变化。从脾细胞纯化的APCs的其它方法如果需要，可以被取代。幼稚T细胞和装甲运兵车应该邪教准备URE从步骤1.3。 - 加入豚鼠补，孵化，并像以前一样在密度离心媒体梯度细胞分离，步骤1.1.13-1.1.14。
- 重悬在RPMI-10 10毫升的细胞，并通过将所述细胞在50毫升离心管成γ辐照的时间长度，将暴露的细胞对25戈瑞辐射照射的APC。此时间长度将取决于辐照和将需要每细胞被照射的时间来计算。
- 如前指望血球细胞，在步骤1.1.10，并调整在APC细胞的2.4×10 6细胞/ ml在RPMI-10的最终浓度。
- 刺激细胞和分化的CD4 T细胞向Th1细胞表型在5天的培养。
注意：虽然我们在这里提出了制备和成像从幼稚的CD4 T细胞中产生的Th1效应的协议，该协议可以调节分化的幼稚细胞进行不同的表型，或叔o使用其它细胞类型，如CD8 T细胞。用于引发和分化条件将不得不凭经验确定。- 在24孔培养皿的每个孔中，结合幼稚的CD4 T细胞的500微升和500微升每孔中照射的APC的，总共3×10 5 T细胞和1.2×10每孔6的APCs。
- 准备在RPMI-10含有2μM同源的OVA肽，20U / ml的重组IL-2，80微克/毫升的抗IL-4（克隆11B11）和40纳克/ ml重组IL-12和过滤器使用0.2的溶液微米注射器过滤。添加该溶液1毫升细胞的每个孔中，为2毫升每孔的总体积。
- 孵育在37℃培养箱将细胞在5％CO 2的3天。
- 在第3天，轻轻吹打重悬细胞，并移动，从各孔1毫升进入新培养井分裂培养物。通过加入1ml /孔的RPMI-10带来每孔2毫升的最终体积+20 U / ml的重组IL-2。</ LI>
- 返回所述板的孵化器和使细胞膨胀，直至5天。
2.细胞转移和炎症的诱导
注意：对于用于成像的最佳细胞数，5×10 6荧光标记的Th1细胞应在200μlPBS中的总体积转移至各小鼠。细胞在这里被标以绿色染料CFSE或近红染料CMTMR，尽管其它细胞追踪染料都可以使用。 CFSE和CMTMR标记的细胞可被共转移，以允许两个不同的效应子CD4 +群体的跟踪。
- 标签效应T细胞与CFSE
- 通过大力吹打细胞每孔，并转移到一个无菌的50ml离心管与吸管收获从培养皿的细胞。计数细胞如在步骤1.1.10，然后离心并在PBS + 5％NCS的10 7个细胞/ ml重悬细胞。
- 稀释5毫米股票CFSE液1：100PBS。通过将在管的侧面的CFSE溶液一滴然后快速摇动管来回调匀添加110为每1ml细胞微升CFSE溶液。
- 孵育所述细胞在室温下5分钟，然后通过加入5ml直接胎牛血清（FCS）的细胞的管淬灭CFSE。使体积至50ml用PBS + 5％NCS。
- 离心细胞和悬浮颗粒在20毫升PBS + 5％NCS。重复此过程两次以洗涤细胞总数的3倍。计数细胞上的血球，和以前一样，在步骤1.1.10，并以2.5×10 7个细胞/ ml转移到小鼠悬浮细胞在无菌PBS中。
- 标签效应T细胞与CMTMR
- 收获细胞如上述在步骤2.1.1，然后计数，离心并在RPMI-10重悬的细胞以10 7个细胞/ ml。
- 直接添加的10mM CMTMR原液到细胞中的10微米的最终浓度。很快吸管日E细胞彻底的CMTMR混合并防止染料沉淀。
- 孵育在37℃水浴中30分钟。洗涤细胞3倍的PBS + 5％NCS和以前一样，在步骤2.1.3-2.1.4。计数和重悬细胞在无菌PBS在2.5×10 7个细胞/ ml转移至小鼠。
- 转移效应T细胞向幼稚6-8周龄的雌性BALB / c小鼠。
- 绘制细胞悬浮液（步骤2.1.4或2.2.3）到一个注射器，照顾握住注射器针头朝上，轻弹注射器的侧面和上下移动柱塞，如果需要的话，除去所有气泡。
- 直到尾静脉出现vasodilated发生在一个干净的笼子里老鼠和热轻轻下一个热灯。鼠标放置在约束装置和擦拭酒精棉签尾巴。缓缓注入200微升细胞悬浮液进入侧尾静脉中。应该是在皮肤下注射或可见起泡无阻力。
- 通过与完全弗氏佐剂免疫诱导皮肤炎症（CFA）
注：在这个协议中，炎症是由皮内注射引起的CFA乳化无论是同源或非同源抗原。其它炎症模型可以被取代，但对于转移和成像的定时所需的细胞数量将需要根据经验调整。- 制备OVA肽在无菌PBS中微量离心管中200μM的溶液。吸管CFA对肽溶液的顶部等体积。
- 通过绘制成一个28 G1 / 2胰岛素注射器，然后浸入溶液放回离心管中，然后重复这个操作大约20次乳化该溶液。当完全乳化，终审法院和肽的解决方案将形成一个厚厚的和不透明的混合物。
注：它使用固定针胰岛素注射器，以形成乳液，因为该乳液将在死空间会丢失在非固定业务承包商是必不可少Ë注射器。 - 滴加少量到放置在培养皿中的水测试乳液。该乳液应保持不变，而不是分散到水中。
- 绘制乳液到300微升28 G1 / 2胰岛素注射器和大幅向下按柱塞以去除大气泡。
- 转印的荧光标记的效应T细胞后，立即麻醉由2,2,2-三溴腹腔注射的小鼠在240毫克/公斤。用温和的脚趾捏评估麻醉，在1毫克递增，管理更多的2,2,2-三溴如果必要的。
注：其他批准的麻醉剂可被取代的2,2,2-三溴乙醇。 - 放置在左手食指一个顶针和认真把握左手拇指和食指腹耳朝上的老鼠的耳朵。确保不施加于耳，这可能会导致对皮肤的机械损伤过大的压力。
- 含滑动终审法院Ë针mulsion进入真皮，斜面朝上，并慢慢地注入10微升乳液进入耳朵。注射的位置应在耳廓的外1/3，稍微偏离中心以允许最佳成像。
- 监测小鼠，直到麻醉逐渐消减和鼠标都能够纠正自己，是门诊。图片小鼠免疫接种后，炎症提供时间来开发和转移的T细胞投放到耳真皮3天。
注：老鼠可能无法独留任何时间，在麻醉下。
3.准备鼠标成像
- 准备导管
- 小心地从用钳子30 G1 / 2结核菌素（TB）的注射器针头除去金属针和清洁掉任何多余的胶，用解剖范围形象化的胶水被完全去除。
- 切尖端关闭另一个30 G1 / 2结核病注射器针头，确保其余针方面依然是P通过目测atent。滑一个18厘米长的PE-10医疗用管的上修整针，并小心地将裸露的金属针约5mm到管的另一端，形成一个导管。
- 填充用无菌PBS 1毫升结核病注射器，除去任何气泡冲洗导管。轻轻放置在注射器的尖端导管和轻轻地推PBS虽然导管在管道除去任何气泡。
注：通过导管推动流体时，有必要保持在导管上的注射器，以防止推导管从注射器的流体压力。 - 直到尾静脉出现vasodilated发生在一个干净的笼子里老鼠和热轻轻下一个热灯。麻醉小鼠用室内空气和异氟烷的混合物（5％诱导，1-2％维护，以2升/分钟流速），通过已被附连到异氟烷蒸发器的鼻锥组件递送。确保鼠标被麻醉的WiTH温柔的脚趾捏。如果观察到的运动由0.1％逐渐提高异氟烷流速。捂在眼睛上用眼药膏，以防止干燥和伤害，同时鼠标被麻醉。
注：重要的是，老鼠永远无人看管而麻醉。小鼠应经常监测麻醉足以轻轻脚趾捏。 - 固定尾部在一双镊子的基础上，然后擦拭用酒精棉签尾巴。小心地将导管推入侧尾静脉，并通过在注射器的柱塞轻轻推检查通畅。应该有运动和PBS的皮肤下没有可见起泡没有阻力，如果它被适当地放置。通过施加氰基丙烯酸酯的组织粘合剂的1-2滴注射部位贴上导管到尾并晾干，约30秒。
- 小心修剪从耳的一对剪刀的背面和侧面的毛，小心不要损坏SK英寸修剪胡须以及。用棉签，滋润用PBS耳朵的内表面上。
- 鼠标和耳旋转到24×50毫米1.5号盖玻片。使用镊子，耳轻轻压平到盖玻片，移动鼠标如果必要，以确保耳塞与玻璃平齐。通过用纸巾轻轻擦拭印迹从耳朵中取出多余的PBS。
注意：确保不要太用力按下在耳朵上，因为皮薄可与压力过大很容易损坏。 - 使用两对弯钳，掌握约20毫米长的一块布胶带纵向顶部角落。放置带的底部到所述盖玻片在小鼠的耳朵的顶部和滚动带过耳的其余部分，推过量头发出的方式与钳如果必要贴上耳到盖玻片。轻轻地按，用干棉签以确保密封耳磁带上，注意不要压在耳朵本身。
- 附上成像平台用胶带37℃加热块。在成像平台的耳区的任一侧上施加真空润滑脂。旋转鼠标盖玻片放置到成像平台，小心对齐耳在毛毡的中央。
注意：避免在磁带上越来越真空硅脂，因为这将导致它来从玻璃盖玻片分离。 - 单元的异氟烷鼻锥到成像平台上的夹持器，从而确保鼻锥是安全的，并完全覆盖鼠标的鼻子。用干净，干燥的棉签坚定而认真按盖玻片上成像平台传播盖玻片下的真空润滑脂。
- 加盖盖玻片到平台用胶带两20毫米件和两个较长片带的平台的上部缠绕。如果任何气泡耳朵和盖玻片之间存在时，它们可以轻轻从下面的Wi按压在耳朵上除去TH一张折叠的纸。
注意：不要使用的纸张太厚或用力按下这是至关重要的，因为这可能会导致组织热烫和损坏，复杂的结果。 - 将鼠标移动到显微镜台上，确保用胶带平台。管真空润滑脂的双层到耳朵周围盖玻片作为用于水浸物镜的储存器。
- 通过成像平台环绕鼠标一个充满水的加热毯。填用37℃的蒸馏水的贮存器。确保一切固定用胶带的舞台和导管的注射器是方便。
4. 体内成像定时和静脉给予抗体
注：此协议要求使用装有钛多光子显微镜：萨激光系统。所使用的目标是25倍放大倍率镜头，1.05 NA，与对象贴IVE加热器设为40℃。此加热器的最适温度凭经验确定为适当的温度，以保持耳真皮，在37℃，并可能需要调整用于其它成像系统一起使用。用于可能的仪器和调整到协议之间变化采集软件可能必须进行的工作的不同的配置的系统。确保图像可以被保存在一个格式与任何所需的分析软件兼容。
- 由物镜定位在耳的中心，并且降低目标只是直到它接触到水的表面上的贮存器定位通过目镜真皮。使用外部光源，期待通过目镜，继续慢慢放低目标，直到耳朵的表面成为关注焦点。降低周围的显微镜载物台的内部和外部的窗帘。
- 确定显微镜的设置和定位成像区域
- IMAGIN前克，通过调节激光波长在多功能激光控制器窗口900纳米，在获取设置的激光功率设置为所需荧光团的最大激发和检测的激光：激光窗口，PMT电压的图像采集控制窗口。
注：此过程使用900纳米的激发波长与过滤器来检测二次谐波产生（420-460纳米），CFSE（495-540纳米）和CMTMR（575-630纳米）。其它配置可以根据需要使用，以检测不同的荧光团。 - 将显微镜为512×512像素分辨率，在收购设置一个2微秒/像素停留时间：规模和模式的窗口。激活一个实时成像模式通过点击“XY重复”，以允许穿过组织为一个区域到图像扫描。理想的是，面积应相当均匀，无气泡，并避免致密毛囊区域。
注：CFA乳液是在绿色和NE明亮的萤光AR-红色通道，应该避免。最佳场通常可以从乳液的边缘发现约3毫米。约10 - 100细胞可以在一个单一的图像进行跟踪。如果太多细胞存在，跟踪软件将通常遇到在试图分离密切位于细胞的错误，从而导致缩短的和/或不准确的细胞轨道。 - 一旦适当的摄像视野的位置被确定，确定将通过定位于真皮的细胞“最高的”被成像在Z区域，通过点击“设定0”键设置的Z位置为0，在Z向下滚动方向上测量细胞的深度的程度。 35-75微米的成像深度是典型的。坐落在收购设置开始和结束位置：显微镜窗口。调整仪器PMT电压和激光功率在“明亮的Z”的窗口在整个摄像视场的深度优化细胞可视化。
注意：避免扬起拉斯维加斯呃功率超过25毫瓦的样品，高功率级别可能会导致热损伤和无菌伤害到真皮。每个显微镜适当的最大功率电平会有所不同，将必须被测量。应当注意，增加激光功率或PMT电压与组织深度不允许在采集后分析不同深度的图像亮度的定量比较。 - 检查“深度”和“时间”按钮，在图像采集控制窗口中的“扫描”按钮下方。设置一个卡尔曼滤波器扫描图像每行3倍，在图像采集控制：过滤器模式窗口，并调整图像采集的Z切片深度：显微镜窗口，以便需要大约1分钟捕捉到一个完整的堆栈，如上所述在窗口的TimeView。
注：堆栈之间的时间间隔不应该超过约1分钟，如更长的间隔防止迅速迁移细胞的跟踪。根据日细胞的e型被成像，此间隔可能需要进行调整以允许用于通过分析软件适当的细胞的跟踪。 Z-片应是不超过5微米。通常2-5微米之间15-18 Z-片厚是适合于1分钟的成像时间间隔。
- IMAGIN前克，通过调节激光波长在多功能激光控制器窗口900纳米，在获取设置的激光功率设置为所需荧光团的最大激发和检测的激光：激光窗口，PMT电压的图像采集控制窗口。
- 捕获预抗体隔时图像
- 捕捉区域的5分钟时间推移图像在收购设置重复次数设置为“5”，以评估组织的稳定性：TimeScan窗口，点击“扫描”按钮。
注：组织“漂移”可以通过不允许足够的时间让耳达到热平衡，耳制剂差，或可以在耳中的一个区域是由于局部的漂移引起的。如果5分钟图像并不稳定，图像中的真皮一个新区域。如果在一个新的区域的第二图像仍然不稳定，最好仔细重复从步骤3.6耳朵制备和成像用新鲜COVerslip。 - 如果组织是5分钟，图像稳定，通过收购设置重复次数为30和45之间收集了30-45分钟的时间推移图像：TimeScan窗口，监视任何轻微的漂移组织作为图像集。文件保存在格式与要使用的分析软件兼容。
注：在协议这一点上，步4.2.2 - 4.3.2可反复在同一个人耳图像的多个位置。单个鼠标不应保持麻醉的时间超过4小时，死亡是更可能发生。
- 捕捉区域的5分钟时间推移图像在收购设置重复次数设置为“5”，以评估组织的稳定性：TimeScan窗口，点击“扫描”按钮。
- 注射阻断抗体和捕获后抗体的形象。
- 绘制抗体混合成1毫升注射器TB并取出针，确保消除所有气泡。在柱塞按使抗体溶液形成“微滴”在注射器的端部。
- 提起在舞台窗帘和定位导管。删除原始PBS-CONTA从导管进不去注射器。如果不设置导管下来，仔细地附上含有抗体的新的注射器。持导管的端部上的注射器和慢慢注入抗体混合物进入导管。确保有注射没有抵抗力。
- 下来将导管和周围降低显微镜阶段窗帘。注注射的时间，并立即开始使用相同仪器设置作为预抗体图象中相同的位置收集一个新20-40分钟成像序列。文件保存在一个合适的格式将要使用的分析软件。
注：时间推移图像之间，观察鼠标充分麻醉和呼吸。这是不建议的图像多个字段以下抗体的管理，因为可以有抗体的清除浮动利率。
- 注射荧光标记的葡聚糖找到血管，评估导管通畅，并量度Blood血管通透性
- 准备在100μl荧光缀合的葡聚糖（70,000兆瓦）无菌PBS的2毫克/毫升溶液，并绘制到注射器，除去任何气泡。
- 用同样的方法，步骤4.4.1-4.4.2，注射器放置到所述导管和静脉内注射的葡聚糖溶液。
- 模式窗口中，用相同的PMT和激光设置作为时间推移图片：通过改变收购设置分辨率拍摄1024×1024像素分辨率的单一堆栈。为了收集图像，取消选中“时间”按钮，在“扫描”按钮下方，然后点击“扫描”按钮。此三维图像将允许位于脉管排除T细胞和表明该导管是专利和正确插入。荧光葡聚糖出血管的扩散也可用于评估局部血管通透性。
注：此高分辨率（1024×1024）的静态图像，用于公关esentation目的且可另外被用于在同一地区的时间推移图象的组织结构的分析。可替代地，一个512×512的图像可以采取，可使用图像分析软件的时间推移的图像合并。葡聚糖给药时间的推移成像也可以根据个人实验室的研究需求所需。在这种情况下，图像应当被设置为在步骤4.2.3-4.3.2。
- 成像完成后，小心地从目标下移开鼠标和解开水毯。通过切割胶带和轻轻提起玻璃板，直到它脱离除去从成像平台盖玻片。而鼠标仍然是麻醉，分离从盖玻片的耳朵。如果这是要在终端程序，安乐死通过颈脱位鼠标。如果保存此鼠标重复成像，它返回到一个干净的笼子从其他老鼠分开，并观察到鼠标可以纠正本身就是门诊。一旦从麻醉中恢复，鼠标可以被返回到与其他动物的笼子。
- 导入影像文件转换成图像分析程序，并执行任何所需的更正。建议非线性增强和自动平滑或降噪程序和算法的规避。通常情况下，图像需要仅通过分析之前手动增加图像的黑点轻微背景校正。通过使用自动细胞跟踪程序与手动校正，分析成像数据作为斯特里特，Gaylo 等 30。
注：有很多可用的图像分析套件，无论是专有软件和开源，可用于从该协议产生的多光子图像量化细胞动力学。要使用图像分析和准确的方法优化软件包将取决于各个实验室的研究需求。
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Representative Results
研究原位免疫反应，而不改变免疫环境的能力是研究与发炎组织T效应细胞的实时交互必需的。由这个协议中，在图1A和B中概述的完好耳真皮的成像，允许转移荧光标记的T效应细胞在皮肤间质的可视化。这允许两个高分辨率（ 图1C）和延时（ 图1D， 电影1）在发炎的真皮效应T细胞动力学的图片。
图1.高分辨率和完整的真皮间质T效应细胞的4D成像 。 （A）试验大纲。耳prepar的（b）照片编用于与乳液的位点（黑虚线）和最佳区域用于成像（红线）成像指示。从纤维状胶原（蓝色）和德克萨斯红-葡聚糖表示CFSE标记的Th1细胞（绿色）高分辨率栈，第二谐波信号（C）的最大3D投影标记的脉管（红色）。白色箭头指示的几个自身荧光毛囊之一。标尺代表50微米（D）跟踪在CFA发炎真皮30分钟Th1细胞迁徙路径。 请点击此处查看该图的放大版本。
该成像协议要求使用在内部构造的专门成像平台，以及一个适于鼻锥为吸入麻醉而成像的交付。成像平台（ 图2A-B）由Øf相一升高的中心部的铝底板。此凸起部具有与丙烯酸衬里的插入部感觉提供给耳支撑而不压缩和潜在破坏性的薄组织。我们设置的几何形状需要灵活可调鼻锥的建设成像过程中，提供吸入麻醉。此鼻锥，包括连接到柔性管（ 图2C）的50毫米部分的改性微量离心管的，被固定在适当位置具有修饰的离心管组成的保持器（ 图2D），并通过钩和环紧固件固定到成像平台。使用钩和环紧固件的允许鼻锥组件，使得小鼠的任一耳可以成像的重新定位，并且可以最佳地定位成用于单个小鼠。
图2.球菌pment的活体成像。定制的成像平台的顶部（A）和侧面（B）的意见。鼻锥异氟醚管理（C）和鼻锥座（D）。 请点击此处查看该图的放大版本。
尾静脉插管允许连续访问循环施用抗体和其它小分子可扩散出来的脉管的，或如高分子葡聚糖较大的荧光分子标记的血管。抗β1和抗β3整经导管封闭抗体，真皮内以前运动细胞阻滞（ 电影2）为100微克给药后。这些细胞具有抗体后降低平均速度施用（ 图3A），以及在曲折指数显著减少，总位移的总轨道长度（ 图3B）的比率。
图3. 抗β1 和抗β3 抗体 的施用 抑制在CFA中发炎的皮肤Th1细胞迁移。（A）的Th1细胞的平均速度之前和100μg抗β1和抗β3整给药后封闭抗体。 （B）的Th1细胞之前和抗体阻断后的蜿蜒索引。大约100跟踪细胞来自图像之前和在一个代表性的实验一个鼠标抗体阻断后。由曼惠特尼统计。ES / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
因为头发不会从耳的表面除去，从头发成像伪影是常见的。应避免从毛囊（ 图4A），并从上覆毛发（ 图4B）阴影和自发荧光自身荧光在可能，因为它们可以掩盖的T细胞和用自动图像分析软件干扰。同样，夹在耳表面与盖玻片之间的气泡可导致成像伪影（ 图4C）。耳的适当的准备，应尽量减少任何剩余气泡的数量和大小。
图4。 从头发中自发荧光及耳前差的公共构件paration（一）自体荧光毛囊。 （B）的自体荧光毛发和毛囊（绿色）和胶原（白色）与上覆头发阴影，从而导致在图像中的暗线。从气泡（C）的工件，示出了位移，自体荧光角化表皮的边缘（虚线）。标尺代表50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
另外，使用的加热多个源可导致与组织的稳定性由于热膨胀和收缩的问题。不正确恒温器的设置，例如，可以成像，可以使结果困难（ 电影3）的解释期间导致大振荡。重要的是要确定该提供恒定的温度和最大化稳定性的任何系统的最佳设置。 Ultimat伊利，温度受控成像室是由于温度变化而除去变性的最佳方式。
电影1 Th1细胞在CFA发炎真皮迁移（右键点击下载）。 30分钟时间推移图像显示Th1细胞（绿色）的真皮层胶原蛋白网络的迁移（二次谐波产生，蓝色）。
电影2 Th1细胞停滞在1β阻滞和β3整合（右键点击下载）。细胞（绿色）被拍摄30分钟的ADMINIST前阻断抗体的定量，然后成像在同一位置的另一20分钟。
电影3.从控制不佳的加热板振荡（右键点击下载）。 Th1细胞（绿色）和二次谐波产生（蓝色）的30分钟时间推移图像。这个图像被收集后，所使用的加热板被发现有一个错误的恒温器，在成像的平台和随后的热膨胀和收缩的温度引起的振荡。
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Discussion
意义
这里，我们提出一个完整的协议为传输，抗原特异性效应Th1细胞在完整小鼠耳真皮4D可视化。此方法提供了以下几个原因一些当前成像模式的优点。通过成像腹耳真皮，我们能够放弃所需的涉及其他部位皮肤成像方案脱毛。虽然脱毛剂通常是温和的，它们已被证明导致破坏皮肤屏障42，这个过程可以刺激免疫应答43,44。还通过避免侵入外科手术以暴露真皮或皮下组织，该协议阻止损伤诱导的炎症和嗜中性粒细胞37和其他免疫细胞的快速招募进入真皮。在本系统中使用静脉导管的递送阻断抗体对关键分子允许DYNA的实时询问CD4 + T细胞的MIC行为。使用这种成像协议已经揭示了在体外系统8时没有发现的CD4 T细胞间质活力30的关键要求。
在该过程的关键步骤
在任何成像协议的一个重要步骤是确保用于成像的稳定组织制备。重要的是要确保有耳朵和盖玻片之间有足够的PBS存在任何气泡和耳是在与玻璃接触，但没有那么多，以使该磁带变得从玻璃脱粘。同样，避免了带保持盖玻片到平台和任何真空润滑脂将防止磁带松动随时间之间的接触。温度也必须保持恒定，以避免振荡和从热收缩或平台材料的膨胀漂移。
限制和修改
45为活时间推移成像的模型。然而，耳朵的常住免疫人口是从皮肤上侧面或足垫46不同，并且当相对于其他部位47的小鼠耳具有明显的血管特性。因此，对于一些应用来说，耳朵的成像数据到其他皮肤部位的比较可能是困难的。
该协议还要求出血流并进入真皮转移的T效应细胞的有效迁移。这限制使用具有在归巢或外渗缺陷细胞，因为它们将不能进入间隙空间的能力。外渗可通过注入细胞直接进入耳真皮37,48，尽管这会造成这种方式可能无法概括在体内外渗经历细胞的定位或行为的一些机械损伤和细胞的递送被绕过。
也考虑使用未着色的受体小鼠进行成像实验，如这里或白化的C57BL / 6- 酪氨酸 的c-2J小鼠中使用的BALB / c小鼠品系的关键。在色素小鼠黑色素，除了是高度自发荧光，下从多光子激光37即使是相对低功率的激发加热。这可能会导致对皮肤和随后的炎症36或荧光斑点31，复杂化的结果的热损伤。这可能限制了可在多参数成像实验中使用的荧光团。然而，一些非常明亮或高表达的荧光分子可以在较低的激光功率有效激发，所有由于在色素小鼠有效的可视化。
未来的应用
因为这是一种非侵入性的过程，它可以很容易地适于与在延长的时间周期序列成像的小鼠的纵向研究。而这里描述会随着时间的推移周期褪色大于3-4天荧光标记，使用内源荧光的细胞或荧光报道细胞的消除了这个问题。事实上，我们先前使用这个协议来跟踪接近体内产生的抗原特异性效应轴承细胞因子的记者，包括IFNγ记者雪人30,49和IL-4记者4get 50。我们还可视化的内源性CD4细胞CD4-Cre重组ROSA26一站式两侧装接loxP EYFP荧光记者小鼠30。作为EYFP和其他荧光蛋白质的荧光性能，从化学染料如CFSE不同，可能需要修改的摄像参数高效的可视化。如增加像素停留时间可提高有些暗淡的荧光团的荧光信号，并减少时间推移图像的长度可以减轻可能观察到的任何漂白变化。在900 nm激发，我们以前没有观察到CFSE，CMTMR或EYFP的显著漂白过短的成像时间间隔。
虽然此过程关注测量CD4效应T细胞运动的动态，但并不限于这种应用。工作目前正在进行中，以测量与抗原通过使用荧光报道小鼠和荧光标记的抗体的注射入真皮呈递细胞标记的细胞或于成像51,52之前组织结构的效应T细胞的动态相互作用。此外，虽然此协议演示了如何使用导管提供封闭抗体，而成像，其他化合物，包括小分子抑制剂，能给药。最终，该协议提供了一个灵活的平台随时间来测量免疫动力学， 体内 ，以非侵入性方式。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢罗切斯特多光子显微镜核心设施的大学与实时成像帮助。支持NIH AI072690和AI02851到DJF; AI114036以股份公司和AI089079到MGO。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
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