Summary
Les mécanismes qui régissent la motilité interstitielle des cellules CD4 T effecteurs aux sites d'inflammation sont relativement peu connus. Nous présentons une approche non invasive pour visualiser et manipuler dans des cellules in vitro -primed T CD4 dans le derme de l' oreille enflammée, ce qui permet pour l' étude du comportement dynamique de ces cellules in situ.
Abstract
La capacité des cellules T CD4 à exercer des fonctions effectrices dépend de la migration rapide et efficace de ces cellules dans les tissus périphériques enflammés par un mécanisme non encore défini. L'application de la microscopie multiphotonique à l'étude du système immunitaire fournit un outil pour mesurer la dynamique des réponses immunitaires dans les tissus intacts. Nous présentons ici un protocole pour l'imagerie multiphotonique intravitale non-invasif des cellules T CD4 dans le derme inflammation de l'oreille de la souris. Utilisation d'une plate-forme d'imagerie personnalisée et un cathéter veineux permet la visualisation de la dynamique des cellules T CD4 dans l'interstitium cutanée, avec la possibilité d'interroger ces cellules en temps réel par l'ajout d'anticorps bloquants à des composants moléculaires clés impliqués dans la motilité. Ce système offre des avantages sur les deux modèles in vitro et des procédures d'imagerie chirurgicale invasive. Comprendre les voies utilisées par les cellules T CD4 pour la motilité peut finalement donner un aperçu des basic fonction des lymphocytes T CD4 ainsi que la pathogenèse de maladies auto-immunes et les pathologies des infections chroniques.
Protocol
Toutes les procédures impliquant des souris ont été approuvées par le soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université de Rochester, et réalisées en stricte conformité avec la Loi sur la protection des animaux et de la Politique sur les services de santé publique sur Humane soin et l'utilisation des animaux de laboratoire administré par le National Institutes de la Santé, Bureau de la protection des animaux de laboratoire.
1. Préparation des effecteurs T CD4 cellules
NOTE: BALB / c TCR transgénique DO11.10 souris qui reconnaissent spécifiquement un peptide à partir d'ovalbumine d'oeuf de poulet (POVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). D'autres systèmes TCR-transgéniques peuvent être substitués, en utilisant le peptide apparenté approprié à la place de POVA l'endroit indiqué.
- Purifier les cellules T CD4 naïfs
- Euthanasier un 6-8 week-vieille femelle DO11.10 souris BALB / c en exposant à 2 L / min CO 2 jusqu'à ce que la souris ne montre aucun signe de mouvement ou de la respiration pendant 1 min, suivie par dislocation cervicale, ou en fonction de lales lignes directrices du comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux locaux. Pulvériser la souris avec une solution d'éthanol à 70% et de faire une incision cm environ 7 dans la peau du menton de la souris à 2/3 du chemin vers le bas de l'abdomen. Faire 2-3 cm incisions de la peau de l'extrémité de l'incision dans l'abdomen vers les pieds arrière. Veillez à ne pas couper dans le péritoine.
- Séparez délicatement la peau du péritoine en tirant doucement avec une pince. Les ganglions lymphatiques inguinaux sont situés sur la peau près de la jonction des pattes arrière avec le corps. Retirer en saisissant et en tirant avec une pince et dans 8 ml de HBSS additionné de 2% de sérum de veau nouveau-né (NCS).
- Récolter les axillaires et les ganglions brachial nœuds de la souris en saisissant et en tirant doucement avec une pince. Placer dans le HBSS + 2% de NCS avec les ganglions lymphatiques inguinaux.
- Récolter les ganglions lymphatiques cervicaux profonds et superficiels situés dans le cou de la souris avec des pinces et les placer dans le HBSS + 2% NCS avec le otses ganglions lymphatiques.
- couper délicatement dans le péritoine, en prenant soin de ne pas couper dans les intestins. Saisir le caecum et le côlon avec une pince et d'exposer les ganglions lymphatiques mésentériques qui sont situés tout le long du côlon. Retirez délicatement les ganglions lymphatiques mésentériques avec une pince et placer avec les autres ganglions lymphatiques.
- Localisez la rate dans la cavité péritonéale et retirez avec précaution, en tenant avec une pince et coupe le tissu conjonctif loin avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Placer la rate avec les ganglions lymphatiques.
- Préparer une suspension cellulaire unique en versant le HBSS + 2% NCS contenant les ganglions lymphatiques et la rate dans une passoire métallique placée dans une boîte de culture de 60 x 15 mm. écraser légèrement les ganglions lymphatiques et la rate à travers le tamis métallique avec le piston d'une seringue de 10 ml dans le HBSS + 2% de NCS.
- En utilisant une pipette, la suspension de cellules dans un 50 ml tube de centrifugeuse propre. Rincer le tamis métallique et la boîte de culture avec 10 ml supplémentaires de HBSS + 2% de NCS, uchanter une pipette, et introduire cette solution dans le même 50 ml tube de centrifugeuse de la suspension cellulaire.
- Faites tourner les cellules à 600 xg pendant 5 min pour sédimenter les cellules et remettre en suspension dans 10 ml de HBSS + 2% NCS par pipetage. Sauf indication contraire, toute centrifugation doit être effectuée à 600 xg pendant 5 min.
- Diluer 10 ul de la suspension cellulaire dans 90 ul de 0,1% de bleu trypan dans du PBS pour une dilution de 1:10. Introduire 10 pi de cellules en bleu Trypan sur un hémocytomètre par pipetage de la solution dans la rainure au niveau du bord de l'hémocytomètre. Compter le nombre de globules blancs dans la grille centrale du hémocytomètre, en ignorant les globules rouges qui apparaissent comme étant légèrement plus petit, rond, les globules rouges teintes bleues et les cellules mortes / mourantes. Multiplier le nombre de cellules comptées par 10 4, par le facteur de dilution (10), et par le volume des cellules (10 ml) pour déterminer le nombre total de cellules récupérées dans le tube de centrifugation de 50 ml.
- Pour enrichir les cellules T CD4, centrifuger ledes cellules de pastilles, et remettre en suspension les cellules à 2x10 7 cellules / ml dans une solution contenant environ 1 pg / ml d' anticorps anti-CD8 (clone 3,155), 1 pg / ml d' anticorps anti-CMH de classe II (clone M5 / 114), et 1 pg / ml anti-CD24 (clone J11d) anticorps dans HBSS + 2% NCS par pipetage.
REMARQUE: Les anticorps utilisés dans cette étape sont dérivées en interne à partir de lignées cellulaires d'hybridome et les concentrations sont approchées. La concentration et le volume de ces anticorps idéales pour la lyse du complément ont été déterminées empiriquement et varient entre les laboratoires. En variante, plusieurs kits disponibles dans le commerce sont disponibles pour la purification des cellules T CD4 + naïves et peuvent être substituées à la lyse du complément et de purification CD62L + représentés ici. Si vous utilisez une autre méthode pour purifier les cellules T CD4 naïfs, ce protocole peut être poursuivi à l'étape 1.2. - Incuber sur la glace pendant 30 min. A la fin de cette incubation, décongeler rapidement Guinée complément de porc en plaçant dans un 37 ° C l'eau bath pendant environ 2 min. Ajouter 100 ul de complément pour chaque 1 ml de cellules dans la solution d'anticorps par pipetage le complément directement dans la suspension cellulaire. Incuber les cellules dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min.
- Ajouter HBSS + 2% de NCS pour amener les cellules à un volume total de 20 ml dans le tube de centrifugation. Couche dans 8 ml de RT milieu de centrifugation de densité (densité 1,086 g / ml) au-dessous des cellules. centrifuger immédiatement les cellules à 1400 x g à température ambiante pendant 15 min avec le frein centrifuge hors tension.
- Recueillir les cellules à l'interface à l'aide d'une pipette les cellules de transfert et sérologiques à un nouveau 50 ml tube de centrifugation. Laver les cellules en amenant le volume dans le tube à centrifuger de 50 ml avec du HBSS + 2% de NCS et la centrifugation.
- Resuspendre les cellules dans un tampon MACS (PBS supplémenté avec 2% NCS et 2 mM EDTA) par pipetage et compter comme précédemment, à l'étape 1.1.10.
- Pour enrichir les cellules T CD4 naïfs, remettre les cellules à 2x10 7 cellules / ml dans une solutionde 2,5 pg / ml de biotine conjugué à un anticorps anti-CD62L dans un tampon MACS, sur la base du nombre compté à l'étape 01.01.16. Incuber pendant 30 min sur la glace.
- Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon MACS, puis centrifuger les cellules. Remettre en suspension les cellules à 10 7 cellules / 100 ul dans un tampon MACS et ajouter des perles de séparation magnétique streptavidine conjuguée à une dilution 1:10 directement aux cellules. Incuber sur la glace pendant 20 min.
- Laver les cellules comme précédemment, à l' étape 01/01/17, et remettre en suspension les cellules à 2x10 8 cellules / ml dans un tampon MACS, dans un volume minimum de 500 ul.
- Placer une colonne de séparation magnétique dans le support d'aimant et laver la colonne en laissant le tampon MACS 3 ml traverser. Appliquer les cellules de la colonne avec une pipette.
- Laver la colonne pour éliminer les cellules non liées par la colonne magnétique par pipetage 3 ml MACS tampon sur la colonne et permettant le tampon MACS de circuler à travers, et répéter 3 fois. Jeter l'écoulement à travers la fraction.
- Remove la colonne du support magnétique et maintenez sur un nouveau 50 ml tube de centrifugeuse. Pipet 5 ml de tampon MACS sur la colonne et utiliser le piston joint à la colonne pour pousser les MACS tampon à travers la colonne pour libérer les cellules de la colonne liée et de recueillir l'écoulement à travers qui contient les cellules T CD4 naïfs enrichis.
- Centrifuger les cellules et remettre en suspension dans 10 ml de RPMI additionné de 10% sérum de veau foetal (FCS), 100 UI / ml de pénicilline, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 50 pM de 2-mercaptoéthanol (RPMI-10). Compter les cellules comme avant, à l'étape 1.1.10.
- Ajuster la concentration finale des cellules T CD4 + naïves à 6x10 5 / ml dans du RPMI-10.
- Purifier T APC spléniques appauvries en cellules
- Euthanasier un 6-8 semaines, âgé de type sauvage souris BALB / c femelles comme à l'étape 1.1.1.
- Pulvériser la souris avec une solution d'éthanol à 70% et on expose la rate en faisant une incision de 3 cm environ sur le côté gauche de la abdome de la sourisn. Découper la couche péritonéale et enlever la rate en saisissant délicatement avec une pince et couper loin du tissu conjonctif sous-jacente avec des ciseaux chirurgicaux.
- Placez la rate dans 8 ml de HBSS + 2% NCS.
- Préparer une suspension cellulaire unique en écrasant la rate, se laver, et compter les cellules, comme avant, dans les étapes 1.1.7-1.1.10
- Appauvrir les lymphocytes T par centrifugation des cellules à 600 xg pendant 5 min à pastille, et remettre en suspension les cellules à 2x10 7 dans une solution d'environ 1 ug / anticorps anti-Thy1.2 ml (clone J1J) en pipettant doucement. Incuber les cellules sur de la glace pendant 30 min.
NOTE: Cet anticorps a été dérivé en interne à partir d'une lignée cellulaire d'hybridome et l'concentraton est approchée. La concentration et le volume de cet anticorps idéal pour la lyse du complément a été déterminé de manière empirique et varieront entre les laboratoires. D'autres méthodes de TTB purifiantes de splénocytes peuvent être substitués si on le désire. cellules et TTB T Naïf doivent être préparés culteure de l'étape 1.3. - Ajouter Guinée complément de porc, laisser incuber, et on sépare les cellules sur un gradient de milieu de centrifugation de densité comme précédemment, dans les étapes 1.1.13-1.1.14.
- Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de RPMI-10 et irradier les véhicules blindés en plaçant les cellules dans un tube de centrifugation de 50 ml dans un irradiateur gamma pendant une durée qui va exposer les cellules à 25 Gy radiation. Cette durée varie en fonction de l'irradiateur et devra être calculée à chaque fois que les cellules sont irradiées.
- Compter les cellules sur un hémocytomètre comme précédemment, à l' étape 01.01.10 et ajuster les cellules APC à une concentration finale de 2.4x10 6 cellules / ml dans du RPMI-10.
- Stimuler des cellules et de différencier les cellules T CD4 Th1 à un phénotype dans une culture de 5 jours.
NOTE: Bien que nous présentons ici un protocole pour la préparation et l'imagerie effecteurs Th1 générées à partir de cellules T CD4 naïfs, ce protocole peut être ajusté pour différencier les cellules naïves à un phénotype différent, ou to utiliser d'autres types de cellules, comme les cellules T CD8. Conditions d'amorçage et la différenciation devront être déterminées empiriquement.- Dans chaque puits d'une boîte de culture de 24 puits, mélanger 500 pi des cellules T CD4 naïfs et 500 pi des TTB irradiés dans chaque puits, pour un total de 3x10 5 cellules T et 1,2x10 6 TTB par puits.
- Préparer une solution dans du RPMI-10 contenant 2 uM cognât peptide OVA, 20 U / ml d'IL-2 recombinante, 80 pg / ml d'anticorps anti-IL-4 (clone 11B11) et 40 ng / ml d'IL-12 recombinante et le filtre en utilisant un 0,2 filtre à seringue pm. Ajouter 1 ml de cette solution à chaque puits de cellules, pour un volume total de 2 ml dans chaque puits.
- Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO 2 pendant 3 jours.
- Le jour 3, diviser les cultures en pipetant doucement pour remettre en suspension les cellules et le déplacement de 1 ml de chaque puits dans une nouvelle culture bien. Amener chaque puits à un volume final de 2 ml par addition de 1 ml / puits de RPMI-10 + 20 U / ml d'IL-2 recombinante. </ Li>
- Remettre les plaques dans l'incubateur et permettent aux cellules de se développer jusqu'à ce jour 5.
2. Transfert des cellules et l'induction de l'inflammation
NOTE: Pour le nombre de cellules optimales pour l' imagerie, 5x10 6 cellules Th1 marquées par fluorescence doivent être transférés à chaque souris dans un volume total de 200 ul de PBS. Les cellules ici sont étiquetés avec le CFSE de colorant vert ou CMTMR quasi-colorant rouge, bien que d'autres colorants tracker de cellules peuvent être utilisés. CFSE et les cellules marquées par CMTMR peuvent être co-transférées pour permettre le suivi de deux populations CD4 effectrices distinctes.
- Étiquette effectrices des cellules T avec des CFSE
- Récolter les cellules des boîtes de culture par pipetage vigoureusement les cellules dans chaque puits, et transférer dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml avec une pipette. Compter les cellules comme dans l' étape 01/01/10, puis centrifugation et remettre en suspension les cellules à 10 7 cellules / ml dans du PBS + 5% NCS.
- Diluer mM solution 5 stock CFSE 1: 100 dansPBS. Ajouter 110 ul de solution CFSE pour chaque 1 ml de cellules en plaçant une goutte de solution CFSE sur le côté du tube, puis rapidement à bascule le tube avant et en arrière pour bien mélanger.
- Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante, puis étancher la CFSE en ajoutant 5 ml de sérum de foetus de veau (FCS) directement au tube de cellules. Amener le volume à 50 ml avec du PBS + 5% NCS.
- Centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans 20 ml de PBS + 5% NCS. Répétez ce processus deux fois pour laver les cellules 3 fois au total. Compter les cellules sur un hémocytomètre, comme précédemment, à l' étape 01/01/10, et remettre en suspension les cellules dans du PBS stérile à 2,5 x 10 7 cellules / ml pour le transfert à des souris.
- Étiquette effectrices cellules avec CMTMR T
- Récolter les cellules comme ci - dessus à l' étape 2.1.1, puis compter, centrifugeuse et remettre les cellules à 10 7 cellules / ml dans RPMI-10.
- Ajouter CMTMR mM de solution mère 10 directement aux cellules pour obtenir une concentration finale de 10 uM. e rapidement pipettese cellules pour bien mélanger dans le CMTMR et éviter la précipitation du colorant.
- Incuber pendant 30 minutes dans un bain-marie à 37 °. Laver les cellules 3x dans du PBS + 5% NCS comme avant, à l'étape 2.1.3-2.1.4. Compter et remettre en suspension les cellules dans du PBS stérile à 2,5x10 7 cellules / ml pour le transfert à des souris.
- cellules T effectrices de transfert à Naïf ancienne souris femelles BALB / c 6-8 semaines.
- Dessinez la suspension cellulaire (étape 2.1.4 ou 2.2.3) dans une seringue, en prenant soin d'enlever toutes les bulles en tenant la seringue aiguille côté-up, effleurant doucement du côté de la seringue et le déplacement du piston vers le haut et vers le bas, si nécessaire .
- Placez la souris dans une cage propre et chauffer doucement sous une lampe de chaleur jusqu'à ce que la veine de la queue semble vasodilated. Placez la souris dans un dispositif de retenue et essuyez la queue avec un tampon imbibé d'alcool. Injecter lentement 200 pi de la suspension cellulaire dans la veine caudale latérale. Il devrait y avoir aucune résistance à l'injection ou barbotage visible sous la peau.
- Provoquer l'inflammation cutanée en immunisant avec l'adjuvant complet de Freund (CFA)
NOTE: Dans ce protocole, l'inflammation est induite par injection intradermique de CFA émulsionnée avec l'antigène soit apparenté ou non apparenté. D'autres modèles inflammatoires peuvent être substitués, bien que le nombre de cellules nécessaires pour le transfert et la synchronisation de l'imagerie devra être ajustée de manière empirique.- Préparer une solution 200 uM de peptide OVA dans du PBS stérile dans un tube de microcentrifugation. Une pipette volume équivalent de CFA au-dessus de la solution de peptide.
- Emulsionner la solution en tirant dans un / 2 seringue à insuline 28 G1 puis plongeant la solution dans le tube à centrifuger, puis en répétant cette action environ 20 fois. Une fois complètement émulsionnée, le CFA et la solution de peptide forment un mélange épais et opaque.
Remarque: il est essentiel d'utiliser une seringue à insuline de l'aiguille fixe pour former l'émulsion, comme l'émulsion sera perdue dans l'espace mort dans une needl non fixéee seringue. - Testez l'émulsion en laissant tomber une petite quantité sur de l'eau placée dans une boîte de Pétri. L'émulsion doit rester intact et ne pas se disperser dans l'eau.
- Dessinez l'émulsion dans un G1 / 2 seringue à insuline 300 pi 28 et appuyez fortement sur le piston pour éliminer les grosses bulles d'air.
- Immédiatement après le transfert de cellules marquées par fluorescence T effectrices, anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 2,2,2-tribromoéthanol à 240 mg / kg. Évaluer l'anesthésie par un pincement de l'orteil douce, administrer plus 2,2,2-tribromoéthanol par incréments de 1 mg, si nécessaire.
NOTE: autres anesthésiques approuvés peut être remplacé par le 2,2,2-tribromoéthanol. - Placez un dé à coudre sur l'index gauche et de saisir attentivement l'oreille de la souris entre le pouce gauche et l'index avec l'oreille ventrale vers le haut. Assurez-vous de ne pas exercer une pression excessive sur l'oreille, ce qui peut causer des dommages mécaniques à la peau.
- Faites glisser l'aiguille contenant le CFA eemulsion dans le derme, côté conique vers le haut, et injecter lentement 10 pl de l'émulsion dans l'oreille. Le placement de l'injection doit être dans la partie extérieure 1/3 du pavillon, légèrement hors-centre pour permettre l'imagerie optimale.
- Surveiller la souris jusqu'à ce que l'anesthésie a cessé et les souris sont capables de se redresser et sont ambulatoires. souris Image 3 jours après la vaccination, en fournissant le temps de l'inflammation à développer et les cellules T transférées à la circulation dans le derme de l'oreille.
NOTE: Les souris ne peuvent pas être laissés sans surveillance à tout moment sous anesthésie.
3. Préparation de la souris pour l'imagerie
- Préparer un cathéter
- Retirez délicatement l'aiguille métallique à partir d'un / 2 tuberculine (TB) aiguille de seringue 30 G1 avec des pinces et nettoyer tout excès de colle, en utilisant un champ de dissection pour visualiser ce que la colle est complètement enlevée.
- Couper l'extrémité hors d'un autre / 2 TB aiguille de seringue 30 G1, en veillant à ce que l'aiguille reste est encore pAtent par inspection visuelle. Glisser une pièce de 18 cm de PE-10 tube médical sur l'aiguille rognée et placer soigneusement l'aiguille métallique nu environ 5 mm dans l'autre extrémité du tube, créant ainsi un cathéter.
- Rincer le cathéter en remplissant une seringue de 1 ml TB avec du PBS stérile, en éliminant les bulles d'air. Placez délicatement le cathéter sur la pointe de la seringue et pousser doucement PBS si le cathéter pour éliminer les bulles dans le tube.
Remarque: lorsque l'on pousse le fluide à travers le cathéter, il est essentiel de maintenir le cathéter sur la seringue pour empêcher une pression de fluide de pousser le cathéter hors de la seringue. - Placez la souris dans une cage propre et chauffer doucement sous une lampe de chaleur jusqu'à ce que la veine de la queue semble vasodilated. Anesthésier la souris avec un mélange d'air ambiant et de l'isoflurane (5% de l'induction, l'entretien 1-2%, à 2 L / débit min) délivrée par l'ensemble de coiffe qui a été attaché à l'évaporateur isoflurane. Assurez-vous que la souris est anesthésiée with un pincement de l'orteil douce. Incrémentielle augmenter le débit isoflurane de 0,1% si le mouvement est observé. Couvrir les yeux avec une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement et les blessures alors que la souris est anesthésiée.
NOTE: Il est essentiel que les souris jamais être laissés sans surveillance pendant anesthésié. Les souris doit être fréquemment contrôlée pour l'anesthésie suffisante par doux pincement de l'orteil. - Immobiliser la queue à la base avec une paire de pinces, puis essuyez la queue avec un tampon imbibé d'alcool. Faites glisser délicatement le cathéter dans la veine caudale latérale et vérifier la perméabilité en poussant doucement sur le piston de la seringue. Il devrait y avoir aucune résistance au mouvement et aucun bouillonnement visible de PBS sous la peau si elle est placée de manière appropriée. Fixer le cathéter à la queue en appliquant 1-2 gouttes de colle tissulaire à base de cyanoacrylate sur le site d'injection et laisser sécher, à environ 30 sec.
- couper soigneusement les cheveux à l'arrière et les côtés de l'oreille avec une paire de ciseaux, en prenant soin de ne pas endommager le skdans. Coupez les moustaches aussi bien. En utilisant un coton-tige, humidifier la surface interne de l'oreille avec du PBS.
- Tournez la souris et l'oreille sur un 24 x 50 mm No. 1,5 couvercle en verre de glissement. En utilisant des pinces, aplatissez doucement l'oreille sur la lamelle, en déplaçant la souris si nécessaire pour veiller à ce que l'oreille est au ras du verre. Enlever l'excès de PBS de l'oreille en tamponnant doucement avec un tissu essuyez.
REMARQUE: Assurez-vous de ne pas appuyer trop fermement sur l'oreille, comme la peau mince peut facilement être endommagé avec une pression excessive. - L'utilisation de deux paires de pinces courbes, saisir un environ 20 mm de long morceau de ruban de tissu de la longueur dans les coins supérieurs. Placez le bas de la bande sur la lamelle en haut de l'oreille de la souris et rouler la bande sur le reste de l'oreille, poussant l'excès de poils sur la voie avec la pince si nécessaire pour fixer l'oreille à la lamelle. Appuyez doucement sur la bande autour de l'oreille avec un coton-tige sec pour assurer un joint étanche, en prenant soin de ne pas appuyer sur l'oreille elle-même.
- Fixer la plate-forme d'imagerie à un bloc C de chauffage de 37 ° avec du ruban adhésif. Appliquer de la graisse à vide de part et d'autre de la zone de l'oreille de la plate-forme d'imagerie. Tourner la souris pour placer la lamelle sur la plate-forme d'imagerie, en prenant soin d'aligner l'oreille dans le centre du feutre.
REMARQUE: Évitez d'obtenir la graisse à vide sur la bande, car cela va causer à venir détaché de la lamelle de verre. - Enclenchez le nosecone isoflurane dans le support sur la plate-forme d'imagerie, veiller à ce que la coiffe est sécurisé et couvrant complètement le nez de la souris. Répartir la graisse à vide sous la lamelle par fermement mais avec précaution en appuyant sur la lamelle sur la plate-forme d'imagerie avec un chiffon propre, coton-tige sec.
- Apposer la lamelle à la plate-forme avec deux 20 mm morceaux de ruban adhésif et deux pièces plus longues de ruban enroulé autour de la partie supérieure de la plate-forme. Si des bulles d'air sont présentes entre l'oreille et la lamelle couvre-objet, ils peuvent être éliminés en pressant doucement sur l'oreille par le bas with un morceau de papier plié.
NOTE: Il est essentiel de ne pas utiliser de papier trop épais ou presser fermement, car cela peut causer des tissus blanchissement et des dommages, ce qui complique les résultats. - Déplacez la souris sur la platine du microscope et de sécuriser la plate-forme avec du ruban adhésif. Tuyauterie une double couche de graisse à vide sur la lamelle autour de l'oreille pour servir de réservoir pour l'objectif d'immersion dans l'eau.
- Enroulez une couverture chauffante remplie d'eau autour de la souris à travers la plate-forme d'imagerie. Remplir le réservoir avec 37 ° C de l'eau distillée. Assurez-vous que tout est fixé sur la scène avec du ruban adhésif et que la seringue du cathéter est facilement accessible.
4. In Vivo Time-lapse Imaging and intraveineux Antibody administration
NOTE: Ce protocole nécessite l'utilisation d'un microscope multiphoton équipé d'un Ti: Sa système laser. L'objectif utilisé est un objectif 25x de grossissement avec 1,05 NA, fixé avec un objetive de chauffage réglé à 40 ° C. La température optimale pour cet élément chauffant a été déterminé de manière empirique à la température appropriée pour maintenir le derme de l'oreille à 37 ° C, et peut devoir être ajusté pour être utilisé dans d'autres systèmes d'imagerie. Le logiciel d'acquisition utilisée peut varier entre les instruments et les ajustements au protocole peut être fait de travailler sur des systèmes configurés différemment. Veiller à ce que les images peuvent être enregistrées dans un format qui est compatible avec tous les logiciels d'analyse souhaitée.
- Localiser le derme à travers les oculaires par le positionnement de l'objectif sur le centre de l'oreille et l'abaissement de l'objectif juste jusqu'à ce qu'il contacte la surface de l'eau dans le réservoir. L'utilisation d'une source de lumière externe, regarder à travers les oculaires et continuer à baisser lentement l'objectif jusqu'à ce que la surface de l'oreille est mis au point. Abaisser les rideaux intérieurs et extérieurs autour de la platine du microscope.
- Déterminer les paramètres du microscope et de localiser une zone pour l'imagerie
- Avant imaging, configurer le laser pour l'excitation maximale et la détection des fluorophores désirées en réglant la longueur d'onde du laser à 900 nm dans la fenêtre Contrôleur laser MP, la puissance du laser dans le réglage d'acquisition: fenêtre à laser, et les tensions PMT dans l'image fenêtre de contrôle d'acquisition .
NOTE: Cette procédure utilise une longueur d'onde d'excitation de 900 nm avec des filtres pour détecter génération de seconde harmonique (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), et CMTMR (575-630 nm). D'autres configurations peuvent être utilisées pour détecter des fluorophores différents comme on le souhaite. - Réglez le microscope à 512 x 512 pixels de résolution, avec un temps de séjour de 2 microsecondes / pixel dans le réglage Acquisition: Taille et Mode fenêtres. Activer un mode d'imagerie en temps réel pour permettre la numérisation à travers le tissu pour une zone d'image en cliquant sur "Répétition XY". Idéalement, la zone doit être relativement uniforme, sans bulles d'air, et en évitant les zones de follicules pileux denses.
NOTE: L'émulsion CFA est autofluorescents brillamment dans le vert et near-rouge canaux et doit être évitée. Un champ optimal peut habituellement se trouve à environ 3 mm du bord de l'émulsion. Environ 10 - 100 cellules peuvent être suivis dans une seule image. Si trop de cellules sont présentes, le logiciel de suivi se rencontrent généralement des erreurs en essayant de séparer les cellules étroitement situées, menant à des pistes de cellules raccourcies et / ou inexactes. - Une fois un champ d'imagerie approprié a été localisé, déterminer la région de Z qui sera imagée par localiser la cellule "plus haut" dans le derme, le réglage de la position Z à 0 en cliquant sur le bouton "Set 0", et le défilement vers le bas dans le Z direction afin de mesurer l'étendue de la profondeur de la cellule. Une profondeur de 35-75 um d'imagerie est typique. Définissez les positions de départ et de fin dans le Cadre d'acquisition: fenêtre Microscope. Ajustez les instruments tensions PMT et la puissance du laser dans la fenêtre "bright Z" pour optimiser la visualisation des cellules dans toute la profondeur du champ d'imagerie.
REMARQUE: Ne pas soulever l'laspuissance er supérieure à 25 mW à l'échantillon, les niveaux de puissance aussi élevé peut causer des dommages à la chaleur et une blessure stérile au derme. Le niveau de puissance maximale appropriée pour chaque microscope variera et devra être mesurée. Il convient de noter que l'augmentation de la puissance du laser ou des tensions PMT avec la profondeur des tissus ne permet pas de comparaison quantitative de luminosité de l'image à différentes profondeurs dans l'analyse post-acquisition. - Cochez la case "Profondeur" et les boutons "Time" sous le bouton "Scan" dans l'image fenêtre de contrôle d'acquisition. Définir un filtre de Kalman pour numériser l'image 3 fois par ligne dans l'acquisition d'images de contrôle: fenêtre du mode de filtre et d'ajuster la profondeur Z-slice dans l'acquisition de l'image: fenêtre Microscope de sorte qu'il faut environ 1 min pour capturer une pile complète, comme indiqué dans la fenêtre TimeView.
REMARQUE: L'intervalle entre les piles ne devrait pas prendre plus de temps à environ 1 min, comme des intervalles plus longs empêchent le suivi des cellules qui migrent rapidement. En fonction de thtype de cellules e imagée, cet intervalle peut avoir besoin d'être ajusté pour permettre un suivi correct de la cellule par un logiciel d'analyse. Z tranches doivent pas être supérieure à 5 um. En général, 15-18 Z tranches entre 5/2 xm d'épaisseur sont appropriés pour l'imagerie d'un intervalle de 1 min.
- Avant imaging, configurer le laser pour l'excitation maximale et la détection des fluorophores désirées en réglant la longueur d'onde du laser à 900 nm dans la fenêtre Contrôleur laser MP, la puissance du laser dans le réglage d'acquisition: fenêtre à laser, et les tensions PMT dans l'image fenêtre de contrôle d'acquisition .
- Capturer une image pré-anticorps time-lapse
- Capturez une image de 5 min time-lapse de la région pour évaluer la stabilité du tissu en fixant le nombre de répétitions à «5» dans le réglage Acquisition: fenêtre TimeScan et en cliquant sur le bouton "Scan".
NOTE: Tissue "dérive" peut être causée par ne pas laisser suffisamment de temps pour l'oreille pour atteindre l'équilibre thermique, une mauvaise préparation de l'oreille, ou peut être due à la dérive locale dans une région de l'oreille. Si l'image de 5 min est pas stable, l'image d'une nouvelle région dans le derme. Si une seconde image dans une nouvelle région reste instable, il est préférable de répéter soigneusement la préparation de l'oreille et de l'imagerie de l'étape 3.6 avec une nouvelle coverslip. - Si le tissu est stable dans l'image 5 min, recueillir une image temps-lapse 30-45 min en réglant le nombre de répétitions entre 30 et 45 dans le Cadre d'acquisition: fenêtre TimeScan, la surveillance de toute dérive de tissu mineur comme l'image est recueillies. Enregistrez le fichier dans un format qui est compatible avec le logiciel d'analyse à utiliser.
NOTE: A ce stade, dans le protocole, les étapes 4.2.2 - 4.3.2 peut être répétée à l'image de multiples endroits dans la même oreille. Un simple clic de souris ne doit pas être maintenu anesthésié pendant plus de 4 heures, comme la mort est plus susceptible de se produire.
- Capturez une image de 5 min time-lapse de la région pour évaluer la stabilité du tissu en fixant le nombre de répétitions à «5» dans le réglage Acquisition: fenêtre TimeScan et en cliquant sur le bouton "Scan".
- Injecter anticorps bloquants et capturer une image post-anticorps.
- Dessinez le mélange d'anticorps dans un 1 ml TB seringue et retirer l'aiguille, en veillant à éliminer toutes les bulles d'air. Appuyer sur le piston de la solution d'anticorps de telle sorte que se forme une «goutte» à la fin de la seringue.
- Soulevez les rideaux autour de la scène et de localiser le cathéter. Retirez l'original PBS-contaSeringue ining du cathéter. Sans fixer le cathéter vers le bas, fixez soigneusement la nouvelle seringue contenant les anticorps. Maintenir l'extrémité du cathéter sur la seringue et d'injecter lentement le mélange d'anticorps dans le cathéter. Assurez-vous qu'il n'y a pas de résistance à l'injection.
- Réglez le cathéter vers le bas et abaisser les rideaux entourant la platine du microscope. Notez l'heure de l'injection et commencer immédiatement la collecte d'une nouvelle séquence d'imagerie 20-40 min dans le même emplacement en utilisant les mêmes réglages de l'instrument que l'image pré-anticorps. Enregistrez le fichier dans un format approprié pour le logiciel d'analyse à utiliser.
NOTE: Entre images time-lapse, observer la souris pour l'anesthésie et la respiration suffisante. Il est recommandé de ne pas l'image plus d'un champ après l'administration d'anticorps, comme il peut y avoir des taux variables de la clairance de l'anticorps.
- Injecter dextran marqué par fluorescence pour localiser les vaisseaux sanguins, d'évaluer la perméabilité du cathéter, et mesurer brécipient de perméabilité Lood
- Préparer une solution de dextran fluorescent conjugué (70.000 MW) dans 100 ul de PBS stérile / ml 2 mg et de tirer dans une seringue, enlever les bulles d'air.
- En utilisant la même technique que dans l'étape 4.4.1-4.4.2, placer la seringue sur le cathéter et injecter la solution de dextran par voie intraveineuse.
- Capture d'une seule pile à 1024 x 1024 pixels de résolution en modifiant la résolution dans le réglage Acquisition: fenêtre Mode, avec les mêmes paramètres PMT et laser comme pour les images de time-lapse. Pour récupérer l'image, décochez le bouton "Time" sous le bouton "Scan", puis en cliquant sur le bouton "Scan". Cette image 3D va permettre aux lymphocytes T d'exclusion situés dans le système vasculaire et montrent que le cathéter a été correctement inséré et brevet. La diffusion de dextran fluorescent hors des vaisseaux peut également être utilisée pour évaluer la perméabilité vasculaire locale.
NOTE: Cette haute résolution (1024 x 1024) image statique est utilisé pour presentation fins et peuvent être en outre être utilisés pour l'analyse de l'architecture du tissu dans la même zone que les images de time-lapse. Alternativement, une image 512 x 512 peut être prise, qui peut être fusionné avec les images en accéléré en utilisant un logiciel d'analyse d'image. Time lapse imagerie de l'administration de dextrane peut également être souhaitable, en fonction des besoins de recherche des laboratoires individuels. Dans ce cas, l'image doit être mis en place comme dans les étapes 4.2.3-4.3.2.
- Après l'imagerie est terminée, retirez soigneusement la souris sous l'objectif et déplier la couverture de l'eau. Enlever les lamelles de la plate-forme d'imagerie en coupant le ruban et doucement en soulevant le verre jusqu'à ce qu'il se détache. Alors que la souris est toujours anesthésié, détacher l'oreille de la lamelle. Si cela doit être une procédure terminal, euthanasier la souris par dislocation cervicale. Si vous enregistrez cette souris pour l'imagerie répétée, revenir à une cage propre séparer des autres souris et observer jusqu'à ce que la souris peut se redresser et estambulatoire. Une fois récupéré de l'anesthésie, la souris peut être renvoyé dans une cage avec d'autres animaux.
- Importez les fichiers d'imagerie dans un programme d'analyse d'image et effectuer toutes les corrections souhaitées. Prévention des améliorations non-linéaires et lissage ou le bruit des programmes et algorithmes automatisés réduction est recommandé. En règle générale, les images ont seulement besoin d'une correction de fond mineure en augmentant manuellement le point de l'image noire avant l'analyse. Analyser les données d'imagerie en utilisant un programme cellulaire suivi automatisé avec correction manuelle, comme dans Overstreet, Gaylo et al 30.
NOTE: Il y a beaucoup de suites d'analyse d'images disponibles, à la fois propriétaires et open source, qui peuvent être utilisés pour quantifier la dynamique des cellules à partir des images multiphotonique dérivées de ce protocole. La méthode exacte de l'analyse d'image et les progiciels optimaux à utiliser dépendra des besoins de recherche des laboratoires individuels.
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Representative Results
La capacité à étudier les réponses immunes in situ , sans altérer l'environnement immunitaire est essentielle pour l' étude des interactions en temps réel des cellules T effectrices avec un tissu enflammé. Imagerie du derme de l' oreille intacts par ce protocole, présenté sur la figure 1A et B, permet la visualisation des cellules T effectrices marquées par fluorescence transférés dans l'interstitium cutanée. Cela permet à la fois à haute résolution (figure 1C) et time-lapse images de la dynamique des cellules T effectrices dans le derme enflammés (figure 1D, de Film 1).
Figure 1. haute résolution et 4D imagerie des cellules T effectrices dans le derme interstitiel intacte. (A) Schéma expérimental. (B) Photographie d'un prépar de l' oreilleed pour l'imagerie avec le site de l'émulsion (ligne noire pointillée) et zone optimale pour l'imagerie (ligne rouge) indiquée. Projection (C) Maximal 3D d'une pile à haute résolution montrant CFSE marqué Th1 cellules (vert), signal de second harmonique à partir de collagène fibrillaire (bleu) et le Texas Red-Dextran étiqueté vasculature (rouge). La flèche blanche indique l'un de plusieurs follicules pileux autofluorescentes. Les barres d'échelle représentent 50 pm (D) chemins migratoires des cellules Th1 suivis pendant 30 min dans le derme CFA-enflammées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ce protocole d'imagerie nécessite l'utilisation d'une plate-forme d'imagerie spécialisé qui a été construite en interne, ainsi qu'un cône de nez adaptée pour la délivrance d'anesthésie par inhalation pendant l'imagerie. La plate - forme d'imagerie (figure 2A-B) est constituée of une plaque de base en aluminium avec une section centrale surélevée. Cette section surélevée comporte une partie en médaillon bordée acrylique feutre pour fournir un appui à l'oreille sans comprimer et potentiellement endommager le tissu mince. La géométrie de notre configuration a nécessité la construction d'un nosecone flexible et ajustable pour fournir une anesthésie par inhalation lors de l'imagerie. Ce nez conique, constitué d'un tube de microcentrifugation modifié reliée à une section de 50 mm de tube flexible (figure 2C), est maintenu en place avec un support composé de microtubes modifiés (figure 2D) et fixée à la plate - forme d'imagerie par l' intermédiaire d' auto - agrippante . L'utilisation d'auto-agrippante permet le repositionnement de l'ensemble de cône de nez de telle sorte que chaque oreille d'une souris peut être imagée et peut être positionné de manière optimale pour les souris individuelles.
Figure 2. Equippement pour l' imagerie intravitale. plate - forme d'imagerie personnalisée construit en haut (A) et de côté (B) vues. Nosecone pour l' administration de l' isoflurane (C) et le porte-nosecone (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Cathétérisation de la veine caudale permet un accès continu à la circulation pour administrer des anticorps et d'autres petites molécules qui peuvent diffuser hors du système vasculaire, ou des molécules fluorescentes plus grandes telles que le dextrane de masse moléculaire élevée pour étiqueter les vaisseaux sanguins. Après l'administration de 100 ug d'anticorps anti-β 1 et anti-intégrine β 3 des anticorps bloquants à travers le cathéter, les cellules précédemment motiles arrêt dans le derme (film 2). Ces cellules ont une vitesse moyenne a diminué après l'anticorps l' administration (figure 3A), ainsi qu'une diminution significative de l'indice de méandre, le rapport du déplacement total de la longueur totale de la voie (figure 3B).
Figure 3. L' administration d'anticorps anti-β 1 et anti-β 3 anticorps inhibe Th1 la migration des cellules dans la peau CFA enflammée. (A) , la vitesse moyenne des cellules Th1 avant et après l' administration de 100 pg anti-β 1 et anti-β 3 intégrine des anticorps bloquants. (B) l'indice de Meandering des cellules Th1 avant et après l'anticorps blocus. Environ 100 cellules sont suivis à partir d'images avant et après l'anticorps blocus à partir d'une seule souris dans une expérience représentative. Statistiques par Mann Whitney.es / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Parce que les cheveux ne sont pas éliminés de la surface de l'oreille, des artefacts d'imagerie de la chevelure sont communs. Autofluorescence de follicules pileux (Figure 4A) et l' observation et autofluorescence des cheveux recouvrant (figure 4B) doit être évitée autant que possible , car ils peuvent masquer les cellules T et interférer avec le logiciel d'analyse d'image automatisée. De la même façon, les bulles d'air piégées entre la surface de l' oreille et la lamelle couvre -objet peut conduire à des artefacts d'imagerie (figure 4C). Une bonne préparation de l'oreille devrait réduire au minimum le nombre et la taille des bulles restantes.
Figure 4. Artefacts communs de autofluorescence de cheveux et les pauvres avant de l' oreilleprépa-. follicules pileux (A) autofluorescents. (B) autofluorescents cheveux et les follicules pileux (vert) et de collagène (blanc) avec des ombres de cheveux sus-jacentes, ce qui provoque des lignes sombres de l'image. (C) Artefact d'une bulle d'air, montrant le bord des déplacés, autofluorescents épiderme kératinisées (ligne pointillée). Les barres d'échelle représentent 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
En outre, l'utilisation de plusieurs sources de chaleur peut entraîner des problèmes avec la stabilité du tissu due à l'expansion et la contraction thermique. Réglages du thermostat incorrects, par exemple, peut conduire à de grandes oscillations lors de l' imagerie qui peut rendre l' interprétation des résultats difficiles (film 3). Il est essentiel de déterminer les paramètres optimaux pour tout système qui fournit une température constante et maximise la stabilité. Ultimately, une chambre d'imagerie à température contrôlée est la meilleure façon d'éliminer la variabilité des changements de température.
Film 1. cellules Th1 qui migrent dans le derme CFA-enflammés (clic droit pour télécharger). Image 30 min time-lapse montrant des cellules Th1 (vert) qui migrent dans le réseau de collagène dermique (deuxième génération harmonique, bleu).
Film 2. Th1 cellules arrestation sur le blocage des β 1 et ß 3 intégrines (clic droit pour télécharger). Les cellules (vert) ont été imagées pendant 30 min avant l'administration des anticorps bloquants, et ensuite imagé pendant 20 minutes dans le même emplacement.
Film 3. Oscillations d'une plaque chauffante mal contrôlé (clic droit pour télécharger). 30 min l' image time-lapse de Th1 cellules (vert) et génération de seconde harmonique (bleu). Après que l'image a été recueillie, la plaque chauffante utilisée a été trouvé avoir un thermostat défectueux, provoquant des oscillations dans la température de la plate-forme d'imagerie et de dilatation thermique ultérieur et de contraction.
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Discussion
Importance
Nous présentons ici un protocole complet pour la visualisation 4D transférés, effectrices spécifiques de l'antigène des cellules Th1 dans les intactes derme de l'oreille de la souris. Cette méthode offre des avantages sur des techniques d'imagerie actuelles pour plusieurs raisons. En imageant le derme de l'oreille ventrale, nous sommes en mesure de renoncer à l'épilation qui est nécessaire pour des protocoles d'imagerie impliquant d'autres sites de la peau. Bien que dépilatoires sont généralement bénins, ils ont été montré pour causer des perturbations à la barrière de la peau 42, un processus qui peut stimuler une réponse immunitaire 43,44. En évitant également des procédures chirurgicales invasives pour exposer le derme ou l' hypoderme, ce protocole empêche l' inflammation induite par les dommages et le recrutement rapide des neutrophiles 37 et d' autres cellules immunitaires dans le derme. L'utilisation d'un cathéter veineux dans ce système pour fournir des anticorps bloquants contre des molécules clés permet interrogation en temps réel de l'dynale comportement micro des lymphocytes T CD4. L'utilisation de ce protocole d'imagerie a révélé des exigences essentielles pour T CD4 motilité cellulaire interstitiel 30 qui ne sont pas détectés dans les systèmes in vitro 8.
Les étapes critiques dans la procédure
Une étape essentielle dans tout protocole d'imagerie est d'assurer une préparation de tissu stable pour l'imagerie. Il est important de veiller à ce qu'il y ait suffisamment de PBS entre l'oreille et la lamelle qu'il n'y a pas de bulles d'air et l'oreille est en contact avec le verre, mais pas autant que pour provoquer la bande à devenir de-collé du verre. De même, en évitant le contact entre la bande de maintien de la lamelle à la plate-forme et de toute graisse à vide empêche la bande de se desserrer au fil du temps. La température doit également être maintenue constante pour éviter les oscillations et la dérive de la contraction thermique ou dilatation des matériaux de plate-forme.
Limitations et modifications
45. Cependant, la population résidente immunitaire de l'oreille est distincte de la peau sur le flanc ou patte 46, et l'oreille de la souris a des propriétés vasculaires distinctes par rapport à d' autres sites 47. Ainsi, pour certaines applications, la comparaison des données d'imagerie de l'oreille vers d'autres sites de la peau peut être difficile.
Ce protocole exige également la migration efficace de cellules T effectrices ont été transférés hors du courant sanguin et dans le derme. Cela limite la capacité d'utiliser des cellules qui ont des défauts dans homing ou extravasation car ils ne seront pas en mesure d'entrer dans l'espace interstitiel. extravasionpeut être contourné en injectant des cellules directement dans le derme de l' oreille 37,48, bien que cela va causer des dommages mécaniques et la livraison des cellules de cette manière ne peut pas récapituler la localisation ou le comportement des cellules qui subissent dans extravasation vivo.
Il est également essentiel d'envisager d' utiliser des souris receveuses non pigmentées pour des expériences d'imagerie, telles que la souche BALB / c utilisé ici ou souris Albino C57BL / 6- Tyr c-2J. La mélanine chez les souris pigmentés, en plus d'être très autofluorescente, se réchauffe , même sous relativement faible puissance d' excitation d'un laser à 37 multiphotonique. Cela peut causer des dommages thermiques à la peau et l' inflammation subséquente 36 ou fluorescent mouchetures 31, ce qui complique les résultats. Cela peut limiter les fluorophores qui peuvent être utilisés dans une expérience d'imagerie multi-paramètres. Cependant, certaines molécules fluorescentes fortement exprimés très lumineux ou peuvent être efficacement excité à la puissance du laser bas, tous lesgrâce à la visualisation efficace chez les souris pigmentées.
Les applications futures
Parce que cela est une procédure non-invasive, il pourrait être facilement adapté pour des études longitudinales sur des souris avec l'imagerie séquentielle sur des périodes de temps prolongées. Bien que le marquage fluorescent comme décrit ici serait fondu sur des périodes supérieures à 3-4 jours, l'utilisation de cellules fluorescentes ou des cellules endogènes rapporteurs fluorescents élimine ce problème. En effet, nous avons déjà utilisé ce protocole pour suivre dans générés vivo- effecteurs spécifiques de l' antigène portant reporters cytokines, y compris le journaliste IFNy Yeti 30,49 et l' IL-4 journaliste 4get 50. Nous avons en outre visualisé les cellules CD4 endogènes dans CD4-Cre EYFP ROSA26-stop-floxée reporter fluorescent souris 30. Étant donné que les propriétés fluorescentes EYFP et d'autres protéines fluorescentes diffèrent des colorants chimiques tels que le CFSE, les modifications des paramètres d'imagerie peuvent être nécessairespour une visualisation efficace. Des changements tels que l'augmentation du temps de séjour de pixels peut améliorer le signal fluorescent de certains fluorophores sombres, et la diminution de la longueur des images de déchéance de temps peut atténuer tout photoblanchiment qui peut être observée. A 900 nm d'excitation, on n'a pas observé précédemment photoblanchiment significative de CFSE, CMTMR ou EYFP sur des intervalles d'imagerie courts.
Bien que cette procédure se concentre sur la mesure de la dynamique des cellules CD4 T effecteurs motilité cellulaire, il ne se limite pas à cette application. Des travaux sont actuellement en cours pour évaluer les interactions dynamiques des cellules T effectrices à cellules présentant l' antigène en utilisant des souris rapporteurs fluorescents et l' injection d'anticorps conjugués par fluorescence dans le derme pour marquer des cellules ou des structures de tissu avant l' imagerie 51,52. En outre, alors que ce protocole illustre l'utilisation du cathéter pour délivrer des anticorps bloquant pendant l'imagerie, d'autres composés, y compris les inhibiteurs de petites molécules, peuventêtre administré. En fin de compte, ce protocole fournit une plate - forme flexible pour mesurer la dynamique immunitaire au fil du temps, in vivo, d'une manière non-invasive.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient l'Université de Rochester installation multiphotonique Microscope de base pour l'aide avec l'imagerie en direct. Pris en charge par le NIH AI072690 et AI02851 à DJF; AI114036 à AG et AI089079 à MGO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
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