Summary
Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.
Abstract
Die Fähigkeit von CD4 T-Zellen-Effektorfunktionen durchzuführen ist abhängig von der eine rasche und effiziente Migration dieser Zellen in entzündetem peripheren Geweben durch eine bislang undefinierten Mechanismus. Die Anwendung der Multiphotonenmikroskopie auf die Untersuchung des Immunsystems liefert ein Werkzeug, um die Dynamik der Immunantworten in intakten Geweben zu messen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die nicht-invasive intravital Multiphotonen- Bildgebung von CD4-T-Zellen in den entzündeten Mausohr Dermis. Verwenden einer benutzerdefinierten Imaging-Plattform und ein Katheter ermöglicht die Visualisierung von CD4 T-Zell-Dynamik in der dermalen interstitium, mit der Fähigkeit, diese Zellen in Echtzeit über die Zugabe von blockierenden Antikörpern zu den wichtigsten molekularen Komponenten der Motilität beteiligt zu befragen. Dieses System bietet Vorteile gegenüber sowohl in vitro - Modellen und chirurgisch - invasiven bildgebenden Verfahren. die Wege, die von CD4-T-Zellen für die Motilität Verständnis liefern kann letztlich Einblick in die Basic Funktion der CD4-T-Zellen sowie die Pathogenese der beiden Autoimmunerkrankungen und Pathologie von chronischen Infektionen.
Protocol
Alle Verfahren Mäuse beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Rochester genehmigt und durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und der Public Health Service Politik auf Humane Pflege und Verwendung von Labor verabreicht Tiere von den National Institutes Gesundheitsamt für Labortierschutz.
1. Herstellung von Effektorzellen CD4 T-Zellen
HINWEIS: Balb / c-TCR-transgenen Mäusen, die DO 11.10 spezifisch ein Peptid aus Hühnerei Ovalbumin (Pova: ISQAVHAAHAEINEAGR) erkennen. Andere TCR-transgenen Systeme ersetzt werden kann, die entsprechende verwandtes Peptid anstelle von Pova mit denen angegeben ist.
- Reinige naive CD4-T-Zellen
- Euthanize eine 6-8 Wochen alte weibliche BALB DO11.10 / c - Maus durch Belichten auf 2 l / min CO 2 , bis die Maus zeigt keine Anzeichen von Bewegung oder Atem für 1 min, gefolgt durch zervikale Dislokation oder nach demRichtlinien des lokalen Institutional Animal Care und Use Committee. Sprühen Sie die Maus mit einer 70% igen Ethanollösung und machen einen etwa 7 cm langer Schnitt in der Haut vom Kinn der Maus auf 2/3 des Weges nach unten den Bauch. Machen Sie 2-3 cm Hautschnitte aus dem Ende des Einschnitts in den Bauch zu den Hinterfüßen. Achten Sie darauf, nicht in das Peritoneum zu schneiden.
- Trennen Sie vorsichtig die Haut vor dem Peritoneum vorsichtig mit einer Pinzette herausziehen. Die inguinalen Lymphknoten werden auf der Haut in der Nähe der Kreuzung der Hinterbeine mit dem Körper befindet. Entfernen durch Ergreifen und Ziehen mit der Pinzette und in 8 ml HBSS, supplementiert mit 2% Serum von neugeborenen Kälbern (NCS).
- Ernten Sie die axillären und brachial Lymphknoten von der Maus durch Greifen und Ziehen vorsichtig mit einer Pinzette. Legen Sie in den HBSS + 2% NCS mit den Leistenlymphknoten.
- Ernten Sie die tiefen und oberflächlichen Lymphknoten liegt in den Hals der Maus mit einer Pinzette und in der HBSS + 2% NCS mit dem otihre Lymphknoten.
- Sanft in das Peritoneum schneiden, dabei nicht in den Darm zu schneiden. Fassen Sie den Blinddarm und Dickdarm mit einer Pinzette und setzen die Mesenteriallymphknoten, die nur entlang des Dickdarms entfernt werden. Entfernen Sie vorsichtig die Mesenteriallymphknoten mit einer Pinzette und legen Sie mit den anderen Lymphknoten.
- Suchen Sie die Milz in der Bauchhöhle und vorsichtig zu entfernen, mit einer Zange halten und das Bindegewebe Wegschneiden mit einem Paar von chirurgische Scheren. Legen Sie die Milz mit den Lymphknoten.
- Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension durch die HBSS + 2% NCS Gießen der Milz und den Lymphknoten in ein Metallsieb in einem 60 x 15 mm Kulturschale platziert enthält. zerdrücken Sie vorsichtig die Milz und die Lymphknoten durch das Metallsieb mit dem Kolben aus einer 10-ml-Spritze in die HBSS + 2% NCS.
- Mit einer Pipette bewegen, um die Zellsuspension in ein sauberes 50 ml Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Metallsieb und Kulturschale mit weiteren 10 ml HBSS + 2% NCS, usingen eine Pipette und legen diese Lösung in der gleichen 50-ml-Zentrifugenrohr als Zellsuspension.
- Dreh die Zellen bei 600 xg für 5 Minuten durch vorsichtiges Pipettieren der Zellen und Resuspendieren in 10 ml HBSS + 2% NCS zu pelletieren. Wenn nicht anders angegeben, sollten alle Zentrifugation bei 600 xg für 5 min durchgeführt werden.
- Verdünne 10 & mgr; l der Zellsuspension in 90 ul 0,1% Trypan-Blau in PBS für eine 1:10 Verdünnung. Platz 10 & mgr; l der Zellen in Trypanblau auf eine Zählkammer pipettiert, um die Lösung in die Nut am Rand des Hämozytometer. Zählen Sie die weißen Blutkörperchen in der Mitte Gitter der Hemocytometer, ignorieren Erythrozyten, die als etwas kleiner, runder erscheinen, Rotton-Zellen und die blauen Tote / sterbende Zellen. Multiplizieren die Anzahl der um 10 4, mit dem Verdünnungsfaktor (10) und durch das Volumen der Zellen (10 ml) gezählten Zellen die Gesamtzahl der Zellen in dem 50 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt , zu bestimmen.
- Zur Bereicherung für CD4 T-Zellen, die ZentrifugeZellen zu pelletieren, und die Zellen bei 2x10 & sup7 ; Zellen / ml in einer Lösung resuspendiert etwa 1 & mgr; g / ml anti-CD8 (Klon 3.155), 1 & mgr; g / ml anti-MHC Klasse II (Klon M5 / 114) enthält, und 1 & mgr; g / ml anti-CD24 (Klon J11d) Antikörper in HBSS + 2% NCS durch vorsichtiges Pipettieren.
HINWEIS: Die in diesem Schritt verwendeten Antikörper abgeleitet in-house aus Hybridom-Zellinien und Konzentrationen approximiert werden. Die Konzentration und das Volumen dieser idealen Antikörper für Komplement-Lyse wurden empirisch ermittelt und zwischen den Labors variieren. Alternativ sind mehrere im Handel erhältliche Kits zur Reinigung von naiven CD4 T-Zellen zur Verfügung und können für die Komplement-Lyse und CD62L + Reinigungsverfahren hier dargestellt, substituiert sein. Wenn ein anderes Verfahren unter Verwendung von naiven CD4-T-Zellen zu reinigen, kann dieses Protokoll aus Schritt 1.2 fortgesetzt werden. - Inkubieren auf Eis für 30 min. Am Ende dieser Inkubation tauen schnell Meerschweinchen-Komplement durch in einem 37 ° C Wasser b platzierenath für ca. 2 min. Füge 100 & mgr; l Komplement für jeweils 1 ml der Zellen in der Antikörperlösung durch Pipettieren das Komplement direkt in die Zellsuspension. Inkubiere Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min.
- Hinzufügen HBSS + 2% NCS die Zellen zu einem Gesamtvolumen von 20 ml in dem Zentrifugenröhrchen zu bringen. Schicht in 8 ml RT Dichtezentrifugation Medien (Dichte 1,086 g / ml) unter den Zellen. zentrifugieren sofort die Zellen bei 1400 × g bei RT für 15 min mit der Zentrifugenbremse ab.
- Sammeln Zellen an der Schnittstelle einer serologischen Pipette und Transfer-Zellen zu einem neuen 50 ml Zentrifugenröhrchen mit. Waschen Sie die Zellen durch das Volumen in dem Zentrifugenröhrchen auf 50 ml mit HBSS + 2% NCS und Zentrifugieren zu bringen.
- Resuspendieren der Zellen in MACS-Puffer (PBS, ergänzt mit 2% NCS und 2 mM EDTA) durch vorsichtiges Pipettieren und wie zuvor in Schritt 1.1.10 zählen.
- Bereichern für naive Zellen CD4 T, Resuspendieren der Zellen bei 2x10 & sup7 ; Zellen / ml in einer Lösungvon 2,5 ug / ml Biotin-konjugiertem anti-CD62L-Antikörper in MACS-Puffer, basierend auf der gezählten Zahl in Schritt 1.1.16. Inkubieren für 30 Minuten auf Eis.
- Waschen Sie die Zellen mit 10 ml MACS-Puffer Zugabe, dann Zentrifugieren der Zellen. Resuspendieren der Zellen bei 10 7 Zellen / 100 & mgr; l in MACS - Puffer und Streptavidin-konjugierte magnetische Trennung Kügelchen bei einer Verdünnung von 1:10 direkt zu den Zellen hinzu. Inkubieren auf Eis für 20 min.
- Waschen Sie die Zellen wie zuvor in Schritt 1.1.17 und Resuspendieren der Zellen bei 2x10 8 Zellen / ml in MACS - Puffer, in einem minimalen Volumen von 500 & mgr; l.
- Legen Sie eine magnetische Trennsäule in dem Magnethalter und waschen Sie die Spalte, indem man 3 ml MACS-Puffer durchfließen. Anwenden, um die Zellen an die Säule mit einer Pipette.
- Die Säule wird zur Entfernung von Zellen nicht durch die magnetische Säule gebunden durch Pipettieren von 3 ml MACS-Puffer auf die Säule und man die MACS-Puffer durchfließen, und 3-mal wiederholen. Entsorgen Sie die Durchflussfraktion.
- Remove die Säule aus dem magnetischen stehen und halten ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen über. Pipettieren von 5 ml MACS-Puffer auf die Säule und den Kolben mit der Säule eingeschlossen verwenden, um Push-Puffer, um die MACS durch die Säule die Säule gebundene Zellen freizusetzen und die Strömung sammeln durch, dass die angereicherte naive CD4-T-Zellen enthält.
- Zentrifugation der Zellen und Resuspendieren in 10 ml RPMI, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 50 uM 2-Mercaptoethanol (RPMI-10). Zählen Sie die Zellen nach wie vor in Schritt 1.1.10.
- Stellen Sie die Endkonzentration der naiven CD4 T - Zellen zu 6x10 5 / ml in RPMI-10.
- Reinige T-Zell-verarmten splenic APCs
- Euthanize eine 6-8 Wochen alten weiblichen Wildtyp-Balb / c-Maus, wie in Schritt 1.1.1.
- Sprühen Sie die Maus mit einer 70% igen Ethanollösung und setzen die Milz durch einen etwa 3 cm langer Schnitt auf der linken Seite der Maus die abdome machenn. Schneiden Sie die Peritonealdialyse Schicht öffnen und die Milz entfernen, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette fassen und von der darunterliegenden Verbindungsgewebe mit einer chirurgischen Schere schneiden.
- Legen Sie die Milz in 8 ml HBSS + 2% NCS.
- Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension durch die Milz Maischen, waschen und die Zellen zählen nach wie vor in den Schritten 1.1.7-1.1.10
- Abzureichern T - Zellen , indem die Zellen bei 600 xg für 5 min zu Pellets Spinnen und Resuspendieren der Zellen bei 2x10 7 in einer Lösung von etwa 1 & mgr; g / ml anti-Thy1.2 - Antikörper (Klon J1J) durch vorsichtiges Pipettieren. Inkubieren der Zellen auf Eis für 30 min.
HINWEIS: Dieser Antikörper wurde hausintern von einer Hybridomzelllinie abgeleitet und die concentraton angenähert wird. Die Konzentration und das Volumen dieses Antikörpers ideal für Komplement-Lyse wurde empirisch ermittelt und wird zwischen Laboren variieren. Andere Verfahren zur Reinigung von APCs aus Splenozyten können, wenn gewünscht ersetzt werden. Naiver T-Zellen und APCs sollte in Kult vorbereitet werdenure aus Schritt 1.3. - In Meerschweinchen-Komplement, brüten sie aus, und trennen Sie die Zellen auf einer Dichte Zentrifugationsmedien Gradienten nach wie vor in den Schritten 1.1.13-1.1.14.
- Resuspendieren der Zellen in 10 ml RPMI-10 und die APCs bestrahlen, indem die Zellen in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen in einem Gamma-Bestrahlungsvorrichtung für eine Zeitdauer platziert, die die Zellen zu 25 Gy Strahlung aussetzt. Diese Zeitdauer hängt von der Bestrahlungsvorrichtung variieren und müssen jedes Mal Zellen bestrahlt werden, berechnet werden.
- Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer wie zuvor in Schritt 1.1.10, und stellen Sie die APC - Zellen zu einer Endkonzentration von 2.4x10 6 Zellen / ml in RPMI-10.
- Stimulieren Zellen und CD4-T-Zellen zu einem Th1-Phänotyp in einer 5-Tage-Kultur zu differenzieren.
HINWEIS: Auch wenn wir hier ein Protokoll präsentieren für die Herstellung und Bebilderung Effektoren Th1 erzeugt von naiven CD4-T-Zellen, kann dieses Protokoll eingestellt werden, um die naive Zellen auf einen anderen Phänotyp zu differenzieren, oder to verwenden andere Zelltypen, wie beispielsweise CD8 T-Zellen. Bedingungen für die Grundierung und die Differenzierung wird empirisch ermittelt werden.- In jede Vertiefung einer Kulturschale mit 24 Vertiefungen, kombinieren 500 ul der naiven CD4 - T - Zellen und 500 & mgr; l der bestrahlten APCs in jeder Vertiefung, für insgesamt 3x10 5 T - Zellen und 1.2x10 6 APCs pro Napf.
- Bereiten einer Lösung in RPMI-10, enthaltend 2 & mgr; M kognaten OVA-Peptid, 20 U / ml rekombinantem IL-2, 80 & mgr; g / ml Anti-IL-4 (Klon 11B11) und 40 ng / ml rekombinantem IL-12 und Filter unter Verwendung einer 0,2 & mgr; m Spritzenfilter. 1ml dieser Lösung zu jeder Vertiefung der Zellen, für ein Gesamtvolumen von 2 ml in jeder Vertiefung.
- Inkubieren der Zellen in einem 37 ° C Inkubator bei 5% CO 2 für 3 Tage.
- Am Tag 3, spaltete die Kulturen durch vorsichtiges Pipettieren Zellen und Bewegen 1 ml aus jeder Vertiefung in eine neue Kultur gut zu suspendieren. Bringen jeder Vertiefung auf ein Endvolumen von 2 ml durch Zugabe von 1 ml / Well RPMI-10 + 20 U / ml rekombinantes IL-2. </ Li>
- Bringen Sie die Platten in den Inkubator und lassen Sie die Zellen bis zum Tag 5 zu erweitern.
2. Übertragung von Zellen und Induktion der Entzündung
HINWEIS: Für eine optimale Zellzahlen für die Bildgebung, 5x10 6 sollte fluoreszenzmarkierten Th1 - Zellen in einem Gesamtvolumen von 200 & mgr; l PBS in jede Maus übertragen werden. Zellen sind hier mit dem grünen Farbstoff CFSE oder nahen roten Farbstoff CMTMR markiert, obwohl auch andere Zell tracker Farbstoffe verwendet werden können. CFSE und CMTMR-markierten Zellen werden kotransferierende für die Verfolgung von zwei verschiedenen Effektor CD4-Populationen zu ermöglichen.
- Label-Effektor-T-Zellen mit CFSE
- Ernte der Zellen aus den Kulturschalen durch kräftiges Pipettieren der Zellen in jeder Vertiefung und Übertragen in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit einer Pipette. Zählen Sie die Zellen wie in Schritt 1.1.10, dann Zentrifuge und Resuspendieren der Zellen in 10 7 Zellen / ml in PBS + 5% NCS.
- Verdünnen Sie 5 mM Lager CFSE Lösung 1: 100 inPBS. Hinzufügen, 110 & mgr; l CFSE Lösung je 1 ml der Zellen durch einen Tropfen CFSE Lösung auf der Seite der Röhre platziert und dann rocking schnell das Rohr hin und her zu durchmischen.
- Inkubiere die Zellen für 5 min bei RT, dann die CFSE Quench durch Zugabe von 5 ml fötales Kälberserum (FCS) direkt auf das Rohr von Zellen. Bringen Sie das Volumen auf 50 ml mit PBS + 5% NCS.
- Zentrifugieren Sie die Zellen und das Pellet in 20 ml PBS + 5% NCS. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male die Zellen 3-mal insgesamt zu waschen. Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer, wie zuvor in Schritt 1.1.10 und Resuspendieren der Zellen in sterilem PBS bei 2,5 x 10 7 Zellen / ml für die Übertragung an Mäusen.
- Label-Effektor-T-Zellen mit CMTMR
- Ernte der Zellen , wie oben in Schritt 2.1.1, dann zählen, Zentrifuge und Resuspendieren der Zellen in 10 7 Zellen / ml in RPMI-10.
- Zugabe von 10 mM CMTMR Stammlösung direkt auf die Zellen für eine Endkonzentration von 10 uM. Schnell pipettieren the-Zellen in der CMTMR und verhindern die Ausfällung des Farbstoffs gründlich zu mischen.
- Inkubieren 30 min in einem 37 ° C Wasserbad. Wasche die Zellen 3x in PBS + 5% NCS wie zuvor in Schritt 2.1.3-2.1.4. Zählen und Resuspendieren der Zellen in sterilem PBS bei 2,5x10 & sup7 ; Zellen / ml für die Übertragung an Mäusen.
- Transfer-Effektor-T-Zellen 6-8 Wochen alte weibliche Balb / c-Mäuse zu naiv.
- Zeichnen Sie die Zellsuspension (Schritt 2.1.4 oder 2.2.3) in eine Spritze, wobei darauf geachtet, alle Blasen zu entfernen, indem die Spritzennadel Seite nach oben halten, sanft auf die Seite der Spritze schnippen und den Kolben nach oben und unten bewegen, wenn nötig .
- Platzieren Sie Mäuse in einem sauberen Käfig und Wärme sanft unter einer Wärmelampe, bis die Schwanzvene vasodilated erscheint. Platzieren Sie die Maus in einer Haltevorrichtung und wischen Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer. 200 ul der Zellsuspension in die laterale Schwanzvene langsam injizieren. Es sollte unter der Haut keinen Widerstand gegen die Injektion oder sichtbare Sprudeln sein.
- Induzieren dermale Entzündung durch mit komplettem Freund'schen Adjuvans (CFA) Immunisieren
HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Entzündung durch intradermale Injektion induziert von CFA mit entweder emulgiert artverwandten oder nicht-verwandtes Antigen. Andere Entzündungsmodelle können substituiert sein, obwohl die Anzahl der Zellen für die Übertragung erforderlich ist und der Zeitpunkt von Abbildungs empirisch werden müssen eingestellt.- Bereiten Sie eine 200 & mgr; M Lösung von OVA-Peptid in sterilem PBS in einem Reaktionsgefäß. Pipettieren ein äquivalentes Volumen von CFA auf der Oberseite der Peptidlösung.
- Emulgieren der Lösung, indem sie in einer 28 G1 / 2-Insulinspritze zeichnen und dann die Lösung wieder in das Reaktionsgefäß zu stürzen, dann diese Aktion etwa 20-mal wiederholen. Wenn sie vollständig emulgiert wird das CFA und Peptidlösung eine dicke und undurchsichtige Gemisch bilden.
Hinweis: Es ist wichtig, eine feste Nadel Insulinspritze zu verwenden, um die Emulsion zu bilden, wie die Emulsion wird in dem toten Raum in einem nicht fest needl verlorene Spritze. - die Emulsion testen, indem eine kleine Menge auf Wasser in eine Petrischale gelegt fallen. Die Emulsion sollte intakt bleiben und nicht ins Wasser zu verteilen.
- Zeichnen Sie die Emulsion in einen 300 & mgr; l 28 G1 / 2 Insulinspritze und drücken Sie scharf auf den Kolben große Luftblasen zu entfernen.
- Unmittelbar nach der Übertragung der fluoreszenz Effektor - T - Zellen gekennzeichnet, anästhesieren die Mäuse durch ip Injektion von 2,2,2-Tribromethanol bei 240 mg / kg. Beurteilen Sie Anästhesie durch eine sanfte Zehe Prise mehr 2,2,2-Tribromethanol in 1-mg-Schritten verabreicht, falls erforderlich.
HINWEIS: andere zugelassene Anästhetika kann für die 2,2,2-Tribromethanol ersetzt werden. - Legen Sie einen Fingerhut auf dem linken Zeigefinger und sorgfältig die Maus Ohr zwischen dem linken Daumen und Zeigefinger greifen mit dem ventralen Ohr nach oben zeigt. Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auf das Ohr auszuüben, die mechanische Schäden an der Haut verursachen können.
- Schieben Sie die Nadel in die CFA e enthält,Emulsion in die Dermis, mit Blick auf Kegel Seite nach oben, und die Injektion sollte langsam 10 ul der Emulsion in das Ohr. Die Platzierung der Injektion sollte in der äußeren 1/3 der Ohrmuschel sein, etwas außerhalb der Mitte für eine optimale Bildgebung zu ermöglichen.
- Monitor-Mäuse, bis die Betäubung abklingt und Mäuse sind in der Lage, sich nach rechts und sind ambulante Patienten. Bild Mäuse 3 Tage nach der Immunisierung, die Zeit für die Entzündung Bereitstellung zu entwickeln und die übertragenen T-Zellen für den Verkehr zu den Ohr Dermis.
HINWEIS: Die Mäuse dürfen nicht unter Narkose jederzeit unbeaufsichtigt gelassen werden.
3. Vorbereitung der Maus für Imaging
- Bereiten Sie einen Katheter
- Entfernen Sie vorsichtig die Metallnadel aus einem 30 G1 / 2 Tuberkulin (TB) Spritzennadel mit einer Zange und reinigen das überschüssige Leim ab, ein Binokular mit sichtbar zu machen, dass der Kleber vollständig entfernt wird.
- Schneiden Sie die Spitze weg von weiteren 30 G1 / 2 TB Spritzennadel, um sicherzustellen, dass die verbleibende Nadel noch pAtent durch visuelle Inspektion. Beleg ein 18 cm großes Stück PE-10 medizinische Schläuche auf dem getrimmten Nadel und legen Sie vorsichtig das blanke Metall Nadel ca. 5 mm in das andere Ende des Schlauchs, einen Katheter zu schaffen.
- Spülen Sie den Katheter durch eine 1 ml TB Spritze mit sterilem PBS Füllung, das Entfernen jeglicher Luftblasen. Sanft legen Sie den Katheter an der Spitze der Spritze und drücken PBS vorsichtig wenn der Katheter keine Blasen in dem Schlauch zu entfernen.
HINWEIS: wenn Flüssigkeit durch den Katheter gedrückt wird, ist es wichtig, den Katheter an der Spritze zu halten vom Drücken des Katheterfluiddrucks zu verhindern, aus der Spritze. - Platzieren Sie Mäuse in einem sauberen Käfig und Wärme sanft unter einer Wärmelampe, bis die Schwanzvene vasodilated erscheint. Anesthetize die Maus mit einer Mischung aus Raumluft und Isofluran (5% Induktion, 1-2% Wartung, bei 2 l / min Volumenstrom) durch die nosecone Baugruppe geliefert, die dem Isofluran Verdampfer angebracht worden ist. Stellen Sie sicher, dass die Maus wi betäubtth eine sanfte Zehe Prise. Inkrementell erhöhen die Isofluran-Flussrate von 0,1%, wenn Bewegung festgestellt wird. Decken Sie die Augen mit Augensalbe zu verhindern, Trocknen und Verletzungen, während die Maus betäubt.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass Mäuse nie während narkotisierten unbeaufsichtigt gelassen werden. Mäuse sollte für eine ausreichende Anästhesie durch sanfte toe Prise häufig kontrolliert werden. - Unbeweglichkeitseffekt den Schwanz an der Basis mit einer Pinzette und dann den Schwanz mit einem Alkoholtupfer abwischen. Schieben Sie vorsichtig den Katheter in die laterale Schwanzvene und überprüfen Durchgängigkeit, indem Sie auf den Kolben der Spritze vorsichtig hineinschieben. Es sollte unter der Haut kein Widerstand gegen die Bewegung und ohne sichtbare perlt PBS sein, wenn sie in geeigneter Weise angeordnet ist. Bringen Sie den Katheter an den Schwanz durch die Anwendung 1-2 Tropfen Cyanoacrylatkleber an der Injektionsstelle und trocknen lassen, ca. 30 sec.
- Sorgfältig schneiden Sie das Haar von der Rückseite und an den Seiten des Ohres mit einer Schere, kümmert sich nicht um die sk zu beschädigenin. Trim als auch die Barthaare. Mit einem Wattestäbchen, befeuchten die innere Oberfläche des Ohres mit PBS.
- Drehen Sie die Maus und Ohr auf einem 24 x 50 mm Nr 1.5 Deckglas. Mit einer Pinzette, glätten sanft das Ohr auf das Deckglas, die Maus zu bewegen, wenn notwendig, um sicherzustellen, dass das Ohr mit dem Glas bündig ist. Entfernen Sie überschüssiges PBS aus dem Ohr, indem Sie vorsichtig mit einem Tuch abwischen Blotting.
HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu fest auf dem Ohr zu drücken, da die dünne Haut kann leicht mit einem übermäßigen Druck beschädigt werden. - ein ca. 20 mm langes Stück Gewebeband der Länge nach an den oberen Ecken Unter Verwendung von zwei Paaren von gebogenen Pinzette fassen. Legen Sie die Unterseite des Bandes auf das Deckglas an der Spitze des Ohrs des Maus und rollen das Band über den Rest des Ohres, Schieben über die Haare aus dem Weg mit der Zange, wenn notwendig, das Ohr auf das Deckglas zu befestigen. Drücken Sie vorsichtig auf das Band um das Ohr mit einem Wattestäbchen trocken Baumwolle eine gute Abdichtung zu gewährleisten, dabei nicht selbst auf dem Ohr zu drücken.
- Bringen Sie die Imaging-Plattform zu einem 37 ° C Heizblock mit Klebeband. Anwenden Vakuumfett auf jeder Seite des Ohres Bereich der Bildgebungsplattform. Drehen Sie die Maus, um das Deckglas auf die Imaging-Plattform zu platzieren, wobei darauf geachtet, das Ohr in der Mitte des Filzes auszurichten.
HINWEIS: Vermeiden Sie Vakuumfett auf dem Band bekommen, da dies dazu führen, dass aus dem Deckglas abgelöst zu kommen. - Lassen Sie die Isofluran nosecone in die Halterung auf der Imaging-Plattform, um sicherzustellen, dass die nosecone sicher und vollständig bedeckt die Maus die Nase. Verbreiten Sie das Vakuumfett unter dem Deckglas durch diesen fest, aber vorsichtig das Deckglas auf die Imaging-Plattform mit einem sauberen, trockenen Wattestäbchen drücken.
- Affix das Deckglas auf die Plattform mit zwei 20 mm Bandstücke und zwei längere Stücke von Band um den oberen Abschnitt der Plattform geschlungen. Falls Luftblasen zwischen dem Ohr und dem Deckglas sind, können sie leicht von unten wi durch Drücken auf dem Ohr entfernt werdenth ein Stück Papier gefaltet.
HINWEIS: Es ist wichtig, nicht Papier zu verwenden, die zu dick ist oder zu fest drücken, da diese Gewebe blanchiert und Schäden verursachen können, verkompliziert Ergebnisse. - Bewegen Sie die Maus auf den Mikroskoptisch und befestigen Sie die Plattform mit Klebeband. Rohr mit einer Doppelschicht aus Vakuumfett auf das Deckglas um das Ohr als Reservoir für das Eintauchen in Wasser Ziel zu dienen.
- Wickeln Sie ein mit Wasser gefülltes Heizdecke um die Maus durch die Imaging-Plattform. Füllen Sie den Behälter mit 37 ° C destilliertes Wasser. Stellen Sie sicher, dass alles, was auf der Bühne mit Klebeband und dass die Spritze des Katheters befestigt ist, ist leicht zugänglich.
4. In vivo - Zeitraffer-Imaging und Intravenöse Antikörper - Administration
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert die Verwendung eines Multiphotonen-Mikroskop, ausgestattet mit einem Ti: Sa-Lasersystem. Das Ziel verwendet wird, ein 25x Vergrößerungslinse mit 1,05 NA, mit einem Gegenstand befestigtive Heizung auf 40 ° C eingestellt. Die optimale Temperatur für diese Heizvorrichtung wurde empirisch bestimmt die geeignete Temperatur sein, um die Ohr Dermis bei 37 ° C zu halten und müssen für die Verwendung in anderen Abbildungssysteme angepasst werden. Die Software Erwerb verwendet wird, kann zwischen den Instrumenten und Anpassungen des Protokolls variieren zu arbeiten unterschiedlich konfigurierten Systemen gemacht werden müssen. Stellen Sie sicher, dass Bilder in einem Format gespeichert werden, die mit jeder gewünschten Analysesoftware kompatibel ist.
- Lokalisieren der Dermis durch die Okulare durch Positionieren des Ziels über die Mitte des Ohrs und Absenken des Ziels gerade bis er an die Oberfläche des Wassers in dem Behälter. Mit Hilfe einer externen Lichtquelle, Blick durch die Okulare und weiterhin langsam das Ziel zu senken, bis die Oberfläche des Ohres in den Fokus kommt. Senken Sie die inneren und äußeren Vorhänge um den Mikroskoptisch.
- einen Bereich für die Bildgebung Bestimmen Mikroskopeinstellungen und suchen
- Vor imaging, konfigurieren Sie den Laser für eine maximale Anregung und Detektion der gewünschten Fluorophore durch die Laserwellenlänge auf 900 nm im MP Laser Controller-Fenster Einstellung der Laserleistung im Rahmen Acquisition: Laser-Fenster, und die PMT-Spannungen in der Bildaufnahme-Steuerungsfenster .
HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird eine Anregungswellenlänge von 900 nm mit Filtern Erzeugung der zweiten Harmonischen (420-460 nm), CFSE (495-540 nm) und CMTMR (575-630 nm) zu erkennen. Andere Konfigurationen können verwendet werden, um unterschiedliche Fluorophore zu erfassen, wie gewünscht. - Stellen Sie das Mikroskop auf 512 x 512 Pixel Auflösung, mit einer 2 & mgr; s / Pixel Verweilzeit im Acquisition Rahmen: Größe und Modus-Fenster. Aktivieren Sie eine Live-Imaging-Modus Scannen durch das Gewebe für einen Bereich zu Bild zu ermöglichen, indem "XY wiederholen" klicken. Idealerweise sollte der Bereich relativ gleichförmig sein, ohne Luftblasen und Bereiche mit dichten Haarfollikel zu vermeiden.
HINWEIS: Die CFA-Emulsion ist hell autofluoreszenten im grünen und near-rot-Kanälen und sollte vermieden werden. Ein optimaler Bereich kann in der Regel etwa 3 mm von der Kante der Emulsion gefunden werden. Etwa 10 bis 100 Zellen können in einem einzelnen Bild verfolgt werden. Wenn zu viele Zellen vorhanden sind, werden Tracking-Software im Allgemeinen begegnen Fehler bei dem Versuch, eng angeordneten Zellen zu trennen, was zu verkürzten und / oder ungenaue Zellspuren. - Sobald ein geeignetes Bildfeld angeordnet ist, bestimmen die Z-Region, die durch Anordnen der Zelle "höchste" in der Dermis abgebildet werden, die Z-Position auf 0 setzen, indem Sie den "Set 0" klicken, und Scrollen in der Z nach unten Richtung Ausmaß der Zelltiefe zu messen. Eine Abbildungstiefe von 35 bis 75 & mgr; m ist typisch. Stellen Sie die Start- und End-Positionen in der Akquisitions Rahmen: Mikroskop-Fenster. Passen Sie die Instrument PMT Spannungen und Laserleistung in der "hellen Z" Fenster Visualisierung der Zellen über die gesamte Tiefe des Abbildungsfeldes zu optimieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie das las Anhebener Leistung über 25 mW bei der Probe, wie hohe Leistungspegel können Hitzeschäden und sterile Verletzungen der Dermis führen. Die entsprechende maximale Leistungspegel für jedes Mikroskop variiert und muss gemessen werden. Es sollte, dass die Laserleistung erhöht wird bemerkt werden, oder PMT Spannungen mit Gewebetiefe nicht für einen quantitativen Vergleich der Bildhelligkeit in der nach dem Erwerb Analyse in unterschiedlichen Tiefen zulässt. - Überprüfen Sie die "Tiefe" und "Time" Tasten unter der Schaltfläche "Scannen" im Image Acquisition Control-Fenster. Stellen Sie einen Kalman-Filter das Bild 3 mal pro Zeile in der Image Acquisition Steuerung zum Scannen: Filtermodus-Fenster und stellen Sie die Z-Scheibe Tiefe im Image Acquisition: Mikroskop Fenster, so dass es etwa 1 min dauert einen vollständigen Stapel zu erfassen, wie erwähnt im Timeview Fenster.
HINWEIS: Der Abstand zwischen den Stapeln sollte nicht länger dauern als etwa 1 min, als längere Intervalle die Verfolgung von schnell wandernden Zellen zu verhindern. Je nach the Art der Zellen abgebildet werden, kann dieses Intervall müssen für die richtige Zellverfolgung durch Analyse-Software zu ermöglichen, angepasst werden. Z-Scheiben sollten nicht mehr als 5 & mgr; m sein. Im Allgemeinen 15-18 Z-Scheiben zwischen 2-5 & mgr; m dick sind geeignet für eine 1 min Abbildungsintervall.
- Vor imaging, konfigurieren Sie den Laser für eine maximale Anregung und Detektion der gewünschten Fluorophore durch die Laserwellenlänge auf 900 nm im MP Laser Controller-Fenster Einstellung der Laserleistung im Rahmen Acquisition: Laser-Fenster, und die PMT-Spannungen in der Bildaufnahme-Steuerungsfenster .
- Nehmen Sie ein Pre-Antikörper Zeitraffer-Bild
- Nehmen Sie ein 5 min Zeitraffer-Bild des Bereichs um die Stabilität des Gewebes, um anhand der Anzahl der Wiederholungen auf "5" in der Acquisition Rahmen: Timescan-Fenster und klicken Sie auf die Schaltfläche "Scannen".
HINWEIS: Tissue "drift" kann, indem sie keine ausreichende Zeit verursacht werden, für das Ohr thermischen Gleichgewicht, schlechte ear Zubereitung zu erreichen, oder kann wegen lokaler drift in einem Bereich des Ohrs sein. Wenn die 5 min Bild ist nicht stabil, Bild eine neue Region in der Dermis. Wenn ein zweites Bild in einer neuen Region instabil bleibt, ist es am besten, sorgfältig das Ohr Vorbereitung und Imaging wiederholen von Schritt 3.6 mit einem frischen coverslip. - Wenn das Gewebe in der 5 min Bild stabil ist, muss eine 30-45 min Zeitraffer-Bild durch die Anzahl der Wiederholungen auf einen Wert zwischen 30 und 45 in der Acquisition Rahmen: Timescan-Fenster, für jede kleinere Gewebedriftüberwachung als das Bild gesammelt. Speichern Sie die Datei in einem Format, das mit der Analyse-Software kompatibel ist zu nutzen.
HINWEIS: An diesem Punkt in dem Protokoll die Schritte 4.2.2 - 4.3.2 können mehrere Stellen im selben Ohr dem Bild wiederholt werden. Eine einzelne Maus sollte länger als 4 Stunden nicht gehalten werden betäubt, wie der Tod wahrscheinlicher ist.
- Nehmen Sie ein 5 min Zeitraffer-Bild des Bereichs um die Stabilität des Gewebes, um anhand der Anzahl der Wiederholungen auf "5" in der Acquisition Rahmen: Timescan-Fenster und klicken Sie auf die Schaltfläche "Scannen".
- Spritzen Sie blockierende Antikörper und erfassen einen Post-Antikörper-Bild.
- Zeichnen Sie die Antikörpermischung in eine 1 ml TB Spritze und entfernen Sie die Nadel, um sicherzustellen, alle Luftblasen zu entfernen. Drücken auf den Kolben, so dass die Antikörperlösung bildet einen "Tröpfchen" am Ende der Spritze.
- Heben Sie die Vorhänge auf der Bühne herum und den Katheter zu lokalisieren. Entfernen Sie den ursprünglichen PBS-containing Spritze aus dem Katheter. Ohne den Katheter nach unten einstellen, legen Sie vorsichtig die neue Spritze, die Antikörper enthalten. Halten Sie das Ende des Katheters auf die Spritze und langsam die Antikörpermischung in den Katheter zu injizieren. Stellen Sie sicher, dass es keinen Widerstand gegen Injektion.
- Stellen Sie den Katheter nach unten und senken die Vorhänge der Mikroskoptisch umgibt. unter Verwendung der gleichen Geräteeinstellungen wie die Pre-Antikörper Bild Beachten Sie die Zeit der Einspritzung und sofort starten eine neue 20-40 min Bildgebungssequenz an der gleichen Stelle zu sammeln. Speichern Sie die Datei in einem geeigneten Format für die Analyse-Software verwendet werden.
HINWEIS: Zwischen Zeitrafferbilder beachten Sie bitte die Maus für eine ausreichende Anästhesie und Atmung. Es ist nicht zu Bild mehr als ein Feld nach der Verabreichung von Antikörpern zu empfehlen, da es variable Raten der Clearance des Antikörpers sein kann.
- Injizieren fluoreszenzmarkierten Dextran Blutgefäße zu finden, Katheter Durchgängigkeit zu bewerten und messen blood Gefäßpermeabilität
- Bereiten Sie eine 2 mg / ml-Lösung von fluoreszenz konjugierten Dextran (70.000 MW) in 100 ul sterilem PBS und ziehen in eine Spritze, entfernen Sie alle Luftblasen.
- Mit der gleichen Technik wie in Schritt 4.4.1-4.4.2, legen Sie die Spritze auf den Katheter und injizieren intravenös die Dextran-Lösung.
- Erfassen Sie einen einzelnen Stapel auf 1024 x 1024 Pixel Auflösung durch Änderung der Auflösung im Acquisition Rahmen: Modus Fenster, mit den gleichen PMT und Lasereinstellungen wie für die Zeitraffer-Bilder. Um das Bild zu sammeln, deaktivieren Sie die "Time" Taste unter dem "Scan" -Taste und dann auf die Schaltfläche "Scannen" klicken. Das 3D-Bild wird für den Ausschluss-T-Zellen in den Gefäßen und zeigen sich erlauben, dass der Katheter war Patent- und richtig eingesetzt ist. Die Diffusion von fluoreszierenden Dextran aus den Gefäßen kann auch zur Beurteilung lokale vaskuläre Permeabilität verwendet werden.
Hinweis: Dieses hochauflösende (1024 x 1024) statisches Bild wird für pr verwendetesentation Zwecken und kann zusätzlich zur Analyse der Gewebearchitektur im gleichen Bereich wie die Zeitraffer-Bilder verwendet werden werden. Alternativ kann auch ein 512 x 512 Bild genommen werden, die mit den Zeitraffer-Bilder zusammengefügt werden können Bildanalyse-Software. Zeitraffer-Aufnahme des Dextrans Verabreichung auch erwünscht sein kann, abhängig von den Forschungsbedarf der einzelnen Labors. In diesem Fall sollte das Bild wie in den Schritten 4.2.3-4.3.2 eingerichtet werden.
- Nach der Bebilderung abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Maus unter dem Ziel und der Wasserdecke auszupacken. Entfernen Sie die Deck von der Imaging-Plattform durch Schneiden des Bandes und sanft heben das Glas, bis es ablöst. Während sich die Maus noch betäubt, das Ohr von der Deck lösen. Wenn dies ein Terminal Verfahren sein, euthanize die Maus durch zervikale Dislokation. Wenn Speichern dieser Maus für die wiederholte Abbildung, senden Sie es an einem sauberen Käfig von anderen Mäusen trennen und zu beobachten, bis die Maus kann sich rechts und istambulante Patienten. Sobald von der Anästhesie erholt, kann die Maus auf einen Käfig mit anderen Tieren zurückgeführt werden.
- Importieren Sie die Imaging-Dateien in ein Bildanalyseprogramm und führen Sie die gewünschten Korrekturen. Vermeidung von nicht-linearen Erweiterungen und automatisierte Glättung oder Rauschunterdrückung Programme und Algorithmen wird empfohlen. Normalerweise müssen Bilder nur einen geringen Hintergrundkorrektur durch manuell den Schwarzpunkt des Bildes vor der Analyse zu erhöhen. Analysieren Sie die Bilddaten durch eine automatisierte Zell-Tracking - Programm mit manueller Korrektur verwenden, wie in Overstreet, Gaylo et al 30.
HINWEIS: Es gibt viele Bildanalyse-Suiten zur Verfügung, sowohl proprietäre und Open Source, die verwendet werden können Zelldynamik aus den Multi Bilder aus diesem Protokoll ergeben, zu quantifizieren. Die genaue Methode der Bildanalyse und die optimalen Softwarepakete verwendet werden, werden auf den Forschungsbedarf der einzelnen Labors ab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Fähigkeit , Immunreaktionen in situ zu untersuchen , ohne die Immunumgebung zu verändern ist wesentlich, mit einem entzündeten Gewebe in Echtzeit Wechselwirkungen von T - Effektorzellen zu studieren. Imaging der intakten Ohr Dermis durch dieses Protokoll, umrissen in Figur 1A und B, ermöglicht die Visualisierung der übertragenen fluoreszenzmarkierten T - Effektor - Zellen in der dermalen Interstitium. Dies ermöglicht sowohl hochauflösendes (1C) und Zeitraffer (1D, Film 1) Bilder von Effektor - T - Zelldynamik in den entzündeten Dermis.
Abbildung 1. Hochauflösende und 4D - Bildgebung von T - Effektorzellen in der intakten Haut Interstitium. (A) Experimentelle Umriss. (B) Fotografie eines Ohr prepared für die Bildgebung mit der Stelle der Emulsion (schwarze gestrichelte Linie) und optimale Bereich für die Bildgebung (rote Linie) angedeutet ist. (C) Maximale 3D - Projektion eines hochauflösenden Stapel zeigt CFSE-markierten Th1 - Zellen (grün), zweite harmonische Signal von fibrillärem Kollagen (blau) und Texas Red-Dextran markierten Gefäße (rot). Der weiße Pfeil zeigt eine von mehreren autofluoreszenten Haarfollikel. Maßstabsbalken stellen 50 & mgr; m (D) Wandernde Pfade von Th1 - Zellen für 30 Minuten in die nachgeführten CFA entzündeten Dermis. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Dieses Bildgebungsprotokoll erfordert die Verwendung einer speziellen Imaging-Plattform, die im eigenen Haus, sowie eine angepasste nosecone für die Lieferung von inhalativen Anästhesie während Bildgebung errichtet wurde. Die Imaging - Plattform (2A-B) besteht of einer Aluminiumgrundplatte mit einem erhabenen mittleren Abschnitt. Dieser erhöhte Abschnitt hat eine Einfügung Teil mit Acryl ausgekleidet fühlte Unterstützung an das Ohr zu schaffen, ohne Komprimierung und möglicherweise das dünne Gewebe zu schädigen. Die Geometrie der Einrichtung erforderlich, die den Aufbau eines flexiblen und einstellbaren nosecone inhalativen Anästhesie während der Bildgebung zu liefern. Diese nosecone, bestehend aus einem modifizierten Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Abschnitt 50 mm verbunden flexibler Schlauch (2C), wird an der Stelle mit einem Halter besteht aus modifizierten Mikrozentrifugenröhrchen (2D) und befestigt an dem Abbildungs Plattform über Klettverschlusses befestigt . Die Verwendung von Klettverschluss ermöglicht die Neupositionierung der nosecone Baugruppe so, dass entweder Ohr einer Maus abgebildet werden kann, und kann optimal für einzelne Mäuse positioniert werden.
Abbildung 2. Equipment für intravital Bildgebung. Maßgeschneiderte Imaging - Plattform in oben (A) und Seite (B) Ansichten. Nosecone für Isofluran Administration (C) und nosecone Halter (D). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Katheterisierung der Schwanzvene ermöglicht kontinuierlichen Zugang zu dem Zirkulations Antikörper und andere kleine Moleküle zu verabreichen, die aus dem Gefäßsystem diffundieren kann oder größere fluoreszierende Moleküle, wie beispielsweise hochmolekulare Dextran Blutgefäße zu etikettieren. Nach der Verabreichung von 100 ug anti-β 1 und anti-β 3 -Integrin - Antikörper durch den Katheter, der zuvor motile Zellen Arrest in der Dermis (Film 2) zu blockieren. Diese Zellen haben eine verringerte mittlere Geschwindigkeit nach der Antikörper Verabreichung (3A), sowie eine deutliche Abnahme in mäanderförmigen Index das Verhältnis der Gesamtverschiebung auf die Gesamtbahnlänge (3B).
Abbildung 3. Die Verabreichung von anti-β 1 und anti-β 3 Antikörper hemmt die Migration Th1 - Zellen in CFA-entzündeter Haut. (A) Mittlere Geschwindigkeit von Th1 - Zellen vor und nach Verabreichung von 100 ug anti-β 1 und anti-β 3 -Integrin blockierende Antikörper. (B) Verschlungene Index von Th1-Zellen vor und nach der Antikörper-Blockade. Etwa 100 verfolgt Zellen sind von den Bildern vor und nach der Antikörper-Blockade von einer einzelnen Maus in einem repräsentativen Experiment. Statistiken von Mann Whitney.es / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Weil Haar nicht von der Oberfläche des Ohrs, Bildartefakte aus dem Haar sind häufig entfernt wird. Autofluorescence von Haarfollikeln (4A) und Shadowing und Autofluoreszenz von darüber liegenden Haar (4B) sollte möglichst vermieden werden , da sie T - Zellen und stören mit automatisierter Bildanalyse - Software verschleiern. In ähnlicher Weise Luftblasen zwischen dem Ohroberfläche gefangen und das Deckglas kann zu Bildartefakte (4C) führen. Die richtige Vorbereitung des Ohres sollte die Anzahl und Größe der verbleibenden Blasen zu minimieren.
Abbildung 4. Gemeinsame Artefakte aus Haar Autofluoreszenz und schlechte Ohr vorreitung. (A) Autofluoreszie- Haarfollikel. (B) Autofluoreszie- Haare und Haarfollikel (grün) und Kollagen (weiß) mit darüber liegenden Haare Schatten, so dass dunkle Linien im Bild. (C) Artifact aus einer Luftblase, welche die Kante der Vertriebenen, autofluoreszenten verhornte Epidermis (gestrichelte Linie). Maßstabsbalken stellen 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Zusätzlich kann die Verwendung von mehreren Wärmequellen zu Problemen mit der Stabilität des Gewebes führen, aufgrund der thermischen Expansion und Kontraktion. Falsche Thermostateinstellungen, zum Beispiel, können zu große Schwingungen während der Bildgebung führen , dass die Interpretation der Ergebnisse schwierig (Movie 3) machen kann. Es ist wichtig, die optimalen Einstellungen für jedes System zu bestimmen, die eine konstante Temperatur sorgt und maximiert die Stabilität. UltimatEly, eine temperaturgesteuerte Abbildungskammer ist der beste Weg Variabilität von Temperaturänderungen zu beseitigen.
Film 1. Th1 - Zellen in den CFA-entzündeten Dermis Migration (Rechtsklick zum Herunterladen). 30 min Zeitrafferbild zeigt Th1 - Zellen (grün) Migration in der dermalen Kollagennetz (Erzeugung der zweiten Harmonischen, blau).
Film 2. Th1 - Zellen Verhaftung auf Blockade von β 1 und & bgr; 3 Integrine (rechts Download anklicken). Die Zellen (grün) wurden 30 Minuten vor dem administ abgebildetration von blockierenden Antikörpern, und dann für weitere 20 min in dem gleichen Ort abgebildet werden.
Film 3. Oszillationen von einer schlecht eingestellten Heizplatte (Rechtsklick zum Herunterladen). 30 min Zeitraffer-Bild von Th1 - Zellen (grün) und Erzeugung der zweiten Harmonischen (blau). Nachdem dieses Bild gesammelt wurde, verwendet die Heizplatte wurde ein defektes Thermostat haben gefunden, Schwingungen in der Temperatur der Abbildungsplattform und anschließender thermischer Expansion und Kontraktion zu verursachen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedeutung
Hier präsentieren wir ein komplettes Protokoll für die 4D-Visualisierung übertragen, antigenspezifischen Effektor Th1-Zellen in den intakten Mausohr Dermis. Dieses Verfahren bietet Vorteile gegenüber einigen aktuellen Bildgebungsmodalitäten aus mehreren Gründen. Durch die Abbildung der ventralen Ohr Dermis, sind wir in der Lage Haarentfernung zu verzichten, die für die Bildgebung Protokolle unter Einbeziehung anderer Hautstellen erforderlich ist. Obwohl Enthaarungsmittel Allgemeinen mild sind, wurden sie Störung der Hautbarriere 42 zu veranlassen , gezeigt ist , ein Verfahren , das eine Immunantwort stimulieren kann 43,44. Durch die auch invasive chirurgische Verfahren vermeidet die Dermis oder Subkutis, dieses Protokoll verhindert eine Beschädigung induzierte Entzündung und die schnelle Rekrutierung von Neutrophilen 37 und anderen Immunzellen in die Dermis zu belichten. Die Verwendung eines Venenkatheters in diesem System blockierende Antikörper gegen Schlüsselmoleküle zu liefern, ermöglicht die Echtzeit-Abfrage des dynamic Verhalten von CD4-T-Zellen. Die Verwendung dieses Abbildungsprotokoll für CD4 T - Zell - Motilität interstitielle 30 kritischen Anforderungen ergeben , die nicht 8 in in vitro - Systemen gefunden wurden.
Kritische Schritte in dem Verfahren
Ein wesentlicher Schritt in jedem Bildgebungsprotokoll wird eine stabile Gewebepräparation für die Bildgebung zu gewährleisten. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass genügend PBS zwischen dem Ohr und dem Deckglas, dass keine Luftblasen und das Ohr in Kontakt mit dem Glas, aber nicht so viel wie das Band zu veranlassen, von der Glas de-eingehalten werden. In ähnlicher Weise die Vermeidung von Kontakt zwischen dem Band das Deckglas auf die Plattform und jede Vakuumfett halten, wird das Band lockert im Laufe der Zeit zu verhindern. Temperatur muss konstant gehalten werden, Schwingungen zu vermeiden und driften durch thermische Kontraktion oder Expansion der Plattform Materialien.
Einschränkungen und Änderungen
45 verwendet. Jedoch ist die Bevölkerungs resident immune des Ohres die sich von der Haut an der Flanke oder Fußballen 46 und dem Mausohr hat verschiedene vaskuläre Eigenschaften im Vergleich zu anderen Seiten 47. So sind einige Anwendungen Vergleich der Ohrabbildungsdaten auf andere Hautstellen kann schwierig sein.
Dieses Protokoll erfordert auch die effektive Migration von übertragenen T-Effektorzellen aus dem Blutstrom und in die Dermis. Dies begrenzt die Fähigkeit, Zellen zu verwenden, die Defekte in Homing oder Extravasation haben, da sie nicht den Zwischenraum zu betreten werden können. Extravasationkann durch Einspritzen von Zellen direkt in den Ohr Dermis 37,48 umgangen werden, obwohl dies eine gewisse mechanische Beschädigung und die Lieferung von Zellen auf diese Weise bewirkt , kann die Lokalisierung oder das Verhalten von Zellen nicht rekapitulieren , die in vivo Extravasation unterziehen.
Es ist auch wichtig , hier oder Albino C57BL / 6- Tyr c-2J - Mäuse verwendet , unter Verwendung von nicht pigmentierten Empfängermäuse für Abbildungsexperimente wie die BALB / c - Stamm zu berücksichtigen. Das Melanin in pigmentierter Mäuse, zusätzlich zu hoch autofluoreszierenden ist, heizt auch unter relativ geringer Leistung Anregung von einem Multi Laser 37 auf. Dies kann die thermische Schädigung der Haut und die anschließende Entzündung 36 oder fluoreszierendes Sprenkelung 31, verkompliziert Ergebnissen führen. Dies kann Fluorophore, die in einer Multiparameter-Abbildungsexperiment verwendet werden kann. Allerdings sind einige sehr helle oder stark exprimiert fluoreszierende Moleküle können bei niedrigen Laserleistung effektiv angeregt werden, die alleGrund für eine effektive Visualisierung in pigmentierten Mäusen.
Zukünftige Anwendungen
Da dies ein nicht-invasives Verfahren ist, könnte es leicht für Langzeitstudien an Mäusen mit sequentiellen Bildgebungs über längere Zeiträume angepasst werden. Während die Fluoreszenzmarkierung, wie hier beschrieben über Zeiträume von mehr als 3-4 Tage verblassen würde, eliminiert den Einsatz von endogen fluoreszierenden Zellen oder fluoreszierenden Reporterzellen dieses Problem. Tatsächlich haben wir bereits dieses Protokoll verwendet vivo- erzeugten Antigen-spezifischen Effektoren Lager Zytokin Reportern zu verfolgen in, einschließlich der IFNy Reporter Yeti 30,49 und IL-4 - Reporter 50 4get. Wir haben zusätzlich die endogene CD4 - Zellen in CD4-Cre ROSA26-stop-floxed eYFP fluoreszierenden Reporter - Mäuse 30 visualisiert. Da die Fluoreszenzeigenschaften von eYFP und andere fluoreszierende Proteine aus chemischen Farbstoffe wie CFSE unterscheiden, können Modifikationen an den Abbildungsparameter benötigt werdenfür eine effiziente Visualisierung. Veränderungen wie die Pixel Verweilzeit zu erhöhen, kann die Fluoreszenzsignal von einigen dim Fluorophore zu verbessern und die Verringerung der Länge der Zeitreihen-Bildern kann jede Photobleichens mildern, die beobachtet werden können. Bei 900 nm Anregung haben wir bisher nicht signifikant Photobleichens von CFSE, CMTMR beobachtet, oder eYFP über kurze Abbildungsintervalle.
Obwohl dieses Verfahren auf der Messung der Dynamik von CD4 Effektor T-Zellen-Motilität konzentriert, ist sie nicht auf diese Anwendung beschränkt. Arbeit ist derzeit laufenden die dynamischen Wechselwirkungen von Effektor - T - Zellen zu messen , mit Antigen -präsentierenden Zellen durch die Verwendung von fluoreszierenden Reportermäusen und Injektion von fluoreszenz konjugierten Antikörpern in die Dermis präsentiert vor Zellen oder Gewebestrukturen zu etikettieren 51,52 zu Bildgebung. Darüber hinaus, während dieses Protokoll die Verwendung des Katheters veranschaulicht, blockierende Antikörper zu liefern, während Bildgebung, andere Verbindungen, einschließlich niedermolekularen Inhibitoren, könnenverabreicht werden. Schließlich bietet dieses Protokoll , um eine flexible Plattform immune Dynamik über die Zeit zu messen, in vivo, in einem nicht-invasive Weise.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken der University of Rochester Multiphotonenionisation Mikroskop Core Facility für die Hilfe bei Live-Bildgebung. Unterstützt von NIH AI072690 und AI02851 zu DJF; AI114036 bis AG und AI089079 zu MGO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
References
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al. Differing requirements for CCR4, E-selectin, and alpha4beta1 for the migration of memory CD4 and activated T cells to dermal inflammation. Journal of immunology. 189 (1), 337-346 (2012).
- Park, E. J., et al. Distinct roles for LFA-1 affinity regulation during T-cell adhesion, diapedesis, and interstitial migration in lymph nodes. Blood. 115 (8), 1572-1581 (2010).
- Masopust, D., Schenkel, J. M. The integration of T cell migration, differentiation and function. Nature reviews. Immunology. 13 (5), 309-320 (2013).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Schon, M. P., Ludwig, R. J. Lymphocyte trafficking to inflamed skin--molecular mechanisms and implications for therapeutic target molecules. Expert opinion on therapeutic targets. 9 (2), 225-243 (2005).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Friedl, P., Entschladen, F., Conrad, C., Niggemann, B., Zanker, K. S. CD4+ T lymphocytes migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1 integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and locomotion. European journal of immunology. 28 (8), 2331-2343 (1998).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102 (9), 3262-3269 (2003).
- Lammermann, T., et al. Cdc42-dependent leading edge coordination is essential for interstitial dendritic cell migration. Blood. 113 (23), 5703-5710 (2009).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nature immunology. 11 (10), 953-961 (2010).
- Jacobelli, J., Bennett, F. C., Pandurangi, P., Tooley, A. J., Krummel, M. F. Myosin-IIA and ICAM-1 regulate the interchange between two distinct modes of T cell migration. Journal of immunology. 182 (4), 2041-2050 (2009).
- von Andrian, U. H. Immunology. T cell activation in six dimensions. Science. 296 (5574), 1815-1817 (2002).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296 (5574), 1876-1880 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
- Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2604-2609 (2003).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nature immunology. 4 (6), 579-585 (2003).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 282-291 (2008).
- Bajenoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Kawakami, N., Flugel, A. Knocking at the brain's door: intravital two-photon imaging of autoreactive T cell interactions with CNS structures. Seminars in immunopathology. 32 (3), 275-287 (2010).
- Wilson, E. H., et al. Behavior of parasite-specific effector CD8+ T cells in the brain and visualization of a kinesis-associated system of reticular fibers. Immunity. 30 (2), 300-311 (2009).
- Schaeffer, M., et al. Dynamic imaging of T cell-parasite interactions in the brains of mice chronically infected with Toxoplasma gondii. Journal of immunology. 182 (10), 6379-6393 (2009).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nature medicine. 17 (6), 744-749 (2011).
- Matheu, M. P., et al. Imaging of effector memory T cells during a delayed-type hypersensitivity reaction and suppression by Kv1.3 channel block. Immunity. 29 (4), 602-614 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Teijeira, A., et al. Lymphatic endothelium forms integrin-engaging 3D structures during DC transit across inflamed lymphatic vessels. The Journal of investigative dermatology. 133 (9), 2276-2285 (2013).
- Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I., Cahalan, M. D. Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8334-8339 (2010).
- Gray, E. E., Suzuki, K., Cyster, J. G. Cutting edge: Identification of a motile IL-17-producing gammadelta T cell population in the dermis. Journal of immunology. 186 (11), 6091-6095 (2011).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of investigative dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PloS one. 8 (2), 57135 (2013).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477 (7363), 216-219 (2011).
- Tozer, G. M., et al. Intravital imaging of tumour vascular networks using multi-photon fluorescence microscopy. Advanced drug delivery reviews. 57 (1), 135-152 (2005).
- Lee, J. N., et al. The effects of depilatory agents as penetration enhancers on human stratum corneum structures. The Journal of investigative dermatology. 128 (9), 2240-2247 (2008).
- Brandt, E. B., Sivaprasad, U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis. Journal of clinical & cellular immunology. 2 (3), (2011).
- Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. European journal of immunology. 34 (8), 2100-2109 (2004).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular research. 19 (3), 374-379 (1980).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. The Journal of investigative dermatology. 135 (1), 84-93 (2015).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plastic and reconstructive surgery. 83 (6), 948-959 (1989).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Stetson, D. B., et al. Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. The Journal of experimental medicine. 198 (7), 1069-1076 (2003).
- Mohrs, M., Shinkai, K., Mohrs, K., Locksley, R. M. Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15 (2), 303-311 (2001).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Cummings, R. J., Mitra, S., Lord, E. M., Foster, T. H. Antibody-labeled fluorescence imaging of dendritic cell populations in vivo. Journal of biomedical optics. 13 (4), 044041 (2008).
