Abstract
Kvantificering respiratoriske flydeegenskaber i de pulmonale acinære dybder, og hvordan de påvirker inhaleret aerosol transport er kritisk over for at optimere narkotika indånding teknikker samt forudsige deposition mønstre af potentielt giftige luftbårne partikler i pulmonale alveolerne. Her er soft-litografi teknikker, der anvendes til at fremstille komplekse acinære-lignende luftvejs strukturer på de sandfærdige anatomiske længde-skalaer, der gengiver fysiologiske acinære strømningsfænomener i et optisk tilgængeligt system. Den mikrofluidapparat har 5 generationer af bifurcating alveolated kanaler med jævne ekspanderende og kontraherende vægge. Væg aktivering opnås ved at ændre trykket inden vandfyldte kamre omkring de tynde PDMS acinar kanalvæggene både fra siderne og toppen af enheden. I modsætning til almindelige flerlags mikrofluidenheder, hvor stabling af flere PDMS forme kræves, er en simpel metode præsenteret for fabrikere toppenkammer ved at indlejre den del af en sprøjtecylinder i PDMS formen. Denne roman microfluidic opsætning leverer fysiologiske vejrtrækning bevægelser som igen giver anledning til karakteristiske acinære luft-strømme. I den aktuelle undersøgelse blev micro partikel billede Velocimetri (μPIV) med flydende ophængt partikler anvendes til at kvantificere sådanne luft strømme baseret på hydrodynamisk lighed matchning. Den gode overensstemmelse mellem μPIV resultater og forventede acinar strømningsfænomener tyder på, at mikrofluid platform kan tjene i nær fremtid som et attraktivt in vitro værktøj til at undersøge direkte luftbårne repræsentativ partikel transport og aflejring i acinære regioner af lungerne.
Introduction
En detaljeret kvantificering af respiratoriske flow dynamik i den distale, alveolated regioner af lungerne er altafgørende til at forstå luftstrømmen blanding i pulmonal acinus og forudsige skæbne inhalerede aerosoler i dybeste luftveje 1-3. Sidstnævnte aspekt er af særlig bekymring, når adressering på den ene side farerne ved inhalerede forurenende partikler eller omvendt i at søge nye strategier for forbedret og målrettet levering af inhalerede lægemidler stof til lokaliserede lunge sites 4, 5 samt til systemisk levering.
Til dato har respiratoriske strømme i de dybe pulmonale acinære regioner blevet typisk undersøgt i silico hjælp Computational Fluid Dynamics (CFD) eller alternativt in vitro med skalerede-up forsøgsmodeller efter hydrodynamisk lighed matchning. I de sidste par årtier har CFD metoder i stigende grad blevet anvendt til at studere acinære strømningsfænomener, fra single alveolære modeller 6, 7 og alveolated kanaler 8-12 til mere omfattende i silico modeller at fange anatomisk-realistisk acinære træstrukturer med flere generationer af alveolated kanaler og op til flere hundrede individuelle alveoler 13-15.
Sammen har numeriske indsats været omdrejningspunktet i at kaste lys over den rolle og indflydelse væg bevægelse under vejrtrækning bevægelser på efterfølgende acinære luftstrømsmønstre. I fravær af vejrtrækning bevægelse, statisk alveoler funktion recirkulerende strømme i deres hulrum, der udviser ingen konvektion udveksling af luft mellem acinære kanal og alveolen 6, 7; med andre ord ville alveolære strømme fuldstændigt isoleret fra strømmene i acinære træer og udveksling af luft ville resultere entydigt fra diffusive mekanismer. Med eksistensen af cykliske udvidelser af den alveolære domæne imidlertid alveolære flow topologier drastisk ændret og resulting strømningsmønstre inde alveoler er intimt bundet til placeringen af en alveole langs acinar træ (f.eks., proksimal vs. distale generationer).
Især har det været en hypotese i simulationer, der alveolære strømningsmønstre er stærkt påvirket af forholdet mellem alveolære at duktalt strømningshastigheder, således at proksimale generationer af pulmonal acinære træ, hvor dette forhold er relativt stor efter massebevarelse over en træstruktur, feature komplekse recirkulerende flyder inde i alveolære hulrum med uoprettelige væske pathlines. Med hver dybere acinære generation, forholdet mellem alveolære til duktale strømningshastigheder aftager gradvist, således at de distale acinære generationer udviser flere radiale-lignende strømlinier, der minder om simple inflationer og deflations af en ballon. Med fremskridt inden for moderne billeddiagnostiske modaliteter, lunge billeddata 16, 17 af gnavere, herunder rotter og mus, har givet anledning til nogle af de første CFD simultioner af anatomisk-rekonstruerede acinære strømme i rekonstruerede alveoler. Trods sådanne lovende fremskridt, er disse nyere undersøgelser stadig begrænset til adressering luftstrøm fænomener i terminal alveolære sække kun 18, 19 eller et par alveoler omkring en enkelt kanal 20. Som et resultat, forbliver state-of-the-art undersøgelser af respiratoriske strømningsfænomener i acinus domineret af undersøgelser, der fokuserer på generiske anatomisk-inspirerede geometrier af acinære miljø 2.
På den eksperimentelle side har forskellige opsætninger byder en luftvej med en eller flere alveoler blevet udviklet over årene 21-24. Men der findes ingen eksperimentelle modeller for bifurcating alveolated luftveje, som er i stand til at efterligne fysiologiske respiration ved at udvide og ordregivende i en vejrtrækning-lignende måde. Givet en mangel på attraktive eksperimentelle platforme ved hånden, studiet af acinære transport fænomener fortsat begrænset med hensyn til validaTing beregningsmæssige undersøgelser og kritisk, er der stadig en mangel på eksperimentelle data til rådighed. . I de seneste år, Ma et al (2009) har konstrueret en opskaleret stiv væg model af et acinus bestående af tre acinære generationer; imidlertid manglen på væggenes bevægelse i denne model begrænset sin evne til at indfange realistiske alveolære strømningsmønstre under vejrtrækning betingelser.
Andre skaleret op forsøg, herunder en bevægende væg model baseret på anatomiske data fra cast replika blev for nylig introduceret 25; men da modellen kun fangede de to sidste acinære generationer (dvs.., terminal SAC), det mislykkedes at fange de komplekse recirkulerende strømme, der kendetegner mere proksimale acinære generationer. Disse sidstnævnte eksempler på skaleret op eksperimenter yderligere understrege de igangværende begrænsninger med sådanne tilgange. Specifikt har ingen eksisterende eksperiment hidtil demonstreret hypotese overgang fra recirkulerende til radial strømmer langsden acinus og derved bekræfte numeriske forudsigelser af flow topologier hypotese at eksistere i reelle pulmonale acinare træer 7, 15. Måske mest kritisk, er skaleret op eksperimenter yderst begrænset undersøge inhaleret partikel transport og deposition dynamik 26 på grund af vanskeligheder i at matche alle relevante ikke dimensionale parametre (f.eks., partikel diffusion, en kritisk mekanisme for sub-micron partikler transport, er helt overset).
Med igangværende eksperimentelle udfordringer, nye eksperimentelle platforme, der tillader undersøgelser af respiratorisk luftstrømme og partikel dynamik i komplekse bevægelige vægge søges acinære netværk. Her er en anatomisk inspireret in vitro acinære model indført. Denne mikrofluide platform efterligner pulmonal acinære flyder direkte på repræsentative acinære skala, og udvider den voksende vifte af pulmonale mikrofluide modeller 27, herunder bronkial flydende plug-flows 28-30 og alveolær-kapillære barriere 31.
Nemlig den foreliggende design har en forenklet fem generation alveolated luftvej træ med cyklisk ekspanderende og kontraherende vægge, hvor cykliske bevægelser opnås ved styring tryk inde i et vandkammer, som omgiver de tynde PDMS sidevægge, og hvor topvæggen deformeres ved et yderligere vand kammer sidder direkte over acinære struktur. I modsætning fælles flerlags mikrofluidenheder, er dette kammer simpelthen dannet ved indlejring den del af en sprøjte inde i PDMS Device tønde, og kræver ikke fremstilling af en yderligere PDMS støbeform.
Den miniaturiserede tilgang præsenteres her giver en enkel og alsidige middel til at gengive komplicerede acinære strukturer med bevægelige vægge i forhold til skaleret-up modeller, mens fanger de underliggende karakteristika acinære flow miljø. Denne platform kan anvendes til flow visualisering ved hjælp fluid-suspenderede partikler inde i luftvejene (se Repræsentative resultater nedenfor). I den nærmeste fremtid, vil modellen blive anvendt med luftbårne partikler for at studere inhalerede acinar partikel dynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Master Fabrication
- Brug dyb reaktiv ion ætsning (DRIE) af en silicium på isolator (SOI) wafer at fremstille en master silicium wafer, som beskrevet i tidligere værker 32, 33.
BEMÆRK: DRIE foretrækkes at standard SU-8 mikrodrejnng grund højdimensionsforhold funktioner (40 um brede og 90 um dybe grave).
2. Støbning og Forsegling af den mikrofluidapparatet
- Bland PDMS og hærder ved et 10: 1 vægtforhold inde i en ren lille beholder, såsom en plast vejer skålen.
- Afgasses blandingen i en ekssikkator under vakuum, indtil alle luftbobler er fjernet.
BEMÆRK: Forbered nok PDMS for alle efterfølgende trin. Her nedenfor, forkortelsen "PDMS" henviser altid til de afgassede 10: 1 PDMS: kurere-agent blanding, der blev udarbejdet i trin 2.1 og 2.2. - Hæld den afgassede-blandingen til en højde på ca. 1 mm over master wafer. Degas igen i mindst40 minutter til fjernelse af alle luftbobler over skiven og minimere boblerne under skiven.
BEMÆRK: Sørg for, at skiven er så tæt som muligt på bunden af pladen. Hvis det er nødvendigt at trykke på wafer forsigtigt til bunden med 2 omrøring sticks og afgasse igen. - Bages ved 65 ° C i 20 minutter i en naturlig konvektion ovn.
BEMÆRK: Efter 20 minutter PDMS er hærdet og næsten fuldt hærdet. Mens en længere bagetid er muligt bagning i 20 min sparer tid og forbedrer vedhæftningen af det andet PDMS lag (se nedenfor) til den første. - Fil afsnittet tønde en plastik 2 ml sprøjte med en fin sandkorn sandpapir til at forbedre overholdelse PDMS. Desuden bruger sand papir til at flade bunden af sprøjtekammeret ved at placere sand papir på en plan overflade og skubbe bunden af sprøjtecylinderen på toppen af det. Rengør sprøjten bruges trykluft.
- Placer sektion af sprøjtecylinderen oven på det første PDMS lag med laRGE åbning vender mod overfladen af PDMS, og hæld et andet lag af PDMS oven på den første til en højde på ~ 5 mm, og afgasses PDMS igen i en ekssikkator.
BEMÆRK: Den anden PDMS lag skal hældes fra den lille beholder omkring tønden, og bør ikke træde i det. - Bag hele opsætningen ved 65 ° C i mindst 2 timer i en naturlig konvektion ovn.
BEMÆRK: Der er ingen grund til at holde cylinderen på plads under hærdeprocesserne da vægten af PDMS presser mod bred base af cylinderen holder cylinderen fast på plads. - Skær gennem PDMS skimmel omkring mønstrede region af master wafer ved hjælp af en skalpel. Mens skæring, bør skalpellen svagt berøre overfladen af skiven. Indsæt derefter forsigtigt en tynd værktøj som wafer pincet i hak skabt af skalpel, og skrælle PDMS afgivne fra master wafer.
- Placer støbt på en blød overflade er dækket med aluminiumsfolie med mønstrede sideopad (dvs.., for cylinderen hænge fra kanten af tabellen), og punch et hul i PDMS ved kammerets indløb og kanal indløb anvendelse af en 1 mm biopsi punch.
- Coat en ren glasplade med en (afgasset) 10: 1 PDMS: hærdning-agent ved anvendelse af en spin-coater programmeret ved 3000 rpm i 30 sek, og bages i> 1 time ved 65 ° C. Derefter rense dias og PDMS støbt ved hjælp af klar tape.
- Behandl overfladen af PDMS mug og PDMS belagt objektglas med O 2 plasma (f.eks ved hjælp af en håndholdt koronabehandler) i 1 min, og tryk derefter forsigtigt overfladerne sammen og bages ved 65 ° C natten over (O / N) .
3. Device Påfyldning og Aktivering
- Bland vand suspenderede fluorescerende polystyrenpartikler med vand og glycerol i en glasbeholder til opnåelse af en 64/36 (v / v) glycerol / vand-blanding med 0,25% (vægt / vægt) partikler ..
- Placer en dråbe af glycerolopløsning på toppen af kanalen indløb og en dråbe DI watis på kammeret indløb, og derefter placere apparatet i en ekssikkator og vakuum til ~ 5 min.
BEMÆRK: Før frigive vakuum vente boblerne, der danner i dråber af glycerol-opløsning og DI vand til pop. Ved vakuum frigivelse væskerne suges ind i hulrummene inde i enheden. Hvis tilbageværende luft forbliver inden kanalerne, fjerne det ved at påføre ydre tryk på væsker (f.eks. Ved hjælp af en sprøjte) og tillader luft at diffundere ind i PDMS. - Injicer ~ 2 ml DI-vand ind i toppen kammer (dvs. sprøjtecylinderen, fig. 2b), indtil den er helt fyldt med vand. Så dækker det øverste kammer med en 19 gauge stump sprøjte tip, klippe spidsen af en anden stump 19 gauge sprøjte tip og indsæt dette tip til siden kammer indløb. Tilslut begge sprøjte tips til en 1 ml sprøjte via tynde Teflon slange og en T-formet konnektor.
BEMÆRK: Sørg for, at en ml sprøjte, Teflon slange, T-formet stik og øverste kammer (2 ml sprøjte barrel) er alle fyldt med vand uden bobler. Dette kan opnås ved at åbne forbindelsespunkter, skubber vandet gennem tomme sektioner af rør eller tilkobling af forbindelsespunkter. - Tilslut 1 ml sprøjte til en sprøjtepumpe forprogrammeret til at efterligne fx en rolig respirationsåndedræt cyklus (med en periode på T = 4 sek) konstrueret af lineære ramper, dvs, fra nul til 1,8 ml / min i 1 sek, fra 1,8 ml / min til -1,8 ml / min i 2 sek og fra -1.8 ml / min tilbage til nul i 1 sek.
4. Flowvisualisering Eksperimenter: Micro-partikel billede Velocimetri (μPIV)
- Mens enheden aktiveres, opnå en række 9 - 12 faselåste, dobbelt-frame billeder af partiklen-seedede strømning under anvendelse af en mikro-partikel billede Velocimetry (μPIV) system bestående for eksempel af en dual frame-multieksponering CCD kamera (f.eks., at 1.600 × 1.200 pixels opnå tilstrækkelig opløsning), en dobbelt pulserende Nd-YAG-laser (bølgelængde: 532 nm, output energi: 400 mJ, puls varighed: 4 nanosekunder), og et omvendt mikroskop.
BEMÆRK: Et sådant system er i stand til at opnå ramme par med en tidsforskydning på ned til nogle få mikrosekunder mellem den første og anden rammer. For at opnå fase-låst dobbelt frame billeder, er det nyttigt at erhverve en dobbelt ramme serie på f.eks., 10 Hz (frame par er adskilt med 0,1 sek fra hinanden). Derefter kan dataene omlægges, således at alle frame par, der er adskilt af en fuld cyklus tid (her T = 4 sek) danne en ny tidsserie. Billede erhvervelse bør gentages flere gange, mens modificere forsinkelse tid mellem den første og anden rammer i hver ramme par (dvs.., 100 mikrosekunder til 0,1 sek) for at løse forskellige flow regioner inde i alveolære hulrum.
Bemærk: alternative opsætninger med hensyn til bedste kombinationer af Image Acquisition systemer (. Dvs, kamera) og belysning kilder (dvs. lasere) til billedet, såsomMikrostrømninger er også tilgængelige 34, 35. - Brug en sum-of-korrelation algoritme til at beregne faselåste hastighedsvektoren kort over det resulterende flow felt fra billedserien for hver tidsforsinkelse anvendes. Gentag denne proces flere gange med varierende ventetider mellem den første og den anden ramme i hver ramme par til løsning forskellige strømningshastigheder regioner inde i alveolære hulrum. Brug derefter en dataanalyse program til at sy sammen de individuelle flow maps i en komplet og høj detaljeret kort over strømningsmønstre som gennemsnittet overlappende datapunkter 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Computer-aided design (CAD) og mikroskop billeder af in vitro acinar platform er vist i fig. En. Det biomimetisk acinære model har fem generationer af forgrening rektangulære kanaler foret med alveolære-lignende cylindriske hulrum (fig. 1). Her bliver modelgenerationer nummereret fra generation 1 (den mest proximale generation) til generation 5 (for det mest distale generation). Bemærk, at kun den kanal indløb fører til generation 1 er åben til det ydre miljø ved hjælp af en åbning i PDMS. De 16 udmunder væk fra generation 5 efterlades lukket for luft (fig. 1a). Ved at modulere jævne vandtrykket inden kamrene, er de tynde mure, der udgør alveolære hulrum og kanaler cyklisk deformeret. Samtidig er loftet af luftvejene deformeres lodret ved hjælp af en ekstra vandkammer placeret over kanalerne; at skabe denne øverste kammer i enenkel måde uden forberedelse af et yderligere mikrofluid lag cylinderen af en sprøjte blev nedsænket inde i PDMS før tværbinding. Dette resulterede i en PDMS lag på ca. 1 mm adskiller de alveolated kanaler og den øverste vandkammerdel (se fig. 2).
Vandet kamre er forbundet med en sprøjtepumpe programmeret til at gentage en række lineært boostes strømningshastigheder for at efterligne en normal til kraftig respirationsåndedræt scenario med en gennemsnitlig voksen person med en 4 sek cyklustid (T). Dette resulterer i en periodisk reduktion og forøgelse af luftvejene volumen; da udløbene er forseglet og kun indløbet er åben til omgivelserne, er fluidet inde i kanalerne inhaleres og udåndet fra apparatet gennem indløbet, i analogi med en naturlig vejrtrækning proces. Her blev de luftvejs kanaler fyldt med en glycerolopløsning podet med fluorescerende partikler (se Protocol) og mikro partikel billede Velocimetry (μPIV) blev anvendt til at kortlægge resulti ng flow felter på tværs af luftvejene træet 33.
Den normaliserede hastighed størrelsesorden (u x / u x, max) i streamwise (dvs.., Aksialt) er retningen på tværs af bredden af kanalerne er vist i fig. 3. Resultaterne er vist på peak indånding hastighed for hver af de 5 enheder generationer, og repræsenterer 2D projektion af strømmen i en tynd plade nær kanalen midterplan. Til sammenligning er den analytiske opløsning af steady-state laminar strømning for en uendelig lang kanal 36 også vist i fig. 3.
Figur 4 viser strømline mønstre og hastighed størrelser inden alveolære hulrum ved midplane i luftvejene på peak indånding. 4a, b og c viser acinære generationer 1, 3 og 5, henholdsvis.
gur 1 "src =" / files / ftp_upload / 53588 / 53588fig1.jpg "/>
Figur 1: Mikrofluid Model af Acinar Tree Network (a) CAD-tegning af den fulde enhed.. (B) Close-up snapshots af acinar træstruktur viser kanalerne, kamrene, og de tynde vægge adskiller dem. Lilla pile angiver de tilsvarende steder og positive y -directions af strømningen profiler vist i fig. Tre. Tilpasset med tilladelse fra ref. 33.
Figur 2:. CAD design af den mikrofluidanordning (a) Stiplede linjer angiver de rør, der fører fra de laterale og øverste kamre til sprøjtepumpen via et T-formet konnektor. (B) side skære gennem midten af indretningen, der illustrerer placeringen af sprøjten i PDMS cast. ENdapted med tilladelse fra ref. 33.
Figur 3: Acinære strømningshastigheder Normaliserede duktal hastighedsprofiler (u x / u x, max) ekstraheret fra PIV langs bredden af kanalen i generationer 1 til 5 på de steder, der er illustreret i fig.. 1, y = 0 falder sammen med midtpunktet placering på tværs af kanalen og u x, max = 0,0104 m / sek svarer her til toppen streamwise hastighed målt i enheden generation 1. PIV målinger vises her på peak indånding (t = 0,6 sek) og den sorte linie svarer til den analytiske hastighedsprofil for krybende strømning inde i en rektangulær kanal med W d = 345 um og <em> h = 92 um. Tilpasset med tilladelse fra ref. 33.
Figur 4: Velocity størrelser og Tilsvarende Streamline Patterns. Data er opnået fra mikro-PIV for et fremspring af strømmen udtaget ved midterplanet af en alveole placeret på enheden generationer 1, 3 og 5. Flow felter er vist ved ca. peak inhalation (t = 0,6 sek). Velocity størrelser er vist på en logaritmisk skala. Tilpasset med tilladelse fra ref. 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk træk ved den mikrofluid acinære platform præsenteret her er dens evne til at reproducere fysiologisk realistiske vejrtrækning bevægelser, der giver anledning til fysiologiske flowprofiler og hastigheder inden acinære kanaler og inden alveolerne. Da mikrofluidkanaler fremstilles med en relativt lav aspektratio (dvs.., W d / h ≈ 3,9, hvor w d er kanalen bredde og h er kanalen højde), de målte strømme vise flere proplignende strømningskarakteristika sammenlignet med de forventede parabolske flow profiler, der ville eksistere i cirkulære kanaler. Alligevel de målte hastigheder er godt inden for det fysiologiske område; det konstateres, at den karakteristiske dimensionsløse Reynolds tal, sammenligner inerti til viskose kræfter, giver maksimalt ca. 0,01, svarende til midten til distale acinære regioner, efter semi-empiriske estimater 2.
indhold "> Her er Reynolds tal defineres som Re = U x, max D h / ν glycerolopløsning, hvor U x, max er den gennemsnitlige streamwise hastighed på tværs af kanalen midterplan i det øjeblik af maksimal strømningshastighed, D h er hydrauliske diameter af kanalen og ν glycerolopløsning er den kinematiske viskositet af glycerolopløsning anvendes til Flowvisualisering som blev matchet til den kinematiske viskositet af luft ved ~ 24 ° C (ν luft = 1,55 × 10 -5 m 2 / sek, ν glycerolopløsning = 1,51 × 10 -5 m 2 / sek). Derudover er en nedgang i strømning størrelsesorden med omkring en faktor to observeres efter hver bifurkation som forventet frade dikotome forgrenede mønstre af acinar model. Nemlig denne kaskade af strømningshastigheder er et vigtigt træk af acinære strømmer i luftvejs træer.Flow profiler i nærheden og inden alveolære hulrum (fig. 4) viser, at duktale hastigheder er gradvist faldende i retning af dybere acinære generationer. Desuden flow størrelser falde stejlt langs åbningen af alveoler resulterer i strømningshastigheder, der er to til tre størrelsesordener langsommere inde alveoler forhold til kanalerne; sådanne flow topologier blev tidligere rapporteret i flere numeriske undersøgelser 1, 9, 15 Desuden flow ændrer sig betydeligt fra den ene acinar generation til en anden, som forudsagt i simuleringer 7, 15:., mens generation 1 er udstyret med en recirkulation zone, som omtrent falder sammen med den midten af alveolen (fig. 4, venstre), generation 3 er kendetegnet ved en recirkuleringszone som forskydes mod den proximale side afbicelle med en mere åben strømline mønster (fig. 4, midten). Endelig er radiale strømlinier uden recirkulation zone observeret i enhedens generation 5 (fig. 4, højre). Så vidt forfatternes viden, det er første gang, at eksistensen af en bred vifte af alveolære strømningsmønstre opfanges eksperimentelt.
Succesen med den præsenterede metode afhænger et par kritiske trin i mikrofabrikation protokollen. Først for at undgå de tynde PDMS vægge fra rive efter frigivelse fra master wafer den ætsede mønster på overfladen af skiven bør have lige vægge og må ikke klæbe til de hærdede PDMS. Derfor anbefales stærkt at producere de vafler hjælp DRIE af en SOI wafer, som beskrevet i Fishler et al. (2013). Sådan en master wafer er holdbar og let kan belægges med et anti-klæbende lag ved enten silanizing overfladen som beskrevet i Fishler et al. (2013), eller ved at sikre that det sidste trin i DRIE proces er, at med passivering med CF 4. Et andet afgørende skridt er arkivering (trin 2.5) og indlejring (trin 2.6) sprøjtecylinderen at skabe den øverste kammer. Luftbobler fanget mellem sprøjten base og det første PDMS lag kan reducere integritet og holdbarhed af den fremstillede enhed. At forhindre dannelse af luftbobler, er det kritisk, at bunden af sprøjtekammeret er flad og ensartet indgivet.
Mens den nuværende udformning tillader fremstilling af en to-lags-enheden ved brug en master wafer, kan en modificeret fremgangsmåde, omfatter en yderligere PDMS lag indeholdende en cirkulær fordybning til dannelse af det øverste kammer. For denne anden PDMS lag et yderligere mester wafer med en cirkulær kant kan fremstilles ved anvendelse af standard SU-8 fotolitografi. En yderligere modifikation af protokollen kan indbefatte en anden fremgangsmåde til PDMS bonding, der ikke kræver en koronabehandler. At klæbe PDMS formen til glassetslide, første belægning objektglasset som beskrevet i trin 2.10 protokollens men bruger en 5: 1 i stedet for en 10: 1 PDMS: hærdning-agent vægtforhold. Bage det coatede glas i 15 minutter ved 65 ° C i en naturlig konvektion ovn, tryk på PDMS formen til PDMS coatede glas, og bages natten over ved 65 ° C i en naturlig konvektion ovn.
I anledning af væske siver fra limning overflade mellem PDMS mug og glas kan der træffes følgende foranstaltninger: (1) sørge for, at koronabehandleren producerer elektriske gnister under behandlingen, hvis ikke, øge udgangsspændingen, (2) forlænge behandling tid med koronabehandler og (3) Brug alternativ metode til limning af PDMS mug på glasset (se ovenfor). Ofte vand kan lække gennem forbindelsen af den tynde teflonrør til kammerindløbet. For at omgå en sådan lækker, skal du sørge for, at 19-gauge stump sprøjte spids bruges til at forbinde Teflon slange til fjorden. Hvis vand utætheder mellem PDMS mug og the øverste kammer (2 ml sprøjtecylinderen) sørge for, at bunden af sprøjtecylinderen blev registreret korrekt (se trin 2.5 i protokollen), og at det andet lag af PDMS blev hældt høj nok (~ 5 mm over det første PDMS lag ).
Bemærk, at omfanget af væggen deformation er stærkt afhængig af PDMS mekaniske egenskaber. Små ændringer i proceduren for enhederne præparatet kan medføre betydelig variation af de målte hastigheder mellem forskellige enheder. For at sikre maksimal brug gentagelsesnøjagtighed konstante betingelser forberedelse (luftfugtighed, bagning gange osv.). Desuden kan finjustering af volumenændringen under enhedens aktivering opnås ved at visualisere den øverste overflade af kanalerne ved hjælp af fasekontrastmikroskopi og justere hastighed ramper af sprøjtepumpen, så den øverste overflade af kanalen er deformeret, så den ønskede afstand som målt ved z-bevægelse af mikroskopbordet.
En vigtig egrænsningertion af den nuværende teknik er, at de nøjagtige morfologiske karakteristika (f.eks anatomi, morfometri) af lungerne ikke kan reproduceres nøjagtigt. Den gør den plane udformning af acinære model ikke fange f.eks ud af plan acinare bifurkationer og forholdet mellem alveolære til duktalt volumen er meget lavere end målt in vivo værdier 37. Derudover forenklede mikrofluid geometri indfanger kun en lille del af en fuld acinus. På trods af disse begrænsninger, den nuværende model er i stand til at reproducere forventede strømningsmønstre og hastigheder direkte på de sande anatomiske længdeskalaer, og derfor repræsenterer en værdifuld test platform for acinære transport fænomener.
Afslutningsvis de fremhævede mikrofluide modeller af de pulmonale acinus viser meget lovende som en in vitro værktøj til kvantitative undersøgelser af respiratorisk acinære strømme efterligne vejrtrækning mønstre. Her, den simple acinært model består af fem generations af ekspanderende og kontraherende alveolated kanaler, således at reproducere nogle af de vigtige underliggende flydeegenskaber forventede at eksistere i acinære region af lungerne. Flow visualisering ved hjælp mikro-PIV, inden alveolære hulrum giver for første gang eksperimentelt bevis for vifte af komplekse recirkulerende og radiale alveolære strømme langs acinære træet. Denne mikrofluid tilgang muliggør fremstilling af komplekse acinare strukturer med bevægelige vægge efter en forholdsvis enkel procedure og tilbyder et attraktivt alternativ til skaleret op acinære modeller. Især med den største fordel ved at levere en model på en en-til-en skala, sande dynamik inhaleret acinære partikel kan undersøges uden yderligere behov for dynamisk lighedsmatching.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent | Dow Corning | (240)4019862 | Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit |
| Plastipak 2 ml syringe | BD | 300185 | |
| Norm-Ject Luer slip 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | |
| 1 mm Biopsy punch | Kai Medical | BP-10F | |
| Laboratory Corona Treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| PHD Ultra Syringe pump | Harvard apparatus | 703006 | |
| Dyed red rqueous fluorescent particles | Thermo-Scientific | Uncatalloged 0.86 µm beads were used | |
| Glycerin AR | Gadot | 830131320 | |
| FlowMaster MITAS micro-particle image velocimetry (µPIV) system | LaVision | 1108630 |
References
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z. Airflow and Particle Transport in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 301-334 (2010).
- Sznitman, J. Respiratory microflows in the pulmonary acinus. J. Biomech. 46 (2), 284-298 (2013).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Gas and aerosol mixing in the acinus. Respir. Physiol. Neurobiol. 163 (1-3), 139-149 (2008).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted Drug-Aerosol Delivery in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10 (1), 195-220 (2008).
- Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Schulz, H., Takenaka, S., Butler, J. P., Henry, F. S., Tsuda, A. Nanoparticle delivery in infant lungs. Proc. Natl. Acad. Sci. 109 (13), 5092-5097 (2012).
- Sznitman, J., Heimsch, F., Heimsch, T., Rusch, D., Rosgen, T. Three-Dimensional Convective Alveolar Flow Induced by Rhythmic Breathing Motion of the Pulmonary Acinus. J. Biomech. Eng. 129 (5), 658-665 (2007).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Chaotic mixing of alveolated duct flow in rhythmically expanding pulmonary acinus. J. Appl. Physiol. 79 (3), 1055-1063 (1995).
- Henry, F. S., Butler, J. P., Tsuda, A. Kinematically irreversible acinar flow: a departure from classical dispersive aerosol transport theories. J. Appl. Physiol. 92 (2), 835-845 (2002).
- Kumar, H., Tawhai, M. H., Hoffman, E. A., Lin, C. L. The effects of geometry on airflow in the acinar region of the human lung. J. Biomech. 42 (11), 1635-1642 (2009).
- Lee, D. Y., Lee, J. W. Characteristics of particle transport in an expanding or contracting alveolated tube. J. Aerosol Sci. 34 (9), 1193-1215 (2003).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. I. Diffusional deposition in the absence of gravity. J. Appl. Physiol. 76 (6), 2497-2509 (1994).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. II. Gravitational sedimentation and inertial impaction. J. Appl. Physiol. 76 (76), 2510-2516 (1994).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol bolus dispersion in acinar airways—influence of gravity and airway asymmetry. J. Appl. Physiol. 113 (3), 442-450 (2012).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol deposition characteristics in distal acinar airways under cyclic breathing conditions. J. Appl. Physiol. 110 (5), 1271-1282 (2011).
- Heimsch, J., Sznitman, T., Wildhaber, J. H., Tsuda, A., Rösgen, T. Respiratory Flow Phenomena and Gravitational Deposition in a Three-Dimensional Space-Filling Model of the Pulmonary Acinar Tree. J. Biomech. Eng. 131 (3), 031010 (2009).
- Litzlbauer, H. D., Korbel, K., Kline, T. L., Jorgensen, S. M., Eaker, D. R., Bohle, R. M., Ritman, E. L., Langheinrich, A. C. Synchrotron-Based Micro-CT Imaging of the Human Lung Acinus. Anat. Rec. Adv. Integr. Anat. Evol. Biol. 293 (9), 1607-1614 (2010).
- Tsuda, A., Filipovic, N., Haberthür, D., Dickie, R., Matsui, Y., Stampanoni, M., Schittny, J. C. Finite element 3D reconstruction of the pulmonary acinus imaged by synchrotron X-ray tomography. J. Appl. Physiol. 105 (3), 964-976 (2008).
- Berg, E. J., Weisman, J. L., Oldham, M. J., Robinson, R. J. Flow field analysis in a compliant acinus replica model using particle image velocimetry (PIV). J. Biomech. 43 (6), 1039-1047 (2010).
- Sznitman, J., Sutter, R., Altorfer, D., Stampanoni, M., Rösgen, T., Schittny, J. C. Visualization of respiratory flows from 3D reconstructed alveolar airspaces using X-ray tomographic microscopy. J. Vis. 13 (4), 337-345 (2010).
- Henry, F. S., Haber, S., Haberthür, D., Filipovic, N., Milasinovic, D., Schittny, J. C., Tsuda, A. The Simultaneous Role of an Alveolus as Flow Mixer and Flow Feeder for the Deposition of Inhaled Submicron Particles. J. Biomech. Eng. 134 (12), 121001 (2012).
- Chhabra, S., Prasad, A. K. Flow and Particle Dispersion in Lung Acini: Effect of Geometric and Dynamic Parameters During Synchronous Ventilation. J. Fluids Eng. 133 (7), 071001 (2011).
- Cinkotai, F. F. Fluid flow in a model alveolar sac. J. Appl. Physiol. 37 (2), 249-251 (1974).
- Karl, A., Henry, F. S., Tsuda, A. Low reynolds number viscous flow in an alveolated duct. J. Biomech. Eng. 126 (4), 420-429 (2004).
- Tippe, A., Tsuda, A. recirculating flow in an expanding alveolar model: experimental evidence of flow-induced mixing of aerosols in the pulmonary acinus. J. Aerosol Sci. 31 (8), 979-986 (2000).
- Berg, E. J., Robinson, R. J. Stereoscopic particle image velocimetry analysis of healthy and emphysemic alveolar sac models. J. Biomech. Eng. 133 (6), 061004 (2011).
- Ma, B., Ruwet, V., Corieri, P., Theunissen, R., Riethmuller, M., Darquenne, C. CFD simulation and experimental validation of fluid flow and particle transport in a model of alveolated airways. J. Aerosol Sci. 40 (5), 403-414 (2009).
- Kumar Mahto, S., Tenenbaum-Katan, J., Sznitman, J. Respiratory Physiology on a Chip. Scientifica. 2012, e364054 (2012).
- Huh, D., Fujioka, H., Tung, Y. C., Futai, N., Paine, R., Grotberg, J. B., Takayama, S. Acoustically detectable cellular-level lung injury induced by fluid mechanical stresses in microfluidic airway systems. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (48), 18886-18891 (2007).
- Song, Y., Baudoin, M., Manneville, P., Baroud, C. N. The air–liquid flow in a microfluidic airway tree. Med. Eng. Phys. 33 (7), 849-856 (2011).
- Tavana, H., Huh, D., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microfluidics, Lung Surfactant, and Respiratory Disorders. Lab Med. 40 (4), 203-209 (2009).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Pihl, J., Sinclair, J., Sahlin, E., Karlsson, M., Petterson, F., J, O. lofsson, Orwar, O. Microfluidic Gradient-Generating Device for Pharmacological Profiling. Anal. Chem. 77 (13), 3897-3903 (2005).
- Fishler, R., Mulligan, M. K., Sznitman, J. Acinus-on-a-chip: A microfluidic platform for pulmonary acinar flows. J. Biomech. 46 (16), 2817-2823 (2013).
- Lindken, R., Rossi, M., Grosse, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (microPIV): recent developments, applications, and guidelines. Lab. Chip. 9 (17), 2551-2567 (2009).
- Wereley, S. T., Meinhart, C. D. Recent Advances in Micro-Particle Image Velocimetry. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 557-576 (2010).
- Bruus, H. Theoretical Microfluidics. Oxford Master Series in Condensed Matter Physics. , (2008).
- Haefeli-Bleuer, B., Weibel, E. R. Morphometry of the human pulmonary acinus. Anat. Rec. 220 (4), 401-414 (1988).
