Abstract
כימות מאפייני תזרים נשימה במעמקי acinar ריאתי וכיצד הם משפיעים תחבורת אירוסול בשאיפה היא קריטית לקראת אופטימיזציה טכניקות שאיפת תרופה וכן לניבוי דפוסים בתצהיר של חלקיקים הנישאים באוויר רעיל בתוך alveoli ריאתי. כאן, שיטות-ליתוגרפיה רך משמשות לפברק מבנים דרך הנשימה acinar הדמוי מורכבים על אורך-הקשקשים אנטומיים האמת שמתרבים תופעות זרימת acinar פיסיולוגיות במערכת נגישה אופטי. המכשיר microfluidic כולל 5 דורות של מתפצל צינוריות כוורת עם הרחבת מעת לעת וקירות קבלנות. להפעלה ללא קיר מושגת על ידי לשנות את הלחץ בתוך תאים מלאי מים הסובבים חומות ערוץ acinar הדקות PDMS היא מן הצדדים וחלקו העליון של המכשיר. בניגוד מכשירי microfluidic multilayer משותפים, שבו הערמה של תבניות מספר PDMS נדרשה, שיטה פשוטה מוצגת לפברק העליוןקאמרי על ידי טבעת סעיף חבית מזרק לתוך תבנית PDMS. ההתקנה microfluidic הרומן הזה מספק תנועות נשימה פיזיולוגיות אשר בתורו להצמיח אוויר-תזרימי acinar מאפיין. במחקר הנוכחי, velocimetry תמונה החלקיקים מיקרו (μPIV) עם חלקיקי הנוזל מושעה שימש לכמת אוויר כזה תזרימי על פי התאמת דמיון הידרודינמית. ההסכם הטוב בין תוצאות μPIV ותופעות זרימת acinar צפויות מראה כי פלטפורמת microfluidic עשויה לשמש בעתיד הקרוב כמו אטרקטיביים כלי במבחנה לחקור תחבורת חלקיקי נציג מוטסת ישירות בתצהיר באזורי acinar של הריאות.
Introduction
כימותים מפורטים של דינמיקת זרימת נשימת דיסטלי, אזורי כוורת של הריאות הם בעל חשיבות עליונה להבנת ערבוב זרימת אוויר בתוך acinus ריאתי וחיזוי גורלם של אירוסולים בשאיפת 1-3 דרכי הנשימה העמוקה. ההיבט השני הזה הוא מדאיג במיוחד כאשר פונים מצד אחד המפגעים של חלקיקים מזהמים בשאיפה או לחילופין בחיפוש אסטרטגיות חדשניות משלוח סמי שיפור הממוקד של תרופות בשאיפה לאתרי ריאות מקומיות 4, 5, כמו גם עבור משלוח מערכתי.
נכון להיום, תזרים נשימה באזורי acinar העמוקים ריאתי נחקר בדרך כלל סיליקון באמצעות דינמיקה של נוזלים חישובית (CFD) או לחלופין במבחנה עם דגמים ניסיוניים מדורגים ומעקב אחר התאמת דמיון הידרודינמית. בעשורים האחרונים, שיטות CFD יושמו ויותר ללמוד תופעות זרימת acinar, מן Singlדואר מודלים המכתשית 6, 7 ו כוורת צינוריות 8-12 ליותר משוכללים במודלי סיליקון הלוכדים אנטומית מציאותי מבני עץ acinar עם מספר דורות של צינוריות כוורת ועד כמה מאה alveoli פרט 13-15.
יחד, מאמצים מספריים היו מרכזיים ושופך אור על התפקיד ומידת ההשפעה של תנועת קיר במהלך נשימת תנועות על שהתפתח דפוסי זרימת אוויר acinar. בהעדר תנועת נשימה, הסירקולציה מחודשת תכונת alveoli סטטי זורמת בתוך החללים שלהם כי התערוכה לא חליפי הסעה של אוויר בין צינור acinar ואת נֹאדִית 6, 7; במילות אחרות, יהיה מבודד תזרים המכתשית טהרת תזרים בתוך עצי acinar וחילופי האוויר יגרמו שיהיו שונים מזה של מנגנונים מתרחבים. עם קיומה של רחבות המחזורית של תחום המכתשית, לעומת זאת, טופולוגיות זרימת המכתשית הם שונים באופן דרסטי ואת resulting תבניות זרימה בתוך alveoli קשורות באופן הדוק למיקום של נֹאדִית לאורך עץ acinar (למשל., הפרוקסימלי לעומת דורות הדיסטלית).
בפרט, זה כבר שער בסימולציות כי תבניות זרימה המכתשית מושפעות במידה רבה על ידי היחס בין מכתשים כדי ductal ספיקות כאלה שדורות הפרוקסימלי של עץ acinar ריאתי, שבו יחס זה הוא גדול יחסית באי שימור מסה על פני מבנה עץ, תכונה הסירקולציה מחודשת מורכבת זורמת בתוך החללים המכתשית עם pathlines נוזל בלתי הפיך. עם כל דור acinar עמוק, היחס בין מכתשים כדי ספיקות ductal הולך ופוחת כזה שדורות acinar דיסטלי להפגין יותר רדיאלי דמוי מייעלים שמזכירים inflations ו deflations פשוט של בלון. עם התקדמות שיטות הדמיה מודרניות, נתוני הדמית ריאות 16, 17 של מכרסמים, כולל חולדה ועכבר, עוררו חלק מכשירי כושר CFD הראשוןations תזרים acinar אנטומית-משוחזר alveoli המשוחזר. למרות התקדמות מבטיחה כזה, המחקרים האחרונים אלה עדיין מוגבלים לטיפול תופעות זרימת אוויר בתוך צקי המכתשית מסוף רק 18, 19 או כמה alveoli סביב צינור יחיד 20. כתוצאה מכך, המדינה- of-the-art חקירות של תופעות זרימה נשימתיות של acinus להישאר בשליטתה של מחקרים התמקדות הגיאומטריות בהשראת אנטומית הגנרית של הסביבה acinar 2.
בצד הניסיון, setups השונה שמציע דרכי נשימה עם alveoli אחד או כמה פותח במשך שנתי 21-24. עם זאת, אין בנמצא דגמים ניסיוניים של מתפצל איירווייז כוורת המסוגלים מחקו נשימה פיזיולוגית ידי ההרחבה מתקשרת באופן נשימה דמוית. בהינתן חוסר פלטפורמות ניסיוני אטרקטיביים בהישג היד, חקר תופעות מעבר acinar נותר מוגבל לגבי validaטינג מחקרים חישובית ובביקורתיות נותר מחסור של נתוני הניסוי זמין. . בשנים האחרונות, מא ואח '(2009) יש לבנות מודל שעבר גדלה, נוקשה-קיר של acinus המורכב משלושה דורות acinar; עם זאת, חוסר תנועת קיר במודל זה מוגבל ביכולת שלו כדי ללכוד תבניות זרימה המכתשית מציאותיות בתנאי נשימה.
ניסויים שעברו גדלה, אחרים כוללים דגם קיר נע המבוסס על נתונים אנטומיים מן ההעתק יצוק הוכנסו לאחרונה 25; עם זאת, מאז המודל היחיד שנתפס הדורות שני acinar האחרון (כלומר., שקי מסוף), היא לא הצליחה ללכוד את תזרימי הסירקולציה המחודשת מורכבות המאפיינות דורות acinar הפרוקסימלי יותר. דוגמאות אלה אחרונים של ניסויים בקנה מידה-אפ נוספת להדגיש את המגבלות המתמשכות עם גישות כאלה. באופן ספציפי, לא ניסוי קיים עד כה הדגים את מעבר שיערותיו מן הסירקולציה מחודשת כדי רדיאלי תזרים יחדacinus ובכך לאשר תחזיות מספריות של טופולוגיות זרימת שיערותיו להתקיים עצי acinar ריאתי אמיתיים 7, 15. אולי הכי קריטי, ניסויים שעברו גדלה, מוגבלים מאוד בחקירה בשאיפת דינמיקת תחבורה בתצהיר חלקיקי 26 בשל קשיים בהתאמה כל הלא הרלוונטיים פרמטרי ממדים (למשל., דיפוזיה של חלקיקים, מנגנון תחבורה קריטי עבור חלקיקים תת-מיקרון, מוזנחת לחלוטין).
עם אתגרים הניסיונות מתמשכים, פלטפורמות ניסיוני חדשות המתירות חקירות של נשימת תזרימי אוויר חלקיקי דינמיקה בקירות מרגשים מורכבי רשתות acinar הם בקשו. הנה, בהשראת אנטומית במודל acinar במבחנה הוא הציג. מחק פלטפורמת microfluidic זה acinar ריאתי זורם ישירות בקנה מידת acinar הנציג, ומרחיב את המגוון הולך וגדל של דגמי microfluidic ריאתי 27, כוללים-פלה תקע נוזלי סימפונותWS 28-30 ואת מחסום-נימי המכתשית 31.
כלומר, העיצוב הנוכחי כולל עץ דרכי נשימת כוורת פשוטה חמישה דור עם הרחבת מחזור והתקשרות קירות, שבו תנועות מחזוריות מושגות על ידי לחץ שליטה בתוך חדר מים המקיף את הקירות הדק PDMS לרוחב והיכן הקיר העליון מעווה על ידי מים נוספים תא יושב ישירות מעל מבנה acinar. שלא כמו במכשירים microfluidic multilayer משותפים, תא זה נוצר פשוט על ידי טבעת סעיף חבית מזרק בתוך מכשיר PDMS, ואינו דורש הכנה של עובש PDMS נוסף.
גישת מיניאטורי שהוצגה כאן מציעה באמצעים פשוטים צדדיים לשחזור מבני acinar מסובכים עם הזזת קירות לעומת דגמים שעברו גדלה, בעת לכידה את תכונות יסוד של סביבת זרימת acinar. פלטפורמה זו יכולה לשמש עבור פלוw להדמיה באמצעות חלקיקים-מושעה נוזל בתוך דרכי הנשימה (ראה תוצאות נציג להלן). בעתיד הקרוב, המודל ישמש עם חלקיקים הנישאים באוויר ללימוד דינמיקת חלקיקי acinar בשאיפה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ייצור מאסטר 1.
- השתמש תחריט יון תגובתי עמוק (DRIE) של סיליקון על מבודד רקיק (SOI) לפברק פרוסות סיליקון מאסטר כמתואר עבודות לשעבר 32, 33.
הערה: DRIE הוא העדיף micromachining SU-8 תקן בשל היבט הגבוה תכונות היחס (40 מיקרומטר הרחב ו 90 מיקרומטר תעלות עמוקות).
יציקת איטום 2. של מכשיר microfluidic
- מערבבי PDMS וסוכן ריפוי בכל 10: 1 יחס משקל בתוך מכולה נקיה קטנה כזה כמנה במשקל פלסטיק.
- דג את התערובת בתוך תא ייבוש תחת ואקום עד שכל בועות האוויר יוסרו.
הערה: הכינו מספיק PDMS את כל הצעדים הבאים. כאן למטה, ראשי התיבות "PDMS" מתייחס תמיד אל 10 degassed: 1 PDMS: תערובת סוכן ריפוי שהוכן צעדי 2.1 ו -2.2. - יוצקים את התערובת-degassed עד לגובה של כ 1 מ"מ מעל פרוסות מאסטר. דגה שוב לפחות40 דקות כדי להסיר את כל בועות האוויר מעל הפרוסות ולמזער את הבועות מתחת הרקיק.
הערה: ודא כי רקיק הוא קרוב ככל האפשר אל תחתית הצלחת. אם העיתונות צורך רקיק בעדינות לתחתית באמצעות 2 בחישה מקלות דגה שוב. - אופים בחום של 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בתנור הסעה טבעית.
הערה: אחרי 20 דקות את PDMS הוא התקשה וכמעט לחלוטין נרפא. בעוד זמן אפייה ארוכה יותר היא אפייה אפשרית עבור 20 דקות חוסכות זמן ומשפרות את הדבקות של שכבת PDMS השנייה (ראה להלן) הראשון. - קובץ החבית קטע מזרק פלסטיק 2 מ"ל להשתמש בנייר חול חצץ דק לשפר דבקות PDMS. בנוסף, השתמש בנייר חול לשטח את הבסיס של חבית מזרק על ידי הנחת נייר חול על משטח שטוח ומחליקים בבסיס חבית מזרק על גבי זה. נקה את המזרק באמצעות אוויר דחוס.
- מניח את החבית קטעה את המזרק על גבי שכבת PDMS הראשונה עם large הפתיחה מול פני השטח של PDMS, ויוצקים שכבה שנייה של PDMS על גבי הראשון עד לגובה של ~ 5 מ"מ, ודגה את PDMS שוב ייבוש.
הערה: שכבת PDMS השנייה צריכה להיות שפך מן המכל הקטן מסביב לחבית, ולא צריך להיכנס בתוכו. - אופים את ההתקנה כולה על 65 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות בתנור הסעה טבעית.
הערה: אין צורך להחזיק את הקנה במקום במהלך תהליכי הריפוי מאז המשקל של PDMS שלחץ את הבסיס הרחב של החבית מחזיק בחבית במקומו. - חותכים דרך עובש PDMS רחבי האזור בדוגמת של פרוסות סיליקון מאסטר באמצעות אזמל. בעוד חיתוך, אזמל צריך לגעת במשטח בחולשה של פרוסות סיליקון. לאחר מכן, הכנס בעדינות כלי רזה כגון מלקחי רקיק החריץ שנוצר על ידי האזמל, לקלף את PDMS שנוצק רקיק האמן.
- מניחים את הגבס על משטח רך מכוסה בנייר אלומיניום עם הצד בדוגמתפונה כלפי מעלה (כלומר., הקנה צריך לתלות מקצה השולחן), ולהכות את חור PDMS על כניסת כניסת ערוץ קאמרית באמצעות אגרוף ביופסיה 1 מ"מ.
- מעיל זכוכית שקופית נקי עם (degassed) 10: 1 PDMS: תערובת סוכן ריפוי באמצעות coater ספין מתוכנת בסל"ד 3000 למשך 30 שניות, ואופים> שעה 1 ב 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לנקות את השקופית PDMS יצוק באמצעות קלטת ברורה.
- פנקו את פני השטח של שקופיות זכוכית מצופה עובש PDMS PDMS עם פלזמה O 2 (למשל, באמצעות treater קורונה כף יד) 1 דקות, ולאחר מכן לחץ בעדינות על משטחים יחד ואופים ב 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה (O / N) .
מילוי Device 3. Actuation
- מערבבים מושעה מים חלקיקי פוליסטירן פלורסנט במים גליצרול בבקבוקון זכוכית כדי לקבל תערובת 64/36 (v / v) גליצרול / מים עם 0.25% (w / w) חלקיקים ..
- מניחים ירידה של הפתרון גליצרול על גבי כניסת ערוץ וירידה של DI וואטאה על צינור הכניסה לתא, ואז למקם את המנגנון בתוך תא ייבוש ואקום עבור ~ 5 דקות.
הערה: לפני שחרור ואקום לחכות הבועות כי הטופס טיפות של תמיסת גליצרול ומים DI פופ. עם ואקום שחרור הנוזלים נשאבים לתוך החללים בתוך המכשיר. אם אוויר שיורית נשאר בתוך הערוצים, לחסל אותו על ידי הפעלת לחץ חיצוני על הנוזלים (למשל., באמצעות מזרק) ומאפשר באוויר כדי לפזר את PDMS. - להזריק ~ 2 מיליליטר מי DI לתוך התא העליון (כלומר, את קנה המזרק, איור. 2b) עד שהוא מתמלא באופן מלא עם מים. ואז לכסות את התא העליון עם קצה מזרק 19 מד בוטה, לחתוך את הקצה עוד טיפ 19 מד מזרק בוטה וכנס הטיפ הזה אל צינור הכניסה לתא בצד. חבר את שני טיפים מזרק מזרק 1 מ"ל דרך צינורות טפלון דק מחבר בצורת האות T.
הערה: ודא כי מזרק 1 מ"ל, צינורות טפלון, מחבר בצורת T קאמרית העליון (Barr מזרק 2 מ"לאל) הם כל מלא מים ללא בועות. זה עשוי להיות מושגת על ידי פתיחת נקודות חיבור, דוחפים מים דרך חלקים ריקים של צינורות וחיבור מחדש עם נקודות חיבור. - חבר את מזרק 1 מ"ל ל משאבת מזרק מראש מתוכנת לחקות למשל מחזור הנשימה גאות שקט (עם תקופה של T = 4 שניות) בנוי רמפות ליניארי, כלומר, מאפס עד 1.8 מ"ל / דקה ב 1 שניות, מ 1.8 מ"ל / דקה כדי -1.8 מ"ל / דקה ב 2 שניות ו מ -1.8 מ"ל / דקה חזרה לאפס ב 1 שניות.
4. ניסויים ויזואליזציה זרימה: velocimetry תמונה מיקרו-חלקיקים (μPIV)
- כאשר המכשיר נמצא ומונעת, להשיג סדרה של 9 - 12 שלב נעול, כפל תמונה מסגרת של זרימת החלקיקים זרע באמצעות velocimetry תמונה מיקרו-חלקיקים (μPIV) מערכת המורכבת למשל של CCD חשיפה מסגרת מספר כפול המצלמה (למשל., 1,600 × 1,200 פיקסלים כדי להשיג רזולוציה מספיק), לייזר פעמו Nd-YAG כפול (גל: 532 ננומטר, אנרגית פלט: 400 MJ, משך דופק: 4 NSEC), ו מיקרוסקופ הפוכה.
הערה: מערכת כזו היא מסוגלת להשיג זוגות מסגרת עם זמן שהייה של עד כמה מייקרו שני בין המסגרות הראשונות ושניות. כדי להשיג תמונות מסגרת נעל פעמיים שלב, כדאי לרכוש סדרה מסגרת כפולה למשל., 10 הרץ (זוגות מסגרת מופרדים ב -0.1 שניות זה מזה). לאחר מכן, הנתונים עשויים להיות מחדש כך שכל זוגות המסגרת כי הם מופרדים על ידי זמן מחזור מלא (כאן T = 4 שניות) יוצרים סדרת זמן חדשה. תמונת רכישה יש לחזור מספר פעמים תוך שינוי זמן ההשהיה בין המסגרות הראשונות ושניות בכל זוג מסגרת (כלומר., 100 μsec ל -0.1 שניות) לפתרון אזורי זרימה שונים בתוך חלל המכתשית.
הערה: הגדרות חלופיות לגבי שילובים הטובים ביותר של מערכות רכישת תמונה (. כלומר, מצלמה) ומקורות תאורה (כלומר, לייזרים) לדימוי כזהmicroflows זמין גם 34, 35. - השתמש באלגוריתם של סכום קורלציה לחשב מפות וקטור מהירות שלב נעולה של שדה זרימת נובעות הסדרת התמונה עבור כל בפיגור זמן בשימוש. חזור על תהליך זה מספר פעמים עם משתנה פעמים בפיגור בין המסגרות הראשונות ושניות בכל זוג מסגרת לפתרון אזורי זרימה שונים בתוך חלל המכתשית. לאחר מכן, להשתמש בתוכנית ניתוח נתונים לאחות את מפות זרימה בודדות לתוך מפה מושלמת גבוהה מפורט של תבניות זרימה על ידי חישוב ממוצע נקודות נתונים חופפים 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות תכנון בעזרת מחשב (CAD) ומיקרוסקופ של פלטפורמת acinar במבחנה מוצגות באיור. 1. מודל acinar biomimetic כולל חמישה דורות של הסתעפות ערוצים מלבניים מצופה חללים גליליים דמוי המכתשית (איור. 1). הנה, דורות המודל ממוספרים מדור 1 (עבור הדור הפרוקסימלי ביותר) לדור 5 (עבור הדור הדיסטלי ביותר). שימו לב שרק כניסת הערוץ מובילה לדור 1 פתוחה לסביבה החיצונית באמצעות פתח PDMS. 16 הצינורות המובילים הרחק דור 5 נותרים סגורים לאוויר (איור. 1a). על ידי ויסות מעת לעת את לחץ המים בתוך תאי, הקירות דקים המהווים החללים המכתשית ותעלות הם מעוותים באופן מחזורי. במקביל, התקרה של דרך הנשימה הוא מעווה אנכי באמצעות תא מים נוסף הממוקם מעל הצינוריות; כדי ליצור תא עליון זה בתוךבצורה פשוטה ללא הכנה של שכבת microfluidic נוספת החבית של מזרק הייתה שקועה בתוך PDMS לפני cross-linking. זה הביא שכבת PDMS של כ 1 מ"מ הפרדת צינוריות כוורת ובית נבחרי מים העליונים (ראה איור. 2).
תאי המים מחוברים משאבת מזרק המתוכנת לחזור על סדרה של ספיקות ליניארי ramped לחקות נורמלי תרחיש נשימה גאות כבד של מבוגר אדם ממוצע עם זמן מחזור 4 שניות (T). התוצאה היא ירידה ועליית עת של נפח דרכי נשימה; מאז השקעים נסגרים רק הכניסה פתוחה לסביבה, הנוזל בתוך הצינורות הוא שואף ונושפת מהמכשיר דרך הכניסה, באנלוגיה כדי תהליך נשימה טבעי. הנה, צינוריות דרכי הנשימה התמלאו פתרון גליצרול זורעים עם חלקיקים ניאון (ראה פרוטוקול) ו velocimetry תמונה החלקיקים מיקרו (μPIV) שימש כדי למפות את resulti ng שדות זרימה פני עץ איירווייז 33.
עוצמת המהירות המנורמלת (u x / u x, המקסימום) ב streamwise (כלומר., צירי) בכיוון לרוחב הערוצים מוצגת באיור. 3. תוצאות מוצגות לפי מהירות משאיפת שיא עבור כל 5 הדורים המכשירים, ומייצגות את הקרנת 2D של הזרימה בתוך לוח דק ליד midplane הדביק. לשם השוואה, הפתרון אנליטי של הזרימה למינרית היציבה של ערוץ ארוך לאין שיעור 36 מוצג גם באיור. 3.
איור 4 מראה לייעל דפוסים ובהירויות מהירות בתוך חללים המכתשית בבית midplane של דרך הנשימה ב משאיפת שיא. 4a הדמוי, B ו- C מתאר דורות acinar 1, 3 ו -5, בהתאמה.
איור 1 "src =" / files / ftp_upload / 53,588 / 53588fig1.jpg "/>
איור 1: דגם Microfluidic של רשת עץ acinar (א) CAD ציור של המכשיר מלא.. (ב) תמונות תקריב של מבנה עץ acinar מראות ערוצים, התאי, ואת הקירות הדקים הפרידו. חצים סגולים לסמן מיקומים המתאימים -directions החיוב y של פרופילי הזרימה שהוצגו באיור. 3. המעובד באישור נ"צ. 33.
איור 2:. CAD עיצוב של המכשיר microfluidic (א) קווים מרוסקים לציין את צינורות המובילים מתאי לרוחב ומלמעלה משאבת מזרק באמצעות מחבר בצורת האות T. צד (ב), בקע את המרכז של המכשיר הממחיש את מיקומו של המזרק בתוך גבס PDMS. אdapted באישור נ"צ. 33.
איור 3: מהירויות זרימת acinar פרופילים מהירים ductal מנורמלים (u x / u x, מקסימום) מופקים PIV לרוחב הערוץ במשך דורות 1 עד 5 במיקומים באיור.. 1; y = 0 חופפת מיקום נקודת האמצע מעבר לתעלה ו u x, מקסימום = 0.0104 מ '/ שנייה מתאימה כאן למהירות streamwise השיא נמדדה מדידות PIV מכשיר דור 1. מוצגת כאן משאיפת שיא (t = 0.6 שניות) והקו השחור תואם את פרופיל מהירות אנליטיים זוחלים זרימה בתוך ערוץ מלבני עם W d = 345 מיקרומטר ו <em> h = 92 מיקרומטר. המעובד באישור נ"צ. 33.
איור 4: בהירויות מהירות ו מקבילים דפוסי יעל. נתונים מתקבלים מהמיקרו-PIV הקרנה של הזרימה שחולצה על midplane של נֹאדִית הממוקמת דורות מכשיר 1, 3 ו -5 שדות זרימה מוצגים כ משאיפת שיא (t = 0.6 sec). בהירויות מהירות מוצגות על סולם לוגריתמים. המעובד באישור נ"צ. 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תכונה קריטית של פלטפורמת acinar microfluidic המוצגת כאן היא יכולתו להתרבות תנועות נשימה מציאותיות פיסיולוגי שיוצרות פרופילי זרימה פיסיולוגיים מהירויות בתוך צינוריות acinar ובתוך alveoli. מאז ערוצי microfluidic מיוצרים עם יחס רוחב-גובה נמוך יחסית (כלומר., W ד / h ≈ 3.9, שבו w ד הוא רוחב צינור ו- h הוא גובה דביק), תזרימי נמדד להראות יותר מאפייני תזרימי דמוי תקע לעומת פרופילי זרימת פרבוליות צפוי כי יתקיימו ערוצים מעגליים. אף על פי כן, המהירויות הנמדדות הן גם בטווח הפיזיולוגי; נמצא כי מספר ריינולדס ממדים המאפיין, השוואת אינרציה לכוחות צמיגים, מניב לכל היותר כ 0.01 המתאים עד אמצע לאזורי acinar דיסטלי, בעקבות ערכות למחצה אמפיריות 2.
תוכן "> כאן, מספר ריינולדס מוגדר Re = U x, מקסימום D h / ν גליצרול פתרון, שבו U x, מקסימום הוא המהירות streamwise הממוצעת ברחבי midplane הצינור ברגע של קצב זרימה מקסימאלי, D h הוא קוטר הידראולי של צינור ו ν פתרון גליצרול הוא צמיגות קינמטיקה של הפתרון גליצרול לשמש ראיה זרימת אשר הותאמה צמיגות קינמטיקה של אוויר ב ~ 24 ° C (ν אוויר = 1.55 × 10 -5 מ '2 / sec, ν פתרון גליצרול = 1.51 × 10 -5 מ '2 / sec). בנוסף, ירידה בסדר גודל זרימת בכ פי שניים הוא ציין לאחר כל הסתעפות כצפוידפוסי הסתעפות דיכוטומי של מודל acinar. כלומר, מפל זה של מהירויות זרימה הוא תכונה חשובה של acinar זורמת עצים דרכי נשימה.פרופילי זרימה ליד ובתוך חללים המכתשית (איור. 4) מראים כי מהירויות ductal הם יורדים בהדרגה כלפי דורות acinar עמוקים. בנוסף, בהירויות זרימה לרדת בתלילות לאורך פתיחת alveoli וכתוצאה מכך מהירויות זרימה כי הן שניים עד שלוש הזמנות של alveoli בתוך איטי גודל לעומת הצינוריות; טופולוגיות זרימה כגון דווחו בעבר במחקרים מספריים מספר 1, 9, 15 בנוסף, דפוסי זרימה משתנים באופן משמעותי מדור acinar אחד למשנו, כפי שחזו בסימולציות 7, 15:. בעוד דור 1 כולל אזור סחרור אשר בערך עולה בקנה אחד עם במרכז נֹאדִית (איור. 4, שמאל), דור 3 מתאפיין אזור סחרור אשר מוסט לכיוון הצד הפרוקסימלי שלנֹאדִית עם דפוס לייעל פתוח יותר (איור. 4, באמצע). לבסוף, מייעלת רדיאלי ללא מרחב סחרור נצפית מכשיר דור 5 (איור. 4, ימין). למיטב ידיעת הכותבים, זו הפעם הראשונה כי קיומו של מגוון רחב של תבניות זרימה המכתשית הוא נתפס באופן ניסיוני.
ההצלחה של השיטה המוצגת תלוי כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול microfabrication. ראשית, כדי למנוע את קירות PDMS הדקים מהקריעה עם שחרורו מן רקיק אמן התבנית חרוטה על פני השטח של פרוסות סיליקון צריכים קירות ישרים ולא חייב לדבוק PDMS נרפא. לכן מומלץ מאוד לייצר ופלים באמצעות DRIE של רקיק SOI כמתואר פישלר ואח '. (2013). כזה רקיק אמן הוא עמיד יכול להיות מצופה בקלות עם שכבת אנטי דבק או על ידי silanizing השטח כמתואר פישלר et al. (2013) או על ידי הבטחת tכובע הצעד האחרון בתהליך DRIE הוא של פסיבציה עם CF 4. שלב קריטי נוסף הוא הגשה (שלב 2.5) והטבעה (שלב 2.6) הקנה המזרק כדי ליצור התא העליון. בועות אוויר הלכוד בין בסיס המזרק ואת שכבת PDMS הראשונה יכול להפחית את השלמות ועמידות של המכשיר מיוצר מאוד. כדי למנוע היווצרות בועה, זה קריטי, כי הבסיס של חבית המזרק הוא שטוח והגיש אחיד.
אמנם העיצוב הנוכחי מאפשר ייצור של דו שכבתי-המכשיר באמצעות רק רקיק ראשי אחד, שיטה שונה עשויה לכלול יצירת שכבת PDMS נוספת המכילה זחה עגולה כדי ליצור התא העליון. עבור שכבה שנייה PDMS זה רקיק אמן נוסף שמציע רכס עגול יכול להיות מפוברק באמצעות photolithography SU-8 סטנדרטי. שינוי נוסף של הפרוטוקול עשוי לכלול שיטה אחרת עבור מליטת PDMS כי אינו מחייב treater קורונה. כדי לדבוק עובש PDMS אל הזכוכיתשקופיות, שכבה ראשונה שקופיות הזכוכית כמתואר בשלב 2.10 לפרוטוקול אבל להשתמש 5: 1 במקום 10: 1 PDMS: יחס משקל-סוכן ריפוי. אופה את הזכוכית המצופית במשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס בתנור הסעה טבעית, קש עובש PDMS אל PDMS מצופה זכוכית, ואופים לילה בשעה 65 ° C בתנור הסעה טבעי.
לרגל דולף נוזל מפני השטח המליט בין עובש PDMS וזכוכית מהאמצעים הבאים ניתן לקחת: (1) לוודא כי treater קורונה מייצר ניצוצות חשמליים במהלך הטיפול, אם לא, להגדיל את מתח המוצא, (2) להאריך זמן בטיפול עם קורונה treater ו (3) להשתמש בשיטה חלופית מליטת עובש PDMS לזכוכית (ראה סעיף לעיל). לעתים קרובות במים עלולים לדלוף דרך החיבור של צינורות טפלון הדקים על צינור הכניסה לתא. כדי לעקוף דולף כזה, לוודא כי קצה המזרק בוטה 19-מד משמש לחיבור צינורות טפלון אל מפרצון. אם דליפות מים בין עובש PDMS ואת התא דואר עליון (מקנה מזרק 2 מיליליטר) לוודא כי הבסיס של חבית המזרק הוגש כראוי (ראה שלב 2.5 בפרוטוקול), וכי השכבה השנייה של PDMS נמזגה גבוהה מספיק (~ 5 מ"מ מעל שכבת PDMS הראשונה ).
ראוי לציין, כי מידת העיוות הקיר תלויה מאוד על תכונות מכניות PDMS. בעקבות שינויים קלים הליך הכנת המכשירים עלולים לגרום השתנות ניכר המהירויות שנמדדו בין התקנים שונים. כדי להבטיח תנאי הכנה מתמידים דירות מקסימליים שימוש (לחות, זמני אפייה וכו.). בנוסף, כוונון עדין של שינוי עוצמת הקול במהלך actuation ההתקן עשוי להיות מושגת על ידי לדמיין את המשטח העליון של ערוצים באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב והתאמת רמפות מהירות של משאבת מזרק כך המשטח העליון של הערוץ הוא מוסח למרחק הרצוי כפי שנמדד על ידי z-התנועה של במת מיקרוסקופ.
Limita חשובtion של הטכניקה הנוכחית הוא כי מאפייני מורפולוגיים המדויקים (למשל, אנטומיה, morphometry) של הריאות לא ניתן לשחזר במדויק. אכן, העיצוב מישוריים של המודל acinar לא ללכוד למשל מחוץ למטוס bifurcations acinar ויחס המכתשית נפח ductal הוא נמוך בהרבה מאשר נמדד vivo ערכים 37. בנוסף, גיאומטרית microfluidic הפשוטה רק לוכדת חלק קטן של acinus מלא. למרות מגבלות אלה, המודל הנוכחי הוא מסוגל לשחזר דפוסי זרימה צפויים מירויות ישירות על המאזניים אורכים אנטומי נכון, ולכן מהווה פלטפורמת בדיקות יקרה עבור תופעות מעבר acinar.
לסיכום, מודלי microfluidic בהשתתפות של acinus ריאתי להראות הבטחה גדולה ככלי במבחנה לחקירות הכמות של acinar נשימת תזרים מחקו דפוסי נשימה. כאן, המודל acinar פשוט מורכב מחמישה גרםenerations של מתפשט ומתכווצים צינוריות כוורת, ובכך לשחזר חלק תכונות הזרימה הבסיסית החשובות הצפוי להתקיים בתוך אזור acinar של הריאות. זרימה להדמיה, באמצעות מיקרו-PIV, בתוך חללים המכתשית מספק עבור הוכחה ניסויית לראשונה של מגוון של הסירקולציה המחודשת מורכב ותזרימי המכתשית רדיאלי לאורך עץ acinar. גישת microfluidic זו מאפשרת ייצור של מבני acinar מורכבים עם קירות נעים בעקבות הליך פשוט יחסית ומציעה חלופה אטרקטיבית למודלי acinar מדורגים-אפ. בפרט, עם היתרון העיקרי של אספקת מודל בקנה מידה אחד-על-אחד, חלקיקי דינמיקה acinar בשאיפה נכונה יכולה להיחקר ללא צורך נוסף בקבלת התאמת דמיון דינמית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent | Dow Corning | (240)4019862 | Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit |
| Plastipak 2 ml syringe | BD | 300185 | |
| Norm-Ject Luer slip 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | |
| 1 mm Biopsy punch | Kai Medical | BP-10F | |
| Laboratory Corona Treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| PHD Ultra Syringe pump | Harvard apparatus | 703006 | |
| Dyed red rqueous fluorescent particles | Thermo-Scientific | Uncatalloged 0.86 µm beads were used | |
| Glycerin AR | Gadot | 830131320 | |
| FlowMaster MITAS micro-particle image velocimetry (µPIV) system | LaVision | 1108630 |
References
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z. Airflow and Particle Transport in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 301-334 (2010).
- Sznitman, J. Respiratory microflows in the pulmonary acinus. J. Biomech. 46 (2), 284-298 (2013).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Gas and aerosol mixing in the acinus. Respir. Physiol. Neurobiol. 163 (1-3), 139-149 (2008).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted Drug-Aerosol Delivery in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10 (1), 195-220 (2008).
- Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Schulz, H., Takenaka, S., Butler, J. P., Henry, F. S., Tsuda, A. Nanoparticle delivery in infant lungs. Proc. Natl. Acad. Sci. 109 (13), 5092-5097 (2012).
- Sznitman, J., Heimsch, F., Heimsch, T., Rusch, D., Rosgen, T. Three-Dimensional Convective Alveolar Flow Induced by Rhythmic Breathing Motion of the Pulmonary Acinus. J. Biomech. Eng. 129 (5), 658-665 (2007).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Chaotic mixing of alveolated duct flow in rhythmically expanding pulmonary acinus. J. Appl. Physiol. 79 (3), 1055-1063 (1995).
- Henry, F. S., Butler, J. P., Tsuda, A. Kinematically irreversible acinar flow: a departure from classical dispersive aerosol transport theories. J. Appl. Physiol. 92 (2), 835-845 (2002).
- Kumar, H., Tawhai, M. H., Hoffman, E. A., Lin, C. L. The effects of geometry on airflow in the acinar region of the human lung. J. Biomech. 42 (11), 1635-1642 (2009).
- Lee, D. Y., Lee, J. W. Characteristics of particle transport in an expanding or contracting alveolated tube. J. Aerosol Sci. 34 (9), 1193-1215 (2003).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. I. Diffusional deposition in the absence of gravity. J. Appl. Physiol. 76 (6), 2497-2509 (1994).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. II. Gravitational sedimentation and inertial impaction. J. Appl. Physiol. 76 (76), 2510-2516 (1994).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol bolus dispersion in acinar airways—influence of gravity and airway asymmetry. J. Appl. Physiol. 113 (3), 442-450 (2012).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol deposition characteristics in distal acinar airways under cyclic breathing conditions. J. Appl. Physiol. 110 (5), 1271-1282 (2011).
- Heimsch, J., Sznitman, T., Wildhaber, J. H., Tsuda, A., Rösgen, T. Respiratory Flow Phenomena and Gravitational Deposition in a Three-Dimensional Space-Filling Model of the Pulmonary Acinar Tree. J. Biomech. Eng. 131 (3), 031010 (2009).
- Litzlbauer, H. D., Korbel, K., Kline, T. L., Jorgensen, S. M., Eaker, D. R., Bohle, R. M., Ritman, E. L., Langheinrich, A. C. Synchrotron-Based Micro-CT Imaging of the Human Lung Acinus. Anat. Rec. Adv. Integr. Anat. Evol. Biol. 293 (9), 1607-1614 (2010).
- Tsuda, A., Filipovic, N., Haberthür, D., Dickie, R., Matsui, Y., Stampanoni, M., Schittny, J. C. Finite element 3D reconstruction of the pulmonary acinus imaged by synchrotron X-ray tomography. J. Appl. Physiol. 105 (3), 964-976 (2008).
- Berg, E. J., Weisman, J. L., Oldham, M. J., Robinson, R. J. Flow field analysis in a compliant acinus replica model using particle image velocimetry (PIV). J. Biomech. 43 (6), 1039-1047 (2010).
- Sznitman, J., Sutter, R., Altorfer, D., Stampanoni, M., Rösgen, T., Schittny, J. C. Visualization of respiratory flows from 3D reconstructed alveolar airspaces using X-ray tomographic microscopy. J. Vis. 13 (4), 337-345 (2010).
- Henry, F. S., Haber, S., Haberthür, D., Filipovic, N., Milasinovic, D., Schittny, J. C., Tsuda, A. The Simultaneous Role of an Alveolus as Flow Mixer and Flow Feeder for the Deposition of Inhaled Submicron Particles. J. Biomech. Eng. 134 (12), 121001 (2012).
- Chhabra, S., Prasad, A. K. Flow and Particle Dispersion in Lung Acini: Effect of Geometric and Dynamic Parameters During Synchronous Ventilation. J. Fluids Eng. 133 (7), 071001 (2011).
- Cinkotai, F. F. Fluid flow in a model alveolar sac. J. Appl. Physiol. 37 (2), 249-251 (1974).
- Karl, A., Henry, F. S., Tsuda, A. Low reynolds number viscous flow in an alveolated duct. J. Biomech. Eng. 126 (4), 420-429 (2004).
- Tippe, A., Tsuda, A. recirculating flow in an expanding alveolar model: experimental evidence of flow-induced mixing of aerosols in the pulmonary acinus. J. Aerosol Sci. 31 (8), 979-986 (2000).
- Berg, E. J., Robinson, R. J. Stereoscopic particle image velocimetry analysis of healthy and emphysemic alveolar sac models. J. Biomech. Eng. 133 (6), 061004 (2011).
- Ma, B., Ruwet, V., Corieri, P., Theunissen, R., Riethmuller, M., Darquenne, C. CFD simulation and experimental validation of fluid flow and particle transport in a model of alveolated airways. J. Aerosol Sci. 40 (5), 403-414 (2009).
- Kumar Mahto, S., Tenenbaum-Katan, J., Sznitman, J. Respiratory Physiology on a Chip. Scientifica. 2012, e364054 (2012).
- Huh, D., Fujioka, H., Tung, Y. C., Futai, N., Paine, R., Grotberg, J. B., Takayama, S. Acoustically detectable cellular-level lung injury induced by fluid mechanical stresses in microfluidic airway systems. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (48), 18886-18891 (2007).
- Song, Y., Baudoin, M., Manneville, P., Baroud, C. N. The air–liquid flow in a microfluidic airway tree. Med. Eng. Phys. 33 (7), 849-856 (2011).
- Tavana, H., Huh, D., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microfluidics, Lung Surfactant, and Respiratory Disorders. Lab Med. 40 (4), 203-209 (2009).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Pihl, J., Sinclair, J., Sahlin, E., Karlsson, M., Petterson, F., J, O. lofsson, Orwar, O. Microfluidic Gradient-Generating Device for Pharmacological Profiling. Anal. Chem. 77 (13), 3897-3903 (2005).
- Fishler, R., Mulligan, M. K., Sznitman, J. Acinus-on-a-chip: A microfluidic platform for pulmonary acinar flows. J. Biomech. 46 (16), 2817-2823 (2013).
- Lindken, R., Rossi, M., Grosse, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (microPIV): recent developments, applications, and guidelines. Lab. Chip. 9 (17), 2551-2567 (2009).
- Wereley, S. T., Meinhart, C. D. Recent Advances in Micro-Particle Image Velocimetry. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 557-576 (2010).
- Bruus, H. Theoretical Microfluidics. Oxford Master Series in Condensed Matter Physics. , (2008).
- Haefeli-Bleuer, B., Weibel, E. R. Morphometry of the human pulmonary acinus. Anat. Rec. 220 (4), 401-414 (1988).
