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Chemistry

Desenvolvimento de um Backbone cíclica Biblioteca de Peptídeos como potencial antiparasitário Therapeutics Usando Microondas Irradiação

Published: January 26, 2016 doi: 10.3791/53589
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

Abstract

Interacções proteína-proteína (IBPs) estão intimamente envolvidos em quase todos os processos biológicos e estão ligadas a muitas doenças humanas. Portanto, há um grande esforço para atingir os IPP em pesquisa básica e na indústria farmacêutica. As interfaces proteína-proteína são geralmente grande e plana, e muitas vezes não têm bolsos, o que complica a descoberta de pequenas moléculas que têm como alvo tais sites. Abordagens alternativas de segmentação utilizando anticorpos têm limitações devido à baixa biodisponibilidade oral, baixa de células-permeabilidade, e ineficiência de produção.

Usando péptidos alvo para interfaces de PPI tem várias vantagens. Os péptidos têm maior flexibilidade conformacional, o aumento da selectividade, e são geralmente baratos. No entanto, os péptidos têm suas próprias limitações incluindo a má estabilidade e ineficiência atravessar membranas celulares. Para superar estas limitações, o péptido de ciclização pode ser realizada. A ciclização foi demonstrado melhorar a selectividade peptídeo, A estabilidade metabólica e biodisponibilidade. No entanto, a previsão da conformação bioactiva de um péptido cíclico não é trivial. Para ultrapassar esta dificuldade, uma abordagem atractiva para o rastreio de uma biblioteca focada para a tela no qual todos os péptidos cíclicos da espinha dorsal tem a mesma sequência primária, mas diferem nos parâmetros que influenciam a sua conformação, como o tamanho do anel e posição.

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a síntese de uma biblioteca de péptidos cíclicos de segmentação de estrutura de parasitas específicos de IPP. Utilizando uma abordagem de design racional, foi desenvolvido a partir de péptidos derivados do receptor de G eishmania proteína C activada para andaime-quinase (ausência). Colocámos a hipótese de sequências em FALTA que são conservadas em parasitas, mas não no homólogo de hospedeiro mamífero, podem representar sítios de interacção para proteínas que são críticas para a viabilidade dos parasitas. Os péptidos cíclicos foram sintetizados utilizando a irradiação de microondas para reduzir os tempos de reacção e aumentareficiência. O desenvolvimento de uma biblioteca de backbone peptídeos cíclicos com diferentes tamanhos de tela de toque facilita uma sistemática para a conformação activa mais biológica. Este método oferece uma maneira geral, rápido e fácil de sintetizar péptidos cíclicos.

Introduction

Interacções proteína-proteína (IBPs) desempenham um papel essencial na maioria dos processos biológicos, de transdução de sinal intracelular para a morte de células 1. Assim, visando IPP é de fundamental importância para a pesquisa básica e aplicações terapêuticas. IPP pode ser regulada por meio de anticorpos específicos e estáveis, mas os anticorpos são caros e difíceis de fabricar e têm uma fraca biodisponibilidade. Alternativamente, IPP pode ser alvo de moléculas pequenas. As moléculas pequenas são mais fáceis de sintetizar e barata em comparação com anticorpos; no entanto, eles são relativamente menos flexível e encaixar melhor do que para as pequenas cavidades grandes para as interfaces proteína-proteína 2,3. Diversos estudos demonstraram que os péptidos, que são mais simples e mais barata do que os anticorpos e mais flexível do que as moléculas pequenas, as interfaces de proteína pode ligar-se e regulam IPP 4,5. O mercado global de peptídeo terapêutico foi avaliada em torno de quinze bilhões de dólares em 2013 e está crescendo 10,5% annually 6. Além disso, existem mais do que 50 péptidos comercializados, cerca de 270 péptidos em diferentes fases de ensaios clínicos, e cerca de 400 péptidos em fases pré-clínicos avançados 7. Apesar de numerosos peptídeos estão sendo usados ​​como drogas, peptídeos ainda representam vários desafios que limitam a sua aplicação generalizada, incluindo fraca biodisponibilidade e estabilidade, a ineficiência nas membranas celulares cruzamento, e flexibilidade conformacional 8,9. Uma alternativa para superar estes inconvenientes é a aplicação de diferentes modificações, tais como (D-amino ácido e N-alquilação) local e global (ciclização) constrangimentos 8,10-12. Estas alterações também ocorrem naturalmente. Por exemplo, a ciclosporina A, um péptido imunossupressor naturais cíclica, contém um único ácido aminado D e sofre modificações de N-alquilação 13,14.

Modificação de amino ácidos naturais para induzir constrangimentos locais, tais como D e N-alquilação, muitas vezes afecta o peptídeo9; s atividade biológica. No entanto, a ciclização, na qual a sequência de interesse pode permanecer a mesma, é mais provável para preservar a actividade biológica. A ciclização é uma forma altamente atraente para restringir o espaço conformacional péptido, reduzindo o equilíbrio entre diferentes conformações. Geralmente, aumenta a actividade biológica e selectividade ao restringir o péptido para a conformação activa que medeia apenas uma função. A ciclização também melhora a estabilidade do péptido, mantendo o peptídeo numa conformação que é reconhecida pelos menos as enzimas degradantes. Com efeito, os péptidos cíclicos foram mostrados como tendo uma melhor estabilidade metabólica, biodisponibilidade, e a selectividade em relação aos seus equivalentes lineares 15-17.

No entanto, a ciclização pode ser uma espada de dois gumes, uma vez que, em alguns casos, a restrição pode impedir que os péptidos de atingir uma conformação bioactiva. Para superar este obstáculo, uma biblioteca focada no qual todos os péptidos possuem o mesmo sequenc primárioE e consequentemente constante farmacóforos podem ser sintetizados. Os péptidos da biblioteca diferem em parâmetros que influenciam a sua estrutura, tais como o tamanho do anel e posição, a fim de rastrear, subsequentemente, para a conformação bioactiva mais 9,18.

Os péptidos podem ser sintetizados tanto em solução como por uma abordagem de síntese de péptidos em fase sólida (SPPS), que é agora a abordagem de síntese de péptidos mais prevalente e será discutido mais adiante. SPPS é um processo pelo qual as transformações químicas são realizadas sobre um suporte sólido através de um ligante para preparar uma vasta gama de compostos sintéticos 19. SPPS de montagem permite que os péptidos por acoplamento consecutivo de ácidos aminados de uma forma passo a passo a partir do terminal C, que está ligado a um suporte sólido, para a extremidade N-terminal. As cadeias laterais de ácido N-a-amino deve ser mascarados com grupos protectores que são estáveis ​​nas condições de reacção utilizadas durante péptido alongamento para assegurar a adição de um aminoácido por rep. No passo final, o péptido é libertado a partir da resina e a cadeia lateral de grupos protectores são removidos simultaneamente. Enquanto o péptido está a ser sintetizado, todos os reagentes solúveis podem ser removidos a partir da matriz de suporte sólida de péptido-se por filtração e lavado no final de cada passo de acoplamento. Com um tal sistema, um grande excesso de reagentes a uma concentração elevada pode conduzir a reacções de acoplamento e a conclusão de todas as etapas de síntese pode ser realizada no mesmo recipiente, sem transferência de material 20.

Embora SPPS apresenta algumas limitações, tais como a produção de reacções incompletas, reacções secundárias, reagentes impuros, bem como dificuldades de controlo da reacção 21, as vantagens de SPPS fez-se o "padrão de ouro" para a síntese de péptidos. Estas vantagens incluem a opção de incorporar ácidos aminados não naturais, automação, fácil purificação, perdas físicas minimizadas, e a utilização de reagentes em excesso, resultando emrendimentos elevados. SPPS demonstrou ser extremamente útil na síntese de sequências difíceis, 21,22 modificações fluorescentes 23, e bibliotecas de péptidos 24,25. SPPS também é muito útil para outras montagens de cadeia poli, tais como os oligonucleótidos, oligossacáridos 28,29 26,27, e ácidos nucleicos peptídicos 30,31. Curiosamente, em alguns casos, a SPPS foi demonstrado ser vantajoso para a síntese de moléculas pequenas que são tradicionalmente feitas em solução de 32,33. SPPS é usado tanto em pequena escala para pesquisa e ensino, bem como 34,35 larga escala na indústria 36-38.

Duas estratégias de síntese que são usados ​​principalmente em SPPS metodologia para a síntese de péptidos são butiloxicarbonilo (Boc) e 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). A estratégia original introduzido para a SPPS Boc foi, o que requer condições fortemente ácidas para remover os grupos protectores da cadeia lateral e clivagem do péptido da resin. A síntese de péptidos de Fmoc-baseado, no entanto, utiliza condições base moderada e é uma alternativa mais leve ao protocolo Boc ácido-lábil 39. A estratégia de Fmoc utiliza ortogonal de t-butilo (tBu) protecção da cadeia lateral que é removido no último passo da síntese, enquanto a clivagem do péptido a partir da resina sob condições ácidas.

O princípio geral para a síntese de péptidos sobre suporte sólido é apresentado na Figura 1. O aminoácido inicial, mascarada por um grupo protector temporário na N-α-terminal, é carregada sobre a resina a partir da extremidade C-terminal. Um grupo de protecção semi-permanente para mascarar a cadeia lateral é também utilizado, se necessário (Figura 1, Passo 1). A síntese do péptido alvo é montado a partir do terminal C para o terminal N de ciclos repetitivos de desprotecção do grupo de protecção N-α-temporária (Figura 1, Passo 2) e o acoplamento do aminoácido seguinte protegido (Figura 1 ong>, Passo 3). Após o último aminoácido está carregado (Figura 1, Passo 4), o péptido é clivado do suporte de resina e os grupos de protecção semi-permanentes são removido (Figura 1, Passo 5).

figura 1
Figura 1. Esquema geral de síntese de péptidos em fase sólida. O aminoácido protegido por N-α está ancorada usando o grupo carboxilo através de um ligante à resina (Passo 1). O péptido desejado é montado de um modo linear a partir do terminal C para o terminal N de ciclos repetitivos de desprotecção do grupo de protecção temporária (TPG) a partir do N-α (Passo 2) e o acoplamento de aminoácidos (Passo 3). Após realização da síntese (Passo 4), os grupos de protecção semi-permanentes (SPG) são desprotegidos durante a clivagem do péptido (Passo 5).obter = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a montagem da cadeia peptídica completa, ciclização pode ser conseguido por várias alternativas: (A) head-to-tail ciclização - Esta é uma maneira conveniente, mas limitado, uma vez que fornece apenas uma opção para ciclização (Figura 2A), (B) ciclização utilizando os aminoácidos da sequência de interesse que contêm grupos funcionais bioactivos - no entanto, a utilização destes aminoácidos pode influenciar a actividade biológica (Figura 2B), e (C) a ciclização através da adição de aminoácidos (ou de outros blocos de construção), sem perturbar a sequência bioactivo. A introdução destas moléculas é generalizado, uma vez que permite a produção de bibliotecas focadas, sem modificar a sequência de interesse (Figura 2C).

Figura 2
Figura 2. estratégias de ciclização de péptido A alternativa (a) ciclização cabeça à cauda através de uma ligação peptídica entre o C-terminal e N-terminal.; (B) a ciclização entre os grupos funcionais, tais como uma ponte de dissulfureto entre resíduos de cisteína (1), ou uma ligação amida entre as cadeias laterais de lisina para aspártico / ácido glutâmico (2), ou a cadeia lateral de N ou C-terminal (3 -4); (C) ciclização adicionando aminoácidos extras ou derivados de aminoácidos ou moléculas pequenas, por exemplo, antes (R0) e depois (R7) a seqüência bioativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Síntese utiliza irradiação de microondas para aquecer reações, acelerando assim a química orgânica assistida por microondas transformações 40,41. Microondas química baseia-se na capacidade de o reagente / solvente para absorver omicroondas energia e convertê-lo para aquecer 42. Antes de a tecnologia se tornou generalizada, grandes inconvenientes tiveram que ser superados, incluindo a controlabilidade e reprodutibilidade dos protocolos de síntese e falta de sistemas disponíveis para temperatura e pressão controles adequados 43,44. O primeiro relatório de síntese de peptídeos assistida por microondas foi feito usando um microondas cozinha para sintetizar vários péptidos curtos (7-10 aminoácidos) com melhoria significativa da eficiência de acoplamento e pureza 45. Além disso, a energia de microondas foi demonstrado para diminuir a agregação de cadeia, reduzir as reacções secundárias, limitar a racemização, e melhorar as taxas de acoplamento, que são todos críticos para sequências longas e difíceis 46-53.

Actualmente a utilização de irradiação de microondas para a síntese de péptidos ou compostos relacionados, um suporte sólido é extensiva, incluindo (a) síntese em água em vez de solvente orgânico 54; (B) a síntese de peptídeos commodificações pós-traducionais comuns, tais como os glicopéptidos 55-58 ou 59-61 fosfopéptidos, cuja síntese é tipicamente difícil, devido à baixa eficiência de acoplamento dos derivados de aminoácidos estereoquimicamente impedidas; (C) a síntese de péptidos com modificação no esqueleto, tal como azapeptides, que pode ser formado pela substituição do C (α) de um resíduo de aminoácido com um átomo de azoto 62, ou peptóides, cuja cadeia lateral está ligada ao azoto da amida em vez do átomo de Ca 63,64; (D) a síntese de péptidos cíclicos 65-71; e (E) a síntese de bibliotecas combinatórias 51,72. Em numerosos casos, os autores relataram uma maior eficiência e reduziu o tempo de síntese que utilizam a irradiação de microondas, em comparação com o protocolo convencional.

Usando um desenho racional 73-75, desenvolvemos peptídeos anti-parasitários que foram derivadas do receptor do andaime L de eishmania foR-quinase C activada (ausência). FALTA desempenha um papel importante na fase inicial de infecção por Leishmania 76. Parasitas que expressam níveis mais baixos de FALTA deixar de parasitar mesmo ratos imunocomprometidos 77 como FALTA está envolvida em processos de parasitas sinalização essenciais e síntese de proteínas 78. Portanto, FALTA é uma chave de proteínas scaffold 79 e um alvo de drogas valiosas. Focando em FALTA sequências que são conservadas em os parasitas, mas não no hospedeiro mamífero CREMALHEIRA homólogo, identificou-se um péptido de 8 amino ácidos (RNGQCQRK) que diminuiu Leishmania sp. Viabilidade em cultura.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de esqueleto cíclico péptidos derivados da sequência da proteína FALTA descrito acima. Os péptidos foram sintetizados num suporte sólido utilizando o aquecimento por microondas através da metodologia de SPPS com o protocolo Fmoc / tBu. Os péptidos foram conjugados com um péptido 47-57 (YGRKKRRQRRR) transportadora TAT através de uma ligação amida comoparte da SPPS. Transporte baseado no TAT de uma variedade de cargas em células tem sido usado por mais de 15 anos e entrega da carga em organelas subcelulares foi confirmada 80. Quatro ligantes diferentes, succínico e anidrido glutárico, bem como adípico e ácido pimélico, foram usadas para efectuar a ciclização para gerar ligantes de ácidos carboxílicos de dois a cinco carbonos. A ciclização foi realizada por meio de energia de microondas, e a clivagem de cadeia lateral e passos de desprotecção final foi feita manualmente, sem energia de microondas. A utilização de um sintetizador de microondas automatizada melhora a pureza do produto, aumentou o rendimento do produto, e reduziu a duração da síntese. Este protocolo geral pode ser aplicada a outros estudos que utilizam péptidos compreender importante mecanismo molecular in vitro e in vivo e ainda desenvolver drogas potenciais para as doenças humanas.

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Protocol

1. Equipamentos e Reagentes Preparação

  1. Preparar equipamentos
    1. Execute todas as etapas dentro de um exaustor utilizando equipamento de protecção individual adequado.
    2. Quimicamente sintetizar péptidos sobre suporte sólido utilizando um forno microondas sintetizador de péptidos com um módulo adicional da Discover equipado com uma sonda de temperatura de fibra óptica para controlar a entrega de microondas de energia em um vaso de reacção de Teflon (30 ml, com uma frita de vidro) ou de um polipropileno descartável Cartucho (12 ml, com uma frita de vidro grosseira).
    3. Para uma mistura adequada, ligar o fornecimento de azoto ao vaso de reacção, ou, alternativamente, selar ambas as extremidades do cartucho de polipropileno, e colocar num agitador rotativo.
    4. Para drenar misturas de reacção ou lavagens, conecte-se o vácuo casa através de um sifão.
    5. Coloque a sonda de fibra óptica para dentro do vaso de reacção.
  2. Preparação de reagentes
    1. Prepare a resina por pesagem Rink Amide AM resina 100-200 mesh (0,204 mg), Adicionam-se 5 ml de mistura 1: 1 de N, N-dimetilformamida (DMF) / diclorometano (DCM) para o vaso de reacção cartucho / polipropileno para lavar a resina para baixo, agita-se durante 2-4 horas a inchar adequadamente, e drenar.
    2. Prepare a 0,2 M de 9-f luorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) -amino soluções de ácido pela dissolução do ácido Fmoc-aminoácido correspondente em DMF e agitar com vortex a mistura até que os aminoácidos são dissolvidos (Tabela 1).
    3. Preparar a mistura solução 0,45 M activador por dissolução de 18,96 g de O - (benzotriazol-1-il) - N, N, N ', N' tetrametilurónio (HBTU) em 100 ml de DMF e a mistura vortex até o sólido estar dissolvido (Tabela 1).
    4. Preparar 2 M base de activador de mistura solução combinando 34,8 ml de N, N-diisopropiletilamina (DIEA) com 65,2 mL de 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) (Tabela 1).
    5. Preparar a mistura solução de 0,1 M de desprotecção por dissolução de 3,37 g de hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt)em 250 ml de uma solução de v / v de 20% de piperidina em DMF e a mistura vortex até o sólido estar dissolvido (Tabela 1).

2. Fmoc-protegido Aminoácido Acoplamento

  1. Acoplamento de aminoácido
    1. Adicionar aminoácido (2,5 ml) / activador (1 mL) / base de activador (0,5 ml) a uma reacção de cartucho vaso / polipropileno e deixar a reacção prosseguir durante 300 segundos (25 W, 75 ° C, Tabela 2). Escorra a solução.
    2. Lava-se a resina com DMF. Adicionar DMF à resina para 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita cinco vezes.
  2. Desprotecção Fmoc
    1. Adicionar 7 ml de 20% de piperidina em DMF com 0,1 M de HOBt a uma reacção de cartucho vaso / polipropileno e incubar durante 30 seg (45 W, 75 ° C, Tabela 2).
    2. Drenar a mistura de reacção.
    3. Adicionar 7 ml de 20% de piperidina em DMF com 0,1 M de HOBt a uma reacção de cartucho vaso / polipropileno e incubar durante 180 seg (45 W, 75 ° C, Tabela 2).
    4. Drenar a mistura de reacção.
    5. Lava-se a resina com DMF. Adicionar DMF à resina para 120 segundos (7 ml 0 W, RT) e drenar a solução. Repita cinco vezes.
      Nota: Opcionalmente, pause o procedimento aqui e retomar em uma data posterior.
  3. Após o passo de acoplamento de aminoácidos, lavar a resina com DCM e armazenamento durante pelo menos vários dias a 4 ° C (para armazenamento de um período mais longo a resina, a - 20 ° C).
    1. Mover a resina do vaso reaccional para um cartucho de polipropileno.
    2. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
    3. Selar o cartucho firmemente polipropileno com uma tampa superior e torneira.
    4. Antes de iniciar uma nova síntese, a resina inchar durante 3-4 horas em DMF (7 mL).
  4. Acompanhamento da síntese
    1. Utilizar o teste de Kaiser (ninidrina) ou teste de cloranil para determinar rapidamente o progresso dasíntese. Opcionalmente, realizar uma reacção de clivagem em pequena escala para determinar a pureza e a massa do peptídeo sintetizado. Consulte a seção 9.
      Nota: Para solucionar o problema ver Tabela 3.
  5. Repita os passos 2.1 e 2.2 como desejado para sintetizar peptídeo orientados: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Anidrido / ligação de ácido

  1. Acoplamento anidrido
    1. Lava-se a resina com NMP. Adicionar NMP para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
    2. Dissolve-se 10 equivalentes do anidrido correspondente em NMP (5 mL), adicionar 1 equivalente de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) e 10 equivalentes de DIEA, para a solução (Tabela 1).
    3. Adicionar 10: mistura de anidrido / DMAP 10 / DIEA, para a resina e incubar durante 300 segundos (25: 1W, 75 ° C, Tabela 2). Escorra a solução.
    4. Lava-se a resina com NMP. Adicionar NMP para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
  2. Ácido acoplamento
    1. Lava-se a resina com DMF. Adicionar DMF à resina para 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
    2. Dissolve-se 10 equivalentes do ácido dicarboxílico correspondente em DMF (5 mL). Adicionar DMAP 1 equivalente e 10 equivalentes de N, N '-diisopropilcarbodiimida (DIC) para a solução (Tabela 1).
    3. Pré-activar-se a mistura através da mistura durante 30 min.
    4. Adicionar a mistura à resina e incubar durante 300 seg (25 W, 75 ° C, Tabela 2) e drenar a solução.
    5. Lava-se a resina com DMF. Adicionar DMF à resina para 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e a drenagem da solução. Repita o passo três vezes.

4. N-metiltritilo (MTT) Proteção Grupo DEPROTECTíon

Nota: A cadeia lateral da lisina foi protegido com N-metiltritilo (Mtt) 81, um grupo de protecção que pode ser selectivamente desprotegido sob condições ácidas lábeis 82,83. Grupo DEPROTECT Mtt proteger manualmente num agitador sem energia de microondas.

  1. Transferir a resina para um cartucho de polipropileno equipado com plugue tampa e torneira.
  2. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
  3. Adicionar 15-25 mL de uma mistura de 1% de ácido trifluoroacético (TFA), 5% de triisopropilsilano (TIS), e 94% de DCM para o cartucho de polipropileno por grama de resina.
    Nota: TFA é um ácido forte e corrosivo e é extremamente irritante para a pele, os olhos, e tecido pulmonar.
    1. Manter as soluções concentradas de TFA na capa em todos os momentos.
    2. Use equipamento de proteção individual (protecção dos olhos, um casaco e luvas de laboratório) e trabalho em uma capa bem ventilado. Alterar luvas prontamentese eles entram em contato com TFA e imediatamente limpa-up de todos os derramamentos. Se a pele ou os olhos entram em contato com o ácido, lave a área afetada imediatamente com água e lavar por mais 15 min.
  4. Coloque o cartucho de polipropileno num agitador e agitar durante 5 min à TA.
  5. Drenar a solução a partir do cartucho de polipropileno por aplicação de vácuo.
  6. Repita os passos 4.3-4.5, três vezes.
  7. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita cinco vezes.

5. A ciclização do péptido linear

  1. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita cinco vezes.
  2. Em um tubo de polipropileno de 50 ml, dissolve-se 5 equivalentes de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-ly-oxi-tris-pirrolidinofosfónio hexafluorphosphate (PyBOP) em Dibromometano (DBM, 5 mL) e adicionar 10 equivalentes de DIEA, para a solução (Tabela 1).
    3. Tabela 2). Escorra a solução.
  3. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.

6. Clivagem e desprotecção de grupos de cadeia lateral

  1. Lava-se a resina com DCM e éter dietílico.
    1. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita mais duas vezes.
    2. Adicionar éter dietílico para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita mais duas vezes.
  2. Seca-se a resina em exsicador de vácuo à temperatura ambiente durante pelo menos 3 h sobre hidróxido de potássio (KOH, 1-10 g).
  3. Pesa-se a resina seca e transferi-lo para um cartucho de polipropileno.
  4. Adicionar 10 ml de uma ácido trifluoroacético (TFA) cocktail de clivagem pré-arrefecido (por exemplo, 90% de TFA, 2,5% de água, 2,5% de TIS e fenol a 5%) para cada um grama de resina.
  5. Agitar por 3 hrà TA.
  6. Recolher a solução de clivagem de TFA, filtrando a resina para um tubo de polipropileno de 50 ml. Para a filtração, usar a frita que está no cartucho de polipropileno de 12 ml.
  7. Adicionar éter dietílico frio (35 ml) para o tubo.
  8. Centrifugar durante 5 min a 1207 xg, a 4 ° C.
  9. Decantar a camada de éter.
  10. Repita o passo 6,7-6,9, cinco vezes.

7. Secar a Cyclic Peptide Backbone

  1. Manter o péptido precipitado no mesmo tubo e secá-lo numa hote durante 30 min.
  2. Dissolve-se o péptido numa mistura 1: 1 de água e acetonitrilo (ACN).
  3. Congelar a solução do produto final em azoto líquido.
  4. Liofilizar o produto final.

8. Caracterização da Backbone cíclica Peptide

  1. Dissolve-se uma pequena amostra (1 mg) do produto em água (400 ul).
  2. Injectar o péptido dissolvido (10-200 ul) para uma fase inversa chromatograp líquida de alta eficiênciaHY sistema (RP-HPLC) para testar a pureza péptido 34.
  3. Verifique a massa do péptido utilizando espectrometria de massa assistida por matriz com dessorção por laser de ionização (MALDI-MS) 84.
    1. Misturar 1 ul (100 uM) de péptido em 1: 1 (v / v) mistura de acetonitrilo: água com 1 ul de matriz (ácido a 5 mg / ml, α-ciano-4-hidroxicinâmico) numa mistura 1: 1 (v / v) mistura de acetonitrilo: água com TFA (0,1%).
    2. Ponto 1 ml na placa MALDI-MS.
    3. Secar a amostra e colocá-lo no espectrómetro de massa.
  4. Pesa-se o péptido e o cálculo do rendimento percentual.
  5. Armazenar a -20 ° C.

9. Acompanhamento da Síntese

  1. Kaiser (ninidrina) teste 85
    1. Preparar as soluções de reagentes.
      1. Preparar a solução A por dissolução de 16,5 mg de cianeto de potássio (KCN) em 25 ml de água destilada. Dilui-se 1 ml da solução acima com 49 ml de piridina.
      2. Preparar a Solução Bpor dissolução de 1 g de ninidrina em 20 ml de etanol.
      3. Preparar a solução de C por dissolução de 40 g de fenol em 20 ml de etanol.
    2. Utilizar o ensaio de Kaiser para verificar a conclusão do acoplamento de aminoácidos ou a desprotecção do grupo de protecção.
      1. Transferir algumas esferas de resina para um tubo de ensaio.
      2. Adicionar três gotas (~ 100 uL) de cada solução (A, B e C) e misturar.
      3. Aquece-se a um tubo de ensaio no bloco de aquecimento a 110 ° C durante 5 min.
        Nota: grânulos coloridos azuis (resultado positivo) indicam reação de acoplamento incompleto ou desprotecção do grupo de protecção Fmoc.
  2. Teste de cloranil 86
    1. Preparar os seguintes reagentes frescos para cada teste.
      1. Prepara-se uma solução de 2% cloranil em DMF, a solução A.
      2. Prepara-se uma solução de 2% de acetaldeído em DMF, a solução B.
    2. Realizar o teste de cloranil para verificar a conclusão do acoplamento de aminoácidos ou tele desprotecção do grupo de protecção.
      1. Misturar 100 ml de solução A com 100 ml de solução B num tubo de 1,5 ml.
      2. Largue as contas e agitar suavemente durante 5 min.
        Nota: Os grânulos de cor castanha escuro (resultado positivo) indicam a desprotecção do grupo protector Fmoc, ou uma reacção de acoplamento incompleta.
  3. Reacção de cisão em pequena escala
    1. Retirar uma pequena quantidade de resina de polipropileno com um cartucho de 3 ml equipada com tampa da torneira e.
    2. Trata-se com uma mistura de 2 mL de 95% TFA, 2,5% de água e 2,5% de TIS.
    3. Agitar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente.
    4. Remover a resina por filtração usando a frita do cartucho de polipropileno e evapora-se os solventes por uma corrente de azoto.
    5. Dissolve-se o resíduo em água e analisar o produto por HPLC e / ou MS.

10. Viabilidade de promastigotas de Leishmania donovani em Cultura Ensaio

    <li> Leishmania donovani (L. donovani) condições de crescimento e tratamento
    1. Cultura L. promastigotas donovani em Modificação de Dulbecco do meio de Eagle (DMEM), com 4,5 g / l de glucose, L-glutamina, piruvato de sódio e a 26 ° C.
    2. Tratar o L. donovani promastigotas com péptidos cíclicos (100 uM) durante 24 h a 26 ° C.
  1. Leishmania donovani (L. donovani) ensaio de viabilidade
    1. Avaliar a viabilidade do parasita com 20 ul alamarBlue de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Determinar redução alamarBlue por medição da fluorescência (excitação a 570 nm e 590 nm de emissão). Valores de fluorescência mais altos indicam uma maior atividade metabólica e aumento da viabilidade do parasita.

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Representative Results

Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de uma pequena biblioteca focada de backbone peptídeos cíclicos que visam especificamente os PPIs vitais do parasita Leishmania e atuar como agentes antiparasitários (para revisão sobre peptídeos que têm como alvo os IPP como agentes antiparasitários 87). Através da síntese de novel backbone péptidos cíclicos, são conservadas em farmacóforos um andaime de tamanho extensível. A força da biblioteca focada aqui proposto é a capacidade de variar tamanhos péptido de andaime, permitindo um grau de liberdade conformacional restringida através de ciclização. Toda a síntese do esqueleto de péptidos cíclicos foi realizada utilizando um sintetizador automatizado de microondas no suporte sólido, segundo o protocolo Fmoc / tBu. A ciclização foi realizada através da criação de uma ligação amida entre o ligante, anidrido / ácido, e a amina da cadeia lateral da lisina. A clivagem da cadeia lateral e desprotecção final foram realizadas manualmente, sem a energia de microondas (para o esquema de síntese e fprodutos inal estrutura veja a Figura 3). O produto foi analisado por HPLC preparativa para produzir 25 mg de pó branco armazenados a -20 ° C. Uma amostra do produto foi verificada por MS (Figura 4) e o seu grau de pureza foi determinada utilizando HPLC analítica (Figura 5). Uma amostra de cada péptido cíclico foi enviado para o rastreio biológico. Um dos quatro péptidos cíclicos (PL1) era activo contra Leishmania donovani (L. donovani), um parasita que provoca leishmaniose visceral, a leishmaniose mais grave em humanos. Peptide PL1 reduziu a viabilidade do parasita em 75% em comparação com o tratamento testemunha (Tabela 4).

Figura 3
Figura 3. Esquema de Síntese e estrutura do péptido cíclico espinha dorsal sintetizados neste estudo Reagentes e condições:. (I) de acoplamento amino ácido: 300 seg, 25 W, 75 ° C,usando 1,1: 1: 2,2 aminoácido / ativador / base ativador. (ii) desprotecção de Fmoc: 30 s e 180 s ambos a 45 W, 75 ° C, usando 20% de piperidina em DMF + 0,1 M de HOBt. (iii) Anidrido de acoplamento: 300 seg, 25 W, 75 ° C, usando 10: 10: 1 de anidrido / DIEA / DMAP em NMP. (iv) desprotecção Mtt: 3 * (300 segundos, 0 W, RT), utilizando 1: 5: 94 de TFA / TIS / DCM. (v) A ciclização: 300 seg, 25 W, 75 ° C, utilizando-se 05:10 PyBOP / DIEA em dBm. (vi) A clivagem e desprotecção: 3 horas, 0 W, RT, utilizando 90: 2,5: 2,5: 5 TFA / TIS / H2O / fenol. Os péptidos foram conjugados com um 47-57 (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) péptido transportador TAT através de uma ligação amida, como parte da síntese em fase sólida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. MALDI-TOF de espectrometria de massa de rastreiobackbone representante peptídeo cíclico. A massa observada, 2853.456 está em estreita concordância com a massa calculada, 2854,271. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. rastreio analítico HPLC em fase reversa de espinha dorsal representante péptido cíclico. Os traços de HPLC analítica do produto em bruto (A) e purificada (B) esqueleto peptídico cíclico são mostrados. Os sistemas de solventes utilizados foram A (H2O com 0,1% de TFA) e B (CH3CN com 0,1% de TFA). Um gradiente linear de 5-50% de B, a 1 ml / min em 15 min a 40 ° C com um C18, 5 um, 150 mm coluna foi aplicado e a detecção foi a 215 nm. Por favor clique aquipara ver uma versão maior desta figura.

Solução Reagente PM (g / mol) d (g / ml) Volume (ml) Concentração (M) Quantia total
- Solução de ácido amino - Aminoácido alanina 311,34 0,2 6,23 g
0,2 M de aminoácido em DMF DMF 100 100 ml
Um exemplo para alanina amino ácido, mas o mesmo cálculo deve ser feito para cada um dos aminoácidos, com o PM apropriado. Para preparar uma solução de 100 ml de ácido amino dissolver 6,23 g de aminoácido alanina em 100 ml de DMF. Armazenar a 4 ° C.
- Solução de desprotecção- HOBt 135,1 0,1 3,37 g
Solução a 20% v / v de piperidina em DMF com 0,1 M de HOBt Piperidina 50 50 ml
DMF 200 200 ml
A desprotecção é usado para a remoção dos α Fmoc N - grupo protector. Para preparar uma solução de 250 ml de desprotecção dissolver 3,37 g de HOBt em 200 ml de DMF e adicionar 50 ml de piperidina. Armazenar a 4 ° C.
- Solução Activador - HBTU 379,24 0,45 18,96 g
HBTU 0,45 M em DMF DMF 100 100 ml
Activador éutilizado com a base activador para activar o aminoácido antes da reacção de acoplamento. Para preparar uma solução de activador de 100 ml, dissolver 18,96 g de HBTU em 100 ml de DMF. Armazenar a 4 ° C.
- Solução de base Activator - DIEA 129,24 0,742 2 34.80 ml
2 M de DIEA em NMP NMP 65,20 ml
Base de activador é utilizado com o activador para activar o aminoácido antes da reacção de acoplamento. Para preparar 100 ml uma mistura solução de base ativador de 34,8 ml e 65,2 ml DIEA NMP. Armazenar a 4 ° C.
Solução Reagente PM (g / mol) d (g / ml) Volume (ml) Eq Quantia total
Solução de anidrido - 10: 1: 10 / anidrido DMAP / DIEA em NMP Glutárico / anidrido succínico 114,1 / 100,07 10 0,11 / 0,10 g
DMAP 122,2 1 0,01 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
NMP 5 5 ml
Dissolve-se 0,11 / 0,10 g de glutárico / anidrido succínico em 5 ml de NMP, adicionar 0,01 g de DMAP e 0,09 mL de DIEA, para a solução. Preparar uma solução fresca.
Solução de ácido - 10: 1: 10 Ácido / DMAP / DIC em DMF Adípico / ácido pimélico 146,14 / 160,17 10 0,15 / 0,16 g
DMAP </ td> 122,2 1 0,01 g
DIC 126,2 0,806 10 0,16 ml
DMF 5 5 ml
Dissolve-se 0,15 / 0,16 g de adípico / ácido pimélico em 5 ml de DMF, adicionar 0,01 g de DMAP e 0,16 ml de DIC para a solução. Preparar uma solução fresca.
Solução ciclização - 05:10 PyBOP / DIEA em DBM PyBOP 520,3 5 0,26 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
DBM 5 ml 5 ml
Dissolve-se 0,26 g de PyBOP em 5 ml DBM e adicionar 0,09 mL de DIEA, para a solução. Prepare umsolução fresca.

Tabela 1. Reagentes e soluções para a síntese de péptidos cíclicos espinha dorsal. Lista das soluções e reagentes para a síntese é fornecida.

Ciclo de micro-ondas Potência (Watts) Temp (° C) Tempo (seg)
1 O acoplamento de ácidos aminados 25 75 300
2 A desprotecção do grupo protector Fmoc (a) desprotecção inicial 45 75 30
(b) desprotecção completa 45 75 180


Tabela 2. ciclos de microondas para acoplamento e desprotecção. Ciclos de Microondasacoplamento de aminoácidos e Fmoc-desprotecção. (1) Acoplamento de aminoácidos. (2) desprotecção do grupo Fmoc de mascaramento é feito em dois passos: (a) iniciais e (b) desprotecção completa.

Problema Possível razão Solução
Testes de Kaiser ou cloranil são positivos após o acoplamento de aminoácidos O acoplamento de aminoácidos é incompleta Repita o passo de acoplamento
Os péptidos não são eficazmente separados do sobrenadante O excesso de TFA quantidade Evapora-se a amostra utilizando uma corrente de azoto
A presença de sequências de deleção no produto Remoção de Fmoc, é incompleto Monitorar a desprotecção por meio de testes de Kaiser ou cloranil e / ou clivagem em pequena escala, no caso da remoção de Fmoc, é o passo de repetição incompleta
Coupl aminoácidoing é incompleta Controlar o acoplamento por meio de testes de Kaiser ou cloranil e / ou clivagem em pequena escala, no caso de o acoplamento de aminoácidos é incompleta repetir o passo e / ou tempo de reacção mais longo usar

Tabela 3. Resolução de Problemas Lista conselho de soluções para os desafios sintéticos mais comuns são fornecidas.

Peptide Seqüência n SENHORITA. Cal. MS Obs. HPLC Rendimento Viabilidade Parasite
PL1 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 2 2854.321 2853.456 98% 86% 25%
pl2 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 3 2868.348 98% 87% 100%
PL3 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 4 2882.375 2881.823 96% 89% 97%
PL4 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 5 2896.402 2895.603 97% 85% 98%

Tabela 4. Caracterização e bioactividade dos péptidos no presente estudo. N refere-se ao número de metilenos no espaçador alquilo (ver Figura 3 para a estrutura). MS foi realizada utilizando a técnica de MALDI e a pureza foi determinada por HPLC analítica. Os peptídeos foram adicionados a promastigotas de Leishmania donovani e a viabilidade dos parasitas foi avaliada e expressos como percentagem de sobrevivência em relação a culturas de controlo incubadas na ausência de péptido. Apenas PL1 teve alta atividade leishmanicida. O observadorfoi cegado para as condições experimentais. Os dados são representativos de três experiências independentes.

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Discussion

A síntese de uma biblioteca focada backbone de péptidos cíclicos derivados da proteína falta de parasita Leishmania usando a um sintetizador de microondas é descrita completamente automatizado. Uma biblioteca orientada de péptidos cíclicos foi desenvolvido com farmacóforos conservada e vários ligantes. A adição de vários ligantes, tais como o anidrido glutárico, anidrido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, lisina, ornitina, e outros blocos de construção podem ser utilizados para aumentar a variedade do espaço conformacional dos péptidos cíclicos. A síntese de uma biblioteca de péptidos cíclicos focado permite aos investigadores para rastrear o espaço conformacional óptima. Uma vez que a conformação de péptidos cíclicos varia dependendo de parâmetros tais como a dimensão do anel e posição, diversos análogos com diferentes conformações pode ser gerada, o que pode ser útil em relação estrutura-actividade biológica estuda 88.

A principal desafio na SPPS é diagnosticar o synthetic progresso e resolução de problemas uma vez que não há intermediários são isolados. Portanto, vários testes colorimétricos podem ser utilizados para monitorizar a reacção, tal como aqueles que identificam aminas livres por testes de Kaiser e cloranil. Se os testes de Kaiser ou cloranil não são indicativos (por exemplo, prolina e hidroxi-prolina não reagem com ninidrina, da mesma forma como os outros aminoácidos, porque o seu grupo alfa-amino é parte de um anel de cinco membros), uma reacção de clivagem em pequena escala e análise de espectrometria de massa pode ser aplicado para monitorizar o progresso de síntese.

Tempo de clivagem e o cocktail de clivagem pode ser modificado em função das propriedades químicas e número dos grupos protectores utilizados. Recomenda-se que um ensaio de clivagem inicial usando uma pequena quantidade de resina (1-10 mg) ser realizada para verificar as condições adequadas. King et al. Testaram diferentes cocktails de clivagem para vários peptídeos e suas diretrizes detalhadas podem ser usados ​​para otimizar reaction. 89 condições Para backbone peptídeos cíclicos, a incubação durante pelo menos 3 horas é recomendado como um padrão para a clivagem completa. No entanto, os péptidos que contêm um elevado número de grupos protectores ou grupos protectores difíceis (por exemplo, éster de t-butilo ou pentametil-2,3-di-hidrobenzofurano-5-sulfonilo) deve ser incubada durante um tempo mais longo para garantir a desprotecção completa. Nisto, nós não estudou sistematicamente o tempo de clivagem ótima ou cocktail. No entanto, verificou-se que um tempo de clivagem de curta duração (menos de 2 horas) resultou em clivagem incompleta de alguns grupos de protecção.

O protocolo de síntese de peptídeos padrão microondas é um método geralmente aplicável para a síntese de uma variedade de péptidos. Na maioria dos casos, a utilização de um sintetizador automático de microondas reduz a duração de síntese e aumenta o rendimento e pureza dos produtos. Além disso, diminui a reacções secundárias tais como a racemização e a formação de aspartimida. Embora não tenhamos feitouma comparação lado-a-lado do forno de microondas e síntese convencional neste estudo, com base na nossa experiência e de outros laboratórios, foi mostrado que a utilização de síntese assistida por micro-ondas é superior ao protocolo convencional 61,70. Quase todos os activadores e resinas podem ser eficazmente utilizados em SPPS microondas e o método geral também pode ser aplicado para a síntese de uma variedade de péptidos modificados, tais como, glicopéptidos, fosfopéptidos, azapeptides, peptóides, e péptidos cíclicos 90.

A ciclização é uma forma conveniente de aumentar a potência e a estabilidade dos precursores lineares. Os péptidos cíclicos podem obter uma conformação restrita desejável que pode contribuir para aumentar a afinidade de ligação e a selectividade. Além disso, os péptidos lineares podem ser modificados para conter várias voltas cíclicas, o que lhes permite, eventualmente, alvo múltiplas interfaces de ligação às proteínas endógenas 91. No entanto, é importante notar que a ciclização não necessarily levar a melhorias na totalidade ou, por vezes, qualquer uma destas propriedades. Certos péptidos cíclicos podem resultar em conformações que não são reconhecidos por receptores-alvo (por exemplo 92,93) .Portanto, uma biblioteca de péptidos cíclicos focado é necessário para o rastreio de bioactividade. Em conclusão, os péptidos sintéticos cíclicos apresentam características farmacológicas desejáveis, são suficientemente pequenos para atravessar a membrana celular, e são suficientemente grandes para ter uma elevada selectividade. Alta potência, especificidade e contribuir para o perfil seguro promessa 'péptidos cíclicos como candidatos a fármacos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, e Daria Mochly-Rosen para discussões úteis. O trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) para nq Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic.
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).

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References

  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37 (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282 (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15 (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, American Chemical Society. 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305 (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10 (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24 (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochemistry. 30 (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116 (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O'Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61 (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121 (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274 (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6 (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using 'safety catch' methodology. J Vis Exp. (63), e4112 (2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2 (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91 (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based 'building block' approach. Nat. Protoc. 2 (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126 (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9 (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446 (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291 (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3 (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1 (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90 (4), 526-536 (2008).
  33. O'Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10 (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84 (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79 (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis - A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2 (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29 (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37 (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5 (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34 (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57 (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20 (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27 (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5 (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13 (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11 (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7 (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8 (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71 (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12 (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14 (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85 (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7 (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4 (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7 (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51 (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75 (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10 (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14 (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2 (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20 (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28 (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7 (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268 (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198 (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6 (6), e20710 (2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259 (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13 (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45 (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60 (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6 (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373 (2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33 (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32 (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39 (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36 (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41 (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28 (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58 (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52 (2), 83-90 (2006).

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Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).

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