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Biology

एक "Humanized" सृजन Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53594
Automatic Translation
1, 1
1Molecular and Cellular Biology Graduate Group, Biology Department, University of Massachusetts, Amherst

Introduction

कोशिका विभाजन के दौरान जीनोम के बराबर अलगाव दोहराया डीएनए और धुरी सूक्ष्मनलिकाएं के बीच सही बातचीत की आवश्यकता है। सूक्ष्मनलिकाएं शारीरिक रूप से kinetochore 1 के रूप में जाना जाता है सेंट्रोमीयरों पर assembles कि प्रोटीन की टुकड़ी के माध्यम से गुणसूत्रों के साथ बातचीत। गुणसूत्रों का सही वितरण बहन गुणसूत्रबिंदुओं जिसमें प्रत्येक बहन विपरीत धुरी डंडे से होने वाले सूक्ष्मनलिकाएं साथ जुड़ा हुआ है, Bioriented रहे हैं कि आवश्यकता है। Kinetochore सूक्ष्मनलिका (के.टी.-मीट्रिक टन) Bioriented रचना में नहीं हैं कि संलग्नक जल्दी से और कुशलता त्रुटि सुधार के रूप में जाना प्रक्रिया में biorientation स्थापित करने का अवसर प्रदान करने के लिए अस्थिर कर रहे हैं। पहले स्तनधारी कोशिकाओं में स्थापित किया गया था कि एक त्रुटि सुधार परख 5 (kinesin -5) Eg5 के खिलाफ प्रतिवर्ती छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग कर Monopolar स्पिंडल कोडांतरण की आवश्यकता है। नशीली दवाओं के उपचार गलत syntelic संलग्नक के एक भीड़ उत्पन्न करता है जो बॉट मेंज बहन गुणसूत्रबिंदुओं एक ही धुरी पोल को देते हैं। दवा की एक बाद वार्शआउट त्रुटि सुधार प्रक्रिया के दृश्य के लिए अनुमति देता है। त्रुटि सुधार परख गलत के.टी.-मीट्रिक टन अनुलग्नकों को सही करने के लिए उम्मीदवार प्रोटीन के योगदान का अध्ययन करने के लिए छोटे अणु inhibitors या knockdowns की उपस्थिति में किया जा सकता है।

जीवित कोशिकाओं में त्रुटि सुधार कल्पना करने की क्षमता आगे इस जटिल प्रक्रिया में शामिल आणविक तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, ज्यादातर सेल लाइनों में मौजूद क्रोमोसोम के बड़ी संख्या में अलग-अलग के.टी.-मीट्रिक टन अनुलग्नकों के अवलोकन में एक चुनौती बन गया है। वे के रूप में कुछ के रूप में 4 गुणसूत्रों 6, लेकिन के छोटे अणु अवरोधकों को रोकने के रूप में ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं त्रुटि सुधार परख को लागू करने के लिए आदर्श होगा इस तरह के एस trityl एल सिस्टीन (STLC) के रूप में kinesin 5 और 7-9 monastrol ड्रोसोफिला कोशिकाओं में धुरी विधानसभा या kinesin-5 मोटर समारोह को प्रभावित नहीं करते। इसलिए हम पीढ़ीटेड kinesin -5 अवरोधकों के प्रति संवेदनशील है कि एक inducible प्रमोटर के तहत मानव kinesin -5 व्यक्त एक ड्रोसोफिला S2 सेल लाइन। इस प्रोटोकॉल अंतर्जात ड्रोसोफिला kinesin -5 सजात, Klp61F पछाड़ना, और सेल आधारित त्रुटि सुधार परख में इस सेल लाइन का उपयोग कैसे करें।

Protocol

1. Transfecting S2 प्रकोष्ठों

  1. एक पहले से सुसंस्कृत 25 सेमी 2 कुप्पी से, करने के लिए उन्हें 100% confluency पर 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा GFP-α ट्यूबिलिन व्यक्त S2 10 कोशिकाओं को जोड़ने, और अनुमति देने के एक 35 मिमी टिशू कल्चर डिश के नीचे करने के लिए अर्ध-पालन लगभग 1 घंटा।
  2. डिश से मीडिया निकालें। Eg5-mCherry के Transfect 2 माइक्रोग्राम 10% FBS के साथ पूरक श्नाइडर के मीडिया के 11 1 के साथ मिलीलीटर का निर्माण निर्माता प्रोटोकॉल का पालन, (श्नाइडर के मीडिया के रूप में इसके बाद के लिए कहा गया है) और अभिकर्मक। Parafilm के साथ पकवान को सील करने और 16-18 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
  3. श्नाइडर के मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें।
  4. 3 दिन के बाद अभिकर्मक पर, एक परीक्षण शामिल होने के लिए श्नाइडर के मीडिया के 1.5 मिलीग्राम से युक्त एक नया 35 मिमी टिशू कल्चर डिश में कोशिकाओं के 500 μl हस्तांतरण। CuSO 4 जोड़कर Eg5-mCherry के अभिव्यक्ति प्रेरित
  5. Concanavalin ए-लेपित coverslips, कोट करने के लिए एक समाधान (0.5 मिलीग्राम / एमएल एच 2 ओ में भंग) concanavalin की पिपेट पर्याप्त मात्रा बनाने के लिए एक एसिड धोया coverslip, अधिक दूर, और शुष्क हवा के लिए coverslip अनुमति देते हैं।
  6. तो coverslip पर प्रेरित कोशिकाओं की 100% confluency पर 500 μl बीज, एक स्वच्छ 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान में एक 22 मिमी x 22 मिमी concanavalin ए-लेपित coverslip रखें और कोशिकाओं आरटी पर 1 घंटे के लिए पालन करने के लिए अनुमति देते हैं।
  7. , Eg5-mCherry अभिव्यक्ति के लिए जाँच एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर आरटी पर इमेजिंग के लिए मीडिया के साथ एक गुलाब के चेंबर में coverslip (या उपयुक्त इमेजिंग पोत) इकट्ठा करने के लिए। कोशिकाओं कल्पना करने के लिए उचित प्रकाश स्रोतों और फिल्टर सेट का प्रयोग करें। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में इस्तेमाल माइक्रोस्कोप एक एलईडी सफेद प्रकाश स्रोत और EGFP (FITC / Cy2) और DsRed (TRITC / Cy3) फिल्टर क्यूब्स है। Eg5-mCherry सूक्ष्मनलिकाएं लिए localizes और एनईए समृद्ध हैआर धुरी डंडे।
  8. यह सुनिश्चित करने के बाद कोशिकाओं Eg5-mCherry और GFP-α ट्यूबिलिन दोनों व्यक्त कर रहे हैं कि, श्नाइडर के मीडिया के 4 मिलीग्राम से युक्त एक 25 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क ट्रांसफ़ेक्ट, uninduced कोशिकाओं के शेष हस्तांतरण।
  9. कोशिकाओं की कुप्पी के लिए 25 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में Blasticidin एस एचसीएल जोड़ें और कोशिका मृत्यु समय समय पर Eg5-mCherry की अभिव्यक्ति के लिए जाँच करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा रहता है जब तक 25 माइक्रोग्राम / एमएल Blasticidin एस एचसीएल की उपस्थिति में बंटवारे के लिए जारी है। 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेल लाइनों को सेते हैं।
    नोट: समय के साथ Eg5-mCherry बढ़ जाती व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत।
  10. कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, दवा के अभाव में विभाजित है और भविष्य में उपयोग के लिए 12 कोशिकाओं फ्रीज करने के लिए जारी है।

2. शाही सेना के हस्तक्षेप

  1. पीसीआर होना करने के लिए (सामग्री सूची में प्रदान की अनुक्रम) जोड़ा T7 प्रमोटर अनुक्रम के साथ प्राइमर का उपयोग सीडीएनए (LD15641) से Klp61F की एक ~ 500 बीपी क्षेत्र बढ़ानाdsRNA संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया।
    1. टेम्पलेट डीएनए के 100 एनजी, प्रत्येक प्राइमर, उचित बफर, और पोलीमर्स के 25 माइक्रोन से युक्त चार पीसीआर प्रतिक्रियाओं, 50 μl प्रत्येक की स्थापना की। पोलीमर्स के निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार thermocycler पर पीसीआर प्रोटोकॉल सेट करें।
    2. पूल और एक पीसीआर निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किट को साफ उपयोग करते हुए साफ चार पीसीआर प्रतिक्रियाओं। -20 डिग्री सेल्सियस पर साफ टेम्पलेट स्टोर।
  2. एक T7 शाही सेना प्रतिलेखन किट का उपयोग निर्माता के निर्देशों का पालन टेम्पलेट से डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) तैयार करें। DsRNA की ~ 5-15 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता की अपेक्षा करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर dsRNA स्टोर।
  3. DsRNA साथ Klp61F पछाड़ना, 25% confluency पर Eg5-mCherry व्यक्त S2 कोशिकाओं 1 घंटे के लिए एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान की तह तक अर्द्ध पालन अनुमति देते हैं।
  4. व्यंजन से मीडिया निकालें और Klp61F के खिलाफ dsRNA के 5 ग्राम जोड़ने (ड्रोसोफिला kinesin -5) सीरम मुक्त श्नाइडर के 1 मिलीलीटर में पतला 'मीडिया।
  5. तो 10% FBS के साथ श्नाइडर के मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ने, 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं। 25 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  6. 24 घंटा dsRNA उपचार के बाद, 500 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए CuSO 4 जोड़कर Eg5-mCherry की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित। एक और 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।

3. लाइव सेल इमेजिंग

  1. एक स्वच्छ 35 मिमी टिशू कल्चर डिश में एक लेपित coverslip concanavalin एक 22 मिमी x 22 मिमी रखें।
  2. बीज dsRNA के साथ इलाज किया और प्रेरित हे / एन concanavalin एक लेपित coverslip पर और उनके बारे में 1 घंटे के लिए पालन करने की अनुमति दी गई है कि कोशिकाओं के 500 μl।
  3. इमेजिंग के लिए एक गुलाब के चेंबर में coverslip (या उपयुक्त पोत) इकट्ठे।
  4. Eg5-mCherry और GFP-α ट्यूबिलिन दोनों व्यक्त mitotic कोशिकाओं का पता लगाएं।
    नोट: धुरी दो ध्रुव के लिए आवश्यक है, जो Klp61F, के बाद से Monopolar स्पिंडल होनी चाहिए केवल GFP-α ट्यूबिलिन व्यक्त mitotic कोशिकाओं, 10,13 नीचे गिरा दिया है।
  5. Eg5-mCherry और GFP-α ट्यूबिलिन दोनों व्यक्त कोशिकाओं में द्विध्रुवी स्पिंडल प्रति मिनट (जैसे, एक फ्रेम) के समय चूक छवियों को ले लीजिए।
  6. इमेजिंग, वहीं गुलाब कक्ष से मीडिया को दूर, और श्नाइडर के मीडिया धुरी पतन कल्पना करने के लिए कक्ष में लगातार 3 मीडिया आदान-प्रदान (~ 5 मिलीलीटर कुल) पर 1 माइक्रोन STLC युक्त के साथ बदलें।
  7. ध्यान से गुलाब कक्ष से STLC युक्त मीडिया को हटाने, और ताजा मीडिया के साथ गुलाब चैम्बर एक आखिरी बार refilling से पहले श्नाइडर के मीडिया 4x (6-8 मिलीलीटर कुल) में धो, दवा वार्शआउट और धुरी पतन रिवर्स करने के लिए। इमेजिंग जारी रखें।

4. त्रुटि सुधार परख

  1. स्वच्छ 35 मिमी टिशू कल्चर बर्तन में एक लेपित coverslips concanavalin एक 22 मिमी x 22 मिमी रखें।
  2. बीज concanavalin एक लेपित coverslip पर Klp61F dsRNA के साथ व्यवहार किया और उन्हें पालन करने की अनुमति दी गई है कि कोशिकाओं के 500 μl।
  3. कोशिकाओं के बाद adher हैंएड, 2 मिलीलीटर तक अंतिम मात्रा लाने के लिए प्रत्येक पकवान श्नाइडर के मीडिया के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. , बँटवारा में कोशिकाओं को गिरफ्तार व्यंजन से प्रत्येक के लिए 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता के लिए MG132 जोड़ने के लिए, और 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. 1 माइक्रोन STLC जोड़ें और ध्रुवों के रूप में करने की अनुमति के लिए 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. Coverslips ताजा श्नाइडर के मीडिया के 2 मिलीलीटर प्रत्येक समय के साथ 3x rinsing द्वारा STLC बाहर धो लें।
  7. एक नियंत्रण के रूप में किसी भी औषधीय दवाओं (जैसे, अरोड़ा काइनेज अवरोधकों) या DMSO के अलावा श्नाइडर के मीडिया के साथ coverslips सेते हैं।
    नोट: एफडीए सांद्रता भिन्न है और उचित अंतिम सांद्रता प्रयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। मीडिया में 1000: शेयर समाधान आमतौर पर अवरोध करनेवाला एक पतला है कि इस तरह के बने होते हैं। इस मामले में एक 1: DMSO के (या उपयुक्त विलायक) के 1,000 कमजोर पड़ने वाहन पर नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। हम 40 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में अरोड़ा बी अवरोध करनेवाला Binucleine 2 का उपयोग करें।
  8. अलग अलग समय बिंदुओं टी में कोशिकाओं को ठीक करेंओ द्विध्रुवी धुरी गठन की प्रगति का निरीक्षण और kinetochore लगाव राज्यों का आकलन करने के लिए। ठीक करना:
    1. जल्दी 1x BRB-80 के 2 मिलीलीटर के साथ coverslips कुल्ला।
    2. 10 मिनट के लिए 1x BRB-80 में पतला 10% paraformaldehyde के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। एक रासायनिक हुड में ध्यान pipet paraformaldehyde।
    3. 8 मिनट के लिए 1x पीबीएस + 1% ट्राइटन एक्स के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं permeabilize।
    4. धो 1x पीबीएस + 0.1% ट्राइटन एक्स के 2 मिलीलीटर के साथ 3x स्लाइड।
    5. स्थानांतरण सेल की ओर एक 150 मिमी पेट्री डिश में (Parafilm के लेबल करने के लिए एक मार्कर का उपयोग उचित रूप से स्लाइड पर नज़र रखने के लिए) Parafilm की एक शीट पर ऊपर का सामना coverslips।
    6. 150 μl उबला हुआ गधा सीरम (बीडीएस) के साथ coverslips कवर और बाध्यकारी गैर विशिष्ट एंटीबॉडी ब्लॉक करने के लिए 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
      नोट: यहाँ, निर्धारण प्रोटोकॉल एक बिंदु पर बाद में जारी रखा जाना बंद कर दिया जा सकता है। Coverslips अप करने के लिए 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक नमी कक्ष में संग्रहित किया जा सकता है। नमी कक्ष बनाने के लिए, एक 150 मिमी पकवान के रिम लाइनएक गीला प्रयोगशाला से पोंछ और पेट्री डिश ढक्कन के साथ कवर किया।
    7. क्रमश: माइक्रोग्राम / एमएल और 1 (निर्माता की सिफारिशों के अनुसार या) ब्लॉक निकालें, और प्राथमिक एंटीबॉडी के 150 μl 2 माइक्रोग्राम / एमएल के अंतिम सांद्रता के लिए गुणसूत्रबिंदुओं और सूक्ष्मनलिकाएं के लिए दाग बीडीएस में उचित पतला साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए coverslips सेते ।
      नोट: यहाँ, निर्धारण प्रोटोकॉल एक बिंदु पर बाद में जारी रखा जाना बंद कर दिया जा सकता है। Coverslips अप करने के लिए 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक नमी कक्ष में संग्रहित किया जा सकता है।
    8. धो 1x पीबीएस + 0.1% ट्राइटन एक्स के 500 μl के साथ 3x coverslips।
    9. बीडीएस में पतला उचित fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ आरटी पर 30-60 मिनट के लिए coverslips सेते हैं।
    10. धो 1x पीबीएस + 0.1% ट्राइटन एक्स के 500 μl के साथ 3x coverslips।
    11. 5 मिनट के लिए एक माइक्रोग्राम / एमएल DAPI के अंतिम एकाग्रता युक्त बीडीएस की 150 μl के साथ coverslips सेते हैं।
    12. Coverslips 2x साथ 1x पीबीएस + 0.1% ट्राइटन एक्स धो लें, और ग माउंटoverslips नीचे बढ़ते मीडिया के 8 μl के साथ एक 3x1 "स्लाइड पर सेल की ओर। स्लाइड्स पर coverslips स्थिर करने के लिए नेल पॉलिश के साथ कोनों उभर आती है।
  9. Eg5-mCherry व्यक्त कर रहे हैं कि द्विध्रुवी स्पिंडल के साथ छवि कोशिकाओं। एक 100X उद्देश्य का उपयोग सभी चैनलों में 0.2 माइक्रोन अंतराल पर 30 विमानों से मिलकर एक जेड श्रृंखला ले लो। ध्यान से लगाव (Bioriented या syntelic संलग्नक) राज्यों निर्धारित करने के लिए गुणसूत्रबिंदुओं और सूक्ष्मनलिकाएं का विश्लेषण।

Representative Results

Klp61F द्विध्रुवी स्पिंडल बनाने के लिए आवश्यक है। मानव kinesin -5, Eg5, ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं (चित्रा 1 ए और डी) में Klp61F के समारोह बचाव कर सकते हैं। Kinesin-5 अवरोध करनेवाला (STLC) के अलावा पर, सफल आरएनएआई पर अंतर्जात Klp61F कमी कोशिकाओं में एक monopole (चित्रा 1C और एफ) में जिसके परिणामस्वरूप मोटर ड्रॉप (चित्रा 1 बी और ई), और धुरी गिर के सूक्ष्मनलिका जुड़े स्तर, (पूरक मूवी 1)। यह kinesin -5 गतिविधि मानव कोशिकाओं में धुरी दो ध्रुव बनाए रखने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि द्विध्रुवी स्पिंडल humanized S2 कोशिकाओं में STLC के अलावा पर पतन उल्लेखनीय है कि। यह दिलचस्प विसंगति दो मॉडल प्रणाली 14 में interpolar सूक्ष्मनलिका ओवरलैप और / या स्थिरता में मतभेद की वजह से हो सकता है। Kinesin -5 निषेध (2A चित्रा और ई) REVE किया जा सकता एक द्विध्रुवी धुरी की दवा और वसूली के बाहर धोने से rsed समय के साथ पीछा किया जा सकता है। अवरोध करनेवाला (चित्रा 2 बी और एफ) को हटाने पर, Eg5-mCherry एक द्विध्रुवी धुरी assembles (चित्रा -2 सी और जी) के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं साथ-एसोसिएट्स रहे हैं, और कोशिकाओं को एक द्विध्रुवी पश्चावस्था (चित्रा 2 डी और एच, पूरक फिल्म 2 में प्रगति कर सकते हैं )।

आकृति 1
1. इसके अलावा 1 माइक्रोन STLC चित्रा ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं में Monopolar स्पिंडल की ओर जाता है। छवियों प्रतिनिधि Eg5-mCherry (एसी) और GFP-α ट्यूबिलिन (डीएफ) व्यक्त एक ड्रोसोफिला S2 सेल के समय चूक इमेजिंग से 1 माइक्रोन के अलावा दौरान STLC। Eg5 अवरोध करनेवाला 3 मिनट में जोड़ा गया है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। टाइमस्टांप = मिनट: सेकंड। w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. STLC के हटाने पर एक द्विध्रुवी धुरी सुधारों। एक STLC वार्शआउट प्रयोग के दौरान Eg5-mCherry (एडी) और GFP-α ट्यूबिलिन (एह) व्यक्त एक ड्रोसोफिला 2 सेल के समय चूक इमेजिंग से प्रतिनिधि छवियाँ। STLC 5 मिनट पर बाहर धोया गया था। STLC को दूर करने के लिए 1 घंटे के भीतर एक द्विध्रुवी धुरी सुधारों। स्केल बार = 5 माइक्रोन। टाइमस्टांप: न्यूनतम:। सेकंड में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "लक्ष्य =" _blank "> पूरक मूवी 1. (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। विदेफीएल्ड प्रतिदीप्ति इमेजिंग Eg5-mCherry व्यक्त एक ड्रोसोफिला S2 सेल के एक प्रतिनिधि उदाहरण है ( बाएं) और GFP-α ट्यूबिलिन (दाएं) 1 माइक्रोन STLC 2 मिनट में जोड़ा गया है, और धुरी रूपों अवरोध करनेवाला के अलावा के बाद 10 मिनट के भीतर एक monopole। छवियाँ हर 1 मिनट हासिल कर लिया और 10 तख्ते की दर से खेले थे। प्रति सेकंड। स्केल बार = 5 माइक्रोन।

फिल्म 2
पूरक मूवी 2. (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। Eg5-mCherry (बाएं) और GFP-α ट्यूबिलिन (दाएं) को व्यक्त करने के लिए एक ड्रोसोफिला S2 सेल के एक प्रतिनिधि उदाहरण के विदेफीएल्ड प्रतिदीप्ति इमेजिंग। 1 माइक्रोन STLC युक्त मीडिया हटा दिया गया था और5 मिनट में rinsed। अवरोध करनेवाला को दूर करने के लिए 1 घंटे के भीतर एक द्विध्रुवी धुरी सुधारों। छवियाँ हर 1 मिनट हासिल कर लिया और प्रति सेकंड 10 फ्रेम की दर से खेले थे। स्केल बार = 5 माइक्रोन।

Discussion

त्रुटि सुधार Visualizing इस महत्वपूर्ण और जटिल सेलुलर प्रक्रिया में शामिल कदम का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। ऐसा करने के लिए, गलत संलग्नक प्रतिवर्ती अवरोधकों का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं, और त्रुटि सुधार दवा की वार्शआउट पर मनाया जाता है। इस परख मूल रूप स्तनधारी टिशू कल्चर कोशिकाओं 5 का उपयोग कर विकसित किया गया था। हालांकि कई मॉडल स्तनधारी प्रकार की कोशिकाओं में गुणसूत्रबिंदुओं की बड़ी संख्या की उपस्थिति व्यक्ति त्रुटि सुधार की घटनाओं को देख में एक चुनौती बन गया है। ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं त्रुटि सुधार के अवलोकन के लिए उन्हें एक और अधिक बेहतर सेल लाइन बनाने, गुणसूत्रबिंदुओं के रूप में कुछ के रूप में 4 जोड़े के पास है। हालांकि, एक बड़ी खामी कई अवरोधकों ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं में अप्रभावी कर रहे हैं। इस प्रकार, मानव kinesin -5 व्यक्त एक humanized ड्रोसोफिला S2 सेल लाइन उत्पन्न करने की क्षमता त्रुटि सुधार का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं हो सकता है एकत्रुटि सुधार का अध्ययन करने के लिए बेहतर सेल लाइन, सेल लाइन प्राप्त करने और आवश्यक जीन नीचे दस्तक में शामिल कई कदम इस तकनीक के लिए कुछ चुनौती बन गया है। उदाहरण के लिए, अभिकर्मक क्षमता काफी कम हो सकता है। कोशिकाओं के कम से कम 20% Eg5-mCherry व्यक्त कर रहे हैं, तो चयन प्रक्रिया में लंबा समय लग जाएगा के रूप में, अभिकर्मक दोहराया जाना चाहिए। इसके अलावा, दोनों फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत समय के साथ कम हो सकती है। यह क्रमश: Eg5-mCherry व्यक्त कोशिकाओं और GFP-α ट्यूबिलिन के लिए चयन करने के लिए Blasticidin एस एचसीएल और hygromycin बी की उपस्थिति में कोशिकाओं बंटवारे से दूर किया जा सकता है। यह ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं कई मानव प्रोटीन और करने के लिए orthologues है कि नोट के लिए भी महत्वपूर्ण है; इसलिए, यह अंतर्जात प्रोटीन के लिए पछाड़ना शर्तों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इष्टतम पछाड़ना की स्थिति dsRNA की राशि और उपचार की लंबाई में भिन्न हो सकते हैं। उद्भव और की तेजी से सुधार को ध्यान में रखते CRISPR-Cas9 तकनीकी15-17 तों, मानव Eg5 द्वारा प्रतिस्थापित Klp61F जीन के साथ एक ड्रोसोफिला सेल लाइन की पीढ़ी अभिकर्मक और पछाड़ना दृष्टिकोण की सीमाओं को पार होता है कि एक शक्तिशाली विकल्प प्रस्तुत करता है। हमारा काम आवश्यक अभिकर्मकों वर्तमान में विकसित किया जा रहा है ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं में ऐसा करने के लिए, हालांकि मक्खी को मानव जीन प्रतिस्थापन इस मामले में एक व्यवहार्य विकल्प होना चाहिए कि यह दर्शाता है।

यह प्रक्रिया Eg5 तक सीमित नहीं है, लेकिन ब्याज की अन्य प्रोटीन के समारोह में अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। पहले से ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं में अप्रभावी हो स्थापित किया गया है कि अवरोधकों का उपयोग करते हैं, इस प्रोटोकॉल बंद लक्ष्य प्रभाव के बारे में चिंताओं के बिना जीवित कोशिकाओं में अवरोधकों के प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पादन सेल लाइन भी उच्च throughput स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता त्रुटि सुधार में शामिल प्रोटीन को निशाना संभावित दवाओं की पहचान के लिए विश्लेषण करती है।

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

हम kinesin -5 निर्माण के उपहार के लिए पेट्रीसिया Wadsworth को धन्यवाद देना चाहूंगा। यह काम, चार्ल्स एच हूड फाउंडेशन, इंक से TJM करने और अनुसंधान अनुदान सं TJM करने ऑफ डाइम्स फाउंडेशन के मार्च से 5 FY13-205, साथ ही समर्थन से एक एनआईएच अनुदान (5 R01 GM107026) द्वारा समर्थित किया गया बोस्टन, एमए। TJM को

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Effectine Transfection Reagent Qiagen 301425
Klp61F cDNA Drosophila Genomic Resource Center 13690 Gene Name LD15641
Schneider’s Media Invitrogen 21720-024
Fetal Bovine Serum, certified Invitrogen 10082-147 Heat Inactivated, US origin
Copper(II) Sulfate (CuSO4) Sigma C8027-500G 500 mM stock
S-trityl-L-cysteine Sigma 164739-5G 1 mM stock in DMSO
Blasticidin HCl Invitrogen R21001 5 mg/ml stock in 1x PBS
Hygromycin B Invitrogen 10687010
T7 Large scale RNA Production System Promega P1320 The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl
Klp61F RNAi F primer Invitrogen TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA
Klp61F RNAi R primer Invitrogen TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC
PCR clean-up kit Mo Bio Laboratories, Inc 1250
Concanavalin A Sigma C5275 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS.
Boiled Donkey Serum Jackson ImmunoResearch Labs 017-000-121 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C.
Mounting Media 20 mM Tris pH 8.0,  0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C.
1x BRB-80 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2
White Light Source Lumencor Inc
ET EGFP Filter Cube Chroma 49002
DSRed Filter Cube Chroma 49005
anti-NDC80 antibody  Custom made by the Maresca Lab
DM1α (anti-α-tubulin) Sigma T6199
anti-CID antibody AbCam ab10887

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheeseman, I. M., Desai, A. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).
  2. Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
  3. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
  4. Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
  5. Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
  6. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
  7. Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
  8. Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
  9. Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).
  10. Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
  11. Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187 (2013).
  12. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
  13. Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
  14. Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
  15. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
  16. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  17. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 107 kinesin -5 Klp61F kinetochore सूक्ष्मनलिका त्रुटि सुधार परख
एक &quot;Humanized&quot; सृजन<em&gt; ड्रोसोफिला</emKinesin -5 के औषधीय निषेध करने के लिए&gt; S2 सेल लाइन संवेदनशील
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Ye, A. A., Maresca, T. J. Generating … More

Ye, A. A., Maresca, T. J. Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5. J. Vis. Exp. (107), e53594, doi:10.3791/53594 (2016).

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