Introduction
Gelijke scheiding van het genoom tijdens celdeling vereist juiste interacties tussen de gerepliceerde DNA en spindle microtubules. Microtubules fysisch interageren met chromosomen door een ensemble van eiwitten die assembleert op centromeren zogenaamde kinetochoor 1. Juiste verdeling van de chromosomen vereist dat zuster kinetochoren worden gebioriënteerde, waarbij iedere zuster wordt geassocieerd met microtubules afkomstig vanuit tegengestelde spoel polen. Kinetochoor microtubule (kt-MT) bijlagen die niet in de Bioriented conformatie worden snel en efficiënt gedestabiliseerd de gelegenheid om biorientation vestigen in een proces dat bekend staat als foutcorrectie bieden. Een foutcorrectie test die eerder in zoogdiercellen werd opgericht 5 vereist het assembleren monopolar spindels met omkeerbare klein molecuul remmers tegen Eg5 (kinesine-5). De behandeling met geneesmiddelen genereert een veelheid van foutieve syntelic bijlagen waarin both zuster kinetochoren hechten aan dezelfde spil paal. Een volgende uitwassen van het geneesmiddel maakt visualisatie van het foutcorrectieproces. De foutcorrectie test kan worden uitgevoerd in aanwezigheid van kleine molecule inhibitoren of knockdowns de bijdrage van kandidaat eiwitten te bestuderen corrigeren van foutieve kt-MT attachments.
De mogelijkheid om foutcorrectie te visualiseren in levende cellen is een krachtig instrument om inzicht in de moleculaire mechanismen betrokken bij dit complex proces. Echter, het grote aantal chromosomen in de meeste cellijnen vormt een uitdaging waarnemen individuele kt-MT attachments. Drosophila S2-cellen zou ideaal zijn voor toepassing van foutcorrectie assay als ze zo weinig als 4 chromosomen 6, maar kleine molecule inhibitoren bevatten kinesine 5 zoals S-trityl-L-cysteïne (STLC) en monastrol 7-9 hebben geen invloed spileenheid of kinesine-5 motorfunctie in Drosophila-cellen. Daarom generated een Drosophila S2-cellijn die humane kinesine-5 onder een induceerbare promoter die gevoelig is voor kinesine-5 remmers. Dit protocol beschrijft hoe de endogene Drosophila kinesine-5 homoloog, Klp61F knockdown, en het gebruik van deze cellijn in de cel-gebaseerde foutcorrectie test.
Protocol
1. transfecteren S2 Cellen
- Uit een eerder gekweekte 25 cm2 kolf, voeg GFP-α-tubuline expressie S2-cellen 10 een eindvolume van 2 ml van 100% confluentie, en laat ze semi-hechten aan de bodem van een 35 mm weefselkweekplaat voor ongeveer 1 uur.
- Verwijder de media uit de schotel. Transfecteren 2 ug van het Eg5-mCherry construct 11 met 1 ml medium Schneider gesupplementeerd met 10% FBS (hierna aangeduid als Schneider media) en transfectiereagens, volgens het protocol van de fabrikant. Verzegel de schaal met Parafilm en incubeer cellen bij 25 ° C gedurende 16-18 uur.
- Voeg 1 ml Schneider media. Terugkeer cellen tot 25 ° C incubator.
- Op dag 3 na transfectie overdracht 500 pi van getransfecteerde cellen in een nieuwe 35 mm weefselkweekplaat met 1,5 ml Schneider media voor een test inductie. Induceren de expressie van Eg5-mCherry door het toevoegen van CUSO4
- Om concanavaline-A gecoate dekglaasjes, pipet voldoende volume van concanavaline A-oplossing (0,5 mg / ml opgelost in H 2 O) om de vacht te maken een zuur gewassen dekglaasje, het overtollige, en laat het dekglaasje aan de lucht drogen.
- Plaats een 22 mm x 22 mm concanavaline-A gecoate dekglaasje in een schone 35 mm weefselkweekschaal, dan zaad 500 gl van 100% samenvloeiing van de geïnduceerde cellen op het dekglaasje en laat de cellen hechten gedurende 1 uur bij KT.
- Om te controleren op Eg5-mCherry expressie, monteer de dekglaasje in een roos kamer (of juiste beeldvorming vat) met de media voor de beeldvorming bij RT op een fluorescentiemicroscoop. Gebruik de juiste lichtbronnen en filter sets om de cellen te visualiseren. Bijvoorbeeld, de microscoop gebruikt in deze studie heeft een witte LED-lichtbron en EGFP (FITC / Cy2) en DsRed (TRITC / Cy3) filter kubussen. Eg5-mCherry lokaliseert aan microtubuli en is verrijkt near spindle polen.
- Daarna zorgen dat de cellen die zowel Eg5-mCherry en GFP-α-tubuline, dragen de resterende getransfecteerde, geïnduceerde cellen een 25 cm2 weefselkweek kolf met 4 ml Schneider media.
- Voeg Blasticidine S HCL bij een uiteindelijke concentratie van 25 ug / ml aan de kolf van getransfecteerde cellen en blijven splitsen in aanwezigheid van 25 ug / ml blasticidine S HCl tot celdood ophoudt waarbij u periodiek op expressie van Eg5-mCherry. Incubeer cellijnen 25 ° C incubator.
NB: Het percentage van cellen die Eg5-mCherry toeneemt in de tijd. - Zodra cellen die stabiel zijn getransfecteerd, blijven splitsen in afwezigheid van geneesmiddel en vries 12 cellen voor toekomstig gebruik.
2. RNA interferentie
- PCR versterken een ~ 500 bp regio Klp61F uit cDNA (LD15641) met behulp van primer met toegevoegde T7 promotorsequentie (sequentie die in Materials List) te zijngebruikt als een sjabloon voor synthese dsRNA.
- Instellen vier PCR-reacties, 50 pi elk gemaakt met 100 ng matrijs-DNA, 25 uM van elke primer, geschikte buffer en polymerase. Zet de PCR-protocol over de thermocycler volgens het protocol van de fabrikant van de polymerase's.
- Pool and clean vier PCR-reacties met een PCR ruimen kit volgens protocol van de fabrikant. Bewaar de schone template bij -20 ° C.
- Bereid dubbelstrengs RNA (dsRNA) vanaf matrijs met een T7 RNA transcriptie kit, volgens de instructies van de fabrikant. Verwacht ~ 5-15 mg / ml concentratie van dsRNA. Bewaar dsRNA bij -20 ° C.
- Om Klp61F Knockdown met dsRNA toestaan S2 cellen die Eg5-mCherry bij 25% confluentie semi-hechten aan de bodem van een 35 mm weefselkweekplaat gedurende 1 uur.
- Verwijder de media uit de gerechten en voeg 5 ug dsRNA tegen Klp61F (Drosophila kinesine-5) verdund in 1 ml serumvrij Schneider 's media.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, voeg 1 ml Schneider's medium met 10% FBS. Incubeer cellen bij 25 ° C.
- 24 uur na behandeling dsRNA, induceren de expressie van Eg5-mCherry door toevoeging CuSO4 tot een eindconcentratie van 500 pM. Incubeer cellen bij 25 ° C nog eens 24 uur.
3. Live-cell imaging
- Plaats een 22 mm x 22 mm concanavaline A gecoate dekglaasje in een schone 35 mm weefselkweekplaat.
- Zaad 500 ul van de cellen die zijn behandeld met dsRNA en geïnduceerde O / N op de concanavaline A gecoate dekglaasje en laat ze hechten gedurende 1 uur.
- Monteer de dekglaasje in een roos kamer (of geschikt vat) voor de beeldvorming.
- Vind mitotische cellen die zowel Eg5-mCherry en GFP-α-tubuline.
OPMERKING: Mitotische cellen die enkel GFP-α-tubuline moet monopolaire spoelen sindsdien Klp61F, die nodig is voor spil tweepoligheid wordt neergeslagen 10,13. - Verzamelen van time-lapse beelden van bipolaire spindels (bijvoorbeeld 1 beeld per minuut) in cellen die zowel Eg5-mCherry en GFP-α-tubuline.
- Terwijl beeldvorming, verwijder de media uit de roos kamer, en te vervangen door Schneider media met 1 uM STLC meer dan 3 opeenvolgende media uitwisselingen (~ 5 ml totaal) in de kamer om spindel instorten visualiseren.
- Om de drug wash-out en achteruit de as instorten, verwijder voorzichtig de-STLC bevattende media van de roos kamer, en was in Schneider media 4x (6-8 ml totaal) voor het bijvullen van de roos kamer nog een laatste keer met verse media. Doorgaan beeldvorming.
4. Error Correction Assay
- Plaats een 22 mm x 22 mm concanavaline A gecoate dekglaasjes in schone 35 mm weefselkweek gerechten.
- Zaad 500 pl cellen die zijn behandeld met Klp61F dsRNA op de concanavaline A gecoate dekglaasje en laat ze hechten.
- Na cellen De nalevinged, voeg 1,5 ml Schneider media elk gerecht het eindvolume tot 2 ml te brengen.
- Cellen arrestatie in mitose, voeg MG132 tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM elk van de gerechten en incubeer 1 uur.
- Voeg 1 uM STLC en incubeer gedurende 1 uur om monopoles te vormen.
- Spoel de STLC door spoelen coverslips 3x met 2 ml vers medium Schneiders per keer.
- Incubeer dekglaasjes met Schneider media naast enige farmacologische middelen (bijvoorbeeld Aurora kinase remmers) of DMSO als controle.
Opmerking: remmerconcentraties variëren en goede eindconcentraties worden bepaald door de experimentator. Stock oplossingen zijn meestal zodanig gemaakt dat de remmer wordt verdund 1: 1000 in de media. In dit geval een 1: 1000 verdunning van DMSO (of geschikt oplosmiddel) dient als voertuigcontrole. We gebruiken de Aurora B remmer Binucleine 2 in een eindconcentratie van 40 uM. - Fix cellen op verschillende tijdstippen to houden aan de progressie van bipolaire spindel vorming en kinetochoor bevestiging staten te beoordelen. Repareren:
- Snel spoel de dekglaasjes met 2 ml van 1x BRB-80.
- Fix cellen door toevoeging van 2 ml 10% paraformaldehyd verdund in 1 x BRB-80 gedurende 10 min. Pipet paraformaldehyde zorgvuldig in een chemische kap.
- Permeabilize cellen met 2 ml 1x PBS + 1% Triton-X 8 min.
- Was 3x dia met 2 ml 1x PBS + 0,1% Triton-X.
- Transfer coverslips cel-kant naar boven op een vel Parafilm (gebruik een marker om Parafilm label adequaat bijhouden van de dia's te houden) in een 150 mm petrischaal.
- Bedek de dekglaasjes met 150 ul gekookt donkey serum (BDS) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur om niet-specifiek antilichaam blokkeert binding.
Opmerking: Hier kan de fixatie protocol gestopt worden op een later tijdstip worden voortgezet. Dekglaasjes kunnen worden opgeslagen in een vochtgehalte kamer bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur. Om de vochtkamer maken, langs de rand van een 150 mm schaalmet een natte laboratorium vegen en bedek met de petrischaal deksel. - Verwijder blok, en incubeer de dekglaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 150 ul van primaire antilichamen geschikt verdund in BDS kleur wordt kinetochoren en microtubuli eindconcentraties van 2 ug / ml (of volgens de aanbevelingen van de fabrikant) en 1 ug / ml, respectievelijk .
Opmerking: Hier kan de fixatie protocol gestopt worden op een later tijdstip worden voortgezet. Dekglaasjes kunnen worden opgeslagen in een vochtgehalte kamer bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur. - Was coverslips 3x met 500 ul van 1 x PBS + 0,1% Triton-X.
- Incubeer dekglaasjes gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur met het geschikte fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in BDS.
- Was coverslips 3x met 500 ul van 1 x PBS + 0,1% Triton-X.
- Incubeer dekglaasjes met 150 pl BDS met 1 ug / ml DAPI eindconcentratie gedurende 5 min.
- Was dekglaasjes 2x met 1x PBS + 0,1% Triton-X en zet coverslips cel naar beneden op een 3x1 "dia met 8 ul van de montage media. Verf de hoeken met nagellak om de dekglaasjes immobiliseren op dia's.
- Afbeelding cellen met een bipolaire spindels die uiten Eg5-mCherry. Neem een Z-serie bestaat uit 30 vliegtuigen bij 0,2 micrometer tussenpozen in alle kanalen met een 100X doelstelling. Analyseert zorgvuldig de kinetochoren en microtubuli naar de bijlage staten (gebioriënteerde of syntelic bijlagen) te bepalen.
Representative Results
Klp61F moet bipolaire assen vormen. De humane kinesine-5, Eg5, kan de functie van Klp61F in Drosophila S2-cellen (Figuur 1A en D) redden. Na toevoeging van het kinesine-5 inhibitor (STLC), microtubule geassocieerde niveaus van de motor druppel (Figuur 1B en E) en de spil stort, wat resulteert in een monopool (figuur 1C en F) in cellen zonder endogene Klp61F na succesvolle RNAi (Aanvullende filmpje 1). Het is opmerkelijk dat de bipolaire spillen instorten na toevoeging van STLC in het gehumaniseerde S2-cellen omdat kinesine-5 activiteit moet spil tweepoligheid in menselijke cellen te behouden. Deze interessante discrepantie gevolg van verschillen in interpolaire microtubuli overlap en / of stabiliteit in beide modelsystemen 14 zijn. Kinesine-5 inhibitie (figuur 2A en E) worden reve rsed door het wassen van de drug en het herstel van een bipolaire spindel kan na verloop van tijd worden gevolgd. Na verwijdering van de remmer (figuur 2B en F), Eg5-mCherry opnieuw associeert met microtubuli als een bipolaire spil monteert (figuur 2C en G), en cellen kan evolueren in een bipolaire anafase (figuur 2D en H, Supplemental film 2 ).
Figuur 1. Toevoeging van 1 uM STLC leidt tot monopolar spindels in Drosophila S2 cellen. Vertegenwoordiger beelden van time-lapse beeldvorming van een Drosophila S2 cel die Eg5-mCherry (AC) en GFP-α-tubuline (DF) bij toevoeging van 1 uM STLC. De Eg5 inhibitor werd toegevoegd 3 min. Schaal bar = 5 micrometer. Timestamp = min: sec. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Een bipolaire spindel hervormingen bij verwijdering van STLC. Vertegenwoordiger beelden van time-lapse beeldvorming van een Drosophila 2 cel die Eg5-mCherry (AD) en GFP-α-tubuline (EH) tijdens een STLC wash-out experiment. STLC werd gewassen op 5 min. Een bipolaire spindel hervormingen binnen 1 uur van het verwijderen van de STLC. Schaal bar = 5 micrometer. Timestamp: min. Sec Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "target =" _ blank "> Aanvullende Movie 1. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Widefield fluorescentie beeldvorming van een representatief voorbeeld van een Drosophila S2 cel die Eg5-mCherry ( links) en GFP-α-tubuline (rechts). 1 uM STLC werd toegevoegd in 2 minuten, en de spil vormt een monopool binnen 10 minuten na toevoeging van de remmer. Beelden werden elke 1 min verkregen en speelde een snelheid van 10 frames per seconde. Schaal bar = 5 micrometer.
Aanvullende Movie 2. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Widefield fluorescentie beeldvorming van een representatief voorbeeld van een Drosophila S2 cel die Eg5-mCherry (links) en GFP-α-tubuline (rechts). Medium dat 1 uM STLC verwijderd engespoeld op 5 min. Een bipolaire spil hervorming binnen 1 uur van het verwijderen van de remmer. Beelden werden iedere 1 min verworven en speelde met een snelheid van 10 frames per seconde. Schaal bar = 5 micrometer.
Discussion
Visualiseren foutcorrectie is een waardevolle techniek om de stappen betrokken bij dit belangrijke en complexe cellen te bestuderen. Hiertoe worden foutieve bijlagen gegenereerd met omkeerbare remmers en foutcorrectie wordt waargenomen na uitwassen van het geneesmiddel. Deze test werd oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van zoogdieren weefselkweek cellen 5. Maar de aanwezigheid van talrijke kinetochoren vele model zoogdierceltypen een uitdaging in het observeren afzonderlijke foutencorrectie gebeurtenissen. Drosophila S2-cellen bezitten weinig als 4 paren van kinetochoren, waardoor ze een grotere voorkeur cellijn voor het observeren foutcorrectie. Echter, een belangrijk nadeel is dat veel remmers effectief in Drosophila S2-cellen. Dus de mogelijkheid om een gehumaniseerd Drosophila S2-cellijn die humaan kinesine-5 een waardevol hulpmiddel voor foutcorrectie bestuderen.
Hoewel Drosophila S2 cellen kan eenbeter cellijn om foutcorrectie te bestuderen, de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van de cellijn en neerhalen essentiële genen stelt een aantal uitdagingen om deze techniek. Zo kan transfectie-efficiëntie behoorlijk laag. Indien minder dan 20% van de cellen tot expressie de Eg5-mCherry, dient de transfectie worden herhaald als het selectieproces langer duren. Ook kan het percentage cellen die zowel fluorescerende eiwitten tijd afnemen. Dit kan worden ondervangen door het splitsen van cellen in aanwezigheid van Blasticidine S HCl en hygromycine B om te selecteren op cellen die Eg5-mCherry en GFP-α-tubuline, respectievelijk. Het is ook belangrijk op te merken dat Drosophila S2 cellen orthologen te veel menselijke eiwitten en; Daarom is het essentieel om de knockdown voorwaarden voor endogene eiwitten te optimaliseren. Optimale knockdown kunnen variëren in de hoeveelheid van dsRNA en de duur van de behandeling. Gezien de opkomst en snelle verbetering van CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, genereren van een Drosophila-cellijn met Klp61F gen vervangen door menselijke Eg5 presenteert een krachtig alternatief dat de beperkingen van de transfectie en knock-down benadering zou overwinnen. Ons werk toont die vliegen op mens genvervanging een haalbare optie in dit geval zijn, hoewel de benodigde reagentia daartoe in Drosophila S2-cellen worden momenteel ontwikkeld.
Deze procedure is niet beperkt tot Eg5, maar kunnen worden toegepast om de functie van andere eiwitten van belang te bestuderen. Bij gebruik van remmers die eerder zijn vastgesteld ineffectief in Drosophila S2 cellen te zijn, kan dit protocol worden aangepast om de rechtstreekse werking van remmers in levende cellen zonder zorgen over palen effecten te bestuderen. De cellijn verkregen met dit protocol kan ook worden gebruikt in high-throughput screening analyses potentiële medicijnen die eiwitten betrokken bij het foutcorrectie identificeren.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We willen graag Patricia Wadsworth bedanken voor de gave van de kinesine-5 construct. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie (5 R01 GM107026) naar TJM en door Research Grant No. 5-FY13-205 van de in maart van Dimes Stichting TJM, alsmede steun van de Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. naar TJM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
- Cheeseman, I. M., Desai, A. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).
- Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
- Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
- Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
- Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
- Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).
- Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
- Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187 (2013).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).
