Abstract
مجمعات البروتين أداء مجموعة من الوظائف الخلوية حاسمة. توضيح التفاعلات والديناميات غير التساهمية من الأهمية بمكان لفهم دور المجمعات في النظم البيولوجية. في حين أن توصيف المباشر من التجمعات الجزيئية البيولوجية أصبحت ذات أهمية متزايدة في السنوات الأخيرة، وتقنيات تجزئة الأم التي تتوافق مع تقنيات تحليل المصب، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي والتي تكون ضرورية لتوسيع هذه الدراسات. ومع ذلك، فإن المجال يفتقر إلى الإنتاجية العالية، مجموعة واسعة، وارتفاع انتعاش طريقة فصل للجمعيات البروتين الأم. هنا، نقدم اضح أصلي مزال هلام السائل جزء انحباس الكهربائي (CN-GELFrEE)، وهي طريقة فصل جديدة لالمجالس بروتين غير التساهمية. وقد تجلى أداء الفصل CN-GELFrEE من المجمعات تجزئة المستخرجة من قلب فأر. تم جمع الكسور أكثر من 2 ساعة وعرض أشرطة منفصلة تتراوح بين ~ 30-500 كيلو دالتون. ويخدعوقد لوحظ نمط sistent زيادة عرض النطاق الترددي الوزن الجزيئي، كل بدءا ~ 100 كيلو دالتون. وعلاوة على ذلك، أظهرت إعادة تحليل لاحق من كسور الأم عبر SDS-PAGE الوزن الجزيئي التحولات يتفق مع تمسخ من المجمعات البروتين. لذلك، وقد ثبت CN-GELFrEE إلى توفر القدرة على أداء عالية الدقة وعالية انتعاش فصل الأم عن مجمعات البروتين من مجموعة كبيرة الوزن الجزيئي، وتوفير الكسور التي تتوافق مع ويحلل البروتين المصب.
Introduction
ويعتقد غالبية العمليات البيولوجية يحدث داخل الخلية التي يتعين الاضطلاع بها من قبل المجالس البروتين بدلا من البروتينات واحدة 1. ونتيجة لذلك، من أجل توضيح دور حيوي معين من وحدة فرعية من البروتين في الخلية لا بد من فهم التفاعلات البنيوية مع البروتينات أو بروابط أخرى في المجمعات 2. ومع ذلك، ودراسة البروتينات أصلا، والحفاظ على تفاعلاتها غير التساهمية والنشاط، لا يزال تحديا. واحد من أوجه القصور في الدراسات البروتين الأم هي تقنية فصل الأم المناسبة التي تتوافق مع مختلف تقنيات تحليل البروتين المصب. لذلك، ازداد الاهتمام مؤخرا في تقنيات الفصل قادرة على تميز المجالس غير التساهمية الجزيئات الحيوية بشكل حاد 3.
تقنيات فصل البروتين أمر لا بد منه لوالكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية وغيرها من الدراسات المختلفة. تقنيات الفصل الأم الحالية لها intrinsiأوجه القصور ج التي تقلل من التوافق مع التحليلات المصب، مثل دقة منخفضة، وانخفاض الإنتاجية، وفقدان لهطول الأمطار، وشرط كميات كبيرة من عينة أولية. يستخدم تنقية تقارب جنبا إلى جنب عادة للدراسات التفاعل البروتين، ولكن لا بد من تنفيذها بشكل منفصل لكل هدف من البروتين، الامر الذي ادى الى تكون غير متوافقة مع تحليل الإنتاجية العالية 4. استبعاد حجم اللوني 5، هطول انتقائية مع أيون تقارب اللوني 5 وكثافة التدرج الفصل 6 وفرت كل فصل الأم، ولكن هي بطبيعتها تقنيات منخفضة الدقة وتتطلب عالية كميات عينة أولية.
بدلا من ذلك، التقنيات المعتمدة هلام، مثل الأزرق الأصلية (الجبهة الوطنية) واضح الأصلية (CN) PAGE (إما 1-D أو 2-D)، عرض عالية الدقة الانفصال. وعلاوة على ذلك، المتناقضة مع غيرها من التقنيات المذكورة، على حد سواء فصل PAGE الأم الحفاظ على الذوبان والتشكل الأصلي لص اسعانجى الأنواع جزيء، بما في ذلك البروتينات مسعور. يوسع هذه القدرة كذلك تغطية بروتيوم التي توصلت إليها هذه الأساليب 7،8 ويتحقق من خلال الكيمياء مختلفة بين CN وBN-PAGE. CN-PAGE تعتمد عادة على المنظفات اتهم لينة مثل جزيئات الناقل، لتحل محل صبغ Coomassie الأزرق في BN-PAGE. BN-PAGE، على الرغم من أن يرتبط مع دقة أعلى، له محاذير مثل انخفاض النشاط الأنزيمي في البروتينات فصل 8 و تشكيل ناتج إضافة Coomassie الجزيء، وهذا الأخير هو يمس بشكل كبير في مرض التصلب العصبي المتعدد المصب يحلل 9. كل من هذه الطرق، ومع ذلك، وترتبط تقليديا مع بطء انتعاش وتغطية بروتيوم ضيقة بسبب تلطيخ والقيود استخراج الهلام 7.
لدراسة البروتينات التشويه والتحريف، وهناك العديد من التقنيات التي تحافظ على جزيء الذوبان أثناء أداء عالية الدقة تجزئة مع استعادة نسبة عالية من البروتين والتي تكون متوافقة مع دiverse تقنيات تحليل البروتين في مرحلة ما بعد الانفصال. هلام مزال السائل جزء الفخ الكهربائي (GELFrEE) هي واحدة من أساليب التجزئة التي تتلاءم مع كل هذه الخصائص. يتم تطبيق هذا الأسلوب إلى حد كبير في دراسات البروتينات من أعلى إلى أسفل عالية الإنتاجية، مشيرا إلى أنه سريع وتنوعا. في GELFrEE والبروتينات هي التشويه والتحريف ومنعزلة على أساس الوزن الجزيئي من خلال مصفوفة هلام أنبوبي، والمسامية والتي يمكن أن تختلف على أساس متطلبات العينات ونتائج تجزئة المطلوب. ومزال كسور في الطور السائل، وبالتالي تقليل القيود الانتعاش المرتبطة SDS-PAGE مع الحفاظ على دقة عالية. ومن ثم يمكن تحليلها قسامات جزء من 1-D PAGE عن الوزن الجزيئي اختيار عرض النطاق الترددي 11. وهناك طلب كبير على المزايا المرتبطة GELFrEE في تقنيات الفصل الأم. الطريقة الموصوفة هنا، واضح الأصلية GELFrEE (CN-GELFrEE)، هو التكيف الأصلي من GELFrEE. من أجل أن تكون متوافقة مع الصورة واسعpectrum من الجزيئات في دولتهم الأم، ويعتمد هذا الأسلوب ليس فقط على لينة الكيمياء CN-PAGE، ولكن أيضا على الفصل المسامية الانحدار، مما يقلل من هطول الأمطار البروتين من خلال القضاء على انتقال قاسية بين مسام موجودة في أنظمة هلام متقطعة 9. عندما يطبق على يجزئ مجمعات البروتين المستخرج من قلب فأر، عرض كسور مزال استرداد عالية وفصل عالية الدقة من مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، الكسور الناتجة متوافقة مع معظم التحليلات المصب البروتين والكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يستند هذا البروتوكول الفيديو على نشر المرتبطة 9. وترد الكواشف محددة والمواد والمعدات اللازمة لتنفيذ كافة الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول في قسم المواد. يتم تصنيف الوصفات والمعلومات لإعداد جميع الحلول المطلوبة في الجدول 1.
1. صب من هلام أنبوب التدرج
- تجميع نظام الصب
- باستخدام لسخونة اللهب شفرة حلاقة أو مشرط، وقطع ماصة 20 مل المصلية على طول القسم متعامد 10 سم من أعلى قمة صرفها. تأكد من أن سطح قطع على نحو سلس. إبقاء أسفل قطعة (مع طرف) والتخلص من قطعة أعلى. المشبك قطعة ماصة أسفل عموديا (نصيحة مخروطي لأسفل) إلى موقف الدعم.
تنبيه: لا تلمس شفرة معدنية ساخنة، استخدم مقابض المناسبة أو ذو طيات لتجنب الحروق. - قطع 3 سم من أنابيب مرنة وتوصيله إلى قطع الماصة التي تمتد على مدىغيض صرفها. ربط صمام التحكم في التدفق في الطرف الآخر من الأنبوب.
- ربط الجزء السفلي من صمام للطرف الاستغناء عن خلاط التدرج باستخدام قطعة من الأنبوب. إبقاء صمام مفتوحة.
- تعيين خلاط التدرج على رأس محرك مغناطيسي. وضع القضبان المغناطيسية داخل غرف الخلط.
- ضع طرف الاستغناء عن خلاط التدرج 5-10 سم أعلى من الجزء العلوي من قطعة ماصة للسماح للهلام أن سكب عن طريق الجاذبية.
- اختبار نظام للكشف عن التسربات مع الماء منزوع الأيونات. إذا تم العثور على أي تسرب، تجفيف النظام عن طريق نفخ الهواء داخله قبل المتابعة.
- تغطية الجزء العلوي من قطعة ماصة مع اثنين أو أكثر من طبقات من الشريط. ثقب ثقبا في طبقات الشريط في وسط فتحة دائرية. تأكد من أن ثقب كبير بما فيه الكفاية لأنبوب زجاجي لتمرير بإحكام من خلال.
- حرك أنبوب زجاجي، حيث سيتم يلقي هلام، من خلال ثقب ثقب، وتمتد على الشريط حتى الزجاج يناسب بإحكام. أناnsert أنبوب زجاجي بحيث الجزء السفلي من أنبوب 2 مم فوق الجزء السفلي ماصة.
- تحقق لمعرفة ما إذا كان عقد أنبوب زجاجي ومركزية وعدم لمس الجدار ماصة بعد الانتهاء من إعداد النظام. هذا النظام هو الآن على استعداد لالصب.
- باستخدام لسخونة اللهب شفرة حلاقة أو مشرط، وقطع ماصة 20 مل المصلية على طول القسم متعامد 10 سم من أعلى قمة صرفها. تأكد من أن سطح قطع على نحو سلس. إبقاء أسفل قطعة (مع طرف) والتخلص من قطعة أعلى. المشبك قطعة ماصة أسفل عموديا (نصيحة مخروطي لأسفل) إلى موقف الدعم.
- جل الصب
- إعداد عازلة هلام، وكالة الأنباء الجزائرية والحلول Coomassie (حلول 1-3، الجدول 1).
- إعداد 12٪ T (حل 4، الجدول 1) و 1٪ T (حل 5، الجدول 1) فصل حلول هلام. إضافة 10 ميكرولتر من حل Coomassie في 12٪ من محلول تي فصل هلام. إضافة وكالة الأنباء الجزائرية وTEMED في كل الحلول مباشرة قبل صب في خلاط التدرج.
تنبيه: بولي أكريلاميد هو أعصاب للغاية ويجب ارتداء القفازات. - تأكد من إغلاق صمام الاستغناء عن خلاط التدرج. إضافة T 12٪ يفصل حل الجل على خلط الأبعد الغرفة من طرف صرفها. فتح صمام بين المجلسين، والسماح للط تدفق الحلn إلى الغرفة التالية.
- إغلاق صمام وماصة للخلع 12٪ من محلول هلام تي الفاصل إلى الغرفة السابقة. ويتم ذلك لتجنب فقاعات الهواء بين المجلسين.
- إضافة T 1٪ يفصل حل هلام لغرفة الخلط الأقرب إلى طرف صرفها. تشغيل محرك مغناطيسي.
- مفتوحة على حد سواء التدرج صمامات خلاط في نفس الوقت للسماح للحلول هلام فصل إلى أن تكون مختلطة وتصب في أنبوب ماصة والزجاج.
- وحالما يتم استنفاد الحلول هلام فصل في خلاط التدرج، فك الارتباط بين أنابيب من الخلاط وزوجين لحقنة 10 مل. تأكد من أن نهاية الأنبوب تبقى فوق مستوى السائل في ماصة حتى يتم إرفاق حقنة بحزم.
- استخدام حقنة لدفع بلطف فصل حل جل ما تبقى من الأنبوب في الأنبوب ماصة والزجاج. إغلاق صمام ماصة قبل السماح فقاعات الهواء فيه.
- إضافة بلطف طبقة من حوالي 0.25 مل من butano الماء المشبعل (الحل 6، الجدول رقم 1) على رأس حل هلام داخل أنبوب زجاجي لختم رد فعل البلمرة من الأوكسجين في الهواء ولشد الغضروف المفصلي العلوي.
- تنظيف جهاز صب على الفور مع الماء منزوع الأيونات (لا تستخدم المنظفات).
- الانتظار بين عشية وضحاها لالبلمرة هلام كاملة في درجة حرارة الغرفة.
- فصل جل أنبوب من الأجهزة وتخزين
- في اليوم التالي، قشر بعناية قبالة الشريط الجزء العلوي من الجهاز.
- افصل صمام من الأنابيب تحت ماصة. الافراج عن ماصة من المشبك وتنفيذ الخطوات 1.3.3. و1.3.4. أكثر من بالوعة.
- زوجان حقنة 10 مل مملوءة بالماء منزوع الأيونات إلى أنابيب مرنة. دفع المياه عبر الأنابيب إلى ماصة، ينزلق ببطء الجل بلمرة من ماصة.
- عقد ماصة أفقيا وتأمين بعناية هلام انزلاق من نهاية مفتوحة.
- قطع بولي أكريلاميد الزائد تحت وآرواوند أنبوب زجاجي باستخدام شفرة حلاقة. تأكد من إنشاء نهاية سلس على هلام داخل أنبوب، بجعله مطاردة مع غيض من أنبوب زجاجي.
- الاستغناء عن أي بيوتانول المتبقية من الجانب العلوي من هلام وتعيين أنبوب هلام في 15 مل أنبوب الطرد المركزي لم يسبق لهم اللعب. خلط 0.5 مل العازلة هلام (محلول 1، الجدول 1) مع 4.5 مل ماء نقي للغاية وإضافة حوالي 2 مل من محلول على كل من الجانب العلوي (داخل أنبوب زجاجي) والجانب السفلي (في أنبوب الطرد المركزي) من أنبوب هلام.
- تغطية الجانب العلوي الكامل للأنبوب الطرد المركزي، بما في ذلك فتح أنبوب زجاجي، مع بارافيلم لمنع التبخر العازلة. ويمكن تخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة حوالي 2 أسابيع.
إعداد 2. عينة
- تزن اثنين من قلوب الماوس وتخطر لهم في طبق بيتري باستخدام شفرة حلاقة.
- إضافة الأنسجة المصنعة لبمدافع الهاون وإضافة ما يكفي من النيتروجين السائل لتغطية العينة. يطحنون الأنسجة مع مدقة، إضافة المزيدالنيتروجين السائل عندما يتبخر.
- بمجرد الأرض الأنسجة بدقة، والسماح لليتبخر النيتروجين وإضافة 1 مل من تحلل العازلة (حل 7، الجدول 1) في 4 درجات مئوية لكل 100 ملغ من الأنسجة. نقل الحل في أنبوب الطرد المركزي.
- أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بعناية جمع طاف في أنبوب جديد وتجاهل بيليه. قياس تركيز البروتين في طاف باستخدام طريقة حمض bicinchoninic 12، أو كما يفضل. ملاحظة: قد يكون مستعدا لست] خلية الأم أو الكسور التحت خلوية كما يفضل. CN-GELFrEE متوافق مع مختلف مختلفة الاستعدادات العينة الأصلية.
- تحضير محلول منظم الإذابة والحل تحميل (الحلول 8 و 9، الجدول 1).
- إذا كانت العينة بيليه، و resuspend في 50-150 ميكرولتر من العازلة الإذابة. نأخذ عينة على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- عازلة تبادل العينة معلق أو المحللة الخلية مع solubilizatعازلة أيون باستخدام 30 كيلو دالتون-MWCO مرشح الطرد المركزي فائقة.
- أجهزة الطرد المركزي لعينة البروتين في 4 درجات مئوية و 10،000 x ج لمدة 5-10 دقائق أو حتى جزء حجم احتفظ وصولا الى ما يقرب من 20 ميكرولتر. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 400 ميكرولتر من العازلة الإذابة للجزء المدورة ومزيج من قبل pipetting. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 10،000 x ج لمدة 5-10 دقائق أو حتى جزء الاحتفاظ وصولا الى ما يقرب من 20 ميكرولتر. تجاهل التدفق من خلال.
- كرر الخطوة 2.9 مرتين إضافية.
- تمييع العينة التي تمت تصفيتها (حوالي 20 ميكرولتر) في 100 ميكرولتر من العازلة الإذابة.
- إضافة 20 ميكرولتر من محلول تحميل لعينة.
جهاز 3. CN-GELFrEE
- لأداء CN-GELFrEE التجزئة وتصنيع أجزاء الجهاز من خلال الإشارة إلى متجر للآلات. تصنيع أجزاء الجهاز في تفلون. يرجى الرجوع إلى الشكل 1 لكافة المعلومات اللازمة لتصنيع قطع الغيار ورس الجدول (2) لعدد من قطع الغيار اللازمة لجهاز واحد.
اعتبارات السلامة: ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. ينبغي توخي الحذر حول إمدادات الطاقة عالية الجهد، وجميع تقاطعات يجب أن يتم تنظيمها بشكل صحيح. لا تلمس الجهاز أو أي منطقة الرطبة المجاورة بينما الجهد في والحفاظ على المنطقة المحيطة بها مقاعد البدلاء الجافة خلال الكهربائي. وعلاوة على ذلك، وإمدادات الطاقة وينبغي أن تتحول خارج تماما عند التعامل مع الجهاز و / أو جمع الكسور. - إعداد المخزن المؤقت الأنود والكاثود عازلة (حلول 11/10، الجدول 1) والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية أو في الجليد.
- تناسب الطرف العلوي من الأنبوب هلام (النهاية دون هلام) من خلال فاصل، وهو الدائري يا وفاصل الثاني، بطريقة "ساندويتش".
- إضافة غرفة عازلة (الكاثود) بعد الفاصل الثاني، وتمرير مسامير بشكل كامل من خلال الثقوب الجانبية، إضافة وتشديد المكسرات لكلا الجانبين. تأكد من أن الطرف العلوي من الزجاجتم إصلاح الصورة أنبوب قبل الفتحة العلوية للغرفة عازلة، وليس مباشرة تحته أو الماضي عليه.
- تناسب نهاية الجزء السفلي من أنبوب هلام من خلال فاصل، وهو الدائري O، غرفة جمع، وفاصل الثاني.
- إضافة غرفة عازلة (الأنود) بعد الفاصل الثاني، وتمرير مسامير بشكل كامل من خلال الثقوب الجانبية، إضافة وتشديد المكسرات لكلا الجانبين. تأكد من أن نهاية الجزء السفلي من أنبوب هلام هو ثابت الماضي الفتحة العلوية للغرفة عازلة، على مقربة لكن لا لمس الجدار الخلفي.
- ضبط الجهاز CN-GELFrEE عموديا مع غرفة عازلة الكاثود صعودا تستخدم موقفا الدعم مع المشابك.
- إضافة العازلة الأنود إلى غرفة عازلة الأنود (القاع) وعازلة القطب السالب إلى غرفة عازلة الكاثود (أعلى). إبقاء جميع المخازن في 4 درجات مئوية.
- إزالة فقاعات الهواء من داخل أنبوب زجاجي من خلال استغلال بلطف أنبوب زجاجي والتحقق من نظام للتسرب.
- تأكد من الأقطاب البلاتين على اتصال مع المخازن المؤقتة في الدوائر والتي على حد سواءمغمورة طرفي أنبوب هلام في المنطقة العازلة داخل كل غرفة.
- توصيل أسلاك الكهرباء من الطاقة الكهربائية إلى المقابس الموز منها: سلبي على غرفة عازلة الكاثود (أعلى) وإيجابي على غرفة عازلة الأنود (القاع).
- تحميل العينة باستخدام غيض تحميل الجل إلى أعلى سطح هلام، داخل أنبوب هلام.
- تشغيل هلام في 1 W ثابت، لتجنب ارتفاع درجة الحرارة، حتى الجبهة صبغ الحمراء في الجزء السفلي من أنبوب هلام.
تنبيه: إيقاف التيار الكهربائي قبل الاستمرار. - تجاهل الأنود والكاثود المخازن.
- Untighten المكسرات من الغرفة العازلة الأنود وتفكيك هل السفلي وغرفة، والحفاظ على فاصل ويا الدائري. وضع نهاية الجزء السفلي من أنبوب هلام داخل غرفة جمع، قبل الفتحة العليا، وليس في الماضي أو مباشرة تحته. دفع هل ويا الدائري بالقرب من غرفة جمع.
- قطع قطعة من السليلوز غشاء غسيل الكلى وترطيب من قبل immerging في المخزن الأنود. تغطية ا ف بerture بين غرفة جمع وهل السفلي باستخدام غشاء غسيل الكلى.
- غرفة تجميع عازلة الأنود بعد الفاصل الثاني، إضافة وتضييق الخناق والمسامير.
- وضع الجهاز أفقيا فوق دلو الجليد. إضافة الأنود والكاثود جديدة المخازن إلى غرف عازلة والتحقق من نظام للتسرب.
- إضافة 150 ميكرولتر من العازلة الأنود في غرفة جمع. إعادة توصيل أسلاك الكهرباء إلى المقابس الموز منها.
- بدوره على امدادات الطاقة في 3 مللي أمبير تيار مستمر. يجب أن الجبهة صبغ ثم تبدأ أزل في المخزن المؤقت في غرفة جمع.
- عند مزال الجبهة صبغ كامل، وإيقاف إمدادات الطاقة وجمع جزء الأول (0 دقيقة)، نقله إلى منخفض البروتين أنبوب microcentrifuge ملزم.
- إعادة ملء الغرفة مع جمع 150 ميكرولتر من العازلة الأنود. منع جميع الكسور التي تم جمعها على الجليد.
- جمع الكسور بعد فترات الزمنية التالية من جمعجزء الأول: 2 دقيقة، 4 دقائق، 6 دقائق، 8 دقيقة، 10 دقيقة، 15 دقيقة، 20 دقيقة، 25 دقيقة، 30 دقيقة، 45 دقيقة و 60 دقيقة. لا حساب للوقت في حين أن التيار الكهربائي هو خارج. لا ننسى لإيقاف التيار الكهربائي قبل جمع الكسور وإعادة ملء الغرفة مع جمع 150 ميكرولتر من العازلة الأنود بين العينات. تحويل امدادات الطاقة مرة أخرى بعد جمع لبدء يبلغ حجمه جزء القادم.
- الاستغناء عن القطب الموجب والسالب مخازن وإضافة حلول جديدة لغرف عازلة بعد 60 دقيقة. جمع الكسور في 90 دقيقة و 120 دقيقة.
- تغيير الأنود والكاثود مخازن في كل ساعة.
- تشغيل أصلي واضح أو PAGE الأم زرقاء مع الكسور وصمة عار كما تفضل. اتبع إرشادات الشركة المصنعة أو بروتوكول المفضل.
- تشغيل الحد SDS-PAGE وصمة عار كما تفضل. اتبع إرشادات الشركة المصنعة أو بروتوكول المفضل.
- تنظيف الكسور GELFrEE والخضوع لقياس الطيف الكتلي الأصلي التحليلات في ضوء ما وصفه العلاقات العامةeviously 9.
الشكل 1: CN-GELFrEE جهاز (A) جهاز GELFrEE أجزاء الرسومات و (ب) صورة من الأجزاء المصنعة. (C) CN-GELFrEE مخطط تجميع الجهاز: (1) غرفة عازلة، (2) الفاصل، (3) يا الدائري، (4) أنبوب هلام، (5) غرفة جمع، و (6) غشاء غسيل الكلى.
الجدول 1: جدول الحلول.
الجدول 2: جدول أجزاء الجهاز GELFrEE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
200 ميكروغرام من البروتينات المستخرجة من بالتبريد قلوب الماوس الأرض كانت مجزأة أصلا إلى 14 أجزاء من 150 ميكرولتر لكل منهما، باستخدام طريقة CN-GELFrEE في 1-12٪ أنبوب تي هلام. تم تشغيل قسامة من 10 ميكرولتر من كل جزء على هلام لوح CN-PAGE والفضة الملون. ويرد وصف واضح للتجزئة والقرار الذي حصلت مع تجزئة CN-GELFrEE في الشكل 2A. تم جمع الكسور أكثر من ساعتين ويبين فحص هلام جود نمط ثابت من زيادة الأوزان الجزيئية تتراوح بين ~ 30-500 كيلو دالتون. يحتوي كل جزء الأنواع التي تتراوح في الكتلة على ~ 100 كيلو دالتون. كسور عرض تداخل انخفاض الجزيئية الوزن النطاقات التي يتم تخفيض على نحو متزايد كما يحدث المزيد من مجموعات بين الكسور. هلام لوح CN-PAGE هو موضح هنا يمثل 6٪ فقط من البروتين تعافى من كل جزء ميكرولتر 150.
كل من fractمزال الأيونات أصلا من CN-GELFrEE خفضت في وقت لاحق والتشويه والتحريف قبل تشغيلها على هلام لوح SDS-PAGE. في الحد من هلام SDS-PAGE لوح (الشكل 2B)، فمن الممكن أن نرى تحولات واسعة في جميع الكسور عند مقارنة الكسور الأم منها (الشكل 2A)، مشيرا إلى أن المجمعات البروتين سليمة تم تفكيكها وخفضت جسور ثاني كبريتيد.
الشكل 2: فصل CN-GELFrEE من قلب فأر المبردة استخراج طحن (A) واضح الأصلية PAGE الكسور CN-GELFrEE التي تم جمعها في فترات زمنية 0-120 دقيقة. اليسار: أصلي ذو وزن جزيئي سلم. (ب) الحد من SDS-PAGE من نفس الكسور كما A. اليسار: انخفاض والتشويه والتحريف الوزن الجزيئي سلم.
ويمكن بعد ذلك كسور تنظيفها وابعثإد لقياس الطيف الكتلي الأصلي يحلل 9. الأصلي الطيف MS من نازعة مالات homodimeric، حدد في بعض الكسور GELFrEE، ويظهر توزيع الشحنة بين 16+ 20+ ووالكتلة الجزيئية من 72843 دا (الشكل 3A). تم عزل الدولة 18+ الاتهام وcollisionally تفعيلها، مما أدى إلى طرد نازعة مالات أحادى مع الكتلة الجزيئية من 36،421.7 (الشكل 3B). تم تطبيق تفعيل المصدر إلى مجمع سليمة من أجل حمل طرد مونومر، والعزلة السماح ومزيد من تفتيت أحادية. خريطة تفتيت 11+ مونومر يمكن ملاحظتها في الشكل 3C. وقد ثبت CN-GELFrEE لتكون متوافقة مع ويحلل الطيف الكتلي، ولم تظهر أي انقطاع للتفاعلات البروتين البروتين noncovalent المجالس الجزيئات.
الشكل (3): أطياف الشامل وتجزئة خريطة homodimer نازعة مالات (A) MS1 الطيف للمجمع سليمة، (ب) MS2 الطيف معرض مونومر طرد من المجمع، و (C) خريطة تجزئة تم الحصول عليها من تشرذم مونومر. . ويشير الأحمر N أن N-محطة والأسيتيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مشتق CN-GELFrEE من مواليد واضح (CN) PAGE نظام المخزن الذي يستخدم خليط من أنيونية والمنظفات محايدة كما جزيئات الناقل 9 لتجزئة البروتين على أساس الوزن الجزيئي من خلال مصفوفة هلام. تطبيق CN-GELFrEE إلى الأصلي الماوس القلب استخراج البروتين ولدت كسور تعقيد منخفضة مع عرض نطاق ترددي منفصلة مع الحفاظ على التفاعلات غير التساهمية من التجمعات الجزيئية البيولوجية. وأظهرت المقارنة بين الكسور بين CN-PAGE والحد من المواد الهلامية لوح SDS-PAGE التحولات الجماعية التي تثبت فقدان التفاعلات غير التساهمية بين الجزيئات في الكسور والكسر من السندات ثاني كبريتيد بين سلاسل البروتين. وتؤكد النتائج على الطابع الأصلي للفصل CN-GELFrEE.
بعض الخطوات في هذا البروتوكول حاسمة وبالتالي تستدعي المزيد من الاهتمام. أولا، بعد الصب، ويجب فصل أنبوب هلام من الجهاز ببطء وبولي أكريلاميد خارجي قطع بعناية. عدم القياملذلك يمكن أن تلحق الضرر هلام، مما تسبب فقاعات الهواء داخل شبكة أو فصل هلام من أنبوب زجاجي. هذه الأضرار يضعف قرار الانفصال ويجب تجنبها تماما. ثانيا، خلال الكهربائي، فإن المقاومة الكهربائية للنظام تزيد ساعات العمل الإضافية، وتوليد الحرارة، وبالتالي فإنه من المهم جدا إما لتنفيذ الإجراء في غرفة باردة أو لنقل الجهاز إلى دلو الجليد بعد أن تم تحميل العينة في هلام، لكي لا تفسد البروتينات تحميلها بواسطة الحرارة. وعلاوة على ذلك، من المهم أن تمانع بعض القيود الرئيسية للتقنية عند تنفيذ بروتوكول صفها. يمكن أن يحمل نسبة عالية من البروتين يقلل قرار CN-GELFrEE. الحمولة الزائدة، وخصوصا من العينات التي تكون فيها عدد قليل من الأنواع أكثر وفرة، وسوف يسبب هذه الأنواع من البروتين ليكون مزال من خلال عدد من الكسور متتالية. فأرة الحاسوب عينات الأرض بالتبريد، كان ينظر إلى أفضل النتائج مع كميات تتراوح بين 200 و 400 ميكروغرام، ولكن هذا السلوك هو عينة التي تعتمد على. أيضا، حسوف مستويات IGH من الملح في العينة يغير خصائص الكهربي للبروتينات، وتغيير نمط الفرقة والحد من قرار تجزئة. يجب أن تمثل هذه الخطوات الحاسمة والقيود على أثناء أداء هذا البروتوكول لتحقيق نتائج أفضل.
وعلاوة على ذلك، فقد تبين CN-GELFrEE لديك عدة خصائص إقبال شديد في اللوني الأصلي. هذه الطريقة فصل بسيط يحقق عالية الدقة تجزئة المجمعات البروتين، وقبول كميات عالية من البروتين الحمل وتجزئة من خلال مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية. وقد ثبت CN-GELFrEE أيضا أن يكون تنوعا للغاية، كونها قادرة على بكسر عينات بيولوجية من مجموعة كبيرة ومتنوعة من الكائنات الحية والاستعدادات المختلفة 9.
وعلاوة على ذلك، وشطف جزء السائل في هذه التقنية يمكن استعادة نسبة عالية من البروتين التي لا يلاحظ في فصل الأم الأخرى التي تعتمد على هلام. وبالإضافة إلى ذلك، على عكس الطرق الأخرى التي همجالس العود في الطور السائل، CN-GELFrEE لا يقلل تركيز العينة. في الواقع، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يزيد من تركيز كل جمعية البروتين ~ 2 أضعاف من عينة إلى الكسور. وأخيرا، فإن العينات السائلة هذه الطريقة يولد متوافقة بسهولة مع مختلف البيوكيميائية المصب والفيزياء الحيوية الأصلي البروتين التحليلات، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي. بعد خطوة واحدة تنظيف تمكنا من تحديد وتوصيف، من خلال مطياف الكتلة الأصلي والمجمعات البروتين غير معروفة في أجزاء CN-GELFrEE، مما يدل على الأزياء الأصلي والتوافق بين هذه التقنيات.
وعلى غرار تغيير طبيعة GELFrEE، هذه التقنية تجزئة الأم الجديدة هي أيضا قابلة للتكيف إلى حد كبير. ويمكن تعديل تركيزات الصب حلول لإنشاء المواد الهلامية التدرج مختلفة، وذلك لتغيير نطاق الوزن الجزيئي أن يتم حل خلال التشغيل. زيادة T٪ من هلام الفصل حلول النتائج في resolut عاليةأيون الأنواع الجماعية أقل، بينما تتناقص أنه يحسن الفصل بين الأنواع عالية الوزن الجزيئي. ويمكن أيضا العصر جمع من خلالها يتم تنفيذ التجربة من تكييفها من أجل تحسين عرض النطاق الترددي ذو وزن جزيئي التي تحققت في كل جزء حسب الحاجة. الوقت تجربة ممتدة فوق 120 دقيقة سيولد نطاقات أعلى من الوزن الجزيئي من يصور في هذا البروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، وتقليل الوقت بين جمع جزء يمكن أن تقلل من تعقيد في كل جزء. لذلك، معلمات متعددة يمكن بسهولة غرامة ضبطها، وتحسين استخدام هذه التقنية لدراسات مختلفة.
وفي الختام، ومزايا CN-GELFrEE تحتل فجوة في مجال تقنيات الفصل الأم عرض عالية الدقة الفصل في مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية، واستعادة نسبة عالية من البروتين، وقبول كميات عالية من البروتين الحمل. وأخيرا، فإن الكسور الناتجة متوافقة مع معظم مواليد المصب وتغيير طبيعة تقنيات تحليل البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
قدمت مؤسسة WM كيك بسخاء التمويل لهذا العمل. وتستند هذه المواد على العمل بدعم من FAPERJ منحة بحثية 100.039 / 2014 من حكومة ريو دي جانيرو الدولة - البرازيل لالمبثوثة، علوم بلا حدود منحة دراسية 88٬888،075416 / 2013-00 من التنسيق لتحسين لموظفي التعليم العالي، في ظل الحكومة من البرازيل، لدعم الخدمات الصحية ومؤسسة العلوم العليا زمالة القومي للبحوث تحت الزمالة رقم 2014171659 لمرصد الصحراء والساحل، وCNPq البحوث منحة 202011 / 2012-7 من حكومة البرازيل لLHFDVPCH هي المستفيدة من الكيمياء في جامعة نورث وسترن للحياة العمليات معهد ما بعد الدكتوراه جائزة الزمالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Materials | |||
| 15 ml conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
