Abstract
complejos de proteínas desempeñan una serie de funciones celulares esenciales. Elucidar sus interacciones no covalentes y dinámicas es de suma importancia para la comprensión del papel de los complejos en los sistemas biológicos. Mientras que la caracterización directa de conjuntos biomoleculares se ha convertido cada vez más importante en los últimos años, las técnicas de fraccionamiento nativos que son compatibles con técnicas de análisis de aguas abajo, incluyendo la espectrometría de masas, son necesarias para ampliar aún más estos estudios. Sin embargo, el campo carece de una, de amplio rango, método de separación de alta recuperación de alto rendimiento para ensamblajes de proteína nativa. A continuación, presentamos clara fracción líquida de gel eluida electroforesis nativa atrapamiento (CN-GELFrEE), que es una modalidad novedosa para la separación de proteínas asambleas no covalentes. rendimiento de separación CN-GELFrEE fue demostrado por los complejos de fraccionamiento extraídos del corazón de ratón. Las fracciones se recogieron durante 2 hr y se muestran bandas discretas que van desde ~ 30 a 500 kDa. Una estafase observó patrón consistente de aumentar los anchos de banda de peso molecular, cada uno que van ~ 100 kDa. Además, la posterior reanálisis de fracciones nativas a través de SDS-PAGE mostró peso molecular se desplaza de acuerdo con la desnaturalización de los complejos de proteínas. Por lo tanto, CN-GELFrEE se demostró que ofrecer la posibilidad de realizar de alta resolución y alta recuperación de separaciones nativos en los complejos de proteínas de una gama amplia de peso molecular, proporcionando fracciones que son compatibles con los análisis de proteínas aguas abajo.
Introduction
La mayoría de los procesos biológicos que ocurren dentro de una célula se cree que ser llevado a cabo por los conjuntos de proteínas en lugar de proteínas individuales 1. En consecuencia, con el fin de elucidar el papel biológico específico de una subunidad de la proteína en una célula que es necesaria para entender sus interacciones estructurales con otras proteínas o ligandos en los complejos 2. Sin embargo, el estudio de las proteínas de forma nativa, el mantenimiento de sus interacciones y la actividad no covalentes, sigue siendo un reto. Una de las deficiencias de los estudios de proteína nativa es una técnica de separación nativa adecuado que sea compatible con diversas técnicas de análisis de proteínas aguas abajo. Por lo tanto, un interés reciente en las técnicas de separación capaz de caracterizar conjuntos no covalentes de biomoléculas ha aumentado considerablemente 3.
técnicas de separación de proteínas son imprescindibles para la bioquímica, la biofísica y varios otros estudios. técnicas de separación nativos actuales tienen intrinsic deficiencias que reducen la compatibilidad con los análisis posteriores, como la baja resolución, de bajo rendimiento, pérdida de la precipitación, y la exigencia de grandes cantidades de muestra inicial. Purificación por afinidad en tándem se utiliza comúnmente para estudios de interacción de proteínas, pero tiene que ser llevado a cabo por separado para cada proteína diana, provocando que sea incompatible con el análisis de alto rendimiento 4. Cromatografía de exclusión de tamaño 5, precipitación selectiva con cromatografía de afinidad por iones y 5 en gradiente de densidad de separación 6 todos se han proporcionado separaciones nativas, sino que son inherentemente técnicas de baja resolución y requieren altas cantidades iniciales de la muestra.
Alternativamente, las técnicas a base de gel, como el azul nativo (BN) y Clear Native PAGE (CN) (ya sea 1-D o 2-D), muestran la separación de alta resolución. Por otra parte, en contraste con otras técnicas mencionadas, ambas separaciones PAGE nativos mantienen la solubilidad y la conformación nativa de un amplio range de especies de macromoléculas, incluyendo proteínas hidrófobas. Esta capacidad amplía aún más la cobertura proteoma alcanzado por estos métodos 7,8 y se logra a través de diferentes química entre CN y BN-PAGE. NC-PAGE se basa comúnmente en detergentes cargados suave como moléculas portadoras, en sustitución del colorante azul de Coomassie en BN-PAGE. BN-PAGE, aunque asociado con una resolución más alta, tiene advertencias, tales como reducción de la actividad enzimática en las proteínas separadas 8 y la formación de aductos molécula de Coomassie, siendo este último muy perjudicial para MS aguas abajo análisis 9. Ambos métodos, sin embargo, están asociados tradicionalmente con baja recuperación y la cobertura proteoma estrecha debido a las manchas y las limitaciones de extracción de gel 7.
Para el estudio de las proteínas desnaturalizadas, hay varias técnicas que mantienen la solubilidad macromolécula en el desempeño de alta resolución de fraccionamiento con alta recuperación de proteínas y que son compatibles con diVerse técnicas de análisis de proteínas después de la separación. Gel-eluido fracción líquida atrapamiento de electroforesis (GELFrEE) es una de las técnicas de fraccionamiento que se ajustan a todas estas características. Este método se aplica en gran medida en los estudios de alto rendimiento proteómica de arriba hacia abajo, lo que indica que es rápido y versátil. En GELFrEE, las proteínas se desnaturalizan y se separó basan en el peso molecular a través de una matriz de gel tubular, la porosidad de los cuales se puede variar basado en los requisitos de la muestra y los resultados de fraccionamiento deseados. Las fracciones que se eluyen en fase líquida, reduciendo así las limitaciones de recuperación asociados con SDS-PAGE, mientras que se mantiene una alta resolución. Alícuotas de fracciones pueden ser analizados por PAGE 1-D para la selección de ancho de banda de peso molecular 11. Hay una gran demanda de las ventajas asociadas a GELFrEE en técnicas de separación nativas. El método descrito en este documento, Claro nativo GELFrEE (CN-GELFrEE), es una adaptación natural de GELFrEE. Con el fin de ser compatible con una amplia spectrum de macromoléculas en su estado nativo, este método se basa no sólo en la química CN-PAGE suave, pero también en una separación en gradiente de porosidad, lo que reduce la precipitación de proteínas mediante la eliminación de la dura transición entre porosidades presentes en los sistemas de gel discontinuos 9. Cuando se aplica a fraccionar complejos de proteínas extraídas de corazón de ratón, fracciones eluidas muestran alta recuperación y una separación de alta resolución de una amplia gama de pesos moleculares se obtuvo. Además, las fracciones resultantes son compatibles con la mayoría de los análisis de proteínas bioquímicas y biofísicas de aguas abajo.
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Protocol
Nota: este protocolo de vídeo se basa en una publicación asociada 9. reactivos específicos, materiales y equipos necesarios para llevar a cabo todos los pasos descritos en este protocolo se enumeran en la sección de materiales. Las recetas e información para la preparación de todas las soluciones requeridas se detallan en la Tabla 1.
1. Verter de Gel tubo de gradiente
- Montaje del sistema de reparto
- Utilizando una hoja de afeitar de llama calentado o bisturí, cortar una pipeta serológica de 20 ml a lo largo de una sección ortogonal de 10 cm desde la parte superior de la punta de dispensación. Asegúrese de que la superficie de corte es suave. Mantenga la pieza inferior (con la punta) y desechar la pieza superior. Sujetar la pieza inferior de la pipeta verticalmente (punta cónica hacia abajo) en un soporte de apoyo.
PRECAUCIÓN: No toque el metal cuchilla caliente, utilizar mangos adecuados o una pinza para evitar quemaduras. - Cortar 3 cm de tubo flexible y conectarlo a la pipeta corte por estirarla por encimala punta dispensadora. Conectar la válvula de control de flujo en el otro extremo del tubo.
- Vincular la parte inferior de la válvula a la punta dispensadora del mezclador de gradiente utilizando un trozo de tubo. Mantenga la válvula abierta.
- Para mezclar gradiente en la parte superior de un agitador magnético. Colocar barras magnéticas en el interior de las cámaras de mezcla.
- Coloque la punta dispensadora de la mezcladora gradiente de 5-10 cm más alto que la parte superior de la pieza de pipeta para permitir que el gel se puede verter por gravedad.
- Probar el sistema en busca de fugas con agua desionizada. Si no se encuentran fugas, secar el sistema soplando aire en su interior antes de continuar.
- Cubra la parte superior de la pieza de la pipeta con dos o más capas de cinta. Perforar un agujero a través de las capas de cinta en el centro de la abertura circular. Asegúrese de que la punción es lo suficientemente grande para que el tubo de vidrio herméticamente para pasar a través.
- Deslice el tubo de vidrio, donde será lanzado el gel, a través del agujero perforado, que se extiende la cinta por lo que el vidrio se ajusta con firmeza. yonsert el tubo de vidrio de modo que la parte inferior del tubo es de 2 mm por encima de la parte inferior de la pipeta.
- Compruebe si el tubo de vidrio se lleva a cabo y centralizada y no está en contacto con la pared de la pipeta una vez que el sistema está preparado. El sistema está listo para la fundición.
- Utilizando una hoja de afeitar de llama calentado o bisturí, cortar una pipeta serológica de 20 ml a lo largo de una sección ortogonal de 10 cm desde la parte superior de la punta de dispensación. Asegúrese de que la superficie de corte es suave. Mantenga la pieza inferior (con la punta) y desechar la pieza superior. Sujetar la pieza inferior de la pipeta verticalmente (punta cónica hacia abajo) en un soporte de apoyo.
- Gel de reparto
- Preparar tampón de gel, APS y soluciones de Coomassie (soluciones 1-3, Tabla 1).
- Preparar 12% T (solución 4, Tabla 1) y 1% T (solución 5, Tabla 1) la separación de las soluciones de gel. Añadir 10 l de solución de Coomassie en la solución de separación T gel 12%. Añadir APS y TEMED en ambas soluciones inmediatamente antes de verter en el mezclador de gradiente.
PRECAUCIÓN: poliacrilamida es altamente neurotóxico y los guantes deben ser usados. - Asegúrese de que la válvula de distribución del mezclador de gradiente está cerrado. Agregar el 12% T solución de gel a la cámara de mezcla más alejado de la punta dispensadora de separación. Abra la válvula entre las dos cámaras y dejar que el flujo de la solución ire a la siguiente cámara.
- Cierre la válvula y la pipeta la solución de gel de separación T dislocada 12% de nuevo a la cámara anterior. Esto se hace para evitar burbujas de aire entre las cámaras.
- Añadir el 1% T solución de gel a la cámara de mezcla más cerca de la punta dispensadora de separación. Encienda el agitador magnético.
- válvulas mezcladoras abrir ambos gradiente al mismo tiempo para permitir que las soluciones de gel de separación para ser mezclados y fluyan en el tubo de pipeta y de vidrio.
- Una vez que se agotan las soluciones de gel de separación en el mezclador de gradiente, desacoplar el tubo del mezclador y acoplarlo a una jeringa de 10 ml. Asegúrese de que el extremo del tubo permanece por encima del nivel de líquido en la pipeta hasta que la jeringa se une firmemente.
- Utilice la jeringa para empujar suavemente la solución de gel de separación restante del tubo en el tubo de pipeta y de vidrio. Cierre la válvula de la pipeta antes de permitir que las burbujas de aire en él.
- añadir con cuidado una capa de aproximadamente 0,25 ml de butano saturado de agual (solución 6, Tabla 1) en la parte superior de la solución de gel en el interior del tubo de vidrio para sellar la reacción de polimerización de oxígeno en el aire y para aplanar el menisco superior.
- Limpiar el aparato vierte inmediatamente con agua desionizada (no utilice detergente).
- Espere durante la noche para la polimerización de gel completa a temperatura ambiente.
- Desmontaje tubo de gel de dispositivos y almacenamiento
- Al día siguiente, la cáscara con cuidado la cinta de la parte superior del dispositivo.
- Desconectar la válvula de la tubería bajo la pipeta. Liberar la pipeta de la pinza y realizar los pasos 1.3.3. y 1.3.4. sobre un fregadero.
- Pareja una jeringa de 10 ml llena de agua desionizada al tubo flexible. Empujar el agua a través de la tubería en la pipeta, deslizando lentamente el gel polimerizado de la pipeta.
- Mantener la pipeta en posición horizontal y fije cuidadosamente el gel se deslice fuera del extremo abierto.
- Corte el exceso de poliacrilamida debajo y around el tubo de vidrio usando una cuchilla de afeitar. Asegúrese de crear un extremo liso en el gel dentro del tubo, por lo que es a nivel con la punta del tubo de vidrio.
- Dispensar cualquier butanol restante desde el lado superior del gel y fijar el tubo de gel en un tubo de centrífuga de destapado de 15 ml. Mezclar 0,5 ml de tampón de gel (solución 1, Tabla 1) con 4,5 ml de agua ultra-pura y añadir alrededor de 2 ml de la solución a tanto en el lado superior (dentro del tubo de vidrio) y el lado inferior (en tubo de centrífuga) del tubo de gel.
- Cubra la parte superior completa del tubo de centrífuga, incluyendo la abertura del tubo de vidrio, con parafilm para evitar la evaporación de amortiguamiento. Los geles se pueden almacenar a 4 ° C durante aproximadamente 2 semanas.
Preparación 2. Muestra
- Pesa dos corazones de ratón y picar en una placa de Petri utilizando una hoja de afeitar.
- Añadir el tejido procesado a un mortero y añadir suficiente nitrógeno líquido para cubrir la muestra. Pulverizar el tejido con una mano de mortero, añadiendo másnitrógeno líquido cuando se evapora.
- Una vez que el tejido se muele a fondo, dejar que se evapore de nitrógeno y añadir 1 ml de tampón de lisis (solución 7, Tabla 1) a 4 ° C por cada 100 mg de tejido. Mueva solución en un tubo de centrífuga.
- Centrifugar a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C. Recoger cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo y desechar el sedimento. Cuantificar la concentración de proteína en el sobrenadante mediante el método del ácido bicinconínico 12, o como se prefiere. Nota: Los lisados celulares nativas o fracciones subcelulares se pueden preparar como se prefiera. CN-GELFrEE es compatible con varios diferentes preparaciones de muestras nativas.
- Preparar la solución tampón de solubilización y la solución de carga (soluciones 8 y 9, Tabla 1).
- Si la muestra es una pastilla, resuspender en 50 a 150 l de tampón de solubilización. Mantenga la muestra en hielo durante 15 min.
- Intercambio de tampón de la muestra se volvió a suspender o el lisado celular con solubilizattampón de ion usando un filtro centrífugo de ultra 30 kDa-MWCO.
- Centrifugar la muestra de proteína a 4 ° C y 10.000 xg durante 5 a 10 min o hasta que el volumen fracción retenida se ha reducido a aproximadamente 20 l. Desechar el flujo continuo.
- Añadir 400 l de tampón de solubilización a la fracción retenida y mezclar mediante pipeteo. Centrifugar a 4 ° C y 10.000 xg durante 5 a 10 min o hasta que la fracción retenida se ha reducido a aproximadamente 20 l. Desechar el flujo continuo.
- Repita el paso 2.9 dos veces más.
- Diluir la muestra filtrada (aproximadamente 20 l) en 100 l de tampón de solubilización.
- Añadir 20 l de solución de carga de probar.
3. Dispositivo CN-GELFrEE
- Para llevar a cabo CN-GELFrEE fraccionamiento, la fabricación de las piezas del dispositivo, haciendo referencia a un taller mecánico. Fabricar las piezas del dispositivo de teflón. Por favor refiérase a la Figura 1 para toda la información necesaria para la fabricación de las piezas y to Tabla 2 para el número de piezas necesarias para un dispositivo.
Consideraciones de seguridad: Usar el equipo de protección personal adecuado. Se debe tener cuidado en torno a las fuentes de alimentación de alta tensión, y todas las uniones se debe montar correctamente. No toque el dispositivo o en cualquier zona húmeda adyacente, mientras que la tensión está en los alrededores y mantener seca el área de banco durante la electroforesis. Por otra parte, la fuente de alimentación debe estar completamente apagado al manipular el dispositivo y / o recolección de fracciones. - Preparar el tampón de ánodo y cátodo (tampón soluciones 10-11, Tabla 1) y mantenerlos a 4 ° C o en hielo.
- Ajuste el extremo superior del tubo de gel (final sin gel) a través de un espaciador, una junta tórica y un segundo separador, en forma de "sandwich".
- Añadir la cámara intermedia (cátodo) después del segundo separador, pasar los tornillos completamente a través de los orificios laterales, añadir y apretar las tuercas a ambos lados. Asegúrese de que el extremo superior de los glass tubo se fija antes de la abertura superior de la cámara de amortiguación, que no están directamente debajo de ella o pasado.
- Montar el extremo inferior del tubo de gel a través de un espaciador, una junta tórica, la cámara de recogida, y un segundo espaciador.
- Añadir la cámara intermedia (ánodo) después del segundo separador, pasar los tornillos completamente a través de los orificios laterales, añadir y apretar las tuercas a ambos lados. Asegúrese de que el extremo inferior del tubo de gel se fija más allá de la abertura superior de la cámara tampón, cerca pero sin tocar la pared posterior.
- Permite configurar el dispositivo NC-GELFrEE verticalmente con la cámara tampón de cátodo hacia arriba con un soporte de apoyo con las abrazaderas.
- Añadir tampón de ánodo a la cámara tampón del ánodo (fondo) y tampón de cátodo a la cámara de tampón de cátodo (parte superior). Mantenga todos los tampones a 4 ° C.
- Eliminar las burbujas de aire desde el interior del tubo de vidrio golpeando suavemente el tubo de cristal y controlar el sistema de fugas.
- Asegúrese de que los electrodos de platino están en contacto con los amortiguadores en las cámaras y que tantoextremos de los tubos de gel se sumergen en la memoria intermedia dentro de cada cámara.
- Conectar los cables de alimentación de la fuente de alimentación a los enchufes de plátano respectivos: negativa en la cámara tampón del cátodo (parte superior) y positiva en la cámara tampón de ánodo (parte inferior).
- Cargar la muestra utilizando una punta de carga de gel a la superficie superior del gel, en el interior del tubo de gel.
- Correr el gel a 1 W constante, para evitar el sobrecalentamiento, hasta que el frente de colorante rojo se encuentra en la parte inferior del tubo de gel.
PRECAUCIÓN: Apague la fuente de alimentación antes de continuar. - Desechar de ánodo y cátodo buffers.
- Aflojar las tuercas de la cámara tampón de ánodo y desmontar el separador inferior y la cámara, el mantenimiento de un espaciador y la junta tórica. Coloque el extremo inferior del tubo de gel dentro de la cámara de recogida, antes de la abertura de la parte superior, no pasado o directamente debajo de ella. Empuje el espaciador y la junta tórica cerca de la cámara de recogida.
- Cortar un trozo de membrana de diálisis de celulosa y rehidratar sumergiéndola en un tampón de ánodo. Cubrir el apaber- entre la cámara de recogida y el espaciador inferior utilizando la membrana de diálisis.
- Montar la cámara tampón de ánodo después del segundo separador, añadir y apretar los tornillos y pernos.
- Coloque el dispositivo en posición horizontal sobre un cubo de hielo. Añadir tampones de ánodo y cátodo frescas a las cámaras de amortiguación y comprobar el sistema de fugas.
- Añadir 150 l de tampón de ánodo en la cámara de recogida. Vuelva a conectar los cables de alimentación a los enchufes de plátano respectivos.
- Encienda la fuente de alimentación a 3 mA de corriente constante. El frente de colorante debe entonces empezar a eluir en la memoria intermedia en la cámara de recogida.
- Cuando se eluye todo el frente de colorante, apague la fuente de alimentación y recoger la primera fracción (0 min) y se la transfiere a un tubo de microcentrífuga de unión baja en proteínas.
- Vuelva a llenar la cámara de recogida con 150 l de tampón de ánodo. Mantenga todas las fracciones recogidas en el hielo.
- Recoger las fracciones después de los siguientes intervalos de tiempo de la colección de laprimera fracción: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min y 60 min. No tienen en cuenta el tiempo, mientras que la fuente de alimentación está apagada. No se olvide de apagar la fuente de alimentación antes de recoger las fracciones y para volver a llenar la cámara de recogida con 150 l de tampón de ánodo entre las muestras. Cortar el suministro eléctrico de nuevo después de la recolección para iniciar la elución de la siguiente fracción.
- Prescindir de los tampones de ánodo y cátodo y añadir nuevas soluciones a las cámaras de amortiguación después de 60 minutos. Recoger fracciones en 90 min y 120 min.
- Cambiar de ánodo y cátodo buffers cada hora.
- Ejecutar una clara nativa o una página nativa azul con las fracciones y mancharlo como se prefiera. Siga las instrucciones del fabricante o protocolo preferido.
- Ejecutar una reducción de SDS-PAGE y mancharlo como preferidos. Siga las instrucciones del fabricante o protocolo preferido.
- Limpiar las fracciones GELFrEE y someterse a análisis de espectrometría de masas nativa como se describe previously 9.
Figura 1:. CN-GELFrEE dispositivo (A) del dispositivo GELFrEE piezas de dibujos y (B) fotografía de piezas fabricadas; (C) CN-GELFrEE esquema de conjunto del dispositivo: (1) cámara intermedia, (2) espaciador, (3) O-anillo, (4) Tubo de gel, (5) la cámara de recogida, y (6) de la membrana de diálisis.
Tabla 1: Tabla de soluciones.
Tabla 2: Tabla de las piezas del dispositivo GELFrEE.
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Representative Results
200 g de proteínas extraídas de criogénicamente corazones ratón de tierra se fraccionaron de forma nativa en 14 fracciones de 150 ml cada uno, utilizando el método de CN-GELFrEE en un tubo de gel T 1-12%. Una parte alícuota de 10 l de cada fracción se ejecuta en un gel de placa CN-PAGE y teñido con plata. Una clara representación del fraccionamiento y resolución obtenida con el fraccionamiento CN-GELFrEE se muestra en la Figura 2A. Las fracciones se recogieron más de dos horas y el ensayo de gel muestra un patrón constante de aumento de pesos moleculares que van desde ~ 30 a 500 kDa. Cada fracción contiene especies que van en los medios de más de ~ 100 kDa. Las fracciones que muestran una baja superposición de peso-rangos moleculares que se reduce cada vez más como ocurren más colecciones entre las fracciones. El gel de placa NC-PAGE se muestra aquí representa sólo el 6% de la proteína recuperada de cada fracción l 150.
Cada uno de los fractiones eluyó de forma nativa desde CN-GELFrEE se reduce y se desnaturaliza antes de ejecutarlas en una placa de gel de SDS-PAGE posteriormente. En el gel SDS-PAGE losa reductor (Figura 2B), es posible ver los cambios de masa en todas las fracciones en comparación con los respectivos fracciones nativas (Figura 2A), lo que indica que los complejos de proteínas intactas fueron desmontados y puentes disulfuro se redujeron.
Figura 2:. De separación CN-GELFrEE del corazón de ratón extracto de molienda criogénica (A) Claro nativo PAGE de las fracciones CN-GELFrEE recogidos en intervalos de tiempo de 0 a 120 min. Izquierda: Escala de peso molecular nativo. (B) La reducción de SDS-PAGE de las mismas fracciones como A. Izquierdo: reducida y la escalera de pesos moleculares desnaturalizado.
Las fracciones que luego se pueden limpiar y submitted a espectrometría de masas analiza nativa 9. Espectro MS nativo de la malato deshidrogenasa homodimérica, identificada en algunas de las fracciones GELFrEE, muestra una distribución de carga entre 16+ y 20+ y una masa molecular de 72.843 Da (Figura 3A). El estado de carga mayor de 18 años se aisló y se colisional-activa, lo que resulta en la expulsión de la malato deshidrogenasa monomérica con una masa molecular de 36,421.7 (Figura 3B). activación Fuente se aplicó al complejo intacto con el fin de inducir la eyección de monómero, lo que permite el aislamiento y la mayor fragmentación de los monómeros. El mapa de la fragmentación de la 11+ monómero se puede observar en la Figura 3C. CN-GELFrEE fue demostrado ser compatible con los análisis de espectrometría de masas, mostrando ninguna interrupción de las interacciones proteína-proteína no covalentes de conjuntos macromoleculares.
Figura 3: espectros de masas y la fragmentación mapa del homodímero malato deshidrogenasa (A) espectro MS1 del complejo intacto, (B) MS2 espectro monómero que presenta expulsado desde el complejo, y (C) un mapa fragmentación obtenido a partir de la fragmentación del monómero. . El N rojo indica que el N-terminal está acetilado.
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Discussion
CN-GELFrEE se deriva del sistema de tampón PAGE nativa claro (CN) que usa una mezcla de detergentes aniónicos y neutros como moléculas portadoras 9 para el fraccionamiento de proteínas basado en el peso molecular a través de una matriz de gel. La aplicación de CN-GELFrEE a un extracto de proteína de corazón de ratón nativo generado fracciones de baja complejidad con anchos de banda discretos, mientras que el mantenimiento de las interacciones no covalentes de los ensamblajes biomoleculares. Comparación de fracciones entre CN-PAGE y la reducción de geles de placa de SDS-PAGE mostró cambios masivos que demuestran la pérdida de interacciones no covalentes entre macromoléculas en las fracciones y rotura de enlaces disulfuro entre cadenas de proteínas. Los resultados confirman el carácter natural de la separación CN-GELFrEE.
Algunos pasos de este protocolo son críticos, lo cual justifica una mayor atención. En primer lugar, después de la fundición, el tubo de gel debe ser separado del dispositivo lentamente y la poliacrilamida externa cortar cuidadosamente. De no hacerlopor lo que puede dañar el gel, haciendo que las burbujas de aire dentro de la malla o separar el gel del tubo de vidrio. Estos daños afecten negativamente a la resolución de separación y se debe evitar a fondo. En segundo lugar, durante la electroforesis, la resistencia eléctrica del sistema aumentará las horas extraordinarias, la generación de calor, por lo que es muy importante, ya sea realizar el procedimiento en una cámara de frío o para mover el dispositivo a un cubo de hielo después de la muestra se ha cargado en la gel, a fin de no desnaturalizar las proteínas cargadas por el calor. Además, es importante a la mente algunas limitaciones fundamentales de la técnica cuando se realiza el protocolo descrito. cargas altas en proteínas pueden reducir la resolución CN-GELFrEE. La sobrecarga, especialmente de muestras en las que algunas especies son más abundantes, hará que las especies de proteínas que se eluyó a través de una serie de fracciones consecutivas. Para criogénicamente muestras de tierra de ratón, los mejores resultados se observaron con cantidades entre 200 y 400 g, pero este comportamiento es dependiente de la muestra. Además, hIGH niveles de sal en la muestra puede alterar las propiedades electroforéticas de proteínas, alteración del patrón de banda y reducir la resolución de fraccionamiento. Estos pasos críticos y limitaciones deben tenerse en cuenta durante la realización de este protocolo para lograr mejores resultados.
Por otra parte, el CN-GELFrEE ha demostrado tener múltiples características de gran demanda en cromatografía nativa. Este método de separación sencilla se consigue una alta resolución de fraccionamiento de complejos de proteínas, la aceptación de altas cantidades de carga de proteínas y fraccionamiento a través de una amplia gama de pesos moleculares. CN-GELFrEE también fue demostrado ser muy versátil, siendo capaz de fraccionamiento de muestras biológicas de una gran variedad de organismos y diferentes preparaciones 9.
Por otra parte, la elución fracción líquida en esta técnica permite una alta recuperación de proteína que no se observa en otras separaciones nativas a base de gel. Además, a diferencia de otros métodos que easambleas laúd en fase líquida, CN-GELFrEE no reduce la concentración de la muestra. De hecho, el protocolo descrito en el presente documento aumenta la concentración de cada ensamblaje de proteínas por ~ 2 veces a partir de la muestra a las fracciones. Finalmente, las muestras líquidas este método genera son fácilmente compatibles con varios bioquímica y biofísica aguas abajo-proteína nativa análisis, incluyendo la espectrometría de masas. Después de un solo paso limpiar hemos sido capaces de identificar y caracterizar, a través de la espectrometría de masas nativa, complejos de proteínas desconocidas en fracciones CN-GELFrEE, lo que demuestra aún más la moda nativa y la compatibilidad entre estas técnicas.
De manera similar a la desnaturalización GELFrEE, esta novedosa técnica de fraccionamiento nativa también es altamente adaptable. Las concentraciones de fundición soluciones se pueden ajustar para crear diferentes geles de gradiente, con el fin de variar la gama de peso molecular que se resuelve durante una carrera. El aumento de la T% del gel de separación soluciones resultados de alta resolucion de las especies de menor masa mientras que la disminución que mejora la separación de especies de alto peso molecular. Los tiempos de recogida a través del cual se lleva a cabo el experimento también se pueden adaptar a fin de optimizar los anchos de banda de peso molecular obtenidos en cada fracción, según sea necesario. tiempo prolongado experimento por encima de 120 min generará rangos de peso molecular incluso más altos que se representan en este protocolo. Además, reduciendo el tiempo entre la recogida de fracciones puede reducir la complejidad en cada fracción. Por lo tanto, varios parámetros pueden ser fácilmente afinaron, la optimización del uso de la técnica para diferentes estudios.
En conclusión, las ventajas CN-GELFrEE ocupan un espacio en el campo de las técnicas de separación nativas que presentan la separación de alta resolución en una amplia gama de pesos moleculares, alta recuperación de la proteína, y la aceptación de altas cantidades de carga de proteína. Finalmente, las fracciones resultantes son compatibles con la mayoría nativa aguas abajo y desnaturalizantes técnicas de análisis de proteínas.
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Acknowledgments
El WM Keck Foundation proporcionó generosamente fondos para este trabajo. Este material está basado en trabajo apoyado por una beca de investigación FAPERJ 100.039 / 2014 del gobierno de Río de Janeiro Estado - Brasil por RDM, Ciencia sin Fronteras beca 88888.075416 / 2013-00 de la Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior, bajo el gobierno de Brasil, para el FSS, la Fundación de Ciencias de becas de Postgrado Nacional de investigación con el número 2014171659 beca para OSS, y por una beca de investigación CNPq 202011 / 2012-7 por parte del gobierno de Brasil por LHFDVPCH es un receptor de Química de la vida de una Universidad Northwestern Procesos Instituto Postdoctoral Beca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Materials | |||
| 15 ml conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
