Abstract
complessi proteici svolgono una serie di funzioni cellulari cruciali. Chiarire le loro interazioni non covalenti e la dinamica è fondamentale per la comprensione del ruolo di complessi nei sistemi biologici. Mentre la caratterizzazione diretta di complessi biomolecolari è diventato sempre più importante negli ultimi anni, le tecniche di frazionamento nativi che sono compatibili con le tecniche di analisi a valle, tra la spettrometria di massa, sono necessari per espandere ulteriormente questi studi. Tuttavia, il campo manca di un high-throughput, ad ampio spettro, metodo di separazione ad alta recupero per gli assembly proteina nativa. Qui, presentiamo chiaro nativo frazione liquida gel-elettroforesi eluita intrappolamento (CN-GELFrEE), che è una modalità di separazione nuovo per assiemi proteici non covalenti. prestazioni di separazione CN-GELFrEE è stata dimostrata da complessi di frazionamento estratte dal cuore del mouse. Le frazioni sono state raccolte più di 2 ore e visualizzati bande discrete che vanno da ~ 30 a 500 kDa. A conè stata osservata modello coerente di aumentare larghezze di banda di peso molecolare, ciascuno compreso ~ 100 kDa. Inoltre, la successiva rianalisi delle frazioni native tramite SDS-PAGE ha mostrato peso molecolare sposta coerente con la denaturazione di complessi proteici. Pertanto, CN-GELFrEE stato dimostrato di offrire la possibilità di eseguire ad alta risoluzione e ad alta recupero separazioni native su complessi proteici da un ampio intervallo di peso molecolare, fornendo frazioni compatibili con analisi di proteine a valle.
Introduction
La maggior parte dei processi biologici che accadono all'interno di una cella si pensa siano svolte da gruppi di proteine piuttosto che singole proteine 1. Di conseguenza, al fine di chiarire il ruolo biologico specifico di una subunità della proteina in una cellula è necessario comprenderne le interazioni strutturali con altre proteine o leganti in complessi 2. Tuttavia, lo studio delle proteine in modo nativo, mantenendo le loro interazioni e le attività non covalenti, rimane difficile. Uno dei difetti di studi proteina nativa è una tecnica di separazione adeguato nativa che è compatibile con varie tecniche di analisi delle proteine a valle. Pertanto, il recente interesse per le tecniche di separazione in grado di caratterizzare le assemblee non covalenti di biomolecole è aumentato bruscamente 3.
tecniche di separazione delle proteine sono indispensabili per la biochimica, biofisica e vari altri studi. Attuali tecniche di separazione nativi hanno intrinsic carenze che riducono la compatibilità con le analisi a valle, come la bassa risoluzione, bassa produttività, perdita di precipitazioni, e l'esigenza di grandi quantità di campione iniziale. Tandem purificazione di affinità è comunemente utilizzato per gli studi di interazione proteina, ma deve essere effettuata separatamente per ciascun target di proteine, causando che sia incompatibile con l'analisi high-throughput 4. Dimensioni cromatografia di esclusione 5, precipitazione selettiva con lo ione cromatografia di affinità 5 e in gradiente di densità separazione 6 tutti hanno fornito le separazioni nativi, ma sono intrinsecamente tecniche a bassa risoluzione e richiedono elevate quantità di campione iniziale.
In alternativa, le tecniche di gel a base, come il blu Native (BN) e Clear Native PAGE (CN) (sia 1-D o 2-D), mostrano la separazione ad alta risoluzione. Inoltre, in contrasto con altre tecniche menzionate, sia le separazioni PAGE nativi mantengono solubilità e conformazione nativa di un'ampia range di specie macromolecola, tra cui proteine idrofobiche. Questa funzionalità amplia ulteriormente la copertura proteoma raggiunta da questi metodi 7,8 e si ottiene attraverso diversi chimica tra CN e BN-PAGE. CN-PAGE si basa comunemente sui detergenti morbido pagano come molecole carrier, sostituendo il colorante Coomassie Blu di BN-PAGE. BN-PAGE, anche se associata a maggiore risoluzione, ha avvertimenti come ridotta attività enzimatica delle proteine separate 8 e formazione di addotti Coomassie molecola, quest'ultimo essendo notevolmente pregiudizievoli per MS valle analisi 9. Entrambi questi metodi, tuttavia, sono tradizionalmente associati a bassa recupero e la copertura proteoma stretta a causa di macchie e le limitazioni di estrazione gel 7.
Per lo studio di proteine denaturate, ci sono diverse tecniche che mantengono macromolecola solubilità durante l'esecuzione di frazionamento ad alta risoluzione con recupero ad alto contenuto proteico e che sono compatibili con diVerse tecniche di analisi delle proteine post-separazione. Gel-eluite frazione liquida Entrapment elettroforesi (GELFrEE) è una delle tecniche di frazionamento che si adattano tutte queste caratteristiche. Questo metodo è ampiamente applicata in studi high-throughput proteomica top-down, che indica che è veloce e versatile. In GELFrEE, le proteine vengono denaturate e separate in base al peso molecolare attraverso una matrice tubolare di gel, la cui porosità può essere variata in base alle esigenze di esempio ei risultati frazionamento desiderati. Le frazioni eluite sono in fase liquida, riducendo così le limitazioni ripristino associati con SDS-PAGE mantenendo alta risoluzione. Aliquote frazione può poi essere analizzati da 1-D PAGE per peso molecolare selezione della larghezza di banda 11. C'è forte domanda per i vantaggi connessi con GELFrEE in tecniche di separazione nativi. Il metodo descritto nel presente documento, Cancella Native GELFrEE (CN-GELFrEE), è un adattamento nativo di GELFrEE. Per essere compatibile con un'ampia spectrum di macromolecole nel loro stato nativo, questo metodo si basa non solo sul morbido chimica CN-PAGE, ma anche sulla separazione di porosità pendenza, che riduce la precipitazione delle proteine eliminando la dura transizione tra porosità presenti nei sistemi gel discontinui 9. Quando viene applicato a frazionare complessi proteici estratti dal cuore del mouse, frazioni eluite visualizzati elevato recupero e la separazione ad alta risoluzione di una vasta gamma di pesi molecolari è stato ottenuto. Inoltre, le frazioni risultanti sono compatibili con la maggior parte analizza valle proteine biochimica e biofisica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Questo protocollo video si basa su una pubblicazione associata 9. reagenti specifici, materiali e attrezzature necessarie per eseguire tutte le operazioni descritte in questo protocollo sono elencati nella sezione materiali. Le ricette e le informazioni per la preparazione di tutte le soluzioni necessarie sono dettagliati nella Tabella 1.
1. Versare di gel tubo Gradiente
- Assemblaggio del sistema di colata
- Utilizzando una fiamma riscaldato lama di rasoio o bisturi, tagliare una pipetta 20 ml sierologico lungo una sezione ortogonale 10 cm dalla parte superiore della punta di erogazione. Assicurarsi che la superficie di taglio è liscia. Tenere il pezzo inferiore (con la punta) e scartare il pezzo superiore. Bloccare il pezzo pipetta in basso in senso verticale (punta conica rivolta verso il basso) per un cavalletto di sostegno.
ATTENZIONE: non toccare il metallo della lama riscaldata, utilizzare apposite maniglie o una pinza per evitare scottature. - Tagliare 3 cm di tubo flessibile e collegarlo alla pipetta taglio allungando soprala punta di erogazione. Collegare la valvola di controllo del flusso all'altra estremità del tubo.
- Collega il fondo della valvola alla punta di erogazione del mixer gradiente con un pezzo di tubo. Tenere la valvola aperta.
- Impostare il mixer pendenza sopra un agitatore magnetico. Posizionare barre magnetiche all'interno delle camere di miscelazione.
- Posizionare la punta di erogazione del mixer gradiente 5-10 cm oltre la parte superiore del pezzo pipetta per consentire il gel da versare per gravità.
- Verificare la tenuta dell'impianto con acqua deionizzata. Se si riscontrano perdite, asciugare il sistema soffiando aria al suo interno prima di continuare.
- Coprire la parte superiore del pezzo pipetta con due o più strati di nastro. Perforare un foro attraverso gli strati del nastro nel centro dell'apertura circolare. Assicurarsi che la puntura è abbastanza grande per il tubo di vetro di passare attraverso ermeticamente.
- Far scorrere il tubo di vetro, dove sarà gettato il gel, attraverso il foro forato, estendendo il nastro in modo che il vetro si adatta perfettamente. ionsert il tubo di vetro in modo che il fondo del tubo è di 2 mm dal fondo della pipetta.
- Verificare se il tubo di vetro viene tenuto e centralizzato e non è a contatto con la parete pipetta volta che il sistema è preparato. Il sistema è pronto per la colata.
- Utilizzando una fiamma riscaldato lama di rasoio o bisturi, tagliare una pipetta 20 ml sierologico lungo una sezione ortogonale 10 cm dalla parte superiore della punta di erogazione. Assicurarsi che la superficie di taglio è liscia. Tenere il pezzo inferiore (con la punta) e scartare il pezzo superiore. Bloccare il pezzo pipetta in basso in senso verticale (punta conica rivolta verso il basso) per un cavalletto di sostegno.
- Gel Casting
- Preparare tampone di gel, APS e soluzioni Coomassie (soluzioni 1-3, tabella 1).
- Preparare 12% T (soluzione 4, Tabella 1) e 1% T (soluzione 5, Tabella 1) separare soluzioni gel. Aggiungere 10 ml di soluzione di Coomassie nella soluzione T gel di separazione 12%. Aggiungi APS e TEMED in entrambe le soluzioni immediatamente prima di versare mixer gradiente.
ATTENZIONE: poliacrilammide è altamente neurotossico e guanti devono essere indossati. - Assicurarsi che la valvola di erogazione del miscelatore gradiente è chiuso. Aggiungere il T 12% separa soluzione di gel al più lontano camera di miscelazione dalla punta di erogazione. Aprire la valvola tra entrambe le camere e lasciare che il flusso della soluzione into la camera successiva.
- Chiudere la valvola e pipetta la soluzione dislocata il 12% gel T separazione torna alla camera precedente. Questo viene fatto per evitare bolle d'aria tra le camere.
- Aggiungere il T 1% separando soluzione di gel alla camera di miscelazione più vicino alla punta di erogazione. Accendere l'agitatore magnetico.
- Aprire entrambe gradiente valvole miscelatrici allo stesso tempo per consentire le soluzioni gel di separazione da miscelare e di fluire nel tubo pipetta e vetro.
- Una volta che le separano soluzioni gel nel mixer gradiente sono esaurite, sganciare il tubo dal mixer e coppia per una siringa da 10 ml. Assicurarsi che l'estremità del tubo rimane sopra il livello del liquido nella pipetta finché la siringa è saldamente collegato.
- Usare la siringa per spingere delicatamente la soluzione gel di separazione residua dal tubo nel tubo pipetta e vetro. Chiudere la valvola pipetta prima di consentire bolle d'aria in esso.
- aggiungere delicatamente uno strato di circa 0,25 ml di butano saturo d'acqual (soluzione 6, Tabella 1) sopra la soluzione di gel all'interno del tubo di vetro per sigillare la reazione di polimerizzazione da ossigeno nell'aria e per appiattire il menisco superiore.
- Pulire l'apparato versando immediatamente con acqua deionizzata (non utilizzare detergenti).
- Attendere notte per polimerizzazione completa gel a temperatura ambiente.
- Rimozione gel tubo da dispositivo e Memorizzazione
- Il giorno seguente, sbucciare con cautela il nastro al largo della parte superiore del dispositivo.
- Scollegare la valvola dal tubo sotto la pipetta. Rilasciare la pipetta dalla pinza ed eseguire operazioni 1.3.3. e 1.3.4. sopra un lavandino.
- Coppia una siringa da 10 ml riempita con acqua deionizzata al tubo flessibile. Spingere l'acqua attraverso il tubo nella pipetta, lentamente scivolare il gel polimerizzato dalla pipetta.
- Tenere la pipetta in orizzontale e fissare accuratamente il gel sfilamento dell'estremità aperta.
- Tagliare l'eccesso di poliacrilammide sotto e around il tubo di vetro con una lama di rasoio. Assicurarsi di creare una estremità liscia sul gel all'interno del tubo, rendendo a filo con l'estremità del tubo di vetro.
- Distribuire qualsiasi butanolo rimanente dal lato superiore del gel e impostare il tubo di gel in un 15 ml provetta da centrifuga livellata. Mescolare 0,5 ml tampone di gel (soluzione 1, Tabella 1) con 4,5 ml di acqua ultra-pura ed aggiungere circa 2 ml della soluzione sia al lato superiore (all'interno del tubo di vetro) e la parte inferiore (nella provetta da centrifuga) del tubo di gel.
- Coprire il lato superiore completa della provetta, tra cui l'apertura del tubo di vetro, con parafilm per evitare buffer di evaporazione. I gel possono essere conservati a 4 ° C per circa 2 settimane.
Preparazione 2. campione
- Pesare due cuori del mouse e tritateli in una capsula di Petri con una lama di rasoio.
- Aggiungere il tessuto processato ad un mortaio e aggiungere azoto liquido sufficiente a coprire il campione. Polverizzare il tessuto con un pestello, aggiungendo piùazoto liquido quando evapora.
- Una volta che il tessuto è accuratamente macinati, lasciare evaporare azoto e aggiungere 1 ml di tampone di lisi (soluzione 7, Tabella 1) a 4 ° C per ogni 100 mg di tessuto. Spostare soluzione in una provetta da centrifuga.
- Centrifugare a 2.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Raccogliere accuratamente il surnatante in una nuova provetta e scartare il pellet. Quantificare la concentrazione proteica nel surnatante utilizzando il metodo dell'acido bicinconinico 12, o come preferito. Nota: I lisati cellulari native o frazioni subcellulari possono essere preparati come preferito. CN-GELFrEE è compatibile con vari diverse preparazioni campione nativo.
- Preparare la soluzione tampone solubilizzazione e la soluzione di carico (soluzioni 8 e 9, tabella 1).
- Se il campione è un pellet, risospendere in 50-150 microlitri di tampone di solubilizzazione. Mantenere il campione in ghiaccio per 15 min.
- Buffer scambiare il campione risospeso o lisato cellulare con solubilizattampone ionico usando un filtro centrifugo ultra 30 kDa-MWCO.
- Centrifugare campione proteico a 4 ° C e 10.000 xg per 5-10 minuti o fino a quando il volume della frazione trattenuto è fino a circa 20 microlitri. Gettare il flow-through.
- Aggiungere 400 ml di tampone di solubilizzazione alla frazione trattenuta e mescolare pipettando. Centrifugare a 4 ° C e 10.000 xg per 5-10 minuti o fino a quando la frazione trattenuto è fino a circa 20 microlitri. Gettare il flow-through.
- Ripetere il passaggio 2,9 altre due volte.
- Diluire il campione filtrato (circa 20 mL) in 100 ml di tampone di solubilizzazione.
- Aggiungere 20 ml di soluzione tampone a campione.
Dispositivo 3. CN-GELFrEE
- Per eseguire CN-GELFrEE frazionamento, fabbricare le parti del dispositivo facendo riferimento ad un negozio di macchina. Fabbricare le parti del dispositivo in Teflon. Si prega di fare riferimento alla Figura 1 per tutte le informazioni necessarie per la fabbricazione dei componenti e to Tabella 2 per il numero di parti necessarie per un dispositivo.
Considerazioni sulla sicurezza: Indossare dispositivi di protezione adeguati. Si deve prestare attenzione intorno agli alimentatori ad alta tensione, e tutti gli incroci deve essere montato correttamente. Non toccare il dispositivo o qualsiasi area umida adiacente mentre la tensione è acceso e mantenere la zona circostante panca a secco durante il elettroforesi. Inoltre, l'alimentazione deve essere completamente spento quando si maneggia il dispositivo e / o la raccolta di frazioni. - Preparare il tampone di anodo e catodo del buffer (soluzioni 10-11, Tabella 1) e tenerli a 4 ° C o in ghiaccio.
- Inserire l'estremità superiore del tubo gel (end senza gel) attraverso un distanziatore, un O-ring e un secondo distanziale, in modo "sandwich".
- Aggiungere la camera polmone (catodo) dopo il secondo distanziale, trasferire completamente le viti attraverso i fori laterali, aggiungere e serrare i dadi su entrambi i lati. Assicurarsi che l'estremità superiore del vetrotubo s è fissato prima dell'apertura superiore della camera polmone, non direttamente sotto o passato.
- Inserire l'estremità inferiore del tubo di gel attraverso un distanziatore, un O-ring, la camera di raccolta, ed un secondo distanziale.
- Aggiungere la camera polmone (anodo) dopo il secondo distanziale, trasferire completamente le viti attraverso i fori laterali, aggiungere e serrare i dadi su entrambi i lati. Assicurarsi che l'estremità inferiore del tubo di gel è fissato passato l'apertura superiore della camera polmone, vicino ma non toccare la parete posteriore.
- Impostare il dispositivo CN-GELFrEE verticalmente con la camera di buffer di catodo verso l'alto utilizzando un cavalletto di sostegno con morsetti.
- Aggiungere buffer di anodo alla camera polmone anodo (basso) e tampone catodo alla camera polmone catodo (in alto). Tenere tutti i buffer a 4 ° C.
- Rimuovere le bolle d'aria dall'interno del tubo di vetro picchiettando delicatamente il tubo di vetro e controllare il sistema per perdite.
- Assicurarsi che gli elettrodi di platino sono in contatto con i tamponi nelle camere e che siaestremità del tubo gel sono immersi nel buffer all'interno di ciascuna camera.
- Collegare i cavi di alimentazione dalla rete elettrica ai rispettivi connettori a banana: negativo sulla camera polmone catodo (alto) e positivo sulla camera polmone anodo (in basso).
- Caricare il campione utilizzando una punta di carico gel per superficie superiore del gel, all'interno del tubo di gel.
- Attivare il gel a 1 W costante, per evitare il surriscaldamento, finché il fronte del colorante rosso è al fondo della provetta gel.
ATTENZIONE: Spegnere alimentazione prima di continuare. - Scartare anodo e catodo buffer.
- Svitare i dadi di camera polmone anodo e smontare il distanziale inferiore e la camera, mantenendo un distanziatore e l'O-ring. Inserire l'estremità inferiore del tubo di gel all'interno della camera di raccolta, prima della apertura superiore, non passato o direttamente sotto di essa. Spingere il distanziatore e O-ring in prossimità della camera di raccolta.
- Tagliare un pezzo di cellulosa membrana di dialisi e reidratare lo immergendo in un tampone anodo. Coprire il aperture tra la camera di raccolta ed il distanziale inferiore utilizzando la membrana di dialisi.
- Montare la camera di buffer di anodo dopo il secondo distanziale, aggiungere e stringere le viti e bulloni.
- Appoggiare il dispositivo in orizzontale su un secchio di ghiaccio. Aggiungere anodo e catodo freschi tamponi alle camere di buffer e controllare il sistema per perdite.
- Aggiungere 150 microlitri di tampone anodico nella camera di raccolta. Ricollegare i cavi di alimentazione ai rispettivi connettori a banana.
- Accendere l'alimentazione a 3 mA di corrente costante. Il fronte del colorante dovrebbe partire per eluire nel buffer nella camera di raccolta.
- Quando l'intero fronte del colorante viene eluito, spegnere l'alimentazione e raccogliere la prima frazione (0 min), trasferendola in un basso contenuto di proteine provetta vincolante.
- Riempire la camera di raccolta con 150 ml di tampone anodo. Tenere tutte le frazioni raccolte sul ghiaccio.
- Raccogliere frazioni dopo i seguenti intervalli di tempo dalla collezione delprima frazione: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min e 60 min. Non tenere conto di tempo mentre l'alimentazione è spento. Non dimenticare di spegnere l'alimentazione prima di raccogliere le frazioni e per riempire la camera di raccolta con 150 ml di tampone anodo tra i campioni. Attivare alimentazione di nuovo dopo la raccolta per iniziare a eluizione della frazione successiva.
- Erogare i buffer anodo e catodo e aggiungere soluzioni nuove alle camere buffer dopo 60 min. Raccogliere frazioni a 90 min e 120 min.
- Cambiare anodo e catodo buffer ogni ora.
- Eseguire un nativo chiara o una pagina nativo blu con le frazioni e macchiare come preferito. Seguire le istruzioni del produttore o protocollo preferito.
- Eseguire un riducendo SDS-PAGE e macchiare come preferito. Seguire le istruzioni del produttore o protocollo preferito.
- Pulire le frazioni GELFrEE e presentare alla spettrometria di massa nativo analisi come descritto previously 9.
Figura 1:. CN-GELFrEE dispositivo (A) dei dispositivi GELFrEE parti disegni e (B) fotografia di pezzi lavorati; (C) CN-GELFrEE schema di montaggio del dispositivo: (1) camera polmone, (2) distanziale, (3) O-ring, (4) tubo del gel, (5) camera di raccolta, e (6) membrana di dialisi.
Tabella 1: Tabella di soluzioni.
Tabella 2: Tabella di GELFrEE parti del dispositivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
200 mg di proteine estratte da criogenicamente cuori del mouse terra sono stati frazionati in modo nativo in 14 frazioni di 150 ml ciascuna, utilizzando il metodo del CN-GELFrEE in un tubo di gel T 1-12%. Una aliquota di 10 microlitri di ogni frazione è stato eseguito su un gel lastra CN-PAGE e argento macchiato. Una chiara rappresentazione del frazionamento e la risoluzione ottenuta con CN-GELFrEE frazionamento è mostrato nella Figura 2A. Le frazioni sono state raccolte oltre due ore e il test gel mostra un modello coerente di aumentare pesi molecolari che variano da ~ 30 a 500 kDa. Ogni frazione contiene le specie che vanno in massa oltre ~ 100 kDa. Le frazioni mostrano una bassa sovrapposizione di peso molecolare-range che è sempre più ridotto, come più raccolte avvengono tra frazioni. Il gel lastra CN-PAGE mostrato qui rappresenta solo il 6% delle proteine recuperato da ogni frazione ml 150.
Ciascuno dei fractioni eluita nativamente dal CN-GELFrEE sono stati successivamente ridotti e denaturato prima della loro esecuzione su un gel lastra SDS-PAGE. Nella riduzione gel lastra SDS-PAGE (Figura 2B), è possibile vedere spostamenti di massa in tutte le frazioni rispetto alle rispettive frazioni nativi (Figura 2A), indicando che i complessi proteici intatti sono stati smontati e ponti disolfuro sono stati ridotti.
Figura 2:. CN-GELFrEE separazione del cuore del mouse estratto di macinazione criogenica (A) Cancella nativo PAGE delle frazioni CN-GELFrEE raccolti ad intervalli di tempo da 0 a 120 min. Sinistra: nativo scala peso molecolare. (B) La riduzione SDS-PAGE di stesse frazioni come A. A sinistra: ridotto e denaturato scala peso molecolare.
Le frazioni possono essere puliti e submittEd alla spettrometria di massa nativo analisi 9. Nativo spettro MS del malato deidrogenasi omodimerica, identificata in alcuni delle frazioni GELFrEE, mostra una distribuzione di carica tra 16+ e 20+ e una massa molecolare di 72.843 Da (Figura 3A). Lo stato di carica 18+ è stato isolato e collisionally-attivato, con la conseguente espulsione del monomerica malato deidrogenasi con una massa molecolare di 36,421.7 (Figura 3B). attivazione sorgente è stato applicato al complesso integro per indurre eiezione monomero, permettendo isolamento e un'ulteriore frammentazione dei monomeri. La mappa frammentazione del 11+ monomero può essere osservato nella Figura 3C. CN-GELFrEE è stato dimostrato di essere compatibile con la spettrometria di massa analisi, mostrando alcuna interruzione dei non covalenti interazioni proteina-proteina di assemblee macromolecolari.
Figura 3: spettri di massa e frammentazione mappa della omodimero malato deidrogenasi (A) MS1 spettro del complesso intatto, (B) MS2 spettro monomero esibendo espulso dal complesso, e (C) una mappa frammentazione ottenuto dalla frammentazione del monomero. . Il rosso N indica che l'N-terminale è acetilato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CN-GELFrEE deriva dal sistema tampone PAGE nativa chiaro (CN) che utilizza una miscela di tensioattivi anionici e detergenti neutri come molecole carrier 9 per frazionamento proteico e peso molecolare attraverso una matrice di gel. L'applicazione di CN-GELFrEE ad un estratto nativo proteina cuore del mouse generato frazioni bassa complessità con larghezze di banda discreti, pur mantenendo le interazioni non covalenti delle assemblee biomolecolari. Confronto di frazioni tra CN-PAGE e riducendo gel lastra SDS-PAGE ha mostrato spostamenti di massa che dimostrano la perdita di interazioni non covalenti tra macromolecole nelle frazioni e rottura dei legami disolfuro tra catene proteiche. I risultati confermano il carattere originario della separazione CN-GELFrEE.
Alcuni passi in questo protocollo sono critici, e quindi meritano più attenzione. Innanzitutto, dopo la fusione, il tubo di gel deve essere staccato dal dispositivo lentamente e la poliacrilammide esterna accuratamente tagliato. In caso contrario,ciò potrebbe danneggiare il gel, provocando bolle d'aria all'interno della trama o staccare il gel dal tubo di vetro. Questi danni compromettono la risoluzione separazione e devono essere accuratamente evitati. In secondo luogo, durante l'elettroforesi, la resistenza elettrica del sistema aumenterà straordinari, generando calore, quindi è molto importante sia eseguire la procedura in una camera fredda o per spostare il dispositivo ad un secchiello dopo che il campione è stato caricato nella gel, per non denaturare le proteine caricate dal calore. Inoltre, è importante ricordare alcune limitazioni chiave della tecnica quando si esegue il protocollo descritto. Carichi elevati di proteine in grado di ridurre la risoluzione CN-GELFrEE. Il sovraccarico, soprattutto di campioni in cui alcune specie sono più abbondanti, causerà tali specie proteiche da eluita attraverso un certo numero di frazioni consecutive. Per topo campioni macinati criogenicamente, i migliori risultati sono stati osservati con quantità comprese tra 200 e 400 mg, ma questo comportamento è dipende dal campione. Inoltre, hlivelli IGH di sale nel campione alterare le proprietà elettroforetiche delle proteine, alterando il modello di banda e riducendo la risoluzione di frazionamento. Questi passaggi critici e limitazioni devono essere contabilizzati durante l'esecuzione di questo protocollo per ottenere risultati migliori.
Inoltre, CN-GELFrEE ha dimostrato di avere più caratteristiche altamente richiesti in cromatografia nativa. Questo metodo di separazione semplice raggiunge alta risoluzione frazionamento di complessi proteici, accettando elevate quantità di carico proteine e frazionamento attraverso un'ampia gamma di pesi molecolari. CN-GELFrEE è stato anche dimostrato di essere molto versatile, essendo in grado di frazionamento campioni biologici da una grande varietà di organismi e diverse preparazioni 9.
Inoltre, l'eluizione frazione liquida in questa tecnica permette elevato recupero di proteine non osservata in altre separazioni native a base di gel. Inoltre, a differenza di altri metodi che eassemblee liuto in fase liquida, CN-GELFrEE non riduce la concentrazione del campione. Infatti, il protocollo qui descritto aumenta la concentrazione di ciascun complesso proteico ~ 2 volte da campione a frazioni. Infine, i campioni di liquido Questo metodo genera sono facilmente compatibili con vari biochimici e biofisici a valle nativo-proteina analisi, tra cui la spettrometria di massa. Dopo un solo passo ripulire siamo stati in grado di identificare e caratterizzare, tramite spettrometria di massa nativo, complessi proteici sconosciuti in frazioni CN-GELFrEE, dimostrando ulteriormente la moda nativo e la compatibilità tra queste tecniche.
Analogamente a denaturazione GELFrEE, questa nuova tecnica di frazionamento nativo è anche altamente adattabile. Le concentrazioni di colata soluzioni possono essere regolati per creare diversi gel gradiente, per variare l'intervallo peso molecolare che si risolve durante una corsa. L'aumento del% T delle soluzioni gel di separazione risultati in alta resolutione di specie massa inferiori riducendo migliora la separazione delle specie di peso molecolare. I tempi di raccolta attraverso il quale viene effettuata l'esperimento possono anche essere adattate per ottimizzare larghezze di banda peso molecolare ottenuti in ogni frazione come necessario. tempo esperimento esteso sopra 120 min genererà ancora più elevati intervalli di peso molecolare rispetto raffigurato in questo protocollo. Inoltre, riducendo il tempo tra raccolta di frazioni può ridurre la complessità di ogni frazione. Pertanto, più parametri possono essere facilmente perfezionati, ottimizzando l'utilizzo della tecnica di diversi studi.
In conclusione, CN-GELFrEE vantaggi occupano un vuoto nel campo delle tecniche di separazione nativi presentano separazione ad alta risoluzione in una vasta gamma di pesi molecolari, elevato recupero di proteine, e accettare elevate quantità di carico proteine. Infine, le frazioni risultanti sono compatibili con la maggior parte nativa downstream e denaturanti tecniche di analisi di proteine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Il WM Keck Foundation generosamente fornito finanziamenti per questo lavoro. Questo materiale si basa su lavoro sostenuto da FAPERJ Research Grant 100,039 / 2014 da parte del governo di Rio de Janeiro - Brasile per RDM, Scienza Senza Frontiere borsa 88.888,075,416 mila / 2013-00 dal Coordinamento per il miglioramento delle Higher Education personale, sotto il governo del Brasile, per HSS, la National Science Foundation Graduate Research Fellowship con il numero 2014171659 comunione per OSS, e CNPq Research grant 202011 / 2012-7 da parte del governo del Brasile per LHFDVPCH è un destinatario di chimica della vita di una Università Northwestern Processi Istituto Postdoctoral Premio Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Materials | |||
| 15 ml conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
