Abstract
קומפלקסי חלבונים לבצע המערה של תפקודים תאיים קריטיים. הבהרת הקישור לא קוולנטי שלהם ודינמיקה היא בעל חשיבות עליונה להבנת תפקידו של מתחמים במערכות ביולוגיות. בעוד האפיון הישיר של מכלולים וביומולקולרית הפך חשוב יותר ויותר בשנים האחרונות, טכניקות חלוקת יליד התואמות טכניקות ניתוח במורד זרם, כוללים ספקטרומטריית מסה, נחוצות כדי להרחיב עוד יותר את המחקרים הללו. עם זאת, השדה חסר שיטת הפרדת תפוקה גבוהה, רחבת היקף גבוהה התאוששות עבור מכלולי חלבון ילידים. כאן, אנו מציגים אלקטרופורזה מלכודת חלק נוזלי eluted ג'ל יליד ברורה (CN-GELFrEE), אשר היא שיטת הפרדת רומן אסיפות חלבון שאינו קוולנטיים. CN-GELFrEE ביצועי הפרדה הודגמו על ידי מתחמי פיצוח שחולצו מן לב עכבר. שברים נאספו מעל 2 hr ומוצגים להקות דיסקרטיות החל ~ 30 כדי 500 kDa. קוןדפוס עולה בקנה אחד של הגדלה רוחבי פס משקל מולקולרי נצפה, כל ~ 100 kDa מנעימים. יתר על כן, הניתוח מחדש הבא של שברי ילידים באמצעות SDS-PAGE הראה-משקל מולקולרי משמר בקנה אחד עם denaturation של קומפלקסי חלבונים. לכן, CN-GELFrEE הוכח להציע את היכולת לבצע הפרדות יליד ברזולוציה גבוהה גבוהה התאוששות על קומפלקסים חלבונים ממגוון משקל מולקולרי גדול, מתן שברים התואמות חלבון במורד הזרם מנתח.
Introduction
רוב התהליכים הביולוגיים קורה בתוך תא נחשבים להתבצע על ידי אסיפות חלבון ולא יחיד חלבונים 1. כתוצאה מכך, על מנת להבהיר את התפקיד ביולוגי הספציפי של למקטע חלבון בתא יש צורך להבין את יחסי הגומלין המבניים שלה עם חלבונים אחרים או הליגנדים מתחמים 2. עם זאת, לומדים חלבונים באופן מקורי, שמירת הקישור לא קוולנטי שלהם ופעילות, נותר מאתגר. אחד החסרונות של מחקרי חלבון יליד הוא טכניקת הפרדת יליד מתאימה התואמת טכניקות ניתוח חלבון במורד שונות. לכן, הריבית האחרונה טכניקות הפרדה מסוגלות מאפיינת מכלולים שאינם קוולנטיים של ביומולקולות גדלה 3 בחדות.
טכניקות הפרדת חלבון הם הכרח ביוכימיה, ביופיזיקה ומחקרים אחרים שונים. יש טכניקות הפרדת יליד נוכחיות intrinsiג ליקויים המפחיתים תאימות עם ניתוחים במורד זרם, כגון ברזולוציה נמוכה, תפוקה נמוכה, אובדן משקע, ואת הדרישה של כמויות גדולות של מדגם ראשוני. טיהור זיקת טנדם היא נפוצה ללימודי אינטראקצית חלבון, אבל זה חייבת להתבצע בנפרד לכל יעד חלבון, גורם לו להיות עולה בקנה אחד עם ניתוח תפוקה גבוהה 4. גודל דרה כרומטוגרפיה 5, ממטרים סלקטיבית עם זיקת יון כרומטוגרפיה 5 וצפיפות-שיפוע הפרדה 6 כל ספקו פרדות ילידים, אבל מטבעם טכניקות ברזולוציה נמוכה ודורשות כמויות מדגם ראשוניות גבוהות.
לחלופין, טכניקות מבוססות ג'ל, כגון כחול שפת אם (BN) ונקה שפת אם (CN) עמוד (או 1-D או 2-D), להציג ההפרדה ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, בניגוד טכניקות אחרות כאמור, הן הפרדות עמוד הילידים לשמור מסיסות קונפורמציה הילידים של r רחבange של מינים מקרומולקולה, כולל חלבונים הידרופובי. יכולת זו עוד מרחיב את הכיסוי proteome הגיע בשיטות אלה 7,8 ו מושגת באמצעות כימיה שונה בין CN ו-PAGE BN. CN-העמוד מסתמך בדרך כלל על חומרי ניקוי רך טעונים כמולקולות מובילות, החלפת צבע Coomassie הכחול-עמוד BN. BN-PAGE, למרות הקשורים ברזולוציה גבוהה יותר, יש אזהרות כגון פעילות האנזימטית מופחתת של חלבונים המופרדים 8 והיווצרות adduct Coomassie מולקולה, שהאחרון קדום רב במורד MS מנתח 9. שתי השיטות הללו, עם זאת, קשורות באופן מסורתי עם התאוששות נמוכה וכיסוי proteome צר עקב מכתים ומגבלות מיצוי ג'ל 7.
לצורך המחקר של חלבונים מפוגלים, ישנן טכניקות כמה מקיימות מסיסות מקרומולקולה בעת ביצוע חלוק ברזולוציה גבוהה עם התאוששות חלבון גבוה התואמות דiverse טכניקות ניתוח חלבון שלאחר ההפרדה. ג'ל eluted נוזלי הפרקציה מילכוד אלקטרופורזה (GELFrEE) היא אחת הטכניקות החלוקות שמתאימות לכל המאפיינים הללו. שיטה זו מיושמת בעיקר במחקרים פרוטאומיקה תפוקה גבוהה מלמעלה למטה, המציין שזה מהיר צדדי. בשנת GELFrEE, חלבונים הם מפוגלים והפרידו מבוססים על משקל מולקולרי באמצעות מטריצת ג'ל צינורי, הנקבובי של אשר ניתן לשנות על פי דרישות מדגם והתוצאות החלוקות הרצויות. שברים הם eluted בשלב נוזל, ובכך להקטין את המגבלות לשחזור משויכות SDS-PAGE, תוך שמירה ברזולוציה גבוהה. Aliquots שבר לאחר מכן ניתן לנתח על ידי עמוד 1-D לבחירת רוחב פס בעל משקל מולקולרי 11. קיים ביקוש גבוה עבור היתרונות הקשורים GELFrEE בטכניקות הפרדה הילידים. השיטה המתוארת במסמך זה, נקה Native GELFrEE (CN-GELFrEE), הוא עיבוד יליד GELFrEE. כדי להיות תואם עם ים רחבpectrum של מקרומולקולות במצב הטבעי שלהם, שיטה זו נשענת לא רק על כימית CN-העמוד הרך, אלא גם על פרדת שיפוע נקבובי, אשר מפחיתה משקעי חלבון על ידי ביטול המעבר הקשה בין porosities הנוכחי במערכות ג'ל רציפות 9. כאשר מוחלים fractionate קומפלקסי חלבונים המופקים לב עכבר, שברי eluted מוצגים התאוששות גבוהה הפרדה גבוהה ברזולוציה של מגוון רחב של משקלות מולקולריים הושגה. יתר על כן, שברים הנובעים תואמים ביותר חלבון ביוכימיות biophysical במורד הזרם מנתח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול וידאו זה מבוסס על פרסום הקשורים 9. ריאגנטים ספציפיים, חומרים וציוד דרוש כדי לבצע את כל השלבים המתוארים בפרוטוקול זה מפורטים בסעיף החומרים. המתכונים ומידע להכנת כל הפתרונות הנדרשים מפורטים בטבלה 1.
1. מילוי מוצרי ג'לי Tube Gradient
- הרכבת מערכת היציקה
- באמצעות סכין או אזמל גילוח להבה מחומם, לחתוך טפטפת סרולוגיות 20 מ"ל יחד קטע מאונך 10 ס"מ מהחלק העליון של קצה מחלק. ודא שמשטח החתך חלק. שמור את החתיכה התחתונה (עם הקצה) וזורק את הפיסה העליונה. הצמד את פיסת פיפטה התחתונה אנכי (טיפ חרוטים פונה כלפי מטה) לעבר חורשת תמיכה.
זהירות: אל תיגע מתכת הלהב המחוממת, השתמש ידיות נכונות או plier כדי למנוע כוויות. - חותכים 3 ס"מ של צינורות גמישים ולחבר אותו אל pipet לחתוך ידי מותח אותו עלהקצה מהחלק. חבר את שסתום בקרת זרימה בקצה השני של הצינור.
- קישור בתחתית השסתום אל הקצה מהחלק של מערבל השיפוע באמצעות פיסת צינורות. שמור את השסתום פתוח.
- הגדר את מערבל צבע על גבי בוחש מגנטי. מניח ברים מגנטיים בתוך חדרי הערבוב.
- מקם את קצה מחלק של מערבל שיפוע 5-10 ס"מ בגובהה מחלקו העליון של היצירה פיפטה כדי לאפשר את הג'ל יימזג על ידי כוח הכבידה.
- בדוק את המערכת לאיתור דליפות מים ללא יונים. אם אין דליפות נמצאים, לייבש את המערכת על ידי נושבת באוויר בתוך אותו לפני שתמשיך.
- תכסה את חלקו העליון של יצירה פיפטה עם שתיים או יותר שכבות של סרט. לנקב חור דרך שכבות קלטת במרכז הפתח העגול. ודא כי לנקב גדול מספיק עבור שפופרת זכוכית לעבור בחוזקה.
- חלק את שפופרת הזכוכית, שם ג'ל יושלך, דרך החור המנוקב, מתיחת הקלטת כך הזכוכית מתאימה בחוזקה. אניnsert שפופרת זכוכית כך התחתון של הצינור הוא 2 מ"מ מעל תחתית פיפטה.
- בדקו אם צינור זכוכית מתקיים ריכוזי אינו נוגע בקיר פיפטה ברגע שהמערכת מוכנה. המערכת מוכנה כעת ליציקה.
- באמצעות סכין או אזמל גילוח להבה מחומם, לחתוך טפטפת סרולוגיות 20 מ"ל יחד קטע מאונך 10 ס"מ מהחלק העליון של קצה מחלק. ודא שמשטח החתך חלק. שמור את החתיכה התחתונה (עם הקצה) וזורק את הפיסה העליונה. הצמד את פיסת פיפטה התחתונה אנכי (טיפ חרוטים פונה כלפי מטה) לעבר חורשת תמיכה.
- ג'ל יציקה
- הכן ג'ל חיץ, APS ופתרונות Coomassie (פתרונות 1-3, טבלה 1).
- הכן 12% T (פתרון 4, טבלה 1) ו -1% T (פתרון 5, טבלה 1) הפרדת פתרונות ג'ל. הוסף 10 μl של פתרון Coomassie בתמיסה ג'ל הפרדה T 12%. להוסיף APS ו TEMED בתחום הפתרונות מיד לפני שפיכה מערבל שיפוע.
זהירות: polyacrylamide מאוד הנוירו וכפפות חייבות להיות משוחקת. - ודא שסתום מהחלק של מערבל השיפוע סגור. מוסיף את 12% T הפרדת פתרון ג'ל אל הרחוק קאמרי ערבוב מהקצה מהחלק. פתח את השסתום בין שני התאים ולתת אני זורם פתרוןn כדי החדר הסמוך.
- סגור את שסתום פיפטה הפתרון ג'ל מפריד 12% T נקע בחזרה לתא הקודם. הדבר נעשה על מנת למנוע בועות אוויר בין תאים.
- מוסיף את T 1% מפריד פתרון ג'ל לתא הערבוב הקרוב הקצה מהחלק. הפעל את הבוחש המגנטי.
- שסתומים מיקסר להרחיב הן שיפוע בעת ובעונה אחת כדי לאפשר פתרונות ג'ל המפריד כדי להיות מעורב וכן לזרום לתוך הצינור פיפטה וזכוכית.
- לאחר הפתרונות ג'ל המפריד במיקסר שיפוע מתרוקנים, לנתק את צינורות מהמיקסר ובני הזוג אותו מזרק 10 מ"ל. ודא שהקצה של הצינור נותר מעל רמת הנוזל ב פיפטה עד המזרק מחובר היטב.
- השתמש מזרק כדי לדחוף את הפתרון ג'ל המפריד הנותרים בעדינות מן הצינור לתוך צינור טפטפת זכוכית. סגור את שסתום פיפטה לפני המאפשר בועות אוויר לתוכו.
- בעדינות להוסיף שכבה של כ 0.25 מ"ל של butano רוויה במיםl (פתרון 6, טבלה 1) על גבי הפתרון ג'ל בתוך שפופרת זכוכית לאטום את התגובה פילמור מן החמצן באוויר כדי לשטח את המניסקוס העליון.
- נקו את המנגנון לשפוך מיד עם מים ללא יונים (לא להשתמש בחומרי ניקוי).
- חכה לילה פילמור ג'ל מלא בטמפרטורת החדר.
- ניתוק Tube ג'ל מהתקן ושמירה
- ביום למחרת, בזהירות לקלף את הקלטת את החלק העליון של המכשיר.
- ניתק את השסתום מן הצינורות מתחת פיפטה. שחרר את פיפטה מן המהדק ולבצע צעדים 1.3.3. ו 1.3.4. מעל כיור.
- זוג מזרק 10 מ"ל מלא מים ללא יונים אל צינורות גמישים. לדחוף מים דרך צינורות לתוך פיפטה, הזזה ג'ל polymerized לאט מתוך פיפטה.
- החזק את פיפטה אופקית ובזהירות לאבטח את הג'ל הזזה מהמבוי הפתוח.
- חותכים polyacrylamide עודף שתחתיהם Around שפופרת זכוכית באמצעות סכין גילוח. הקפד ליצור סוף חלקה על הג'ל בתוך הצינור, בכך שהוא מיושר עם קצה שפופרת זכוכית.
- לוותר כל butanol שנותר מן הצד העליון של ג'ל ולהגדיר את הצינור ג'ל בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר סגור ופתוח. מערבבים 0.5 מ"ל חיץ ג'ל (פתרון 1, טבלה 1) עם 4.5 מ"ל מים טהורים ולהוסיף כ -2 מ"ל של הפתרון הן בצד העליון (בתוך שפופרת זכוכית) ואת הצד התחתון (צינור צנטריפוגות) של צינור ג'ל.
- מכסה את הצד העליון המלא של הצינור צנטריפוגות, לרבות פתיחת שפופרת הזכוכית, עם parafilm על מנת למנוע אידוי חיץ. ג'לים יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שבועות.
לדוגמא כנה 2.
- לשקול שני לבבות עכבר לרכך אותם בצלחת פטרי באמצעות סכין גילוח.
- מוסיפים את רקמות מעובד כדי במכתש ולהוסיף חנקן נוזלי מספיק כדי לכסות את המדגם. לכתוש את הרקמה עם עלי, הוספה עודחנקן נוזלי כשזה מתאדה.
- לאחר הרקמה טחון היטב, ולתת להתאדות חנקן ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ תמוגה (פתרון 7, טבלה 1) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך כל 100 מ"ג של רקמת גוף. זז פתרון לתוך צינור צנטריפוגות.
- צנטריפוגה XG ב 2000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. בזהירות לאסוף את supernatant בצינור חדש וזורקים את הכדור. לכמת את ריכוז החלבון ב supernatant בשיטת חומצת bicinchoninic 12, או כפי מועדף. הערה: lysates תא Native או שברי subcellular עשוי להיות מוכנים כמועדף. CN-GELFrEE תואם הכנות מדגם ילידים שונות.
- הכן את הפתרון חיץ solubilization פתרון הטעינה (פתרונות 8 ו -9, טבלה 1).
- אם המדגם הוא גלולה, resuspend אותו 50-150 μl של חיץ solubilization. שמור את המדגם על קרח במשך 15 דקות.
- מאגר להחליף המדגם resuspended או lysate התא עם solubilizatחיץ יון באמצעות מסנן צנטריפוגלי אולטרה 30 kDa-MWCO.
- צנטריפוגה מדגם חלבון ב 4 ° C ו- XG 10,000 למשך 5-10 דקות או עד נפח שבריר שמר הוא עד כ 20 μl. מחק את הזרימה דרך.
- להוסיף 400 μl של חיץ solubilization לשבר שמר ומערבבים ידי pipetting. צנטריפוגה ב 4 ° C ו- XG 10,000 למשך 5-10 דקות או עד שבריר שמר הוא עד כ 20 μl. מחק את הזרימה דרך.
- חזור על שלב 2.9 פעמים נוספות.
- לדלל את המדגם המסונן (כ 20 μl) ב 100 μl של חיץ solubilization.
- הוסף 20 μl של פתרון הטעינה לדגום.
3. התקן CN-GELFrEE
- כדי לבצע חלוקה CN-GELFrEE, לייצר את חלקי המכשיר על ידי פנייה במסגריה. ייצור חלקי מכשיר הטפלון. עיין איור 1 עבור כל המידע הדרוש כדי לייצר את החלקים tלוח o 2 עבור מספר החלקים הדרושים עבור התקן אחד.
שיקולי בטיחות: ללבוש ציוד מגן אישי מתאים. יש להקפיד ברחבי ספקי כוח במתח גבוה, וכל צומת צריכים להיות מותקן כראוי. אין לגעת במכשיר או כל אזור רטוב הסמוך בעוד המתח על ולשמור על יבש באזור הספסל שמסביב במהלך אלקטרופורזה. יתר על כן, את אספקת החשמל צריכה להיות כבויה לחלוטין במהלך טיפול בו המכשיר ו / או איסוף שברים. - הכן את החיץ האנודה חיץ הקתודה (פתרונות 10-11, טבלה 1) ולשמור אותם על 4 מעלות צלזיוס או בקרח.
- התאם את הקצה העליון של צינור ג'ל (סוף בלי ג'ל) דרך spacer, O-טבעת וכן spacer שני, בצורה "כריך".
- מוסיפים את תא חיץ (קטודה) לאחר spacer השני, לעבור את הברגים באופן מלא דרך החורים בצד, להוסיף ולהדק אגוזים לשני הצדדים. ודא כי הקצה העליון של גלאסצינור s הוא קבוע לפני הצמצם גבי תא החיץ, לא ישירות מתחתיה או שעברו אותו.
- התאם את הקצה התחתון של צינור ג'ל דרך spacer, א-טבעת O, התא המורכב, וכן spacer שני.
- מוסיפים את תא חיץ (האנודה) לאחר spacer השני, לעבור את הברגים באופן מלא דרך החורים בצד, להוסיף ולהדק אגוזים לשני הצדדים. ודא את הקצה התחתון של צינור ג'ל קבוע בעבר הצמצם גבי תא החיץ, קרוב, אבל לא נוגע בקיר האחורי.
- הגדר את התקן CN-GELFrEE אנכית עם תא חיץ קטודה כלפי מעלה שימוש במעמד תמיכה עם מהדק.
- הוסף חוצץ האנודה לתא חיץ האנודה (למטה) ו חיץ קטודה לתא חיץ הקתודה (למעלה). שמור את כל המאגרים ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר בועות אוויר בתוך שפופרת זכוכית על ידי הקשה על שפופרת זכוכית בעדינות לבדוק את המערכת עבור נזילה.
- ודא אלקטרודות הפלטינה נמצאות בקשר עם המאגרים בתאי וששניקצות צינור ג'ל שקועים למאגר בתוך כל תא.
- חבר כבלי חשמל מאספקת החשמל את מצתי בננת בהתאמה: שלילית על חדר חיץ קתודה (למעלה) וחיובית על חדר חיץ האנודה (למטה).
- טען המדגם באמצעות קצה עומס ג'ל לראש השטח של ג'ל, בתוך הצינור ג'ל.
- הפעל את הג'ל על קבוע 1 W, כדי למנוע התחממות יתר, עד לחזית צבע אדום היא בתחתית צינור ג'ל.
זהירות: כבו אספקת החשמל לפני שתמשיך. - בטל מאגרים האנודה ואת הקתודה.
- Untighten האגוזים על ידי לשכת חיץ האנודה ואת לפרק את spacer התחתון ובית הנבחרים, שמירה על spacer ואת טבעת O. מניח את הקצה התחתון של הצינור ג'ל בתוך התא המורכב, לפני הצמצם העליון, לא בעבר או ישירות מתחתיה. דחוף את spacer ו- O-Ring הקרוב התא המורכב.
- חותכים חתיכה של קרום תאית דיאליזה רעננותם זה על ידי immerging במאגר האנודה. מכסים את aperture בין התא המורכב ואת spacer התחתונה באמצעות קרום הדיאליזה.
- להרכיב את תא חיץ האנודה לאחר spacer השני, להוסיף ולהדק את הברגים וברגים.
- הנח את המכשיר בצורה אופקית מעל דלי קרח. הוספת מאגרים האנודה ואת הקתודה טריות לתאי החיץ ולבדוק את המערכת עבור נזילה.
- להוסיף 150 μl של חיץ האנודה לתוך התא המורכב. חבר מחדש את כבלי חשמל את מצתי בננת בהתאמה.
- הפעל את אספקת החשמל זרם קבוע 3 מילי-אמפר. החזית לצבוע אז צריכה להתחיל elute למאגר בתא האוסף.
- כאשר החזית לצבוע כולו eluted, לכבות את אספקת החשמל ולאסוף את החלק הראשון (0 דקות), והעברתו לתוך צינור נמוך חלבון מחייב microcentrifuge.
- למלא את התא המורכב עם 150 μl של חיץ האנודה. שמור את כל השברים שנאספו על הקרח.
- אסוף שברים לאחר מרווחי הזמן הבאים מאוסף שלחלק ראשון: 2 דקות, 4 דקות, 6 דקות, 8 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות, 25 דקות, 30 דקות, 45 דקות ו 60 דקות. לא מדבר על זמן ואילו אספקת החשמל כבויה. אל תשכחו לכבות את אספקת החשמל לפני איסוף השברים וכדי למלא את התא המורכב עם 150 μl של חיץ האנודה בין דגימות. הפעל אספקת החשמל שוב לאחר איסוף להתחיל משחררי השבר הבא.
- מחלק את המאגרים האנודה ואת הקתודה ולהוסיף פתרונות מפתיעים לתאי החיץ לאחר 60 דקות. אסוף שברים ב 90 דק 'ו 120 דק'.
- שנת מאגרים האנודה ואת קתודה בכל שעה.
- הפעל יליד ברור או עמוד כחול עם ילידי שברים ללכלך אותם כמועדפת. בצע את ההוראות או הפרוטוקול עדיף של היצרן.
- הפעל SDS-PAGE צמצום ללכלך אותם כמועדפת. בצע את ההוראות או הפרוטוקול עדיף של היצרן.
- לנקות את השברים GELFrEE ולהגיש ספקטרומטריית מסה יליד מנתח כמו יחסי ציבור תיארeviously 9.
איור 1:. CN-GELFrEE מכשיר (א) GELFrEE חלקים מכשיר רישומים (ב) תצלום של חלקים המיוצרים; (C) CN-GELFrEE הרכבת מכשיר ערכה: (1) תא חיץ, (2) spacer, (3) O-Ring, (4) ג'ל צינור, (5) תא מורכב, ו (6) קרום דיאליזה.
טבלה 1: טבלת פתרונות.
טבלה 2: טבלה של חלקי המכשיר GELFrEE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
200 מיקרוגרם של חלבונים המופקים לבבות עכבר קרקע בהקפאה היו מופרדים באופן מקורי ל -14 שברים של 150 μl כל, בשיטת CN-GELFrEE בתוך שפופרת ג'ל 1-12% T. Aliquot של 10 μl של כל חלק היה לרוץ על ג'ל לוח CN-עמוד וכסף מוכתם. תיאור ברור של החלוקה והרזולוציה שהושגה עם חלוקת CN-GELFrEE מוצג איור 2 א. שברים נאספו למעלה משעתיים ואת assay ג'ל מציג דפוס עקבי של הגדלת משקל מולקולרי החל ~ 30 כדי 500 kDa. חלק מכיל מינים הנעים במסה מעל ~ 100 kDa. שברים להציג חפיפה נמוכה של משקל מולקולרי-טווחים מצטמצמים יותר ויותר ככל אוסף יותר יקר בין שברים. הג'ל לוח CN-עמוד המוצג כאן מייצג רק 6% של חלבון התאושש 150 כל שבריר μl.
כל אחד Fractיוני eluted מקוריים מן CN-GELFrEE הופחת לאחר מכן ו מפוגל לפני הפעלת אותם על ג'ל לוח SDS-PAGE. בתוך הג'ל לוח SDS-PAGE צמצום (איור 2 ב), ניתן לראות משמרות המוניות בכל השברים בהשוואת שברי יליד בהתאמה (איור 2 א), המציין כי קומפלקסי חלבונים שלמים פורקו וגשרי דיסולפיד הופחתו.
איור 2:. הפרדת CN-GELFrEE של תמצית שחיקה קריוגני לב עכבר (א) למחוק Native עמוד של שברי CN-GELFrEE שנאספו במרווחי זמן 0 כדי 120 דק '. משמאל: סולם בעל משקל מולקולרי ילידים. (ב) צמצום SDS-PAGE מאותו שברים כמו א השמאל: מופחת סולם בעל משקל מולקולרי מפוגל.
שברים לאחר מכן ניתן לנקות submittאד ספקטרומטריית מסה יליד מנתח 9. ספקטרום MS יליד dehydrogenase malate homodimeric, מזוהה בחלק שברי GELFrEE, מראה מטענים בין 16+ ו 20+ ו מסה מולקולרית של 72,843 Da (איור 3 א). מדינת 18+ התשלום הייתה מבודדת ולא collisionally מופעל, וכתוצאה מכך הוא הוצאתן של דהידרוגנז malate monomeric עם מסה מולקולרית של 36,421.7 (איור 3B). הפעיל מקור יושם למתחם השלם על מנת לגרום פליטת מונומר, בידוד המאפשר ופיצול נוסף של מונומרים. מפת הפיצול של מונומר 11 + ניתן לראות באיור 3C. CN-GELFrEE הוכח להיות תואם עם ספקטרומטריית מסה מנתח, מראה שום הפרעה של אינטראקציות בין חלבונים noncovalent מכלולים macromolecular.
איור 3: ספקטרה ופיצול Mass מפת dehydrogenase malate homodimer (א) ספקטרום MS1 של המתחם שלם, (B) מונומר מפגין קשת MS2 נפלט מן המתחם, ו (ג) מפה הפיצול המתקבל הפיצול של מונומר. . החנקן האדום מציין כי N-המסוף acetylated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CN-GELFrEE נגזר יליד ברור (CN) מערכת חיץ עמוד המשתמשת תערובת של anionic ודטרגנטים ניטראלי כמולקולות מובילות 9 עבור חלוקת חלבון בעל משקל מולקולרי מבוססת באמצעות מטריקס ג'ל. היישום של CN-GELFrEE כדי לחלץ חלבון לב עכבר יליד שנוצר שברים מורכבים נמוכים עם רוחבי פס דיסקרטי תוך שמירת קישור לא קוולנטי של מכלולי biomolecular. השוואת שברים בין CN-PAGE ג'לים לוח SDS-PAGE צמצום הראתה משמרות מונית הממחישים אובדן הקישור לא קוולנטי בין מקרומולקולות את השברים ושבירים של אג"ח דיסולפיד בין שרשרות חלבון. התוצאות לאשר את אופי יליד ההפרדה CN-GELFrEE.
כמה צעדים בפרוטוקול זה קריטי ובכך להצדיק תשומת לב רבה יותר. ראשית, אחרי הליהוק, צינור הג'ל צריך להיות מנותק מהמכשיר לאט ואת polyacrylamide החיצוני לחתוך בזהירות. אי ביצוע הוראה זועלול לגרום ניזק ג'ל, גרימת בועות אוויר בתוך הרשת או ניתוק ג'ל מצינור הזכוכית. נזקים אלה לפגוע ברזולוציה ההפרדה יש להימנע ביסודיות. שנית, במהלך אלקטרופורזה, ההתנגדות החשמלית של המערכת תגדל שעות נוספות, יצירת חום, ולכן הוא מאוד חשוב גם לבצע את ההליך בתא קר או להזיז את מכשיר דלי קרח לאחר המדגם כבר העמיס ג'ל, כדי שלא לפגל את החלבונים נטען על ידי חום. יתר על כן, חשוב אכפת כמה מגבלות עיקריות של הטכניקה בעת ביצוע הפרוטוקול המתואר. המון חלבון גבוה עלולים להפחית ברזולוצית CN-GELFrEE. צריך מוגזם, במיוחד של דגימות שם כמה מינים נפוצים יותר, יגרום מיני חלבון אלה להיות eluted באמצעות מספר שברים רצופים. לקבלת דוגמיות קרקע בהקפאת עכבר, את התוצאות הטובות ביותר נראו עם כמויות בין 200 ל -400 מיקרוגרם, אבל ההתנהגות הזאת היא מדגם תלוי. כמו כן, hרמות igh מלח במדגם תהיינה לשנות את מאפייני electrophoretic של חלבונים, לשנות את דפוס הלהקה וההפחתה ברזולוציה החלוקה. שלבים ומגבלות חיוניים אלו יטופלו בזמן ההופעה של פרוטוקול זה כדי להשיג תוצאות טובות יותר.
יתר על כן, CN-GELFrEE הוצגה יש מאפיינים מרובים דרש מאוד כרומטוגרפיה הילידים. שיטת ההפרדה הפשוטה הזאת משיגה חלוקה ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים חלבונים, לקבל כמויות גבוהות של עומס חלבון פיצוח באמצעות מגוון רחב של משקלים מולקולריים. CN-GELFrEE הוכח גם להיות מאוד תכליתי, להיות מסוגל פיצוח דגימות ביולוגיות ממגוון גדול של אורגניזמים תכשירים שונים 9.
יתר על כן, elution החלק הנוזלי בטכניקה זו מאפשר שחזור חלבון גבוה כי לא הוא ציין הפרדות יליד ג'ל מבוססת אחרים. בנוסף, שלא כמו שיטות אחרות eאסיפות לאוטה בשלב נוזלי, CN-GELFrEE אינו מפחית ריכוז מדגם. למעשה, הפרוטוקול המתואר במסמך זה מגביר את הריכוז של כל רכבת חלבון על ידי ~ פי 2 ממדגם שברים. לבסוף, דגימות נוזל שיטה זו יוצרת תואמים בקלות עם ביוכימיים במורד שונים חלבון יליד biophysical מנתח, כולל ספקטרומטריית מסה. אחרי צעד אחד לנקות הצלחנו לזהות ולאפיין, באמצעות ספקטרומטריית מסת ילידים, קומפלקסי חלבונים ידועים שברי CN-GELFrEE, נוסף הממחיש את האופנה ותאימות יליד בין הטכניקות הללו.
בדומה denaturing GELFrEE, טכניקת חלוקת יליד הרומן הזה היא גם וישימה מאוד. ריכוזי ליהוק פתרונות עשויים להיות מותאמים כדי ליצור ג'ל שיפוע שונה, על מנת לגוון את מגוון המשקל המולקולרי כי נפתר במהלך ריצה. הגדלת% T של תוצאות פתרונות ג'ל ההפרדה resolut גבוההיון של מינים המוניים נמוכים תוך הפחתה זה משפר הפרדת מיני משקל מולקולריים גבוהים. הזמנים האוספים שדרכו הניסוי מתבצע יכולים גם להיות מותאמים כדי לייעל את רוחבי פס בעל המשקל המולקולרי מושג בכל שבריר לפי צורך. זמן ניסוי מורחב מעל 120 דק 'יפיק אפילו גבוה טווח משקל מולקולרי מ מתואר בפרוטוקול זה. בנוסף, צמצום זמן בין איסוף שבריר יכול להפחית את המורכבות בכל חלק. לכן, מספר רב של פרמטרים ניתן בקלות מכויל, ייעול השימוש בטכניקה זו כדי מחקרים שונים.
לסיכום, היתרונות CN-GELFrEE לכבוש פער בתחום טכניקות הפרדה יליד הצגת ההפרדה ברזולוציה גבוהה בתוך טווח רחב של משקלים מולקולריים, התאוששות חלבון גבוהה, וקבלת כמויות גבוהות של עומס חלבון. לבסוף, שברי הנובעים תואמים ביותר ילידים במורד וטכניקות ניתוח חלבון denaturing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
קק קרן סיפקה מימון בנדיבות עבור עבודה זו. חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי מענק מחקר FAPERJ 100.039 / 2014 מהממשלה של ריו דה ז'נרו מדינה - ברזיל עבור RDM, מדע בלי מלגת גבולות 88888.075416 / 2013-00 מן לתיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה, תחת הממשלה של ברזיל, עבור HSS, את מלגת מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע תחת מספר המילגה 2014171659 עבור OSS, ועל ידי מענק מחקר CNPq 202,011 / 2012-7 מממשלת ברזיל עבור LHFDVPCH הוא הנמען של כימיה של החיים של אוניברסיטת Northwestern תהליכים מכון דוקטורים אחוות פרס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Materials | |||
| 15 ml conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
