Abstract
蛋白质复合物进行的关键细胞功能的阵列。阐明它们的非共价相互作用和动力学是非常重要的用于理解在生物系统中复合物的作用。而生物分子组件的直接表征近年来已变得日益重要，天然分级分离技术能与下游分析技术，包括质谱兼容，是必要的，以进一步扩展这些研究。然而，该领域缺乏高通量，宽范围，高回收率分离为天然蛋白质装配方法。这里，我们提出明确天然凝胶洗脱液体馏分包封电泳（CN-GELFrEE），这对于非共价蛋白组件的新颖的分离方式。 CN-GELFrEE分离性能是由来自小鼠心脏提取物分馏证明。级分收集在2小时和显示离散频带范围从〜30到500 kDa的。一个反面观察到提高分子量带宽sistent图案，各测距〜100 kDa的。此外，通过SDS-PAGE天然组分的随后再分析表明分子量转移与蛋白质复合物的变性一致。因此，CN-GELFrEE被证明提供从一个大分子量范围上的蛋白质复合物执行高分辨率和高恢复天然分离的能力，从而提供了与下游蛋白质分析兼容的级分。
Introduction
大多数生物过程的细胞内发生的被认为是由蛋白质组件而不是单一的蛋白质1进行。因此，为了阐明在细胞中的蛋白质亚基的特定的生物作用，有必要了解在配合物2其与其他蛋白或配体的结构的相互作用。然而，研究蛋白质本身，保持它们的非共价相互作用和活性，仍然具有挑战性。一种天然蛋白质研究的缺点是一个合适的原生的分离技术，可与各种下游蛋白质分析技术兼容。因此，最近在分离技术能够表征生物分子的非共价组件兴趣急剧3上升。
蛋白质分离技术是势在必行生物化学，生物物理学以及其他各种研究。目前本地分离技术具有intrinsiÇ缺陷减少下游分析，例如低分辨率，低吞吐量，损耗沉淀，和大量初始样品的要求兼容。串联亲和纯化通常用于蛋白质相互作用研究，但它必须为每个蛋白靶单独进行，导致它与高通量分析4不相容。尺寸排阻色谱法5，与所有已提供天然分离的，但本质上是低的分辨率的技术，并且需要高的初始样品量离子亲和层析5和密度梯度分离6选择性沉淀。
可替代地，基于凝胶的技术，如蓝母语（BN）和清除母语（CN）页（或1-D或2-D）显示的高分辨率分离。此外，与其他技术中提到的对比，这两种天然PAGE分离维持宽广的r溶解性和天然构象大分子物种，包括疏水性蛋白质的法兰。这种能力进一步扩大这些方法7,8达到了蛋白质组覆盖率，并通过CN和BN-PAGE之间不同的化学反应来实现的。 CN-PAGE通常依赖于软收取清洁剂为载体分子，取代了考马斯亮蓝染料BN-PAGE。 BN-PAGE，尽管具有较高的分辨率相关联，具有警告诸如在分离的蛋白8和考马斯分子加合物的形成降低的酶活性，后者大大有损于下游MS分析9。这两种方法，但是，在传统的低回收和窄蛋白质组覆盖率由于染色和凝胶提取局限性7相关联。
对于变性蛋白的研究，也有保持高分子的溶解度，同时执行具有高蛋白质回收率高分辨率分馏几种技术并且是与D兼容iverse分离后的蛋白质的分析技术。凝胶洗脱的液体馏分包封电泳（GELFrEE）是适合所有这些特征的分级分离技术之一。此方法是在高通量自上而下蛋白质组学研究大量应用，这表明它是快速和通用性。在GELFrEE，蛋白质变性并通过管状凝胶基质分隔基于分子量，它的孔隙率可以根据样品的要求和所需的分馏结果而变化。级分洗脱在液相，因而减少，同时保持高分辨率用SDS-PAGE相关联的恢复限制。分数等分试样然后可以通过1-D PAGE对于分子量带宽选择11进行分析。有用于与天然分离技术GELFrEE相关的优点的高需求。本文中所描述的方法中，清除本地GELFrEE（CN-GELFrEE），是GELFrEE土生土长适应。为了与一个宽s兼容在其天然状态大分子pectrum，这种方法不仅依赖于软CN-PAGE化学，而且还取决于孔隙率梯度分离，这通过消除存在于不连续的凝胶系统9孔隙率之间的苛刻过渡减少蛋白质沉淀。当施加到分馏从小鼠心脏提取的蛋白质复合物，洗脱的级分显示高回收率，得到一个宽范围的分子量的高分辨率分离。此外，将所得的级分与最下游的生物化学和生物物理蛋白质分析相容。
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Protocol
注意：此视频协议是基于一个相关联的出版物9。特定试剂，物质和必要执行在该协议中描述的所有步骤的设备都列在材料部分。准备所需的所有解决方案的食谱和信息逐项表1。
1.梯度管凝胶的浇注
- 装配铸造系统
- 使用火焰加热刀片或手术刀，剪20ml的血清吸管沿正交部分10厘米处的分配尖端的顶部。确保该切割表面是光滑的。保持底部件（与尖端），丢弃该顶部件。夹住吸管底部垂直件（朝下锥尖），以支持立场。
注意：不要触摸加热的金属刀片，使用正确的手柄或钳子，以免烫伤。 - 切3厘米柔性管并通过拉伸其在它连接到切吸管的分配尖端。流量控制阀连接在该管的另一端。
- 连结在阀的底部，使用一个管件的梯度混合器的分配尖端。保持阀打开。
- 设置在磁力搅拌器上的顶部的梯度混合器。将磁条混合室中。
- 梯度混合器比吸移管件的顶端高5-10厘米，以允许该凝胶通过重力倾倒的分配尖端的位置。
- 测试对于去离子水的泄漏系统。如果没有发现泄漏，通过不断前吹空调里面的干燥系统。
- 覆盖吸管一块用胶带的两层或更多层的顶部。通过在圆形开口的中心的带层刺穿的孔。确保穿刺是足够大的玻璃管，通过紧紧地传递。
- 滑动玻璃管，其中该凝胶将被投射，通过穿刺孔，拉伸带子，以便在玻璃配合紧密。一世nsert玻璃管，以使管的底部为2mm以上的吸管底部。
- 检查，看看是否玻璃管被保持并集中和一旦系统制备未接触移液器壁。该系统现在可以用于铸造。
- 使用火焰加热刀片或手术刀，剪20ml的血清吸管沿正交部分10厘米处的分配尖端的顶部。确保该切割表面是光滑的。保持底部件（与尖端），丢弃该顶部件。夹住吸管底部垂直件（朝下锥尖），以支持立场。
- 铸造凝胶
- 制备凝胶缓冲液，APS和考马斯溶液（溶液1-3， 表1）。
- 制备12％的T（溶液4， 表1）和1％T（溶液5， 表1）分离胶溶液。添加10微升的考马斯溶液在12％T分离凝胶溶液。立即梯度混合器浇注前添加两个解决方案APS和TEMED。
注意：聚丙烯酰胺是高度神经毒性和手套必须佩戴。 - 确保梯度混合器的分配阀关闭。添加12％T分离胶溶液，以从分配尖端混合室最远。打开两个腔室之间的阀门，让溶液流动我n要在下室。
- 关闭阀和吸取的脱臼12％T分离凝胶溶液返回到前室中。这样做是为了避免室之间的空气的气泡。
- 添加1％T分离胶溶液，以最接近于分配尖端混合室。开启磁力搅拌器。
- 同时开放两梯度混合器阀，以允许要混合的分离胶溶液和流入吸管和玻璃管。
- 一旦在梯度混合器分离胶解决方案的日益枯竭，解耦从混频器和耦合它油管10毫升注射器。确保管的端部保持在吸移管中的液面之上，直到注射器连接牢固。
- 使用注射器从管的其余分离胶溶液轻轻推入吸管和玻璃管。让气泡进入前关闭阀门吸管。
- 轻轻加入约0.25毫升的水饱和butano层L（溶液6， 表1）在玻璃管内的凝胶溶液的顶部，以密封由氧气聚合反应中的空气和变平的顶部弯月面。
- 用去离子水（不使用清洁剂）立即清洁浇注设备。
- 恨不得一夜之间在室温下完成凝胶聚合。
- 从设备和存储分离凝胶管
- 在第二天，小心剥离胶带切断装置的顶部。
- 断开吸管下的管道阀门。从松开夹紧吸管并执行步骤1.3.3。 1.3.4和。在水槽上方。
- 夫妇10毫升注射器填充有去离子水的柔性管。通过管道将水推到吸管，慢慢滑动聚合凝胶出来的吸管。
- 水平握住吸管，小心地固定凝胶滑出开口端。
- 下面和ARO切掉多余的聚丙烯酰胺UND使用刀片玻璃管。确保创建管内的凝胶上的平滑端，通过使与玻璃管的末端齐平。
- 分配从凝胶的顶侧上的任何剩余的丁醇和设置凝胶管中的未加帽的15ml离心管中。混合0.5毫升凝胶缓冲液（溶液1， 表1）用4.5ml超纯水，并添加凝胶管的溶液，二者的顶侧（玻璃管内）和底侧（离心管）的约2ml。
- 覆盖离心管的全部顶侧，包括玻璃管开口，用封口膜，以防止缓冲器蒸发。凝胶可以储存在4℃下约2个星期。
2.样品制备
- 权衡两个鼠标心和在用剃刀刀片培养皿剁碎它们。
- 经处理的组织添加到研钵中，并添加足够的液体氮，以覆盖样品。粉碎组织用杵，增加更多的当蒸发液氮中。
- 一旦组织被充分研磨，让氮气蒸发，并于4℃下加入1ml裂解缓冲液（溶液7， 表1）每100毫克组织。移动溶液放入离心管中。
- 离心机在2000×g离心在4℃下5分钟。小心收集在一个新的管中的上清液并弃沉淀。量化使用二辛可宁酸法12在上清液中的蛋白质浓度，或作为优选的。注：为首选本土细胞裂解物或亚细胞组分可制得。 CN-GELFrEE与各种不同的原生样品制备兼容。
- 制备的溶解缓冲液和加载溶液（溶液8和9， 表1）。
- 如果样品是粒料，重悬它在50-150微升溶解缓冲液中。保持在冰上的样品15分钟。
- 缓冲交换再悬浮样本或solubilizat细胞裂解产物使用30kDa的-MWCO超离心过滤器的离子的缓冲区。
- 离心在4℃下将蛋白质样品和10,000 xg离心5-10分钟，或直至保留分数体积下降到约20微升。丢弃的流量通过。
- 加入400微升溶解缓冲的留存率和吹打混合。离心机在4℃和10000×g离心5-10分钟，或直至保留分数下降到约20微升。丢弃的流量通过。
- 重复步骤2.9两次。
- 在100μl溶解缓冲液的稀释过滤的样品（约20微升）。
- 加入20微升装载解决方案样片。
3. CN-GELFrEE设备
- 执行CN-GELFrEE分馏，通过参照一个机械车间制造设备的部件。制造特氟隆的设备部件。请参阅图1为所有必要的信息以制造零件和叔O 表2为必要的部分的一台设备的数目。
安全注意事项：穿戴合适的个人防护装备。应注意周围的高压电源，以及所有路口应正确地安装。不要触摸设备或任何相邻潮湿地区，而电压是和电泳过程中保持周围台区域干燥。此外，电源应该完全处理时，该设备和/或收集的级分关闭。 - 制备阳极缓冲和阴极缓冲液（溶液10-11， 表1）并保持在4℃或在冰上。
- 通过间隔，O形环和第二隔板适合凝胶管（端无凝胶）的顶端，在“三明治”时尚。
- 第二间隔物后添加缓冲室（阴极），通过侧孔完全通过螺钉，添加并拧紧螺母双方。确保GLAS的顶端小号管在缓冲室的顶部开口之前，不根据它直接或过去它固定。
- 通过间隔，O形环，该收集室，和一第二隔板适合凝胶管的底端。
- 第二间隔物后添加缓冲室（阳极），通过侧孔完全通过螺钉，添加并拧紧螺母双方。确保该凝胶管的下端是固定的过去的缓冲室的顶部开口，靠近但不接触的后壁。
- 与阴极缓冲室使用向上支撑支架用夹子固定垂直设置CN-GELFrEE设备。
- 加阳极缓冲到阳极缓冲室（底部）和阴极缓冲到阴极缓冲室（顶部）。保留所有的缓冲区，在4℃。
- 轻轻拍打玻璃管从玻璃管内除去气泡并检查系统的泄漏。
- 确保铂电极与在腔室和两个缓冲器接触凝胶管端部浸渍在各腔室中的缓冲。
- 在阴极缓冲室（顶部）的阴性和阳性对阳极缓冲室（底部）：从电源给各个香蕉插头连接电源线。
- 加载使用凝胶负载尖顶部凝胶的表面，凝胶管内的样品。
- 在1瓦恒定运行凝胶，以避免过热，直到红色染料前处于凝胶管的底部。
注意：在继续之前关闭电源。 - 丢弃阳极和阴极缓冲器。
- Untighten由阳极缓冲室的螺母和拆卸底部垫片和腔室，保持隔离件和O形圈。放置在收集室内部的凝胶管的底端，顶端开口，而不是过去的或直接在它之下之前。推衬垫和O形环接近该收集室。
- 剪下一块纤维素透析膜，并通过在阳极缓冲佛光普照补充水分吧。覆盖AP收集腔室，并使用透析膜的底部隔离件之间erture。
- 组装第二间隔后阳极缓冲室，添加并拧紧螺钉和螺栓。
- 水平放置的设备在一个冰桶。加入新鲜的阳极和阴极缓冲来缓冲室并检查系统是否泄漏。
- 添加150微升阳极缓冲进入收集室。重新连接电源线到相应的香蕉插头。
- 打开以3mA的恒流电源。然后染料前应该开始洗脱成在收集腔室中的缓冲。
- 当整个染料前被洗脱，关闭电源，并收集在第一部分（0分钟），将其传送到一个低蛋白结合的离心管。
- 重新填充用150微升阳极缓冲的收集室。置于冰上所有收集到的分数。
- 收集以下的时间间隔后馏分的收集第一级分：2分钟，4分钟，6分钟，8分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟，30分钟，45分钟和60分钟。不占时间而电源关闭。不要忘记收集的级分之前关闭电源，并用150微升样品之间阳极缓冲液再填充收集室。再次打开电源在收集之后开始洗脱下一小部分。
- 分配所述阳极和阴极缓冲液和60分钟后，以缓冲室补充新鲜的解决方案。在90分钟和120分钟收集的级分。
- 改变每小时的阳极和阴极的缓冲区。
- 运行一个明确的本地或与分数蓝色本地PAGE和染色它作为首选。按照制造商的说明或首选协议。
- 运行还原SDS-PAGE和染色它作为首选。按照制造商的说明或首选协议。
- 清理GELFrEE分数，并提交到本机质谱分析所描述的PReviously 9。
图1：CN-GELFrEE装置 （A）GELFrEE设备零件图纸和制造的部件（B）的照片; （℃）CN-GELFrEE装置组件方案：（1）缓冲室，（2）间隔，（3）O形环，（4）凝胶管，（5）收集室，和（6）渗析膜。
表1：溶液的表。
表2：GELFrEE设备部件表。
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Representative Results
200微克从低温研磨小鼠心脏提取的蛋白质的是在本机分级分离成每150微升14级分，使用在1-12％T凝胶管的CN-GELFrEE方法。的10微升每一组分的等分试样上的CN-PAGE平板凝胶和银染色运行。与CN-GELFrEE分馏得到的分馏和分辨率的清晰描绘示于图2A。级分收集在两个小时，并在凝胶测定显示增加的分子量范围从约30至500 kDa的一致的模式。每个部分包含了种类约100 kDa的不等的肿块。分数显示为多个集合分数之间发生的日益减少分子量范围以较低的重叠。这里示出的CN-PAGE平板凝胶表示只有6％从每个150微升馏分中回收的蛋白质。
每个FRACT的离子本身洗脱从CN-GELFrEE随后降低之前上的SDS-PAGE板凝胶运行它们变性。在还原SDS-PAGE平板凝胶（ 图2B），可以相对于各自天然馏分（ 图2A）时，表示完整的蛋白质复合物分解和二硫键被还原成看到在所有级分的质量变化。
图2：小鼠心脏低温研磨提取物CN-GELFrEE分离 （A）清除本地人在时间间隔0〜120分钟收集CN-GELFrEE部分页面。左：原生分子量阶梯。 （b）减少相同的级分的SDS-PAGE为A左：还原和变性分子量阶梯。
然后馏分可清洗和submitt编辑原生质谱分析9。该同源二聚体苹果酸脱氢酶，在一些GELFrEE馏分鉴定的天然MS谱，示出了16岁以上和20 +和72843达（ 图3A）的分子量之间的电荷分布。在18岁以上的充电状态被分离和过碰撞活化，导致单体苹果酸脱氢酶与36,421.7（ 图3B）的分子质量的喷射。源的激活施加到完整复杂以诱导单体喷射，允许分离和单体的进一步分裂。所述11+单体的碎片地图可在图3C中被观察到。 CN-GELFrEE被证明与质谱分析，显示没有大分子组件的非共价蛋白 - 蛋白相互作用的破坏是兼容。
图3：质谱和破碎的同型二聚体苹果酸脱氢酶的图 （A）中的完整复合物MS1光谱，（B）的MS2谱显示出单体从复合物排出，以及（C）从单体的碎片而获得的碎裂图谱。 。红色N表示N-末端被乙酰化。
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Discussion
CN-GELFrEE是从使用作为基于分子量蛋白质分馏载体分子9阴离子和中性洗涤剂的混合物通过凝胶基质的清晰天然（CN）PAGE缓冲液系统的。 CN-GELFrEE的与天然小鼠心脏蛋白提取物中的应用产生的低复杂性的级分用分立的带宽，同时保持生物分子装配的非共价相互作用。 CN-PAGE和还原SDS-PAGE平板凝胶之间的级分的比较表明，展示在馏分大分子和蛋白链之间的二硫键断裂之间的非共价相互作用的损失质量偏移。该结果证实了CN-GELFrEE分离的本地字符。
在这个协议中的某些步骤是至关重要的，因此值得更多的关注。首先，铸造后，将凝胶管应该从缓慢的设备和小心切开外部聚丙烯酰胺分离。否则，会损坏凝胶，引起网眼内气泡或分离从玻璃管的凝胶。这些损害损害分离分辨率和应彻底避免。其次，电泳期间，该系统的电阻会加班增加，产生热量，因此，它是非常重要的，以无论是在冷室执行的过程或在样品中被加载之后向所述装置移动到冰桶凝胶，为了不因热变性加载蛋白质。此外，在执行所述协议时介意该技术的一些主要限制是重要的。高蛋白负荷可以减少CN-GELFrEE分辨率。超载，特别是其中少数种类较为丰富的样本，将导致这些蛋白质种类，通过多个连续分数洗脱。小鼠低温研磨的样品，最好的结果被认为具有200和400微克之间的量，但这种行为是示例依赖性。此外，H样品中的盐的IgH水平会改变蛋白质的电泳性能，改变带图案并减小分馏分辨率。这些关键步骤和限制应此协议的性能，以达到更好的效果时予以考虑。
此外，CN-GELFrEE显示出具有在天然色谱多个高度要求的特性。这个简单的分离方法实现蛋白质复合物的高分辨率分馏，通过一个宽范围的分子量的接受高含量的蛋白质负荷和分馏的。 CN-GELFrEE也被证明是非常通用的，能够从大量的各种生物和不同制剂9的分馏的生物样品。
此外，在该技术的液体馏分洗脱使未在其他基于凝胶的天然分离观察到高的蛋白质回收率。此外，不同于其他方法，电子琵琶组件在液相，CN-GELFrEE不减少样品浓度。实际上，本文描述的协议增加了由从样本〜2倍至级分的每一个蛋白装配的浓度。最后，液体样品这种方法生成的各种下游的生物化学和生物物理天然蛋白的分析，包括质谱容易兼容。一个单一的清理步骤之后，我们能够识别和特征，通过本机质谱，在CN-GELFrEE分数未知的蛋白质复合物，进一步表明这些技术的本土时尚和兼容性。
同样变性GELFrEE，这种新颖的本地分馏技术也很强的适应性。浇铸溶液的浓度可被调节以创建不同的梯度凝胶，以便改变被运行期间解析的分子量范围。增加分离胶解决方案成果％T高resolut低质量物种的离子，同时降低它提高高分子量物质的分离。通过该实验进行的收集时间也可以适于以优化根据需要在每个级分获得的分子量带宽。扩展实验时间超过120分钟将产生超过本协议描述的更高分子量范围。此外，减少收集馏分之间的时间可减少在每个级分的复杂性。因此，多个参数可以很容易地进行微调，优化使用的技术中，以不同的研究。
总之，CN-GELFrEE优点占据的天然分离技术中的分子量，高蛋白质回收率的宽范围呈递高分辨率分离，并接受高含量的蛋白质负载的字段的间隙。最后，将得到的级分与最下游的天然和变性蛋白质分析技术兼容。
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Acknowledgments
该凯克基金会慷慨地为这项工作提供了资金。这种材料是基于由FAPERJ科研补助金100.039 / 2014里约热内卢州政府支持的工作 - 巴西RDM，从科学的协调高等教育人才的改进无国界奖学金88888.075416 / 2013-00，政府下巴西，高速钢，在团契号2014171659美国国家科学基金会研究生研究奖学金用于OSS，以及研究的CNPq拨款，巴西LHFDVPCH政府202011 / 2012-7是生命的西北大学的化学的接收方处理研究所博士后奖学金二等奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Materials | |||
| 15 ml conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a |
References
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