Abstract
Eiwitcomplexen voeren een reeks belangrijke cellulaire functies. Ophelderen van hun niet-covalente interacties en dynamiek van het grootste belang voor het begrijpen van de rol van de complexen in biologische systemen. Terwijl de directe karakterisering van biomoleculaire assemblees in de afgelopen jaren steeds belangrijker is geworden, inheemse fractionering technieken die compatibel zijn met downstream analysetechnieken, met inbegrip van massaspectrometrie zijn, zijn nodig om deze studies verder uit te breiden. Niettemin, het veld mist een high-throughput, wide-range, high-recovery scheiding methode voor het natieve eiwit assemblages. Hier presenteren we duidelijke natieve geëlueerd vloeibare fractie insluiten elektroforese (CN-GELFrEE), wat een nieuw scheiding modaliteit voor niet-covalente eiwit samenstellen. CN-GELFrEE scheiding prestatie werd aangetoond door fractioneren complexen geëxtraheerd uit muis hart. Fracties werden verzameld gedurende 2 uur en weergegeven discrete banden variërend van ~ 30-500 kDa. Een conconsistente patroon van toenemend molecuulgewicht bandbreedte werd geobserveerd, elke variërend ~ 100 kDa. Verder latere heranalyse van natieve fracties via SDS-PAGE toonde molecuulgewicht verschuift in overeenstemming met de denaturatie van eiwitcomplexen. Daarom CN-GELFrEE werd bleek het vermogen om hoge resolutie en hoge recovery natieve scheidingen op eiwitcomplexen uit een groot molecuulgewichttraject bieden, die fracties die geschikt downstream eiwitanalyses zijn.
Introduction
De meeste biologische processen gebeurt in een cel worden bedacht door verzamelingen van eiwitten in plaats van één eiwit 1 uit te voeren. Bijgevolg, om de specifieke biologische functie van een eiwit subeenheid ontrafelen in een cel is het noodzakelijk om de structurele interacties met andere eiwitten of liganden in complexen 2 begrijpen. Echter, het bestuderen van eiwitten native, met behoud van hun niet-covalente interacties en de activiteit blijft uitdagend. Een tekortkoming van natief eiwit studies is een geschikt natief scheidingstechniek die compatibel is met verschillende stroomafwaartse eiwitanalyse technieken. Daarom heeft de recente interesse in scheidingstechnieken in staat is het karakteriseren van niet-covalente assemblages van biomoleculen fors 3 toegenomen.
Eiwit scheidingstechnieken zijn noodzakelijk om de biochemie, biofysica en diverse andere studies. Huidige inheemse scheidingstechnieken hebben intrinsic tekortkomingen die compatibiliteit te verminderen met downstream-analyses, zoals lage resolutie, lage omzet, verlies voor neerslag, en de eis van grote hoeveelheden van de eerste steekproef. Tandem affiniteitszuivering wordt gebruikt voor eiwit interactie studies, maar het moet afzonderlijk voor elk eiwit doel uitgevoerd, waardoor het onverenigbaar met high-throughput analyse 4 zijn. Gelpermeatiechromatografie 5, selectieve precipitatie met ion affiniteitschromatografie 5 en dichtheid-gradiënt scheiding 6 hebben alle inheemse scheidingen voorzien, maar zijn inherent lage resolutie technieken en vereisen hoge initiële monster bedragen.
Alternatief gel gebaseerde technieken, zoals Blue inheemse (BN) en Clear Eigen (CN) PAGE (ofwel 1-D of 2-D), weergegeven hoge resolutie scheiding. Bovendien, contrasteren met andere technieken genoemd, zowel inheemse PAGE scheidingen behouden oplosbaarheid en inheemse conformatie van een brede range van macromolecuul species, waaronder hydrofobe eiwitten. Deze mogelijkheid verbreedt verder het proteoom dekking te bereiken met deze methoden 7,8 en wordt bereikt door middel van verschillende chemie tussen CN en BN-PAGE. CN-PAGE berust gewoonlijk op zachte gebracht wasmiddelen als dragermoleculen, ter vervanging van de Coomassie Blue kleurstof in BN-PAGE. BN-PAGE, hoewel geassocieerd met een hogere resolutie, heeft kanttekeningen zoals verminderde enzymatische activiteit in de gescheiden eiwitten 8 en Coomassie molecule adduct formatie, waarbij de laatste zeer nadelig is voor downstream MS analyses 9. Beide methoden zijn echter traditioneel geassocieerd met lage terugwinning en smalle proteoom dekking voor verkleuring en gelextractie beperkingen 7.
Voor de studie van gedenatureerde eiwitten, zijn er verschillende technieken die macromolecule oplosbaarheid houden tijdens het uitvoeren van hoge-resolutie fractionering met eiwitrijke terugwinning en die verenigbaar zijn met diVerse nascheiding eiwit analysetechnieken. Gel geëlueerd vloeibare fractie Vangst Elektroforese (GELFrEE) is een van de fractionering technieken die al deze kenmerken passen. Deze methode wordt voornamelijk toegepast in high-throughput top-down proteomics studies, wat aangeeft dat het is snel en veelzijdig. In GELFrEE, eiwitten gedenatureerd en gescheiden op basis van molecuulgewicht door een buisvormige gelmatrix, kan de porositeit daarvan worden gevarieerd gebaseerd op monstervereisten en de gewenste fractionering resultaten. Fracties worden geëlueerd in de vloeistoffase, waardoor de terugwinning beperkingen geassocieerd met SDS-PAGE onder handhaving van hoge resolutie verminderen. Fractie fracties kunnen vervolgens met 1-D PAGE worden geanalyseerd op moleculair gewicht bandbreedte selectie 11. Er is grote vraag naar de voordelen verbonden aan GELFrEE in inheemse scheidingstechnieken. De hierin beschreven werkwijze, Clear Indiaans GELFrEE (CN-GELFrEE), is een inwoner aanpassing van GELFrEE. Om compatibel met een breed s zijnpectrum van macromoleculen in hun natieve toestand, deze werkwijze berust niet alleen op de zachte CN-PAGE chemie, maar ook op een porositeit gradiëntscheiding, welk eiwit precipitatie vermindert door het elimineren van de ruwe overgang tussen poreusheid aanwezig discontinue gelsystemen 9. Toegepast op eiwitcomplexen geëxtraheerd uit muizenhart fractioneren, weergegeven geëlueerde fracties hoge herstel en een hoge-resolutie scheiding van uiteenlopende molecuulgewichten werd verkregen. Verder zijn de verkregen fracties zijn compatibel met de meeste downstream biochemische en biofysische analyses eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Deze video protocol is gebaseerd op een bijbehorende publicatie 9. Specifieke reagentia, materiaal en apparatuur noodzakelijk alle stappen in dit protocol worden beschreven zijn opgesomd in de sectie materialen. De recepten en gegevens bereiding van alle benodigde oplossingen worden gespecificeerd in Tabel 1.
1. Het gieten van Gradient Tube Gels
- Montage van de Casting System
- Met een vlam verwarmd scheermesje of scalpel, snijd een 20 ml serologische pipet langs een orthogonale doorsnede 10 cm van de bovenkant van het afgifte-uiteinde. Zorg ervoor dat het snijvlak glad is. Houd het onderste stuk (met de punt) en gooi het bovenste stuk. Klem de onderste pipet stuk verticaal (kegelvormige punt naar beneden) om een statief.
LET OP: Raak de verwarmde mes metaal, gebruik de juiste handvatten of een tang om brandwonden te voorkomen. - Snij 3 cm van flexibele buizen en sluit deze aan op de snede pipet door strekken het overde afgifte-uiteinde. Sluit de stroomregelklep aan het andere uiteinde van de buis.
- Verbinden de onderkant van de klep naar de afgifte-uiteinde van de gradiënt mixer met een buisstuk. Houd de klep open is.
- Stel de gradiënt mixer op een magnetische roerder. Plaats magnetische bars in de mengkamers.
- Plaats de afgifte-uiteinde van de gradiënt mixer 5-10 cm boven de bovenkant van de pipet stuk, teneinde de gel door zwaartekracht te gieten.
- Test het systeem op lekkage met gedemineraliseerd water. Als er geen lekken worden gevonden, droogt het systeem door te blazen lucht in voordat u verder gaat.
- Bedek de bovenkant van de pipet stuk met twee of meer lagen tape. Doorboren gat door de tape lagen in het midden van de cirkelvormige opening. Zorg ervoor dat de punctie is groot genoeg voor de glazen buis strak passeren.
- Schuif de glazen buis, waar de gel zal worden uitgebracht, via de lekke gat, het uitrekken van de tape, zodat het glas strak past. iknsert de glazen buis zodat de bodem van de buis 2 mm boven de bodem pipet.
- Controleer of de glazen buis wordt vastgehouden en gecentraliseerd en niet aanraken van de pipet muur zodra het systeem wordt voorbereid. Het systeem is nu gereed voor het gieten.
- Met een vlam verwarmd scheermesje of scalpel, snijd een 20 ml serologische pipet langs een orthogonale doorsnede 10 cm van de bovenkant van het afgifte-uiteinde. Zorg ervoor dat het snijvlak glad is. Houd het onderste stuk (met de punt) en gooi het bovenste stuk. Klem de onderste pipet stuk verticaal (kegelvormige punt naar beneden) om een statief.
- casting Gel
- Bereid gel buffer, APS en Coomassie-oplossingen (oplossingen 1-3, tabel 1).
- Bereid 12% T (oplossing 4, Tabel 1) en 1% T (oplossing 5, tabel 1) het scheiden gel oplossingen. Voeg 10 ul van Coomassie-oplossing in 12% T scheidende gel oplossing. APS en TEMED in beide oplossingen Snel voor het gieten in gradiënt mixer.
LET OP: polyacrylamide is zeer neurotoxisch en handschoenen moeten worden gedragen. - Controleer de doseerklep van de gradiënt mixer gesloten. Voeg de 12% T scheiden geloplossing de mengkamer verst van het afgifte-uiteinde. Open de klep tussen beide kamers en laat de oplossing stromen into de volgende kamer.
- Sluit de klep en pipet de ontwrichte 12% T scheidende gel oplossing terug naar de vorige kamer. Dit wordt gedaan om luchtbellen tussen de kamers te vermijden.
- Voeg de 1% T scheiden geloplossing de mengkamer dichtst bij het afgifte-uiteinde. Zet de magneetroerder.
- Open beide gradiënt mengkranen tegelijkertijd zodat de scheidende gel oplossingen te mengen en te stromen in de pipet en glazen buis.
- Zodra de scheidende gel oplossingen in het verloop menger uitgeput, ontkoppelen de slang van de mixer en deszelfs een 10 ml spuit. Zorg dat het uiteinde van de buis steeds boven het vloeistofniveau in de pipet tot de spuit stevig is bevestigd.
- Gebruik de spuit om duw de resterende scheiden gel oplossing uit de slang in de pipet en de glazen buis. Sluit de pipet klep alvorens luchtbellen in.
- Voorzichtig een laagje van ongeveer 0,25 ml water verzadigde butanol (oplossing 6, Tabel 1) bovenop de geloplossing in de glazen buis de polymerisatiereactie uit zuurstof verzegelen lucht boven meniscus plat.
- Reinig de stromende apparaat onmiddellijk met gedemineraliseerd water (gebruik geen wasmiddel).
- Wacht nachts voor volledige gelpolymerisatie bij kamertemperatuur.
- Losmaken Gel Tube uit Apparaatbeheer en opslaan
- De volgende dag, zorgvuldig verwijderen van de tape van de bovenkant van het apparaat.
- Koppel de klep van de buis onder het pipet. Laat de pipet uit de klem en voer de stappen 1.3.3. en 1.3.4. boven de gootsteen.
- Paar een 10 ml injectiespuit gevuld met gedeïoniseerd water om de flexibele buis. Duw water door de slang in de pipet, langzaam glijden de gepolymeriseerde gel uit de pipet.
- Houd de pipet horizontaal en zorgvuldig zet de gel uitschuiven van het open einde.
- Snijd overtollig polyacrylamide onder en around de glasbuis met een scheermesje. Zorg ervoor dat een glad uiteinde aan de gel in de buis te creëren, doordat het gelijk met het uiteinde van de glazen buis.
- Verdeel resterende butanol vanaf de bovenzijde van de gel en zet de gelbuis per afgetopte 15 ml centrifugebuis. Meng 0,5 ml gel buffer (oplossing 1, Tabel 1) met 4,5 ml ultrazuiver water en voeg ongeveer 2 ml van de oplossing voor zowel de bovenzijde (binnen glazen buis) en de onderzijde (in centrifugebuis) van gelbuis.
- Bedek de volledige bovenkant van de centrifugebuis, waaronder de glasbuis opening met parafilm buffer verdamping te voorkomen. Gels gedurende 2 weken bewaard bij 4 ° C.
2. Monstervoorbereiding
- Weeg twee muis harten en gehakt ze in een petrischaal met behulp van een scheermesje.
- Voeg het verwerkte weefsel een vijzel en voeg voldoende vloeibare stikstof om het monster te dekken. Verpulveren van het weefsel met een stamper, het toevoegen van meervloeibare stikstof als het verdampt.
- Zodra het weefsel grondig gemalen, laat de stikstof verdampen en voeg 1 ml lysis buffer (oplossing 7, tabel 1) bij 4 ° C voor elke 100 mg weefsel. Verplaats oplossing in een centrifugebuis.
- Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verzamel zorgvuldig de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis en gooi de pellet. Kwantificeren de eiwitconcentratie in het supernatant met behulp van de bicinchoninezuur-methode 12, of zoals de voorkeur. Opmerking: Native cellysaten of subcellulaire fracties kunnen worden bereid als voorkeur. CN-GELFrEE is compatibel met verschillende inheemse monster preparaten.
- Bereid de solubilisatie bufferoplossing en laden oplossing (oplossing 8 en 9, tabel 1).
- Als het monster een pellet te resuspenderen in 50-150 pl solubilisatiebuffer. Bewaar het monster op ijs gedurende 15 min.
- Buffer wisselen de geresuspendeerde monster of het cellysaat met solubilization buffer met behulp van een 30-kDa MWCO ultra centrifugaal filter.
- Centrifugeer het eiwit monster bij 4 ° C en 10.000 g gedurende 5-10 min of totdat de vastgehouden fractie volume tot ca. 20 pl. Gooi het doorstroomkanaal.
- Voeg 400 ul van solubilisatie buffer aan de ingehouden fractie en meng door pipetteren. Centrifugeer bij 4 ° C en 10.000 g gedurende 5-10 min of totdat de vastgehouden fractie tot ca. 20 pl. Gooi het doorstroomkanaal.
- Herhaal stap 2,9 nog tweemaal.
- Verdun het gefiltreerde monster (ongeveer 20 ui) in 100 pl solubilisatiebuffer.
- Voeg 20 ul van beladingsoplossing te proeven.
3. CN-GELFrEE Device
- Om CN-GELFrEE fractionering uit te voeren, de vervaardiging van de onderdelen van het apparaat door te verwijzen naar een werkplaats. Vervaardigen de onderdelen van het apparaat in Teflon. Zie Figuur 1 voor alle nodige informatie om de onderdelen en t vervaardigeno Tabel 2 voor het aantal benodigde onderdelen voor een bepaald apparaat.
Veiligheidsoverwegingen: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Zorg moeten worden genomen om de high-voltage voedingen, en alle knooppunten moet correct worden gemonteerd. Gebruik het apparaat of een aangrenzende natte ruimte niet aan terwijl de spanning is ingeschakeld en het omringende bank gebied droog te houden tijdens de elektroforese. Voorts moet de stroomvoorziening volledig worden uitgeschakeld bij het hanteren van het apparaat en / of het verzamelen van fracties. - Bereid de anode en kathode buffer buffer (oplossingen 10-11, Tabel 1) en bewaar ze bij 4 ° C of op ijs.
- Breng het boveneinde van de gelbuis (uiteinde zonder gel) via een spacer, een O-ring en een tweede afstand in een "sandwich" mode.
- Voeg de buffer kamer (kathode) na de tweede afstandhouder, passeren de schroeven volledig door de zijkant gaten, toe te voegen en draai de moeren aan beide kanten. Zorg ervoor dat de bovenkant van het glass buis is bevestigd voor de top opening van de buffer kamer, niet direct onder het of verleden.
- Breng de onderkant van de gel buis door een tussenstuk, een O-ring, de verzamelkamer, en een tweede afstandhouder.
- Voeg de buffer kamer (anode) na de tweede afstandhouder, passeren de schroeven volledig door de zijkant gaten, toe te voegen en draai de moeren aan beide kanten. Zorgen dat het ondereinde van de gelbuis is bevestigd boven de bovenste opening van de bufferkamer, maar sluit de achterwand niet raken.
- Stel de CN-GELFrEE apparaat verticaal met de kathode buffer kamer boven het gebruik van een statief met klemmen.
- Voeg buffer anode aan de anode bufferkamer (onder) en kathode buffer om de kathode bufferkamer (boven). Houd alle buffers bij 4 ° C.
- Verwijder luchtbellen van binnen de glazen buis door zachtjes te tikken op de glazen buis en controleer het systeem op lekkage.
- Controleer de platina-elektroden in contact zijn met de buffers in de kamers en dat beidegel buis uiteinden worden ondergedompeld in de buffer in elke kamer.
- Sluit de stekkers uit het stopcontact aan de respectieve banaanstekkers: negatief op de kathode buffer kamer (boven) en positief over de anode buffer kamer (onderaan).
- Laad het monster met behulp van een gel belasting tip naar boven oppervlak van de gel, binnen de gel buis.
- Voer de elektroforese op 1 W constant, om oververhitting te voorkomen, totdat de rode kleurstof voorkant is aan de onderkant van de gel buis.
LET OP: Schakel de voeding uit voordat u verdergaat. - Gooi anode en kathode buffers.
- En los de moeren van de anode buffer kamer en demonteer de onderste afstandhouder en de kamer, het handhaven van een afstandhouder en de O-ring. Plaats de onderkant van de gel buis in de verzamelkamer, voordat de bovenste opening, dat eerdere of direct eronder. Duw de spacer en de O-ring in de buurt van de collectie kamer.
- Knip een stuk cellulose dialysemembraan en hydrateren door alom tegenwoordige in anode buffer. Bedek de aperture tussen de verzamelkamer en de onderste afstandhouder met het dialysemembraan.
- Monteer de anode buffer kamer na de tweede afstandhouder, toe te voegen en draai de schroeven en bouten.
- Leg het toestel horizontaal over een ijsemmer. Voeg frisse anode en kathode buffers aan de buffer kamers en controleer het systeem op lekkage.
- Voeg 150 ul van anode buffer in de collectie kamer. Sluit de netsnoeren aan de respectieve banaanstekkers.
- Schakel de stroomvoorziening 3 mA constante stroom. De kleurstof voorkant moet dan beginnen te elueren in de buffer in de collectie kamer.
- Wanneer de gehele kleurstof voorzijde wordt uitgewassen, schakelt u de stroomvoorziening en het verzamelen van de eerste fractie (0 min), het overbrengen van het in een laag-eiwit binding microcentrifugebuis.
- Vul de opvangruimte met 150 ul van anode buffer. Houd alle verzamelde fracties op het ijs.
- Verzamel fracties na de volgende tijdsintervallen uit de collectie van heteerste fractie: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min en 60 min. Houden geen rekening met de tijd, terwijl de stroomtoevoer is uitgeschakeld. Vergeet niet de voeding uit te schakelen voordat het verzamelen van de fracties en de opvangruimte te vullen met 150 ul van anode buffer tussen de monsters. Schakel de voeding weer aan na het verzamelen om te beginnen met het elueren van het volgende deel.
- Verdeel de anode en kathode buffers en nieuwe oplossingen toevoegen bufferkamers na 60 min. Verzamel fracties van 90 min en 120 min.
- Veranderen anode en kathode buffers per uur.
- Voer een duidelijke inwoner of een blauwe inheemse pagina met de fracties en vlekken op het als voorkeur. Volg de instructies van de fabrikant of de voorkeur protocol.
- Voer een reducerende SDS-PAGE en vlekken als voorkeur. Volg de instructies van de fabrikant of de voorkeur protocol.
- Het schoonmaken van de GELFrEE breuken en voorleggen aan inheemse massaspectrometrie-analyses zoals beschreven previously 9.
Figuur 1:. CN-GELFrEE apparaat (A) GELFrEE apparaat delen tekeningen en (B) foto van de vervaardigde onderdelen; (C) CN-GELFrEE inrichtingsamenstel schema: (1) bufferkamer, (2) spacer, (3) O-ring (4) gel buis (5) verzamelkamer, en (6) dialysemembraan.
Tabel 1: Tabel oplossingen.
Tabel 2: Tabel van GELFrEE onderdelen van het apparaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
200 ug van eiwitten geëxtraheerd uit cryogeen gemalen muisharten werden native gefractioneerd in 14 fracties van 150 pl elk, met behulp van de methode CN-GELFrEE in een 1-12% T gel buis. Een hoeveelheid van 10 pl van elke fractie werd op een CN-PAGE plaatgel en zilver gekleurd. Een duidelijke afbeelding van de fractionering en resolutie verkregen met CN-GELFrEE fractionering wordt getoond in figuur 2A. Fracties werden verzameld gedurende twee uur en de gel assay toont een consistent patroon van toenemende moleculair gewichten van ~ 30-500 kDa. Elke fractie bevat soorten, variërend in gewicht meer dan ~ 100 kDa. Fracties vertonen een lage overlap van moleculair-weight-ranges die in toenemende mate wordt verlaagd als meer collecties gebeuren tussen de fracties. De CN-PAGE plaatgel hier vertegenwoordigt slechts 6% van de teruggewonnen uit elke 150 pl eiwitfractie.
Elk van de fractionen geëlueerd native van CN-GELFrEE werden vervolgens gereduceerd en gedenatureerd voorafgaand aan het runnen van hen op een SDS-PAGE slab gel. In de reducerende SDS-PAGE plaatgel (figuur 2B), kan men zien massaverschuivingen in alle fracties in vergelijking met de respectievelijke natieve fracties (Figuur 2A) dat aangeeft dat intacte eiwitcomplexen werden gedemonteerd en disulfidebruggen verlaagd.
Figuur 2:. CN-GELFrEE scheiding van de muis hart cryogeen malen extract (A) Duidelijke Inheems PAGE van CN-GELFrEE fracties verzameld op tijdsintervallen 0-120 min. Links: inheemse moleculair gewicht ladder. (B) reducerende SDS-PAGE van dezelfde fracties als A. Links: gereduceerd en gedenatureerd molecuulgewicht ladder.
De fracties kunnen vervolgens worden gereinigd en kunnen indienened native massaspectrometrie analyseert 9. Inheemse MS spectrum van het homodimere malaatdehydrogenase, die in sommige GELFrEE fracties, geeft een ladingsverdeling tussen 16+ 20+ en een molecuulgewicht van 72.843 Da (figuur 3A). De 18+ laadtoestand werd geïsoleerd en door botsingen geactiveerd, wat resulteert in het uitstoten van monomere malaatdehydrogenase met een molecuulgewicht van 36,421.7 (figuur 3B). Bron activering werd op het intacte complex om monomeer uitwerpen, waardoor isolatie en verdere fragmentatie van de monomeren induceren. De fragmentatie kaart van de 11+ monomeer kan worden waargenomen in Figuur 3C. CN-GELFrEE bewezen verenigbaar met massaspectrometrie analyses, toont geen verstoring van de niet-covalente eiwit-eiwit interacties van macromoleculaire samenstellingen.
Figuur 3: Massa spectra en fragmentatie kaart van de homodimeer malaatdehydrogenase (A) MS1 spectrum van het intacte complex, (B) MS2 spectrum vertonen monomeer uitgeworpen van het complex, en (C) een versnippering kaart verkregen uit de versnippering van het monomeer. . De rode N geeft aan dat de N-eindstandige geacetyleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CN-GELFrEE is afgeleid van het natieve heldere (CN) PAGE buffersysteem dat een mengsel van anionische en neutrale wasmiddelen als dragermoleculen voor 9 molecuulgewicht-eiwitten fractionering gebruikt door een gelmatrix. De toepassing van de GN-GELFrEE om een native muis hart eiwit extract gegenereerd lage complexiteit fracties met discrete bandbreedtes met behoud van niet-covalente interacties van biomoleculaire assemblies. Vergelijking van fracties tussen CN-PAGE en reducerende SDS-PAGE toonde plaatgels massaverschuivingen dat het verlies van niet-covalente binding tussen macromoleculen in de breuken en verbreken van disulfidebindingen tussen eiwitketens tonen. De resultaten bevestigen de inheemse karakter van de scheiding CN-GELFrEE.
Sommige stappen in dit protocol zijn van cruciaal belang en dus garandeert meer aandacht. Eerst, na gieten, de gelbuis moet worden losgemaakt van het apparaat en de externe langzaam polyacrylamide mooigesneden. Gebeurt dit niet,dus kan de gel beschadigen, waardoor luchtbellen in het gaas of losmaken van de gel uit de glazen buis. Deze schade afbreuk doen aan de resolutie van de scheiding en moet grondig worden vermeden. Anderzijds in elektroforese, de elektrische weerstand van het systeem overwerk toenemen, waarbij warmte vrijkomt, dus is het belangrijk zijn om zowel de procedure in een koude kamer of instellen dat ijsemmer verplaatsen nadat het monster in de geladen gel, teneinde niet op het geladen eiwitten denatureren door warmte. Bovendien is het belangrijk om een aantal belangrijke beperkingen van de techniek gedachten bij het uitvoeren van de beschreven protocol. Eiwitrijk lasten kan verminderen CN-GELFrEE resolutie. Overbelasting vooral monsters waar enige soorten zijn overvloediger, veroorzaakt deze proteïneverbindingen worden geëlueerd door een aantal opeenvolgende monsters. Voor muis cryogeen gemalen monsters, werden de beste resultaten gezien met bedragen tussen de 200 en 400 ug, maar dit gedrag is sample-afhankelijk. Ook hoge niveaus van zout in het monster zal de elektroforetische eigenschappen van eiwitten te veranderen, het veranderen van de band patroon en het verminderen van de fractionering resolutie. Deze kritische stappen en beperkingen moeten worden verklaard tijdens de uitvoering van dit protocol om betere resultaten te bereiken.
Verder werd aangetoond CN-GELFrEE om meerdere zeer gevraagd kenmerken in de native chromatografie hebben. Deze eenvoudige scheidingsmethode bereikt een hoge-resolutie fractionering van eiwitcomplexen, accepteren grote hoeveelheden eiwitten lading en fractioneren met uiteenlopende molecuulgewichten. CN-GELFrEE werd bewezen zeer veelzijdig, in staat fractioneren biologische monsters uit een groot aantal verschillende organismen en verschillende preparaten 9.
Bovendien is de vloeibare fractie elutie in deze techniek maakt eiwitrijke herstel dat niet waargenomen in andere gel-gebaseerde natieve scheidingen. In tegenstelling tot andere methoden die eluit assemblages in vloeibare fase, is CN-GELFrEE niet verminderen sample concentratie. In feite, de hierin beschreven protocol verhoogt de concentratie van elk eiwit samenstel van ~ 2-voudig van monster tot breuken. Tenslotte de vloeistofmonsters dit systeem zet gemakkelijk compatibel met verschillende downstream biochemische en biofysische analyses natief eiwit, waaronder massaspectrometrie. Na een enkele opruimen stap waren we in staat om te identificeren en te karakteriseren, door middel van inheemse massaspectrometrie, onbekende eiwitcomplexen in CN-GELFrEE fracties, verder aantonen van de inheemse mode en compatibiliteit tussen deze technieken.
Net als denaturerende GELFrEE, deze nieuwe inheemse fractionering techniek is ook een groot aanpassingsvermogen. De concentraties van het gieten oplossingen kunnen worden aangepast om verschillende gradiëntgels maken, teneinde het molecuulgewicht bereik dat wordt opgelost tijdens een run variëren. Verhogen van de% T van de gel-oplossingen leidt tot hoge resolution van lagere massa soorten terwijl het verminderen van het verbetert de scheiding van hoog molecuulgewicht. De afhaaltijden waardoor het experiment wordt uitgevoerd, kan ook worden aangepast om het molecuulgewicht bandbreedtes bereikt in elke fractie behoefte optimaliseren. Extended experiment tijd boven 120 min zal nog hoger moleculair gewicht varieert dan afgebeeld in dit protocol te genereren. Bovendien, het verminderen van de tijd tussen de fractie collectie kan de complexiteit in elke fractie te verminderen. Meervoudig parameters kunnen gemakkelijk worden verfijnd, optimaal gebruik van de techniek verschillende studies.
Tot slot, CN-GELFrEE voordelen te bezetten een gat in het gebied van inheemse scheidingstechnieken presenteren hoge resolutie scheiding in een breed scala van moleculaire gewichten, hoog eiwit herstel, en het aanvaarden van grote hoeveelheden eiwit belasting. Tenslotte de verkregen fracties zijn compatibel met de meeste stroomafwaartse natieve en denaturerende eiwit analysetechnieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De WM Keck Foundation royaal verstrekte financiering voor dit werk. Dit materiaal is gebaseerd op het werk ondersteund door FAPERJ onderzoek subsidie 100,039 / 2014 van de regering van Rio de Janeiro - Brazilië voor RDM, Science without Borders beurs 88.888,075416 / 2013-00 van het Coördinatieorgaan voor de verbetering van het hoger onderwijs personeel, onder de regering van Brazilië, voor HSS, de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder fellowship nummer 2014171659 voor OSS, en door CNPq onderzoek subsidie 202.011 / 2012-7 van de regering van Brazilië voor LHFDVPCH is een ontvanger van een Northwestern University's Chemistry of levensprocessen Institute Postdoctorale Fellowship Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Materials | |||
| 15 ml conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
