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Chemistry

CN-GELFrEE - Clear india geleluiert flüssige Fraktion Verleitung Elektrophorese

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Protein-Komplexe führen eine Reihe von entscheidenden zellulären Funktionen. Aufklären ihre nicht-kovalente Wechselwirkungen und Dynamik ist von größter Bedeutung für das Verständnis der Rolle der Komplexe in biologischen Systemen. Während die direkte Charakterisierung biomolekularer Baugruppen zunehmend in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen hat, einheimische Fraktionierung Techniken, die mit Techniken Downstream-Analyse kompatibel sind, einschließlich der Massenspektrometrie, sind notwendig, um weiter diese Studien erweitern. Dennoch fehlt das Feld einen hohen Durchsatz, Weitbereichs, High-Recovery-Trennverfahren für native Protein Baugruppen. Hier präsentieren wir klare nativen geleluiert flüssige Fraktion Einklemmung Elektrophorese (CN-GELFrEE), das ist eine neue Trennmethode für nicht-kovalente Protein-Baugruppen. CN-GELFrEE Trennleistung wurde durch Fraktionierung Komplexe aus Mäuseherzen extrahiert demonstriert. Die Fraktionen wurden über 2 Stunden gesammelt und angezeigt im Bereich diskrete Banden von ~ 30 bis 500 kDa. A congängige Muster Molekulargewicht Bandbreiten der Erhöhung beobachtet, jeweils im Bereich ~ 100 kDa. Ferner zeigte anschließende Re-Analyse von nativen Fraktionen über SDS-PAGE Molekulargewicht mit der Denaturierung von Proteinkomplexen konsistent verschiebt. Daher wurde CN-GELFrEE erwies sich die Fähigkeit zur Durchführung hochauflösenden und hoch Recovery nativen Trennungen auf Proteinkomplexe aus einem großen Molekulargewichtsbereich zu bieten, Fraktionen bieten, die mit kompatibel sind Downstream-Protein analysiert.

Introduction

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Der Großteil der biologischen Prozesse innerhalb einer Zelle passiert sind gedacht , durch Proteinanordnungen statt 1 einzelne Proteine ​​durchgeführt werden. Folglich, um die spezifische biologische Rolle einer Protein - Untereinheit in einer Zelle zu erläutern ist es notwendig , seine strukturelle Wechselwirkungen mit anderen Proteinen oder Liganden in den Komplexen 2 zu verstehen. Allerdings Proteine ​​nativ zu studieren, die Aufrechterhaltung ihrer nicht-kovalente Wechselwirkungen und Aktivität, bleibt eine Herausforderung. Einer der Nachteile von nativem Protein Studien ist eine geeignete einheimische Trenntechnik, die mit verschiedenen Downstream-Protein-Analyse-Techniken kompatibel ist. Aus diesem Grund hat scharf 3 aktuelle Interesse an der Trenntechniken fähig zur Charakterisierung nicht-kovalente Baugruppen von Biomolekülen erhöht.

Protein-Trenntechniken sind unerlässlich, Biochemie, Biophysik und verschiedene andere Studien. Aktuelle nativen Trenntechniken haben intrinsic Mängel, die die Kompatibilität mit Downstream-Analysen, wie niedrige Auflösung, geringem Durchsatz, Verlust an Niederschlag, und die Anforderung von großen Mengen an Ausgangsprobe zu reduzieren. Tandem Affinitätsreinigung wird für die Proteininteraktionsstudien allgemein verwendet, aber es muss separat für jedes Protein Target durchgeführt, wodurch es 4 inkompatibel mit Hochdurchsatz - Analyse. Grßenausschlußchromatographie 5, selektive Fällung mit Ionen - Affinitätschromatographie 5 und Dichtegradienttrennmittel 6 alle nativen Trennungen zur Verfügung gestellt haben, sind aber von Natur aus niedrig auflösenden Techniken und erfordern hohe Anfangsprobenmengen.

Alternativ Gelbasis Techniken, wie Blue Native (BN) und Clear Native (CN) PAGE (entweder 1-D oder 2-D), zeigen hochauflösende Trennung. Darüber hinaus im Gegensatz zu anderen Techniken erwähnt, beide native PAGE Trennungen halten Löslichkeit und nativer Konformation eines breiten range von Makromolekül-Spezies, einschließlich hydrophobe Proteine. Diese Fähigkeit erweitert ferner die Proteom Abdeckung durch diese Verfahren erreicht 7,8 und wird durch unterschiedliche Chemie zwischen CN und BN-PAGE erreicht. CN-PAGE setzt häufig auf weichen geladene Reinigungsmittel als Trägermoleküle, die Coomassie-Blau-Farbstoff in BN-PAGE zu ersetzen. BN-PAGE, wenn auch mit einer höheren Auflösung verbunden sind , hat Vorbehalte wie reduzierte enzymatische Aktivität in den getrennten Proteine ​​8 und Adduktbildung Coomassie Molekül, wobei letztere stark abträglich nachgelagerten MS wird analysiert 9. Beide Verfahren sind traditionell jedoch in Verbindung mit niedrigen Erholung und schmalen Proteom Abdeckung aufgrund der Färbung und -Gelextraktions Einschränkungen 7.

Für die Studie von denaturierten Proteinen, gibt es mehrere Techniken, die Makro Löslichkeit aufrechtzuerhalten, während hochauflösende Fraktionierung mit hohem Proteinwiederherstellung durchführen und dass sind kompatibel mit diVerse Nachabscheidung Proteinanalysetechniken. Geleluiert flüssige Fraktion Entrapment Electrophoresis (GELFrEE) ist eine der Fraktionierungstechniken, die alle diese Eigenschaften passen. Dieses Verfahren wird in Hochdurchsatz-top-down Proteomstudien weitgehend angewendet, was darauf hinweist, dass es schnell und vielseitig ist. In GELFrEE, Proteine ​​denaturiert und getrennt werden bezogen auf das Molekulargewicht durch eine röhrenförmige Gel-Matrix kann die Porosität von denen basierend auf Probe Anforderungen und den gewünschten Fraktionierung Ergebnisse variiert werden. Die Fraktionen werden in der flüssigen Phase eluiert, wodurch die Erholung Einschränkungen reduziert mit SDS-PAGE assoziiert, während eine hohe Auflösung. Die Fraktion Aliquots können dann durch 1-D PAGE für Molekulargewicht Bandbreite Auswahl 11 analysiert werden. Es besteht eine hohe Nachfrage nach den mit GELFrEE verbundenen Vorteile in nativen Trenntechniken. Das hier beschriebene Verfahren, löschen Mutter GELFrEE (CN-GELFrEE), ist eine native Bearbeitung von GELFrEE. Um mit einem breiten s kompatibel zu seinpectrum von Makromolekülen in ihrem nativen Zustand stützt sich dieses Verfahren nicht nur auf dem weichen CN-PAGE Chemie, sondern auch auf einem Porositätsgradienten Trennung, die durch Eliminieren des harten Übergang zwischen Porositäten in diskontinuierlichen Gelsystemen 9 Proteinpräzipitation reduziert. Bei Anwendung auf Proteinkomplexe, extrahiert aus Maus Herz fraktionieren, angezeigt eluierten Fraktionen hohe Rückgewinnung und eine hochauflösende Trennung von einem breiten Bereich von Molekulargewichten erhalten wurde. Ferner sind die resultierenden Fraktionen kompatibel mit den meisten nachgelagerten biochemischen und biophysikalischen Protein analysiert.

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Protocol

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Hinweis: Dieses Video - Protokoll basiert auf einer zugehörigen Veröffentlichung 9. Spezifische Reagenzien, Material und Ausrüstung notwendig, alle Schritte in diesem Protokoll beschriebenen Aufgaben werden in der Materialien aufgeführt. Die Rezepte und Informationen für die Vorbereitung aller erforderlichen Lösungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Gießen von Gradient Röhrchengele

  1. Montage des Gießsystem
    1. Mit einem flamm erhitzt Rasierklinge oder einem Skalpell, schneiden Sie ein 20 ml serologische Pipette entlang einer orthogonalen Abschnitt 10 cm von der Spitze der Abgabespitze. Stellen Sie sicher, dass die Schnittfläche glatt ist. Halten Sie das Unterteil (mit der Spitze) und das Oberteil zu verwerfen. Klemmen Sie die untere Pipette Stück vertikal (konische Spitze nach unten) auf einen Träger stehen.
      ACHTUNG: Berühren Sie nicht die erhitzte Klinge Metall, verwenden Sie die richtige Griffe oder eine Zange um Verbrennungen zu vermeiden.
    2. Schneiden Sie 3 cm Schlauch und verbinden Sie es mit dem Schnitt pipettieren, indem sie es erstreckt sich überdie Abgabespitze. Verbinden dem Strömungssteuerventil an dem anderen Ende des Rohres.
    3. Verbinden die Unterseite des Ventils zu der Abgabespitze des Gradienten-Mischer ein Rohrstück verwendet wird. Halten Sie das Ventil geöffnet.
    4. Stellen Sie den Gradienten-Mischer auf einem Magnetrührer. Legen Magnetstäbe in den Mischkammern.
    5. Positionieren Sie die Abgabespitze des Gradienten-Mischer 5-10 cm höher als das obere Ende der Pipette Stück zu ermöglichen, für das Gel durch die Schwerkraft gegossen werden.
    6. Testen Sie das System auf Lecks mit entsalztem Wasser. Wenn keine Lecks gefunden werden, trocknen Sie das System durch die Luft im Inneren, bevor Sie fortfahren weht.
    7. Die Oberseite der Pipettenstück mit zwei oder mehr Schichten des Bandes. Stechen Sie ein Loch durch die Bandschichten in der Mitte der kreisförmigen Öffnung. Stellen Sie sicher, dass die Einstich groß genug ist für das Glasrohr dicht passieren.
    8. Schieben Sie die Glasröhre, wo das Gel gegossen werden, durch die punktierten Loch, Dehnen des Bandes so das Glas fest sitzt. ichnsert der Glasröhre, so dass der Boden des Röhrchens beträgt 2 mm über dem Pipetten Unterseite.
    9. Überprüfen Sie, ob das Glasrohr gehalten wird und zentral organisiert und wird nicht die Pipette Wand zu berühren, sobald das System vorbereitet wird. Das System ist nun bereit für das Gießen.
  2. Casting Gel
    1. Bereiten Sie Gel - Puffer, APS und Coomassie - Lösungen (Lösungen 1-3, Tabelle 1).
    2. Vorbereitung 12% T (Lösung 4, Tabelle 1) und 1% T (Lösung 5, Tabelle 1) Trenngel Lösungen. In 10 ul Coomassie Lösung in 12% T Trenn Gel-Lösung. In APS und TEMED in beiden Lösungen unmittelbar vor dem in Gradientenmischer Gießen.
      ACHTUNG: Polyacrylamid ist hoch neurotoxisch und Handschuhe getragen werden müssen.
    3. Stellen Sie sicher, dass das Abgabeventil des Gradienten-Mischer geschlossen ist. Fügen Sie die 12% T Trenngel-Lösung zu der Mischkammer am weitesten von der Abgabespitze. Öffnen Sie das Ventil zwischen den beiden Kammern und lassen Sie den Lösungsstrom into die nächste Kammer.
    4. Schließen Sie das Ventil und Pipette die ausgerenkt 12% T Trenn Gel-Lösung zurück zur vorherigen Kammer. Dies geschieht, um Luftblasen zwischen den Kammern zu vermeiden.
    5. Fügen Sie die 1% T Trenngel-Lösung zu der Mischkammer am nächsten an der Abgabespitze. Schalten Sie den Magnetrührer.
    6. Open beide Gradienten Mischventile zur gleichen Zeit die Trenngel-Lösungen zu ermöglichen, gemischt und fließen in die Pipette und Glasröhre.
    7. Sobald die Trennung Gel-Lösungen in den Gradienten-Mischer aufgebraucht sind, entkoppeln den Schlauch aus dem Mischer und koppeln sie mit einem 10-ml-Spritze. Sicherstellen, dass das Ende des Rohres oberhalb des Flüssigkeitsspiegels in der Pipette verbleibt, bis die Spritze fest verbunden ist.
    8. Verwenden Sie die Spritze vorsichtig auf die verbleibenden Trenngel Lösung aus dem Schlauch in die Pipette und Glasrohr zu schieben. Schließen Sie die Pipette Ventil vor Luftblasen hinein ermöglicht.
    9. Sanft fügen Sie eine Schicht von etwa 0,25 ml Wasser gesättigten butanol (Lösung 6, Tabelle 1) auf der Oberseite der Gellösung im Inneren der Glasröhre um die Polymerisationsreaktion von Sauerstoff in Luft zu versiegeln und die obere Meniskus abzuflachen.
    10. Reinigen Sie die Gießvorrichtung sofort mit VE-Wasser (nicht verwenden Waschmittel).
    11. Warten Sie über Nacht für eine vollständige Gelpolymerisation bei Raumtemperatur.
  3. Abnehmen Gel-Schlauch aus dem Geräte und Speichern
    1. Am folgenden Tag, ziehen vorsichtig das Klebeband von der Oberseite des Gerätes.
    2. Ziehen Sie das Ventil aus der Rohrleitung unter der Pipette. Lassen Sie die Pipette aus der Klemme und führen Sie die Schritte 1.3.3. und 1.3.4. über ein Waschbecken.
    3. Paare, die eine 10-ml-Spritze mit VE-Wasser auf den Schlauch gefüllt. Push Wasser durch den Schlauch in die Pipette langsam das polymerisierte Gel Gleiten aus der Pipette.
    4. Halten Sie die Pipette horizontal und sichern sorgfältig das Gel aus dem offenen Ende gleiten.
    5. Das überstehende Polyacrylamid unter und around das Glasrohr mit einer Rasierklinge. Stellen Sie sicher, um eine glatte Ende auf dem Gel in der Röhre zu schaffen, indem sie mit der Spitze des Glasrohres bündig.
    6. Dispense alle verbleibenden Butanol aus der Oberseite des Gels und stellen Sie die Gelrohr in einem unverschlossenen 15 ml Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie 0,5 ml Gel - Puffer (Lösung 1, Tabelle 1) mit 4,5 ml ultrareinem Wasser und fügen Sie ca. 2 ml der Lösung , um sowohl die Oberseite (im Glasrohr) und der Unterseite (in Zentrifugenröhrchen) von Gelrohr.
    7. Decken die gesamte Oberseite des Zentrifugenröhrchens, einschließlich der Glasrohröffnung, mit Parafilm Pufferverdampfung zu verhindern. Gele können für ca. 2 Wochen bei 4 ° C gelagert werden.

2. Probenvorbereitung

  1. Wiegen zwei Mäuseherzen und Hackfleisch sie in einer Petrischale mit einer Rasierklinge.
  2. Fügen Sie das verarbeitete Gewebe zu einem Mörser und fügen Sie ausreichend flüssigem Stickstoff um die Probe zu bedecken. Pulverisieren des Gewebes mit einem Stößel, indem mehrflüssigem Stickstoff, wenn es verdampft.
  3. Sobald das Gewebe gründlich gemahlen wird, lassen den Stickstoff verdampfen und 1 ml Lyse - Puffer (Lösung 7, Tabelle 1) bei 4 ° C pro 100 mg Gewebe. Bewegen Lösung in ein Zentrifugenröhrchen.
  4. Zentrifuge bei 2.000 xg für 5 min bei 4 ° C. den Überstand in ein neues Röhrchen sorgfältig sammeln und das Pellet verwerfen. Quantifizierung der Proteinkonzentration im Überstand des Bicinchoninsäure - Methode unter Verwendung von 12 oder als bevorzugt. Hinweis: Mutter Zelllysate oder subzellulären Fraktionen hergestellt, wie es bevorzugt sein kann. CN-GELFrEE ist kompatibel mit verschiedenen nativen Probenvorbereitungen.
  5. Bereiten Sie die Solubilisierung Pufferlösung und Beladungslösung (Lösung 8 und 9, Tabelle 1).
  6. Wenn die Probe ein Pellet resuspendieren es in 50-150 ul Solubilisierungspuffer. Halten Sie die Probe auf Eis für 15 min.
  7. Pufferaustausch die erneut suspendiert Probe oder des Zelllysats mit solubilizatIonen-Puffer mit einem 30 kDa-MWCO Ultrazentrifugenfilter.
  8. Zentrifugieren der Proteinprobe bei 4 ° C und 10.000 × g für 5-10 Minuten, oder bis die zurückgehaltene Fraktion Volumen bis auf etwa 20 & mgr; l. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
  9. In 400 ul Solubilisierungspuffer auf die zurückgehaltene Fraktion und mischen durch Pipettieren. Zentrifuge bei 4 ° C und 10.000 × g für 5-10 Minuten, oder bis die zurückgehaltene Fraktion wird auf etwa 20 & mgr; l. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
  10. Wiederholen Sie Schritt 2.9 zwei weitere Male.
  11. Verdünne die filtrierte Probe (etwa 20 ul) in 100 ul Solubilisierungspuffer.
  12. In 20 ul Beladungslösung zu probieren.

3. CN-GELFrEE Geräte

  1. CN-GELFrEE Fraktionierung, die Herstellung der Geräteteile durchzuführen, indem eine Maschine Geschäft bezieht. Herstellen, die Geräteteile aus Teflon. Bitte siehe Abbildung 1 für alle notwendigen Informationen , um die Teile und t herstelleno Tabelle 2 für die Anzahl der erforderlichen Teile für ein Gerät.
    Sicherheitshinweise: Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. Achten Sie darauf, um die Hochspannungs-Stromversorgung genommen werden, und alle Kreuzungen sollten richtig montiert. Berühren Sie das Gerät nicht oder jede benachbarte Nassbereich, während Spannung auf und halten die umgebende Bankbereich trocken während der Elektrophorese. Darüber hinaus sollte die Stromversorgung vollständig ausgeschaltet werden, wenn das Gerät und / oder Sammelfraktionen Handhabung.
  2. Bereiten Sie die Anodenpuffer und Kathodenpuffer (Lösungen 10-11, Tabelle 1) und halten sie bei 4 ° C oder in Eis.
  3. Den oberen Ende des Gelrohr (Ende ohne Gel) durch einen Abstandshalter, einen O-Ring und einem zweiten Abstandshalter, in einer "Sandwich" Art und Weise.
  4. Fügen Sie die Pufferkammer (Kathode) nach dem zweiten Abstandshalter, übergeben Sie die Schrauben vollständig durch die Seitenlöcher, hinzufügen und ziehen Sie die Muttern an beiden Seiten. Stellen Sie sicher, dass das obere Ende der Glass Schlauch wird vor dem oberen Öffnung der Pufferkammer befestigt ist, nicht direkt unter ihm oder daran vorbei.
  5. Den unteren Ende des Gelrohr durch einen Abstandshalter, einen O-Ring, der Sammelkammer und einem zweiten Abstandhalter.
  6. Fügen Sie die Pufferkammer (Anode) nach dem zweiten Abstandshalter, übergeben Sie die Schrauben vollständig durch die Seitenlöcher, hinzufügen und ziehen Sie die Muttern an beiden Seiten. Stellen Sie sicher, dass das untere Ende des Gelrohr über die obere Öffnung der Pufferkammer befestigt ist, in der Nähe, aber nicht die Rückwand berühren.
  7. Stellen Sie die CN-GELFrEE Gerät vertikal mit der Kathodenpufferkammer nach oben ein Stützgestell mit Schellen.
  8. Hinzufügen Anodenpuffer an die Anodenpufferkammer (unten) und der Kathodenpuffer in die Kathodenpufferkammer (oben). Halten Sie alle Puffer bei 4 ° C.
  9. Entfernen Sie Luftblasen aus dem Inneren der Glasröhre durch sanft das Glasrohr tippen und überprüfen Sie das System auf Lecks.
  10. Sicherstellen, dass die Platinelektroden in Kontakt mit den Puffern in den Kammern sind und daß sowohlGel Rohrenden werden in dem Puffer innerhalb jeder Kammer eingetaucht.
  11. Schließen Sie die Netzkabel von der Stromversorgung zu den entsprechenden Bananenstecker: negativ auf die Kathodenpufferkammer (oben) und positiv auf der Anodenpufferkammer (unten).
  12. Legen Sie die Probe ein Gel Lastspitze mit Oberfläche des Gels nach oben innerhalb des Gelrohr.
  13. Die Elektrophorese bei 1 W konstant ist, eine Überhitzung zu vermeiden, bis die rote Farbstofffront an der Unterseite des Gelschlauch ist.
    VORSICHT: Schalten Sie die Stromversorgung, bevor Sie fortfahren.
  14. Verwerfen Anoden- und Kathodenpuffern.
  15. Lösen Sie die Muttern von der Anodenpufferkammer und zerlegen den unteren Abstandhalter und die Kammer, einen Abstandshalter und den O-Ring zu halten. Legen Sie das untere Ende des Gelrohr innerhalb der Sammelkammer, bevor die obere Öffnung, nicht in der Vergangenheit oder direkt darunter. Schieben Sie den Abstandhalter und O-Ring nahe an der Sammelkammer.
  16. Schneiden Sie ein Stück von Cellulose-Dialysemembran und rehydratisieren es in Anodenpuffer durch immerging. Decken Sie die aperture zwischen der Sammelkammer und dem unteren Abstandshalter die Dialysemembran verwendet wird.
  17. Montieren Sie die Anodenpufferkammer nach dem zweiten Abstandshalter, fügen Sie und ziehen Sie die Schrauben und Bolzen.
  18. Legen Sie das Gerät horizontal über einem Eiskübel. Fügen Sie frische Anode und Kathode Puffer zu den Pufferkammern und prüfen Sie das System auf Lecks.
  19. In 150 ul Anodenpuffer in die Sammelkammer. Schließen Sie die Netzkabel an die jeweiligen Bananenstecker.
  20. Schalten Sie die Stromversorgung bei 3 mA Konstantstrom. Die Farbstofffront sollte dann beginnen, in den Puffer in der Sammelkammer zu eluieren.
  21. Wenn der gesamte Farbstoff-Front eluiert wird, schalten Sie die Stromversorgung und sammeln die erste Fraktion (0 min), die Übertragung in ein Low-Protein-Bindung Mikrozentrifugenröhrchen aus.
  22. Füllen Sie die Sammelkammer mit 150 ul Anodenpuffer. Halten Sie alle gesammelten Fraktionen auf Eis.
  23. Sammle Fraktionen nach den folgenden Zeitabständen aus der Sammlung deserste Fraktion: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min und 60 min. Nicht zur Zeit berücksichtigen, während die Stromversorgung ausgeschaltet ist. Vergessen Sie nicht die Stromversorgung auszuschalten, bevor die Fraktionen gesammelt und die Sammelkammer zu füllen mit 150 ul Anodenpuffer zwischen den Proben. Schalten Sie Stromversorgung wieder nach der Sammlung zu beginnen, die nächste eluierende Fraktion.
  24. Dispense die Anoden- und Kathodenpuffer und fügen neue Lösungen zu den Pufferkammern nach 60 min. Sammle Fraktionen bei 90 min und 120 min.
  25. Ändern Sie Anoden- und Kathodenpuffer jede Stunde.
  26. Führen Sie einen klaren nativen oder eine blaue native PAGE mit den Fraktionen und färben es als bevorzugt. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers oder bevorzugte Protokoll.
  27. Führen eines reduzierenden SDS-PAGE und beflecken es als bevorzugt. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers oder bevorzugte Protokoll.
  28. Reinigen Sie die GELFrEE Fraktionen und legt auf native Massenspektrometrie analysiert, wie beschrieben previously 9.

Abbildung 1
Abb . 1: CN-GELFrEE Gerät (A) GELFrEE Vorrichtungsteile Zeichnungen und (B) Fotografie der hergestellten Teile; (C) CN-GELFrEE Gerät Montageschema: (1) Pufferkammer, (2) Abstandhalter (3) O-Ring, (4) Gelrohr, (5) Sammelkammer, und (6) Dialysemembran.

Tabelle 1
Tabelle 1: Übersicht über die Lösungen.

Tabelle 2
Tabelle 2: Tabelle der GELFrEE Geräteteile.

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Representative Results

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200 & mgr; g Proteine ​​aus kryogen gemahlener Mäuseherzen extrahiert wurden jeweils mit dem CN-GELFrEE Verfahren in einem 1-12% T Gelrohr nativ in 14 Fraktionen von 150 & mgr; l fraktioniert. Eine aliquote Menge von 10 ul jeder Fraktion auf einer CN-PAGE Flachgel und mit Silber gefärbt wurde durchgeführt. Eine klare Darstellung der Fraktionierung und Auflösung erhalten mit CN-GELFrEE Fraktionierung ist in 2A gezeigt. Fraktionen wurden über zwei Stunden gesammelt und das Gel-Assay zeigt ein konsistentes Muster Molekulargewichte der Erhöhung von ~ 30 bis 500 kDa reichen. Jede Fraktion enthält Arten bis hin in Masse über ~ 100 kDa. Die Fraktionen zeigen eine geringe Überlappung der Molekulargewichtsbereiche, die zunehmend als weitere Sammlungen zwischen den Fraktionen passieren reduziert wird. Die CN-PAGE-Plattengel hier gezeigten stellt nur 6% der von jeder 150 & mgr; l Fraktion gewonnen Protein.

Jede der fractIonen eluiert nativ aus CN-GELFrEE wurden anschließend reduziert und denaturiert, bevor sie auf einem SDS-PAGE-Plattengel zu laufen. In dem reduzierenden SDS-PAGE - Plattengel (2B), ist es möglich , Massenverschiebungen in allen Fraktionen zu sehen , wenn sie auf die jeweiligen Mutterfraktionen (2A) verglichen wird , das anzeigt , dass intakte Protein - Komplexe wurden zerlegt und Disulfidbrücken reduziert.

Figur 2
Abbildung 2:. CN-GELFrEE Trennung von Mäuseherzen Kryogenvermahlung Extrakt (A) Klar native PAGE von CN-GELFrEE Fraktionen in Zeitintervallen 0 bis 120 min gesammelt. Links: natives Molekulargewicht Leiter. (B) Reduzieren der SDS-PAGE von gleichen Fraktionen wie A. Links: reduziert und denaturiert molekulare Leiter.

Die Fraktionen können dann gereinigt und submitt werdened auf native Massenspektrometrie analysiert 9. Nativer MS - Spektrum der homodimeren Malat - Dehydrogenase, in einigen der GELFrEE Fraktionen identifiziert, zeigt eine Ladungsverteilung zwischen 16+ und 20+ und einer Molekularmasse von 72.843 Da (3A). Die 18+ Ladungszustand wurde isoliert und stoßaktiviert, was zu dem Ausstoß von monomeren Malat - Dehydrogenase mit einem Molekulargewicht von 36,421.7 (3B). Source-Aktivierung wurde mit dem intakten Komplex angewendet, um Monomer Ausstoß zu induzieren, wodurch die Isolierung und weitere Fragmentierung der Monomere. Die Fragmentierung Karte des 11+ Monomer kann in 3C beobachtet werden. CN-GELFrEE wurde bewiesen, kompatibel zu sein mit der Massenspektrometrie analysiert, keine Störung der nicht-kovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen von makromolekularen Anordnungen zeigt.

Figur 3 Abbildung 3: Die Massenspektren und die Fragmentierung Karte der Homodimer Malat - Dehydrogenase (A) MS1 - Spektrum des intakten Komplexes, (B) MS2 - Spektrum aufweist Monomer aus dem Komplex ausgestoßen wird, und (C) eine Karte Fragmentierung von der Fragmentierung des Monomers erhalten. . Die rote N zeigt an, dass das N-terminal acetyliert ist.

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Discussion

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CN-GELFrEE wird aus der klaren Mutter (CN) PAGE - Puffersystem abgeleitet , die eine Mischung aus anionischen und neutralen Reinigungsmitteln als Trägermoleküle 9 für molekulargewichtsabhängige Proteinfraktionierung durch eine Gelmatrix verwendet. Die Anwendung des CN-GELFrEE zu einer nativen Maus Herz Proteinextrakt erzeugt geringe Komplexität Fraktionen mit diskreten Bandbreiten unter Beibehaltung nicht-kovalente Wechselwirkungen von Biomolekülen Baugruppen. Vergleich der Fraktionen zwischen CN-PAGE und reduzierenden SDS-PAGE-Gelen zeigte Bramme Massenverschiebungen, die einen Verlust von nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen Makromolekülen in den Fraktionen und Bruch von Disulfidbindungen zwischen den Proteinketten zeigen. Die Ergebnisse bestätigen die nativen Charakter der CN-GELFrEE Trennung.

Einige Schritte in diesem Protokoll sind kritisch und somit mehr Aufmerksamkeit. Erstens, nach dem Gießen sollte die Gelrohr aus dem Gerät langsam gelöst werden und das externe Polyacrylamid sorgfältig geschnitten. Geschieht dies nicht,so kann das Gel beschädigen, Luftblasen innerhalb des Mesh verursachen oder um das Gel aus dem Glasrohr gelöst wird. Diese Beschädigungen beeinträchtigen die Trennung Auflösung und sollte gründlich vermieden werden. Zweitens, während der Elektrophorese wird der elektrische Widerstand des Systems Überstunden erhöhen, Wärme zu erzeugen, so ist es sehr wichtig, um entweder das Verfahren in einer Kältekammer durchzuführen oder um das Gerät zu einem Eisbehälter zu bewegen, nachdem die Probe in die geladen ist Gel, um nicht die geladenen Proteine ​​durch Hitze zu denaturieren. Darüber hinaus ist es wichtig, einige wichtige Einschränkungen der Technik in den Sinn, wenn die beschriebenen Protokoll durchgeführt wird. Hohe Proteinlasten können CN-GELFrEE Auflösung reduzieren. Überlastung, insbesondere von Proben, in denen einige Arten reichlicher vorhanden sind, werden diese Proteinspezies veranlassen, durch eine Anzahl von aufeinanderfolgenden Fraktionen eluiert werden. Für Maus kryogen Bodenproben wurden die besten Ergebnisse mit Mengen zwischen 200 gesehen und 400 ug, aber dieses Verhalten ist Probe abhängig. Auch high Niveaus des Salzes in der Probe werden die elektrophoretischen Eigenschaften der Proteine, Änderung des Bandenmusters und der Verringerung der Fraktionierung Auflösung ändern. Diese kritischen Schritte und Einschränkungen sollten bei der Durchführung dieses Protokolls zu erzielen bessere Ergebnisse berücksichtigt werden.

Des Weiteren wurde CN-GELFrEE mehrere hoch geforderten Eigenschaften in nativen Chromatographie haben gezeigt. Diese einfache Trennverfahren erreicht hochauflösende Fraktionierung von Proteinkomplexen, hohe Mengen an Protein Last und Fraktionieren durch einen breiten Bereich von Molekulargewichten zu akzeptieren. CN-GELFrEE wurde auch sehr vielseitig erwiesen, in der Lage ist Fraktionieren biologischen Proben von einer großen Vielfalt von Organismen und verschiedenen Zubereitungen 9.

Zudem ermöglicht die flüssige Fraktion Elutionszeit in dieser Technik hohe Proteinrückgewinnung, die nicht in anderen Gelbasis nativen Trennungen beobachtet wird. Zusätzlich, im Gegensatz zu anderen Verfahren, dass eLaute Baugruppen in flüssiger Phase, CN-GELFrEE nicht Probenkonzentration zu reduzieren. Tatsächlich erhöht das Protokoll hier beschrieben, die Konzentration von jedem Protein Montage durch ~ 2-fach von Probe zu Fraktionen. Schließlich sind die flüssigen Proben dieses Verfahren erzeugt leicht kompatibel mit verschiedenen nachgeschalteten biochemischen und biophysikalischen native Proteinanalysen, Massenspektrometrie einschließlich. Nach einer einzigen aufzuräumen Schritt waren wir in der Lage, durch native Massenspektrometrie, unbekannte Proteinkomplexe in CN-GELFrEE Fraktionen zu identifizieren und zu charakterisieren, weiter die native Mode und die Kompatibilität zwischen diesen Techniken zu demonstrieren.

Ähnlich zu denaturieren GELFrEE, diese neuartige nativen Fraktionierung Technik ist auch sehr anpassungsfähig. Die Konzentrationen von Gießlösungen können eingestellt werden, um unterschiedliche Gradienten-Gelen zu erzeugen, um den Molekulargewichtsbereich zu variieren, die während eines Laufs aufgelöst wird. Erhöhung der% T der Trenngel-Lösungen führt zu hohen resolutIonenmassenarten niedriger, während es verbessert Spezies Trennung von hohem Molekulargewicht abnimmt. Die Leerungszeiten, durch die das Experiment durchgeführt wird, kann auch angepasst werden, um die Molekulargewichtsbandbreiten in jeder Fraktion erreicht zu optimieren, wie gebraucht. Erweiterte Versuchszeit über 120 min erzeugen wird noch höhere Molekulargewichtsbereiche als in diesem Protokoll dargestellt. Darüber hinaus kann die Zeit zwischen Fraktionssammlung Reduzierung der Komplexität in jeder Fraktion zu reduzieren. Daher können mehrere Parameter leicht fein abgestimmt werden, die Verwendung der Technik, um verschiedene Studien zu optimieren.

Abschließend besetzen CN-GELFrEE Vorteile eine Lücke im Bereich der nativen Techniken Trennung hochauflösende Trennung in einer breiten Palette von Molekulargewichten, hohe Proteingewinnung präsentiert, und hohe Mengen an Eiweißbelastung zu akzeptieren. Schließlich werden die resultierenden Fraktionen kompatibel mit den meisten nachgelagerten nativen und denaturierenden Techniken Proteinanalyse.

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Acknowledgments

Die WM Keck-Stiftung großzügig Mittel für diese Arbeit. Dieses Material basiert auf der Arbeit von Grant FAPERJ Forschung unterstützt 100,039 / 2014 von der Regierung von Bundesstaat Rio de Janeiro - Brasilien für RDM, Wissenschaft ohne Grenzen Stipendium 88888,075416 / 2013-00 von der Koordination zur Verbesserung der Hochschulpersonal, unter der Regierung die National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Kameradschaft Nummer 2014171659 für OSS und durch CNPq Forschungsstipendium 202011 / 2012-7 von der Regierung von Brasilien für LHFDVPCH von Brasilien, für HSS, ist ein Empfänger einer der Northwestern University Chemie der Lebensprozesse Institut Postdoctoral Fellowship Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

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References

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Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

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