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Chemistry

NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

complexos de proteína executar uma variedade de funções celulares cruciais. Elucidando suas interações e dinâmica não-covalentes é fundamental para a compreensão do papel dos complexos em sistemas biológicos. Embora a caracterização direta de conjuntos biomoleculares tornou-se cada vez mais importante nos últimos anos, técnicas de fraccionamento nativas que são compatíveis com técnicas de análise a jusante, incluindo espectrometria de massa, são necessárias para expandir ainda mais esses estudos. No entanto, o campo não tem um alto rendimento, ampla gama de alta recuperação método de separação para os conjuntos de proteínas nativas. Aqui, apresentamos clara fração líquida eluída-gel eletroforese aprisionamento nativo (CN-GELFrEE), que é uma nova modalidade de separação para os conjuntos de proteínas não-covalentes. desempenho de separação CN-GELFrEE foi demonstrada por complexos de fraccionamento extraídos do coração mouse. As fracções foram recolhidas ao longo de 2 h e exibida bandas discretas que variam de ~ 30 a 500 kDa. A confoi observado padrão sistente de aumentar a largura de banda de peso molecular, cada um variando ~ 100 kDa. Além disso, subsequente reanálise das fracções nativas através de SDS-PAGE mostrou peso molecular desloca consistente com a desnaturação de complexos de proteínas. Portanto, NC-GELFrEE foi provado oferecem a possibilidade de realizar de alta resolução e de alta recuperação separações nativas em complexos de proteína a partir de uma grande gama de pesos moleculares, proporcionando fracções que são compatíveis com as análises de proteínas a jusante.

Introduction

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A maioria dos processos biológicos que acontecem dentro de uma célula são pensados ​​para ser levada a cabo por conjuntos de proteínas, em vez de proteínas individuais 1. Por conseguinte, a fim de elucidar o papel biológico específico de uma subunidade de proteína numa célula é necessário para entender as suas interacções com outras proteínas estruturais ou ligandos em complexos de 2. No entanto, estudando proteínas nativamente, mantendo suas interações e atividade não-covalentes, continua sendo um desafio. Uma das deficiências dos estudos proteína nativa é uma técnica de separação nativa adequado que seja compatível com as várias técnicas de análise de proteína a jusante. Portanto, recente interesse em técnicas de separação, capazes de caracterizar os conjuntos não covalentes de biomoléculas aumentou acentuadamente 3.

técnicas de separação de proteínas são fundamentais para bioquímica, biofísica e vários outros estudos. técnicas de separação nativos atuais têm intrinsideficiências c que reduzem a compatibilidade com análises a jusante, tais como baixa resolução, baixa taxa de transferência, perda de precipitação, bem como a exigência de grandes quantidades de amostra inicial. Tandem purificação por afinidade é normalmente utilizada para estudos de interacção proteína, mas tem que ser levada a cabo separadamente para cada proteína alvo, fazendo com que seja incompatível com a análise de alto rendimento 4. Cromatografia de exclusão de tamanho 5, precipitação seletiva com cromatografia de afinidade de iões de 5 e densidade de gradiente de separação 6 todos têm fornecido separações nativos, mas são inerentemente técnicas de baixa resolução e requerem grandes quantidades iniciais de amostras.

Alternativamente, técnicas baseadas em gel, tais como azul nativo (BN) e Clear PAGE nativo (CN) (ou 1-D ou 2-D), apresentar separação de alta resolução. Além disso, em contraste com outras técnicas mencionadas, ambas as separações página native manter a solubilidade e conformação nativa de um r largaange de espécies de macromoléculas, incluindo as proteínas hidrofóbicas. Esse recurso amplia ainda mais a cobertura proteoma alcançado por estes métodos 7,8 e é conseguida através da química diferente entre CN e BN-PAGE. CN-PAGE comumente se baseia em detergentes suave cobrado como moléculas de transporte, substituindo o corante azul de Coomassie em BN-PAGE. BN-PAGE, embora associado com maior resolução, tem advertências, tais como redução da atividade enzimática nas proteínas separadas 8 e formação de aduto molécula de Coomassie, sendo este último muito prejudicial para MS jusante analisa 9. Ambos os métodos, no entanto, são tradicionalmente associados com baixa recuperação e cobertura proteoma estreita devido à coloração e limitações de extração de gel 7.

Para o estudo de proteínas desnaturadas, existem várias técnicas que manter a solubilidade macromolécula durante a execução de fraccionamento de alta resolução com elevada recuperação de proteína e que são compatíveis com diVerse técnicas de análise de proteína pós-separação. Gel que eluiu fracção líquida Armadilha de electroforese (GELFrEE) é uma das técnicas de fraccionamento que cabem todas estas características. Este método é amplamente aplicado em estudos de alto rendimento proteómica de cima para baixo, indicando que ele é rápido e versátil. Em GELFrEE, as proteínas são desnaturadas e separados com base no peso molecular por meio de uma matriz de gel tubular, a porosidade dos quais podem ser variadas com base em requisitos de amostra e os resultados desejados de fraccionamento. As fracções foram eluídas em fase líquida, reduzindo assim as limitações associadas com a recuperação de SDS-PAGE, mantendo alta resolução. Alíquotas fracção pode, então, ser analisado por um D-PAGE para-peso molecular selecção largura de banda 11. Há uma alta demanda para as vantagens associadas GELFrEE em técnicas de separação nativas. O método aqui descrito, claro nativo GELFrEE (NC-GELFrEE), é uma adaptação nativa de GELFrEE. A fim de ser compatível com uma ampla spectrum de macromoléculas no seu estado nativo, este método baseia-se não só na química suave NC-PAGE, mas também em uma separação por gradiente de porosidade, o que reduz a precipitação de proteína, eliminando a transição entre a dura porosidades presentes em sistemas de gel descontínuos 9. Quando aplicado a fraccionar complexos de proteínas extraídas a partir do coração de rato, fracções eluídas apresentado uma separação de alta resolução de uma ampla gama de pesos moleculares obtida foi elevada recuperação e. Além disso, as fracções resultantes são compatíveis com a maioria das análises bioquímicas e biofísicas da proteína a jusante.

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Protocol

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Nota: Este protocolo de vídeo é baseado em uma publicação associada 9. reagentes específicos, materiais e equipamentos necessários para executar todos os passos descritos neste protocolo são listados na seção materiais. As receitas e informações para a preparação de todas as soluções necessárias são discriminados na Tabela 1.

1. derramamento de geles de tubo de gradiente

  1. Montagem do Sistema de Fundição
    1. Usando uma lâmina de barbear aquecido à chama ou bisturi, cortar uma pipeta de 20 ml serológica ao longo de uma secção ortogonal 10 cm a partir do topo da ponta de aplicação. Certifique-se de que a superfície de corte é suave. Mantenha a parte inferior (com a ponta) e descartar a parte superior. Fixe a peça pipeta de fundo vertical (ponta cónica virada para baixo) para uma posição de apoio.
      CUIDADO: Não toque na lâmina de metal aquecida, utilize pegas adequados ou um alicate para evitar queimaduras.
    2. Cortar 3 cm de tubo flexível e conecte-o a pipeta corte esticando-o sobrea ponta de aplicação. Ligar a válvula de controlo de escoamento na outra extremidade do tubo.
    3. Ligar a parte inferior da válvula de distribuição para a ponta do misturador de gradiente usando um pedaço de tubo. Mantenha a válvula aberta.
    4. Ajuste o misturador de gradiente sobre um agitador magnético. Coloque barras magnéticas no interior das câmaras de mistura.
    5. Posicionar a ponta distribuidora do misturador de gradiente de 5-10 cm acima da parte superior da peça de pipeta para permitir a gel para ser vertida por gravidade.
    6. Testar o sistema quanto a vazamentos com água deionizada. Se não há vazamentos são encontrados, secar o sistema de sopro de ar dentro dele antes de continuar.
    7. Cobrir a parte superior da peça de pipeta com duas ou mais camadas de fita. Perfurar um orifício através das camadas de fita, no centro da abertura circular. Certifique-se que a punção é grande o suficiente para o tubo de vidro para passar firmemente completamente.
    8. Deslize o tubo de vidro, onde o gel será lançado, através do furo perfurado, esticando a fita assim que o vidro se encaixa bem. EuNSERT o tubo de vidro de modo que o fundo do tubo é de 2 mm acima da parte inferior da pipeta.
    9. Verifique se o tubo de vidro é mantido e centralizada e não está a tocar na parede pipeta uma vez que o sistema está preparado. O sistema está agora pronto para a fundição.
  2. Gel fundição
    1. Prepare tampão gel, APS e soluções Coomassie (soluções 1-3, Tabela 1).
    2. Preparar 12% T (solução 4, Tabela 1) e 1% de T (solução a 5, Quadro 1) separar as soluções de gel. Adicionar 10 ul de solução de Coomassie na solução de gel de separação a 12% T. Adicionar APS e TEMED em ambas as soluções imediatamente antes de derramar no misturador de gradiente.
      CUIDADO: poliacrilamida é altamente neurotóxico e as luvas devem ser usados.
    3. Verifique se a válvula de distribuição do misturador de gradiente está fechado. Adicionar a solução de gel de separação para a câmara de mistura mais afastado da ponta de distribuição de 12% t. Abrir a válvula entre ambas as câmaras e deixar o fluxo da solução into a próxima câmara.
    4. Fechar a válvula e pipetar a solução deslocado gel a 12% t de separação de volta para a câmara anterior. Isto é feito para evitar bolhas de ar entre as câmaras.
    5. Adicionar a solução de gel de separação para a câmara de mistura mais próxima da ponta dispensadora 1% T. Ligar o agitador magnético.
    6. Abertas tanto gradiente válvulas misturadoras ao mesmo tempo para permitir que as soluções de gel de separação a ser misturados e a fluir para dentro do tubo da pipeta e vidro.
    7. Uma vez que as soluções de gel de separação no misturador de gradiente são esgotados, desacoplar o tubo a partir do misturador e acoplá-lo a uma seringa de 10 ml. Certifique-se a extremidade do tubo permanece acima do nível do líquido na pipeta até que a seringa está firmemente ligado.
    8. Usar a seringa para empurrar suavemente a solução restante gel de separação a partir do tubo dentro do tubo da pipeta e vidro. Fechar a válvula de pipeta antes de permitir que as bolhas de ar nele.
    9. Adicionar cuidadosamente uma camada de cerca de 0,25 ml de butano-água saturadaG (solução de 6, Tabela 1) na parte superior da solução de gel no interior do tubo de vidro para selar a reacção de polimerização a partir de oxigénio no ar e para achatar a parte superior do menisco.
    10. Limpe o equipamento derramando imediatamente com água deionizada (não use detergente).
    11. Espera durante a noite para a polimerização de gel completa à temperatura ambiente.
  3. Destacando Tubo Gel de dispositivos e Armazenamento
    1. No dia seguinte, cuidadosamente descascar a fita fora da parte superior do dispositivo.
    2. Desligar a válvula do tubo sob a pipeta. Solte a pipeta da braçadeira e executar as etapas 1.3.3. e 1.3.4. sobre uma pia.
    3. Pares uma seringa de 10 ml cheia com água desionizada à tubagem flexível. Empurrar a água através da tubagem para a pipeta, lentamente deslizando o gel polimerizado para fora da pipeta.
    4. Manter a pipeta horizontal e garantir cuidadosamente o gel de correr para fora da extremidade aberta.
    5. Corte o excesso de poliacrilamida abaixo e around do tubo de vidro usando uma lâmina de barbear. Certifique-se de criar um efeito suave sobre o gel no interior do tubo, tornando-o nivelado com a extremidade do tubo de vidro.
    6. Dispensar qualquer butanol restante do lado de cima do gel e definir o tubo de gel num tubo de centrífuga de 15 ml destapado. Misturar 0,5 ml de tampão em gel (solução 1, Tabela 1) com 4,5 ml de água ultra-pura e adicionar cerca de 2 ml da solução tanto para o lado de cima (no interior do tubo de vidro) e o lado inferior (no tubo de centrifugação) do tubo de gel.
    7. Cobrir o lado de cima completa do tubo de centrífuga, incluindo a abertura do tubo de vidro, com parafilme tampão para evitar a evaporação. Os géis podem ser armazenadas a 4 ° C durante cerca de 2 semanas.

Preparação 2. Amostra

  1. Pesar dois corações do rato e pique-os em uma placa de Petri usando uma lâmina de barbear.
  2. Adicionar o tecido processado para um almofariz e adicionar azoto líquido suficiente para cobrir a amostra. Pulverizar o tecido com um pilão, a adição de maisazoto líquido quando se evapora.
  3. Uma vez que o tecido é completamente moída, deixar evaporar o azoto e adicionar 1 ml de tampão de lise (solução 7, Tabela 1) a 4 ° C para cada 100 mg de tecido. Mover solução para um tubo de centrífuga.
  4. Centrifugar a 2.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Recolher cuidadosamente o sobrenadante num novo tubo e rejeitar o sedimento. Quantificar a concentração de proteína no sobrenadante através do método de ácido bicinconínico 12, ou, como preferido. Nota: Os lisados ​​celulares ou fracções subcelulares nativos podem ser preparados como preferidos. NC-GELFrEE é compatível com várias preparações de amostras nativas diferentes.
  5. Preparar a solução tampão de solubilização e solução de carga (soluções de 8 e 9, Tabela 1).
  6. Se a amostra é um sedimento, que ressuspender em 50-150 ul de tampão de solubilização. Manter a amostra em gelo durante 15 min.
  7. Troca de tampão da amostra ressuspensa ou o lisado celular com solubilizattampão de iões utilizando um filtro de centrífuga de 30 kDa de ultra-MWCO.
  8. Centrifugar a amostra de proteína, a 4 ° C e 10000 x g durante 5-10 minutos ou até que o volume de fracção retida é baixo a cerca de 20 ul. Descartar o fluxo de passagem.
  9. Adicionar 400 ul de tampão de solubilização para a fracção retida e misturar por pipetagem. Centrifugar a 4 ° C e 10000 x g durante 5-10 minutos ou até que a fracção retida é de até pelo menos cerca de 20 ul. Descartar o fluxo de passagem.
  10. Repita o passo 2.9 duas vezes.
  11. Dilui-se a amostra filtrada (aproximadamente 20 ul) em 100 jil de tampão de solubilização.
  12. Adicionar 20 ul de solução de carregamento de amostra.

3. Dispositivo de NC-GELFrEE

  1. Para executar CN-GELFrEE fracionamento, fabricar as peças do dispositivo, referindo-se a uma oficina mecânica. Fabricar as peças do dispositivo em Teflon. Por favor, consulte a Figura 1 para todas as informações necessárias para fabricar as peças e tO Quadro 2 para o número de peças necessárias para um dispositivo.
    Considerações de segurança: Usar equipamento de protecção individual adequado. Cuidados devem ser tomados em torno das fontes de alimentação de alta tensão, e todas as junções devem ser correctamente montado. Não toque no dispositivo ou em qualquer área molhada ao lado quando a tensão está ligado e manter a área do banco circundante seco durante a eletroforese. Além disso, a fonte de alimentação deve ser completamente desligado durante o manuseamento do dispositivo e / ou a recolha de fracções.
  2. Preparar o tampão de ânodo e cátodo (tampão de soluções 10-11, Tabela 1) e mantê-los a 4 ° C ou em gelo.
  3. Coloque a extremidade superior do tubo de gel (gel sem fim) através de um espaçador, um anel de vedação e um segundo espaçador, de uma forma "sanduíche".
  4. Adicionar a câmara tampão (cátodo) após o segundo espaçador, passar os parafusos totalmente através dos orifícios laterais, adicionar e aperte as porcas para ambos os lados. Certifique-se de que a extremidade superior dos Glass tubo é fixado antes da abertura superior da câmara de buffer, não diretamente sob ele ou após ela.
  5. Coloque a extremidade inferior do tubo de gel através de um espaçador, um O-ring, a câmara de recolha, e um segundo espaçador.
  6. Adicionar a câmara tampão (ânodo) após o segundo espaçador, passar os parafusos totalmente através dos orifícios laterais, adicionar e aperte as porcas para ambos os lados. Certifique-se de que a extremidade inferior do tubo de geleia é fixado passado a abertura superior da câmara de amortecimento, perto, mas não toca na parede traseira.
  7. Defina o dispositivo CN-GELFrEE verticalmente com a câmara tampão de cátodo para cima usando um suporte de apoio com grampos.
  8. Adicionar tampão de ânodo para a câmara de ânodo tampão (em baixo) e tampão de cátodo para a câmara tampão de cátodo (em cima). Mantenha todos os buffers a 4 ° C.
  9. Remova as bolhas de ar no interior do tubo de vidro batendo suavemente o tubo de vidro e verificar o sistema de escapamento.
  10. Verifique se os eletrodos de platina estão em contato com os amortecedores nas câmaras e que tantoextremidades do tubo de gel são imersas em tampão de dentro de cada câmara.
  11. Conecte os cabos de alimentação da fonte de alimentação às respectivas fichas de banana: negativo na câmara tampão de cátodo (parte superior) e positiva na câmara tampão do ânodo (em baixo).
  12. Carregar a amostra, utilizando uma ponta de carga de gel para o topo da superfície do gel, no interior do tubo de gel.
  13. Submeter o gel a 1 W constante, para evitar o sobreaquecimento, até a frente do corante vermelho é no fundo do tubo de gel.
    CUIDADO: Desligue a fonte de alimentação antes de continuar.
  14. Descartar ânodo e do cátodo tampões.
  15. Desapertar as porcas por a câmara tampão do ânodo e desmontar o espaçador e a câmara de fundo, a manutenção de um espaçador e o O-ring. Coloque a extremidade inferior do tubo de gel no interior da câmara de recolha, antes da abertura de topo, não passado directamente ou sob ele. Empurre o espaçador e O-ring perto da câmara de recolha.
  16. Cortar um pedaço de membrana de diálise de celulose e hidratar-lo por imergindo em tampão de ânodo. Cubra a aperture entre a câmara de recolha e o espaçador de fundo utilizando a membrana de diálise.
  17. Monte a câmara tampão do ânodo após o segundo espaçador, adicionar e aperte os parafusos e porcas.
  18. Coloque o dispositivo na posição horizontal sobre um balde de gelo. Adicionar frescos ânodo e do cátodo buffers para as câmaras de amortecimento e verificar o sistema de escapamento.
  19. Adicionar 150 ul de tampão de ânodo para dentro da câmara de recolha. Volte a ligar os cabos de alimentação para as respectivas fichas de banana.
  20. Ligue a fonte de alimentação a 3 mA de corrente constante. A frente de corante deve então começar a eluir no buffer na câmara de recolha.
  21. Quando toda a frente de corante é fluido, desligue a fonte de alimentação e recolher a primeira fracção (0 min), transferindo-o para um tubo de microcentrífuga de ligação de baixa proteína.
  22. Reabastecer a câmara de recolha com 150 ul de tampão de ânodo. Mantenha todas as fracções recolhidas em gelo.
  23. Recolha frações após as seguintes intervalos de tempo da coleção doprimeira fracção: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min e 60 min. Não levam em conta o tempo enquanto a fonte de alimentação está desligado. Não se esqueça de desligar a fonte de alimentação antes de recolher as fracções e para encher a câmara de recolha com 150 ul de tampão de ânodo entre as amostras. Ligue a fonte de alimentação novamente após a coleta para começar a eluição da fracção seguinte.
  24. Dispensar os buffers ânodo e do cátodo e adicionar novas soluções para as câmaras tampão após 60 min. Recolha fracções aos 90 min e 120 min.
  25. Alterar ânodo e do cátodo buffers a cada hora.
  26. Execute um nativo clara ou uma página nativa azul com as frações e manchá-la como preferencial. Siga as instruções do fabricante ou protocolo preferido.
  27. Executar um SDS-PAGE redutor e manchá-la como preferencial. Siga as instruções do fabricante ou protocolo preferido.
  28. Limpar as frações GELFrEE e submeter-se a espectrometria de massa nativa analisa como pr descritaeviously 9.

figura 1
Figura 1:. CN-GELFrEE dispositivo dispositivo GELFrEE peças desenhos (A) e (B) fotografia de peças fabricadas; (C) NC-GELFrEE esquema de montagem do dispositivo: (1) tampão de câmara, (2) espaçador, (3) o O-ring, (4) do tubo de gel, (5) câmara de recolha, e (6) da membrana de diálise.

tabela 1
Tabela 1: Tabela das soluções.

mesa 2
Tabela 2: Tabela de GELFrEE peças do dispositivo.

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Representative Results

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200 ug de proteínas extraídas a partir de corações de rato criogenicamente solo foram fraccionados nativamente em 14 fracções de 150 mL cada, utilizando o método CN-GELFrEE num tubo de gel de T 1-12%. Uma alíquota de 10 ul de cada fracção foi corrida num gel de laje NC-PAGE e corados com prata. Uma descrição clara do fraccionamento e a resolução obtida através do fraccionamento NC-GELFrEE é mostrado na Figura 2A. As fracções foram recolhidas ao longo de duas horas e o ensaio em gel mostra um padrão consistente de aumentar pesos moleculares que variam de ~ 30 a 500 kDa. Cada fracção contém espécies que variam em massa mais de ~ 100 kDa. Frações exibir uma baixa sobreposição de-categorias de peso molecular que é cada vez mais reduzidos à medida que mais coleções acontecer entre frações. A placa de gel NC-PAGE mostrado aqui representa apenas 6% da proteína recuperada a partir de cada fracção de 150 uL.

Cada um dos Fractiões eluída nativamente de NC-GELFrEE foram subsequentemente reduzidas e desnaturadas antes de executá-los em uma placa de gel SDS-PAGE. Na redução em gel de SDS-PAGE a laje (Figura 2B), é possível ver deslocamentos de massa em todas as fracções, quando em comparação com as respectivas fracções nativas (Figura 2A), indicando que os complexos de proteína intacta foi desmontado e as pontes de dissulfureto foram reduzidos.

Figura 2
Figura 2:. Separação CN-GELFrEE de coração de rato extrato de moagem criogênica (A) Limpar Native PAGE de fracções CN-GELFrEE recolhidos em intervalos de tempo 0 a 120 min. Esquerda: escada de peso molecular nativo. (B) A redução SDS-PAGE de fracções iguais que A. Esquerda: reduzida e escada de peso molecular desnaturado.

As fracções podem então ser limpo e submitted a espectrometria de massa nativa analisa 9. Espectro MS nativo do malato desidrogenase homodimérica, identificados em algumas das fracções GELFrEE, mostra uma distribuição de carga entre 16+ e 20+ e uma massa molecular de 72843 Da (Figura 3A). O estado de carga 18 + foi isolado e collisionally-activada, o que resulta na ejecção da malato-desidrogenase monomérica com uma massa molecular de 36,421.7 (Figura 3B). Fonte de activação foi aplicada ao complexo intacto, a fim de induzir a ejecção monómero, permitindo o isolamento e maior fragmentação dos monómeros. O mapa fragmentação do 11+ monómero pode ser observado na Figura 3C. NC-GELFrEE foi provado ser compatível com as análises de espectrometria de massa, mostrando nenhuma interrupção das interacções proteína-proteína não covalentes de montagens macromoleculares.

Figura 3 Figura 3: Os espectros de massa e fragmentação mapa do malato desidrogenase homodímero (A) espectro MS1 do complexo intacto, (B) MS2 espectro de monómeros exibindo ejectado a partir do complexo, e (C) um mapa fragmentação obtida a partir da fragmentação do monómero. . A N vermelho indica que o N-terminal é acetilada.

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Discussion

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NC-GELFrEE é derivado a partir do sistema de tampão de PAGE nativa claro (CN) que utiliza uma mistura de detergentes aniónicos e neutros, como moléculas de transporte 9 para o fraccionamento de proteínas baseado no peso molecular, por meio de uma matriz de gel. A aplicação de CN-GELFrEE a um extrato de proteína de coração de rato nativo gerado frações de baixa complexidade com larguras de banda discreta, mantendo interações não covalentes de montagens biomoleculares. Comparação das fracções entre NC-PAGE e reduzindo geles slab de SDS-PAGE mostrou deslocamentos de massa que demonstram a perda de interacções não covalentes entre macromoléculas nas fracções e quebra de ligações dissulfureto entre as cadeias de proteína. Os resultados confirmam o caráter natural da separação CN-GELFrEE.

Alguns passos neste protocolo são críticos e, assim, garante mais atenção. Em primeiro lugar, após a fundição, o tubo de gel deve ser destacado do dispositivo lentamente e a poliacrilamida externo corte cuidadosamente. Se não o fizerassim pode danificar o gel, fazendo com que as bolhas de ar dentro da malha ou retirar o gel a partir do tubo de vidro. Estes danos prejudicar a resolução separação e deve ser cuidadosamente evitado. Em segundo lugar, durante a electroforese, a resistência eléctrica do sistema irá aumentar horas extras, geradores de calor, por isso, é muito importante quer realizar o procedimento de uma câmara fria ou a mover o dispositivo para um balde de gelo após a amostra ter sido carregada no em gel, a fim de não desnaturar as proteínas carregadas pelo calor. Além disso, é importante para ocupar-se algumas limitações principais da técnica ao executar o protocolo descrito. cargas de alta proteína pode reduzir resolução CN-GELFrEE. A sobrecarga, especialmente de amostras em que algumas espécies são mais abundantes, fará com que estas espécies de proteínas a ser eluído através de uma série de fracções consecutivas. Para amostras moída criogenicamente do rato, os melhores resultados foram observados com valores entre 200 e 400 ug, mas este comportamento é amostra-dependente. Além disso, hos níveis de IGH de sal na amostra irá alterar as propriedades de electroforese de proteínas, alteração do padrão de banda e reduzir a resolução de fraccionamento. Estes passos críticos e limitações devem ser contabilizados durante a execução deste protocolo para alcançar melhores resultados.

Além disso, CN-GELFrEE mostrou ter várias características altamente exigidos em cromatografia nativa. Este método de separação simples consegue-alta resolução fraccionamento de complexos de proteínas, aceitar quantidades elevadas de carga de proteína e de fraccionamento, através de uma vasta gama de pesos moleculares. CN-GELFrEE também foi provado ser muito versátil, sendo capaz de fraccionar amostras biológicas a partir de uma grande variedade de organismos e diferentes preparações 9.

Além disso, a eluição da fracção de líquido nesta técnica permite a recuperação da proteína que não é observada em outras separações à base de gel nativo. Além disso, ao contrário de outros métodos que emontagens alaúde em fase líquida, CN-GELFrEE não reduz a concentração da amostra. Na verdade, o protocolo aqui descrito aumenta a concentração de proteína por cada conjunto de ~ 2 vezes em relação a amostra de fracções. Finalmente, as amostras líquidas Este método gera são prontamente compatíveis com os vários bioquímica e biofísica jusante nativa-proteína analisa, incluindo espectrometria de massa. Após uma única limpar passo, fomos capazes de identificar e caracterizar, por meio de espectrometria de massa nativa, complexos de proteínas desconhecidas em frações CN-GELFrEE, demonstrando ainda mais a forma nativa e compatibilidade entre essas técnicas.

Da mesma forma que a desnaturação GELFrEE, esta técnica de fracionamento nativa romance também é altamente adaptável. As concentrações de soluções de fundição pode ser ajustado para criar diferentes géis de gradiente, a fim de variar a gama de peso molecular que é resolvido durante uma corrida. Aumentando% do T do gel de separação soluções resulta em alta resolutião de espécies de massa inferior ao diminuir o que melhora a separação das espécies de elevado peso molecular. Os tempos de recolha por meio do qual a experiência é levada a cabo também pode ser adaptado a fim de optimizar as larguras de banda de peso molecular obtidos em cada fracção, conforme necessário. Experiência do tempo prolongado acima de 120 min irá gerar gamas de peso molecular ainda mais elevados do que descritos neste protocolo. Além disso, a redução de tempo entre a recolha de fracções pode reduzir a complexidade em cada fracção. Portanto, vários parâmetros podem ser facilmente ajustadas, otimizando o uso da técnica a diferentes estudos.

Em conclusão, as vantagens CN-GELFrEE ocupar uma lacuna no domínio das técnicas de separação nativas que apresentam separação de alta resolução em uma ampla gama de pesos moleculares, recuperação de alta proteína, e aceitar grandes quantidades de carga de proteína. Finalmente, as fracções resultantes são compatíveis com a maior parte nativos a jusante e técnicas de análise de proteínas desnaturantes.

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Acknowledgments

O WM Keck Foundation generosamente forneceu o financiamento para este trabalho. Este material é baseado no trabalho apoiado pela FAPERJ bolsa de investigação 100,039 / 2014 do governo do Rio de Janeiro Estado - Brasil, para RDM, Ciência Sem Fronteiras bolsa 88888,075416 / 2013-00 da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, sob o governo do Brasil, por HSS, o National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o número comunhão 2014171659 para OSS, e pelo CNPq bolsa de investigação 202011 / 2012-7 do governo do Brasil para LHFDVPCH é um receptor de Química da vida de uma Universidade Northwestern Processos Instituto de Pós-Doutorado Fellowship Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

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References

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NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese
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Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

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