Abstract
Белковые комплексы выполняют множество важных клеточных функций. Выяснение их нековалентных взаимодействий и динамики имеет первостепенное значение для понимания роли комплексов в биологических системах. В то время как прямая характеристика биомолекулярными узлов приобретает все большее значение в последние годы, отечественные методы фракционирования, которые совместимы с ниже по течению методов анализа, в том числе масс-спектрометрии, которые необходимы для дальнейшего расширения этих исследований. Тем не менее, поле не хватает высокой пропускной способности, широкий ассортимент, высокое восстановления метод разделения для нативного белка сборок. Здесь мы приводим четкую нативный гель-элюированный жидкая фракция экстрагирующее электрофорез (CN-GELFrEE), который является новым модальность разделения для нековалентных белковых агрегатов. эффективность разделения CN-GELFrEE была продемонстрирована ректификационных комплексов, извлеченных из сердца мыши. Фракции собирали в течение 2 ч и отображаются дискретные полосы в диапазоне от ~ 30 до 500 кДа. мошенникнаблюдалась последовательны модель увеличения ширины полосы молекулярного веса, каждый в пределах ~ 100 кДа. Кроме того, последующее переанализ родных фракций с помощью SDS-PAGE показал молекулярной массы сдвигает в соответствии с денатурации белковых комплексов. Поэтому, CN-GELFrEE было доказано, чтобы предложить возможность выполнять с высоким разрешением и высокой восстановления родные разделений на белковых комплексов из большого диапазона молекулярной массы, обеспечивая фракции, которые совместимы с белком анализа вниз по течению.
Introduction
Большинство биологических процессов , происходящих в клетке , как полагают, осуществляется с помощью белковых агрегатов , а не единичных белков 1. Следовательно, для того , чтобы выяснить специфическую биологическую роль субъединицы белка в клетке, необходимо понимать его структурные взаимодействия с другими белками или лигандов в комплексах 2. Тем не менее, изучение белков изначально, поддерживая их нековалентных взаимодействий и активность, остается сложной. Одним из недостатков нативных изучения белков является подходящим нативный метод разделения, который совместим с различными методами вниз по течению анализа белков. Поэтому в последнее время интерес к методам разделения , способные характеризовать нековалентных сборки биомолекул резко возросла 3.
методы разделения белков крайне важны для биохимии, биофизики и различных других исследований. Современные отечественные методы разделения имеют intrinsiC недостатки, которые снижают совместимость с ниже по течению анализов, таких как низкое разрешение, низкая пропускная способность, потери осадков, а также требование больших количеств исходного образца. Аффинной очистки Tandem обычно используется для исследования взаимодействия белка, но оно должно проводиться отдельно для каждого белка - мишени, в результате чего ее несовместимой с анализом высокой пропускной способностью 4. Хроматографи с исключением размеров 5, избирательное осаждение с ионом аффинной хроматографии 5 и градиенте плотности разделения 6 все предусмотрели нативные разделений, но по своей сути являются методы с низким разрешением и требуют высоких начальных количеств образцов.
В качестве альтернативы, гель на основе методики, такие как голубой Native (BN) и Clear Native (CN) PAGE (либо 1-D или 2-D), отображать разделение с высоким разрешением. Кроме того, контрастирующие с упомянуто другие методы, как родные СТР разделений поддерживают растворимость и нативную конформацию широкого гАнж макромолекулы видов, в том числе гидрофобных белков. Эта возможность дополнительно расширяет охват протеома достигнутый этими методами 7,8 и достигается за счет различной химии между CN и BN-PAGE. CN-PAGE обычно полагается на мягкие заряженные моющие средства в качестве молекул-носителей, заменяя Кумасси синего красителя в BN-PAGE. BN-PAGE, хотя связано с более высоким разрешением, имеет подводные камни , такие как снижение ферментативной активности в разделенных белков 8 и образованием молекулы Кумасси аддукта, причем последний значительно ущемляет вниз по течению масс - спектрального анализа 9. Оба эти методы, однако, традиционно ассоциируется с низким уровнем восстановления и узкого охвата протеома из - за окрашивания и ограничений экстракции геля 7.
Для изучения денатурированных белков, существует несколько методов, которые поддерживают растворимость макромолекулы при выполнении высокого разрешения фракционирования с регенерацией с высоким содержанием белка, и которые совместимы с Diverse методы анализа белков после разделения. Гель-элюированный жидкая фракция Защемление Электрофорез (GELFrEE) является одним из методов фракционирования, которые соответствуют всем этим характеристикам. Этот метод широко применяется в высоких пропускной исследованиях сверху вниз протеомики, указывая, что он быстр и универсален. В GELFrEE, белки денатурируют и отделены друг от друга на основе молекулярной массы через трубчатую гелевую матрицу, пористость которых может изменяться в зависимости от требований образца и от желаемых результатов фракционирования. Фракции элюировали в жидкой фазе, тем самым уменьшая ограничения восстановления, связанные с SDS-PAGE при сохранении высокого разрешения. Фракция аликвоты затем могут быть проанализированы с помощью 1-D PAGE для выбора полосы пропускания молекулярной массы 11. Существует высокий спрос на преимущества, связанные с GELFrEE в родных методами разделения. Описанный здесь метод Clear Родные GELFrEE (CN-GELFrEE), является уроженцем адаптация GELFrEE. Для того, чтобы быть совместимым с широкойяpectrum макромолекул в нативном состоянии, этот метод основан не только на мягкой химии CN-PAGE, но и на разделении пористости градиента, что уменьшает осаждение белков, устраняя резкий переход между пористостью , присутствующих в прерывистых гелевых системах 9. При применении к фракционирования белковых комплексов, выделенных из сердца мыши, элюированные фракции отображается высокое извлечение и разделение с высоким разрешением в широком диапазоне молекулярных масс был получен. Далее, полученные фракции совместимы с большинством вниз по течению биохимические и биофизические белковый анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Это видео протокол основан на соответствующей публикации 9. Конкретные реагенты, материалы и оборудование, необходимое для выполнения всех шагов, описанных в данном протоколе, перечислены в разделе материалов. Рецепты и информация для подготовки всех необходимых решений детализированы в таблице 1.
1. Заливка градиента Гели для труб
- Сборка литейной системы
- С помощью пламени обогревом лезвия бритвы или скальпель, вырезать 20 мл серологической пипеткой вдоль ортогональной секции 10 см от верхней части наконечника раздаточного. Убедитесь в том, что поверхность среза гладкая. Держите нижнюю часть (с наконечником) и удалите верхнюю часть. Зажмите нижнюю часть пипетки по вертикали (конический наконечник лицевой стороной вниз) к опорной стойке.
ВНИМАНИЕ: Не касайтесь металла с подогревом лезвия, используйте соответствующие ручки или плоскогубцев, чтобы избежать ожогов. - Вырезать 3 см гибкой трубки и подключить его к разрезанной пипетку, растягивая его надозирующий наконечник. Подключите клапан управления потоком на другом конце трубки.
- Ссылка на нижнюю часть клапана для раздаточного наконечника градиентного смесителя, используя кусок трубы. Держите клапан открытым.
- Установите градиент миксера в верхней части магнитной мешалкой. Поместите магнитные стержни внутри смесительной камеры.
- Расположите дозирующий наконечник градиента смесителя на 5-10 см выше, чем в верхней части пипетки части, чтобы дать возможность гель переливаться под действием силы тяжести.
- Проверьте систему на наличие утечек с деионизированной водой. Если никаких утечек не обнаружено, высушить систему путем продувки воздуха внутри него, прежде чем продолжить.
- Накройте верхнюю часть пипетки прокладка с двумя или более слоями ленты. Прокол отверстие через слои ленты в центре круглое отверстие. Убедитесь в том, что пункции является достаточно большим для стеклянной трубки, чтобы пройти через плотно.
- Вставьте стеклянную трубку, в которой гель будет наложено, через проколотый отверстие, растягивая ленту таким образом стекло плотно прилегает. яnsert стеклянной трубки таким образом, чтобы нижняя часть трубы составляет 2 мм над поверхностью дна пипеткой.
- Проверьте, чтобы увидеть, если стеклянная трубка удерживается и централизовано и не касаясь пипеткой стены, как только система подготовлена. Теперь система готова для литья.
- С помощью пламени обогревом лезвия бритвы или скальпель, вырезать 20 мл серологической пипеткой вдоль ортогональной секции 10 см от верхней части наконечника раздаточного. Убедитесь в том, что поверхность среза гладкая. Держите нижнюю часть (с наконечником) и удалите верхнюю часть. Зажмите нижнюю часть пипетки по вертикали (конический наконечник лицевой стороной вниз) к опорной стойке.
- Гель литья
- Подготовить гель буфера, APS и решения кумасси (растворы 1-3, таблица 1).
- Приготовьте 12% T (раствор 4, таблица 1) и 1% T (решение 5, таблица 1) , разделяющий гель решения. Добавляют 10 мкл раствора Кумасси в 12% растворе Т разделительный гель. Добавить APS и TEMED в обоих растворах непосредственно перед заливкой в градиентной смесителе.
ВНИМАНИЕ: полиакриламид сильно нейротоксическое и перчатки должны носить. - Убедитесь, что дозирующий клапан градиентного смеситель закрыт. Добавьте 12% T, разделяющую гель раствора в смесительную камеру, самой дальней от наконечника раздаточного. Откройте клапан между обеими камерами, и пусть я теку решениеNto следующую камеру.
- Закройте клапан и пипетки вывих 12% -ный раствор T разделительный гель назад к предыдущей камере. Это сделано, чтобы избежать воздушных пузырей между камерами.
- Добавляют 1% T, разделяющую гель раствора в смесительную камеру, ближайшей к кончику раздаточной. Включите магнитную мешалку.
- Размыкается в обоих градиентных смесительными клапанами, в то же время, чтобы позволить разделительные растворы гель для смешивания и течь в пипетку и стеклянную трубку.
- После того, как разделительные гелевые растворы в градиенте смесителем истощаются, расцепить трубки из смесителя и пары его в шприц объемом 10 мл. Убедитесь, что конец трубы остается выше уровня жидкости в пипетку до тех пор, пока шприц надежно закреплен.
- Используйте шприц, чтобы аккуратно вставьте оставшиеся отделяющую раствора геля из трубки в пипетку и стеклянную трубку. Закройте клапан пипетки, прежде чем разрешить пузырьки воздуха в него.
- Аккуратно добавить слой около 0,25 мл насыщенного водой butanoл (раствор 6, таблица 1) на верхней части раствора геля внутри стеклянной трубки , чтобы запечатать реакции полимеризации с кислородом в воздухе и выравниваться верхний мениск.
- Очистите разливочный аппарат немедленно деионизованной водой (не используйте моющие средства).
- Подождите в течение ночи для полной полимеризации геля при комнатной температуре.
- Отсоединение гель туба из устройства и хранения
- На следующий день, осторожно снимите ленту с верхней части устройства.
- Отсоедините клапан от трубки под пипеткой. Отпустите пипетку из зажимов и выполните шаги 1.3.3. и 1.3.4. над раковиной.
- Пара 10 мл шприц, наполненный деионизированной водой с гибкой трубкой. Нажмите воду через трубку в пипетку, медленно сдвигая полимеризованный гель из пипетки.
- Держа пипетку горизонтально и осторожно закрепить гелем выскальзывание открытого конца.
- Отрежьте избыток полиакриламида ниже и Ароунд стеклянную трубку с помощью лезвия бритвы. Убедитесь, чтобы создать гладкую конец на гель внутри трубки, сделав его заподлицо с концом стеклянной трубки.
- Разлить оставшуюся бутанола из верхней части геля и установите пробки геля в незакрытом 15 мл центрифужную пробирку. Смешайте 0,5 мл геля буфера (раствор 1, таблица 1) с 4,5 мл сверхчистой воды и добавляют приблизительно 2 мл раствора для обоих элементов на верхней стороне (внутри стеклянной трубки) и нижней стороной (в центрифужной пробирке) гелевой трубки.
- Накройте всю верхнюю сторону центрифуге трубки, в том числе отверстие стеклянной трубки, с парафином, чтобы предотвратить испарение буфера. Гели можно хранить при температуре 4 ° С в течение приблизительно 2 недель.
2. Подготовка проб
- Взвесить два сердца мыши и рубите их в чашку Петри с помощью лезвия бритвы.
- Добавьте обработанную ткань в ступке и добавить достаточное количество жидкого азота для покрытия образца. Распылить ткань с пестиком, добавляя большежидкий азот, когда она испаряется.
- После того , как ткань тщательно измельчают, дайте испариться азота и добавляют 1 мл буфера для лизиса (раствор 7, таблица 1) при 4 ° С на каждые 100 мг ткани. Переместить раствор в центрифужную пробирку.
- Центрифуга при 2000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Осторожно собрать надосадочную жидкость в новую пробирку и отбросить осадок. Количественно концентрации белка в надосадочной жидкости с использованием метода с применением бицинхониновой кислоты 12, или в качестве предпочтительного. Примечание: Коренной Клеточные лизаты или субклеточных фракций, могут быть получены в качестве предпочтительных. CN-GELFrEE совместим с различными носителями различных препаратов образцов.
- Приготовьте раствор солюбилизации буфера и загрузки раствора (растворов 8 и 9, таблица 1).
- Если образец представляет собой гранулы, ресуспендируют его в 50-150 мкл буфера солюбилизации. Хранить пробы на льду в течение 15 мин.
- Буфер обмена ресуспензированной образец или клеточного лизата с solubilizatионный буфер с использованием 30 кДа-MWCO ультра центробежный фильтр.
- Центрифуга образец белка при 4 ° С и 10000 мкг в течение 5-10 мин, или пока не удерживается объемная доля снижается до примерно 20 мкл. Выбросьте проточные.
- Добавить 400 мкл буфера для солюбилизации нераспределенной фракции и перемешать с помощью пипетки. Центрифуга при 4 ° С и 10000 мкг в течение 5-10 мин или пока удерживается фракция до объема приблизительно 20 мкл. Выбросьте проточные.
- Повторите шаг 2,9 еще два раза.
- Развести отфильтрованный образец (приблизительно 20 мкл) в 100 мкл буфера для солюбилизации.
- Добавьте 20 мкл раствора нагрузки к образцу.
3. CN-GELFrEE устройства
- Для выполнения CN-GELFrEE фракционирование, изготовления деталей устройства со ссылкой на механический цех. Изготовление деталей устройства в тефлоном. Пожалуйста , обратитесь на рисунке 1 всю информацию , необходимую для изготовления деталей и тO Таблица 2 для числа необходимых деталей для одного устройства.
Соображения безопасности: Надеть соответствующие средства индивидуальной защиты. Следует соблюдать осторожность вокруг высоковольтных источников питания, и все узлы должны быть правильно установлены. Не прикасайтесь к устройству или любой смежной мокрую зону, когда напряжение на и поддерживать окружающую скамейка область сухой во время электрофореза. Кроме того, блок питания должен быть полностью выключен при работе с устройством и / или сбор фракций. - Готовят буфер анодный и катодный буфер (растворов 10-11, таблица 1) , и держать их при 4 ° С или на льду.
- Установить верхний конец трубки геля (конец без геля) через спейсер, уплотнительное кольцо и второй распорки, в моде "сэндвич".
- Добавьте буферную камеру (катод) после того, как второй распорки, проходят винты полностью через боковые отверстия, добавить и затянуть гайки с обеих сторон. Убедитесь в том, что верхний конец Glass трубка закреплена перед верхней апертуре буферной камеры, а не непосредственно под ним или мимо него.
- Установить нижний конец трубки геля через спейсер, уплотнительное кольцо, накопительную камеру, и второй распорки.
- Добавьте буферную камеру (анод) после того, как второй распорки, проходят винты полностью через боковые отверстия, добавить и затянуть гайки с обеих сторон. Убедитесь, что нижний конец трубки Гель фиксируют мимо верхней апертуры буферной камеры, близко, но не касаясь задней стенки.
- Установите устройство CN-GELFrEE вертикально с катодный буферную камеру вверх, используя опорную стойку с зажимами.
- Добавить анодный буфер к аноду буферной камеры (внизу) и катодный буфер к катоду буферной камеры (вверху). Хранить все буферы при температуре 4 ° С.
- Удалите пузырьки воздуха из стеклянной трубки, осторожно коснувшись стеклянную трубку и проверить систему на наличие утечек.
- Убедитесь, что платиновые электроды находятся в контакте с буферами в камерах и что обаКонцы гель трубки погружают в буфер в каждой камере.
- Подключите шнуры питания от источника питания к соответствующим однополюсных вилок: отрицательный на катоде буферной камере (вверху) и положительной на аноде буферной камеры (внизу).
- Загрузить образец с использованием наконечника гель нагрузки на верхнюю поверхность геля, внутри трубки геля.
- Выполнить гель на 1 постоянной W, чтобы избежать перегрева, пока передний красный краситель не находится в нижней части трубки геля.
ВНИМАНИЕ: Выключите питание, прежде чем продолжить. - Откажитесь анодных и катодных буферы.
- Untighten гайки от буферной камеры анодной и демонтировать нижнюю распорку и камеру, поддерживая разделителей и уплотнительное кольцо. Поместите нижний конец трубки гель на внутреннюю поверхность камеры для сбора, перед верхней апертуры, а не в прошлом или непосредственно под ним. Нажмите на прокладку и уплотнительное кольцо близко к камере для сбора.
- Отрежьте кусок целлюлозы диализной мембраны и увлажняет ее immerging в анодной буфере. Накройте арerture между камерой сбора и нижней распорки с помощью диализной мембраны.
- Соберите анод буферную камеру после второго распорки, добавлять и затянуть винты и болты.
- Положите устройство горизонтально над ведерке со льдом. Добавить свежие анодных и катодных буферы буферных камер и проверить систему на наличие утечек.
- Добавьте 150 мкл буфера анода в накопительную камеру. Снова подключите кабели питания к соответствующим однополюсных вилок.
- Включите питание на 3 мА постоянного тока. Фронт краситель должен затем начать вымывается в буфер в накопительной камере.
- Когда передний весь краситель вымывается, выключите питание и собрать первую фракцию (0 мин), переводя ее в низкобелковой связывание трубки микроцентрифужных.
- Пополняйте накопительную камеру с 150 мкл буфера анода. Держите все собранные фракции на льду.
- Сбор фракций после следующих интервалов времени из коллекцииПервая фракция: 2 мин, 4 мин, 6 мин, 8 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 45 мин и 60 мин. Не приходится время, пока питание отключено. Не забудьте отключить питание перед сбором фракций и для пополнения накопительной камеры 150 мкл буфера между анодной образцов. Включите питание снова после сбора, чтобы начать элюирование следующую фракцию.
- Разливают анодную и катодную буферы и добавлять новые решения в буферных камер через 60 мин. Сбор фракций через 90 мин и 120 мин.
- Изменение анодных и катодных буферы каждый час.
- Запуск четкий родной или синий родную страницу с фракциями и окрашивает его в качестве предпочтительной. Следуйте инструкциям производителя или предпочтительного протокола.
- Запуск восстанавливающего SDS-PAGE и окрашивают его в качестве предпочтительной. Следуйте инструкциям производителя или предпочтительного протокола.
- Зачистить GELFrEE фракций и представить родной масс-спектрометрии анализа, как описано прeviously 9.
Рисунок 1:. CN-GELFrEE устройство (A) GELFrEE устройство частей чертежи и (Б) фотография изготовленных деталей; (C) , CN-GELFrEE схема сборки устройства: (1) буферная камера, (2) распорка, (3) уплотнительное кольцо (4) гель туба, (5) камера для сбора, и (6) диализную мембрану.
Таблица 1: Таблица решений.
Таблица 2: Таблица деталей устройства GELFrEE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
200 мкг белков, экстрагированных из криогенным сердца земля мыши фракционировали изначально на 14 фракций по 150 мкл каждая, с использованием метода CN-GELFrEE в 1-12% туба Т гель. Аликвоту 10 мкл каждой фракции был подвергнут анализу на геле слябов CN-PAGE и окрашивали серебром. Четкое изображение фракционирования и разрешения , полученного с CN-GELFrEE фракционирования показано на рисунке 2А. Фракции собирали в течение двух часов, и анализ геля показывает последовательную картину увеличения молекулярной массы в диапазоне от ~ 30 до 500 кДа. Каждая фракция содержит виды, располагающиеся в массе над ~ 100 кДа. Фракции отображать низкое перекрытие молекулярно-массового диапазонов, которые все больше и больше, как больше уменьшенных коллекции происходят между фракциями. Гель горбыль CN-PAGE показано здесь представляет только 6% белка, извлеченного из каждой 150 мкл фракции.
Каждый из fractионы изначально элюируют из CN-GELFrEE затем восстанавливали и денатурированный перед запуском их в полиакриламидном геле слябов SDS-PAGE. В восстановительном SDS-PAGE гель слябов (Фигура 2В), можно видеть , массовые сдвиги во всех фракций по сравнению с соответствующими носителями фракций (рис 2А), что указывает , что интактные белковые комплексы были разобраны и дисульфидные мостики были уменьшены.
Рис . 2: CN-GELFrEE отделение мыши сердца криогенной экстракта шлифовального (A) Очистить Родные ПААГ CN-GELFrEE фракций , собранных с интервалом времени от 0 до 120 мин. Слева: родной молекулярной массы лестницы. (B) Уменьшение SDS-PAGE одних и тех же фракций , как А. Слева: снижение и денатурированный молекулярной массы лестницы.
Фракции затем могут быть очищены и submittе изд родному масс - спектрометрии анализа 9. Родной MS спектр гомодимерной малатдегидрогеназы, которые были определены в некоторых из GELFrEE фракций, показывает распределение заряда между 16+ и 20+ и молекулярной массой 72,843 Da (рис 3А). Государственный 18+ заряд был выделен и столкновительно активированные, что приводит к выбросу мономерного малатдегидрогеназу с молекулярной массой 36,421.7 (фиг.3В). Источник активации был применен к неповрежденной комплекса с целью побудить мономера выброс, что позволяет изоляцию и дальнейшее дробление мономеров. Дробление карта 11+ мономера можно наблюдать на фиг.3С. CN-GELFrEE было доказано, чтобы быть совместимым с анализа масс-спектрометрии, не показывая нарушению нековалентных белок-белковых взаимодействий макромолекулярных сборок.
На рисунке 3: Масс - спектры и фрагментация карта гомодимере малатдегидрогеназу (А) МС1 спектр интактного комплекса, (В) МС2 спектр экспонирование мономер выбрасываются из комплекса, и (С) отображение фрагментации получена в результате фрагментации мономера. , Красный N указывает на то, что N-терминал ацетилированный.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CN-GELFrEE происходит от родной ясно (CN) СТР буферной системы , которая использует смесь анионных и нейтральных моющих средств в качестве молекул - носителей 9 для молекулярной массы на основе фракционирования белков через матрицу геля. Применение CN-GELFrEE к родному экстракта белка мыши сердца генерируется низкие фракции сложности с дискретными полосой пропускания при сохранении нековалентных взаимодействий биомолекул сборок. Сравнение фракций между CN-PAGE и восстановителей для SDS-PAGE гелей показал слябов массовые сдвиги, которые демонстрируют потерю нековалентных взаимодействий между макромолекул в фракций и разрыва дисульфидных связей между белковых цепей. Полученные результаты подтверждают нативный характер разделения CN-GELFrEE.
Некоторые шаги в этом протоколе имеют решающее значение, и, таким образом, заслуживают большего внимания. Во-первых, после того, как литье, гель трубка должна быть отсоединена от устройства медленно, а внешний полиакриламида вырезать тщательно. В противном случаеЭто может привести к повреждению геля, в результате чего пузырьки воздуха внутри сетки или отсоединением гель из стеклянной трубки. Эти повреждения ухудшают разрешение разделения и следует тщательно избегать. Во-вторых, во время электрофореза, электрическое сопротивление системы будет сверхурочные увеличиваться, генерируя тепло, таким образом, очень важно, чтобы либо выполнить процедуру, описанную в холодильной камере или для перемещения устройства в ведре со льдом, после того, как образец был загружен в гель, чтобы не денатурации белков, загруженные с помощью тепла. Кроме того, важно, чтобы запомнить некоторые ключевые ограничения метода при выполнении описанного протокола. Высокие нагрузки белка может уменьшить разрешение CN-GELFrEE. Перегрузки, особенно в образцах, где несколько видов, более богатые, приведет к тому, виды белка элюируется через ряд последовательных фракций. Для мышей криогенным проб грунта, лучшие результаты были получены при таком количестве от 200 до 400 мкг, но такое поведение образца зависит. Кроме того, чIgh уровни соли в образце изменит электрофоретических свойства белков, изменяя набор полос и уменьшения разрешения фракционирования. Эти критические шаги и ограничения должны учитываться во время выполнения этого протокола для достижения лучших результатов.
Кроме того, CN-GELFrEE было показано несколько высоко требуемые характеристики в родной хроматографии. Этот простой метод разделения достигает высокой разрешающей способностью фракционирование белковых комплексов, принимая большое количество белка нагрузки и фракционированию с помощью широкого спектра молекулярных масс. CN-GELFrEE также оказались весьма универсальными, будучи способным фракционирования биологических образцов из большого разнообразия организмов и различных препаратов 9.
Кроме того, жидкая фракция элюирование в этой технике позволяет высокое извлечение белка, который не наблюдается в других гелевых на основе нативных разделений. Кроме того, в отличие от других способов, которые длютня сборки в жидкой фазе, CN-GELFrEE не снижает концентрацию пробы. На самом деле, протокол, описанный здесь, увеличивает концентрацию каждой сборки белка ~ 2 раза от образца к фракции. Наконец, жидкие образцы этот метод генерирует легко совместимы с различными вниз по течению биохимических и биофизических нативного белка анализы, в том числе и масс-спектрометрии. После однократной очистке шагом мы смогли идентифицировать и охарактеризовать, с помощью масс-спектрометрии нативной, неизвестных белковых комплексов в CN-GELFrEE фракций, дополнительно демонстрируя родной моды и совместимости между этими методами.
Подобно денатурирующих GELFrEE, этот новый метод родное фракционирование также хорошо адаптируется. Концентрации литья растворов, могут быть скорректированы, чтобы создать различные градиентном геле, для того, чтобы варьировать диапазон молекулярной массой, который разрешенное во время бега. Увеличение% T геля разделения растворов приводит к высокой resolutионов низких массовых видов при одновременном уменьшении улучшает разделение видов с высокой молекулярной массой. Времена сбора, через которую эксперимент проводится также может быть адаптирован для того, чтобы оптимизировать пропускную способность молекулярной массой, достигнутые в каждой фракции, по мере необходимости. Длительное время эксперимента выше 120 мин будет генерировать даже более высокие диапазоны молекулярной массой, чем изображенные в этом протоколе. Кроме того, сокращение времени между сбором фракций может уменьшить сложность в каждой фракции. Таким образом, несколько параметров могут быть легко доработаны, оптимизации использования методики для различных исследований.
В заключение, CN-GELFrEE преимущества занимают пробел в области нативных методов разделения, представляющих разделение с высоким разрешением в широком диапазоне молекулярных масс, высокое извлечение белка, и принимая большое количество белковой нагрузки. Наконец, полученные фракции совместимы с большинством вниз по течению нативных и денатурирующих методов анализа белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Кек фонд WM любезно предоставили финансирование для этой работы. Этот материал основан на работе, поддержанной исследовательского гранта FAPERJ 100,039 / 2014 от правительства Рио-де-Жанейро - Бразилия для RDM, науки без границ науки +88888,075416 / 2013-00 от координации по улучшению высшего образования персонала, при правительстве из Бразилии, HSS, Национальный научный фонд стипендий Магистратура исследований в рамках стипендий номером 2014171659 для ОСС, и исследовательский грант CNPq 202011 / 2012-7 от правительства Бразилии для LHFDVPCH является получателем химии северо-западного университета жизненных процессов института Постдокторское Присуждение стипендий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | This solution is neurotoxic. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | This chemical is an irritant. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | This chemical is flammable, toxic, and corrosive. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | This chemical is an irritant. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | This chemical is toxic. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | This chemical is toxic. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Any supplier | n/a | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | This chemical is flammable and toxic. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | This chemical is toxic. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | This chemical is an irritant. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | This chemical flammable and irritant. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Any supplier | n/a | |
| Magnetic bars | Any supplier | n/a | Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage up to 1,500 V |
| Refrigerated centrifugue | Eppendorf | 022622552 | Up to 15,000 x g |
| Materials | |||
| 15 ml conical tube | Any supplier | n/a | |
| 30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexible tubing | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Approximately 1 m length |
| Ice bucket | Any supplier | n/a | |
| Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) | Any supplier | n/a | Aquarium valves are compatible. |
| Mortar and pestle | Any supplier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind tube 1.5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Razor blade | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel for any kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serological pipets (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Syringe (10 ml) | Any supplier | n/a |
References
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
