Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

CN-gelfri - Clear Native Gel-eluerade vätskefraktion Entrapment Elektrofores

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Proteinkomplex utför en rad viktiga cellulära funktioner. Belysa deras icke-kovalenta interaktioner och dynamiken är avgörande för att förstå betydelsen av komplex i biologiska system. Medan den direkta karakterisering av biomolekylära församlingar har blivit allt viktigare under de senaste åren, inhemska fraktioneringstekniker som är kompatibla med efterföljande analystekniker, inklusive masspektrometri, är nödvändiga för att ytterligare utöka dessa studier. Icke desto mindre, i fältet saknar en hög genomströmning, wide-range, high-återhämtning separationsmetod för infödda proteinaggregat. Här presenterar vi klart nativ gel-eluerade vätskefraktion entrapment elektrofores (CN-gelfri), som är en ny separations modaliteten för icke-kovalenta proteinaggregat. CN-gelfri separationsprestanda visades genom fraktionering komplex som extraherats från mus hjärta. Fraktioner uppsamlades över två timmar och visas diskreta band som sträcker sig från ~ 30 till 500 kDa. En conkonsekvent mönster av ökande molekylvikt bandbredder observerades, var och en sträcker sig ~ 100 kDa. Vidare efterföljande återanalys av nativa fraktioner genom SDS-PAGE visade molekylvikt skiftar i överensstämmelse med den denaturering av proteinkomplex. Därför var CN-gelfri visat sig erbjuda möjligheten att utföra högupplösta och hög återhämtning nativa separationer på proteinkomplex från ett stort molekylviktsområde, som ger fraktioner som är kompatibla med efterföljande proteinanalyser.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Majoriteten av biologiska processer som sker inuti en cell tros utföras av proteinaggregat i stället för enstaka proteiner 1. Följaktligen är det för att belysa den specifika biologiska rollen av ett protein-subenhet i en cell som krävs för att förstå de strukturella interaktioner med andra proteiner eller ligander i komplex 2. Men studera proteiner inbyggt, behålla sina icke-kovalenta interaktioner och aktivitet, förblir utmanande. En av bristerna av nativa proteinstudier är ett lämpligt nativ separationsteknik som är kompatibel med olika nedströms proteinanalystekniker. Därför har nyligen intresse i separationstekniker kan karakterisera icke-kovalenta aggregat av biomolekyler ökat kraftigt 3.

Proteinseparationstekniker är absolut nödvändigt att biokemi, biofysik och olika andra studier. Aktuella nativa separationstekniker har intrinsic brister som minskar kompatibilitet med efterföljande analyser, såsom låg upplösning, låg genomströmning, förlust för nederbörd, och kravet på stora mängder ursprungliga provet. Tandem affinitetsrening används ofta för proteininteraktionsstudier, men det måste göras separat för varje protein mål, vilket gör att vara oförenlig med hög genomströmning analys 4. Gelkromatografi 5, selektiv utfällning med ion affinitetskromatografi 5 och densitets gradient separation 6 alla har gett inhemska separationer, men är i sig lågupplösta tekniker och kräver höga initiala provmängder.

Alternativt gelbaserade tekniker, såsom Blue Native (BN) och Clear Native (CN) PAGE (antingen 1-D eller 2-D), uppvisar hög upplösning separation. Dessutom kontrasterar med andra tekniker som nämns, både naturlig PAGE separationer upprätthålla löslighet och nativa konforma av ett brett range av makromolekyl arter, däribland hydrofoba proteiner. Denna förmåga breddar ytterligare proteomet täckning nås av dessa metoder 7,8 och uppnås genom olika kemi mellan CN och BN-PAGE. CN-PAGE förlitar vanligen på mjuk laddade rengöringsmedel som bärarmolekyler, ersätter Coomassie Blue färgämne i BN-PAGE. BN-PAGE, men i samband med högre upplösning, har förbehåll såsom minskad enzymatisk aktivitet i de separerade proteinerna 8 och Coomassie molekyl adduktbildning, den sistnämnda är mycket skadligt för nedströms MS analyser 9. Båda dessa metoder är emellertid traditionellt förknippas med låg återhämtning och smal proteom täckning tack vare färgning och gel utvinning begränsningar 7.

För studier av denaturerade proteiner, finns det flera tekniker som upprätthåller makromolekyl löslighet när de utför hög upplösning fraktionering med hög proteinutvinning och som är kompatibla med diverse post-separationsproteinanalystekniker. Gel-Eluerat vätskefraktionen Entrapment Elektrofores (gelfri) är en av de fraktioneringstekniker som passar alla dessa egenskaper. Denna metod är till stor del tillämpas i hög genomströmning top-down proteomikstudier, vilket indikerar att den är snabb och mångsidig. I gelfri proteiner denatureras och separeras baserat på molekylvikt genom en rörformad gelmatris kan porositet som varieras baserat på provkrav och de önskade fraktione resultat. Fraktioner elueras i vätskefas, vilket minskar återställnings begränsningar förknippade med SDS-PAGE med bibehållen hög upplösning. Bråk portioner kan sedan analyseras med en-D PAGE för molekylvikt val bandbredd 11. Det finns stor efterfrågan på de fördelar som är förknippade med gelfri i inhemska separationstekniker. Den metod som beskrivs häri, Clear Native gelfri (CN-gelfri), är en infödd anpassning av gelfri. För att vara kompatibel med en bred spectrum av makromolekyler i deras nativa tillstånd, förlitar sig denna metod inte bara på den mjuka CN-PAGE kemi, utan också på en porositet gradientseparation, vilket minskar proteinutfällning genom att eliminera den hårda övergången mellan porositeter som föreligger i diskontinuerliga gelsystem 9. När det appliceras på fraktionera proteinkomplex som extraherats från mushjärta, eluerade fraktionerna visas högt utbyte och en hög upplösning separation av ett brett intervall av molekylvikter erhölls. Vidare är de resulterande fraktionerna är kompatibla med de flesta nedströms biokemiska och biofysiska proteinanalyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Obs: Denna video Protokollet är baserat på en tillhörande publikation 9. Specifika reagens, material och utrustning som krävs för att utföra alla de steg som beskrivs i detta protokoll återfinns i avsnittet material. Recepten och information för beredning av alla nödvändiga lösningar specificeras i tabell 1.

1. hälla av Gradient rörgeler

  1. Montering av gjutsystem
    1. Med användning av en flam-upphettades rakblad eller skalpell, skär ett 20 ml serologisk pipett längs en ortogonal sektion 10 cm från toppen av tubens spets. Se till att snittytan är slät. Hålla bottenstycket (med spetsen) och kassera toppstycket. Kläm fast botten pipetten stycket vertikalt (konisk spets nedåt) till ett stödstativ.
      VARNING: Rör inte den uppvärmda bladet metall, använd riktiga handtag eller en tång för att undvika brännskador.
    2. Klipp 3 cm flexibel slang och anslut den till snittet pipett genom att sträcka den övertubens spets. Ansluta flödesreglerventilen i den andra änden av röret.
    3. Länka botten av ventilen till tubens spets av gradienten biandaren med användning av en slang. Hålla ventilen öppen.
    4. Ställa in gradientblandare ovanpå en magnetomrörare. Placera magnetskenor inuti blandningskamrarna.
    5. Positionera tubens spets av gradienten biandaren 5-10 cm högre än överdelen av pipetten stycket för att tillåta gelén som skall hällas av tyngdkraften.
    6. Testa systemet för läckor med avjoniserat vatten. Om inga läckor finns, torka systemet genom att blåsa luft i det innan du fortsätter.
    7. Täck toppen av pipetten stycke med två eller flera skikt av tejp. Punktera ett hål genom de bandskikten i centrum av den cirkulära öppningen. Säkerställa att punktionen är tillräckligt stor för glasröret för att passera tätt igenom.
    8. Skjut glasröret, där gelén kommer att kastas genom punkterade hålet, som sträcker bandet så att glaset sluter tätt. jagnsert glasröret så att botten av röret är 2 mm över pipetten botten.
    9. Kontrollera om glasröret hålls och centraliserade och inte vidrör pipetten väggen när systemet är förberett. Systemet är nu redo för gjutningen.
  2. gjutning Gel
    1. Bered gel buffert, APS och Coomassie lösningar (lösningar 1-3, Tabell 1).
    2. Förbered 12% T (lösning 4, Tabell 1) och 1% T (lösning 5, Tabell 1) separation av gel lösningar. Tillsätt 10 pl Coomassie lösning i T separations gellösning 12%. Lägg APS och TEMED i båda lösningarna omedelbart innan du häller i gradientblandare.
      VARNING: polyakrylamid är mycket neurotoxiskt och handskar måste användas.
    3. Kontrollera att utmatningsventilen av gradienten blandaren är stängd. Tillsätt 12% T separerande gellösningen till blandningskammaren längst bort från tubens spets. Öppna ventilen mellan de båda kamrarna och låt vätskeflödet into nästa kammare.
    4. Stäng ventilen och pipett ur led 12% T separations gellösningen tillbaka till föregående kammaren. Detta görs för att undvika luftbubblor mellan kamrarna.
    5. Tillsätt 1% T separerande gellösningen till blandningskammaren närmast tubens spets. Slå på magnetomröraren.
    6. Öppna både gradientblandare ventiler samtidigt för att tillåta de separerande gel lösningar som skall blandas och att flöda in i pipetten och glasröret.
    7. När väl de separerande gellösningar i gradientblandare är uttömda, koppla loss slangen från biandaren och koppla den till en 10 ml spruta. Se till att änden av röret förblir över vätskenivån i pipetten tills sprutan är ordentligt fastsatt.
    8. Använd sprutan för att försiktigt trycka den återstående separerande gellösningen från slangen i pipetten och glasrör. Stänga pipetten ventilen innan man tillåter luftbubblor in i den.
    9. Försiktigt lägga ett lager av ca 0,25 ml vattenmättad Butanol (lösning 6, Tabell 1) på toppen av gellösningen inuti glasröret för att täta polymerisationsreaktionen från syre i luft och att platta toppen menisken.
    10. Rengör hälla apparaten omedelbart med avjoniserat vatten (använd inte diskmedel).
    11. Vänta över natten för fullständig gel polymerisation vid rumstemperatur.
  3. Lösgör Gel Tube från enhet och Förvaring
    1. Dagen därpå, skala försiktigt tejpen från toppen av enheten.
    2. Koppla bort ventilen från slangen under pipetten. Släpp pipetten från klämman och utför steg 1.3.3. och 1.3.4. över ett handfat.
    3. Par en 10 ml spruta fylld med avjoniserat vatten till den flexibla slangen. Tryck vatten genom slangen i pipetten, sakta glida den polymeriserade gelén ur pipetten.
    4. Hålla pipetten horisontellt och noggrant fästa gelén glider ut ur den öppna änden.
    5. Klipp bort överflödigt polyakrylamid under och around glasröret med användning av ett rakblad. Se till att skapa en slät ände på gelén i röret, genom att göra den i jämnhöjd med spetsen på glasröret.
    6. Dispensera eventuell kvarvarande butanol från den övre sidan av gelén och ställa gelén rör i en icke-begränsade 15 ml centrifugrör. Blanda 0,5 ml gelbuffert (lösning 1, tabell 1) med 4,5 ml ultrarent vatten och tillsätt ca 2 ml av lösningen på både den övre sidan (inom glasrör) och bottensidan (i centrifugrör) av gelröret.
    7. Täcka hela ovansidan av centrifugröret, inklusive röret öppningen glas, med parafilm för att förhindra buffert avdunstning. Geler kan lagras vid 4 ° C under omkring 2 veckor.

2. Provberedning

  1. Väg två mus hjärtan och finhacka dem i en petriskål med användning av ett rakblad.
  2. Lägg den behandlade vävnaden till en mortel och tillsätt tillräckligt flytande kväve för att täcka provet. Pulverisera vävnaden med en mortelstöt, lägga till merflytande kväve när det avdunstar.
  3. När vävnaden är helt jordade, låt kväve avdunsta och tillsätt 1 ml lyseringsbuffert (lösning 7, tabell 1) vid 4 ° C för varje 100 mg vävnad. Flytta lösning i ett centrifugrör.
  4. Centrifugera vid 2000 xg under 5 min vid 4 ° C. Noggrant samla supematanten i ett nytt rör och kassera pellet. Kvantifiera proteinkoncentrationen i supernatanten med användning av bicinkoninsyra-metoden 12, eller som föredraget. Notera: Native Cellysat eller subcellulära fraktioner kan framställas såsom föredragna. CN-gelfri är kompatibel med olika inhemska provpreparat.
  5. Förbereda solubiliseringen buffertlösning och lastning lösning (lösningar 8 och 9, tabell 1).
  6. Om provet är en pellet, återsuspendera det i 50-150 pl solubiliseringsbuffert. Hålla provet på is under 15 min.
  7. Buffert byta ut återsuspenderade provet eller cellysatet med solubilizatjon-buffert med användning av ett 30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter.
  8. Centrifugera proteinprovet vid 4 ° C och 10.000 x g under 5-10 min eller tills den kvarhållna fraktionen volymen är ned till ca 20 | j, l. Kassera genomströmning.
  9. Tillsätt 400 | il solubiliseringsbuffert till den kvarhållna fraktionen och blanda genom pipettering. Centrifugera vid 4 ° C och 10.000 x g under 5-10 min eller tills den kvarhållna fraktionen är ned till ca 20 | j, l. Kassera genomströmning.
  10. Upprepa steg 2,9 ytterligare två gånger.
  11. Späd det filtrerade provet (approximativt 20 | il) i 100 pl solubiliseringsbuffert.
  12. Tillsätt 20 | il av laddningslösningen till provet.

3. CN-gelfri Device

  1. För att utföra CN-gelfri fraktionering tillverka enhetens delar genom att hänvisa till en verkstad. Tillverka enhetens delar i teflon. Se figur 1 för all information som behövs för att tillverka delar och to Tabell 2 för antalet nödvändiga delar för en enhet.
    Säkerhetsfaktorer: Bär lämplig personlig skyddsutrustning. Försiktighet bör iakttas kring högspännings nätaggregat, och alla korsningar bör korrekt monterad. Rör inte enheten eller någon intilliggande våtrum medan spänningen är på och underhålla omgivande bänken området torrt under elektrofores. Dessutom bör strömförsörjningen vara helt avstängd vid hantering av enheten och / eller uppsamling av fraktioner.
  2. Förbereda anoden buffert och katodbuffert (lösningar 10-11, tabell 1) och hålla dem vid 4 ° C eller på is.
  3. Sätt på den övre änden av gelröret (slutet utan gel) genom en spacer, en O-ring och en andra distansorgan, i en "sandwich" mode.
  4. Tillsätt buffertkammaren (katod) efter den andra distans, passera skruvarna helt genom sidohålen, lägga till och dra åt muttrarna på båda sidor. Se till att den övre änden av glass röret fixeras innan den övre öppningen av buffertkammaren, inte direkt under det eller förbi.
  5. Passa bottenänden av gelén röret genom ett distansorgan, en O-ring, uppsamlingskammaren, och ett andra distansorgan.
  6. Tillsätt buffertkammaren (anod) efter den andra distans, passera skruvarna helt genom sidohålen, lägga till och dra åt muttrarna på båda sidor. Se till att den nedre änden av gelén röret fixeras förbi den övre öppningen hos buffertkammaren, nära men inte vidrör den bakre väggen.
  7. Ställ CN-gelfri enheten lodrätt med katodbuffertkammaren uppåt med hjälp av en stödstativ med klämmor.
  8. Lägg anod buffert till anoden buffertkammaren (botten) och katodbufferten till katodbuffertkammaren (överst). Håll alla buffertar vid 4 ° C.
  9. Avlägsna luftbubblor från insidan glasröret genom att försiktigt knacka på glasröret och kontrollera systemet för läckage.
  10. Se till platinaelektroderna är i kontakt med de buffertar i kamrarna och att bådegel rörändar är nedsänkta i bufferten inuti varje kammare.
  11. Anslut strömsladdar från strömförsörjningen till respektive banankontakter: negativ på katodbuffertkammaren (överst) och positiv på anoden buffertkammaren (botten).
  12. Ladda provet med användning av en gel belastningsspets till toppen ytan av gelén, inne i gelröret.
  13. Kör gelen vid ett W konstant, för att undvika överhettning, tills den röda färgfronten är på botten av gelén röret.
    VARNING: Stäng av strömmen innan du fortsätter.
  14. Kassera anod- och katod buffertar.
  15. Lossa muttrarna från anoden buffertkammaren och ta isär den nedersta distansorganet och kammaren, bibehållande av en spacer och O-ringen. Placera den nedre änden av gelröret inuti uppsamlingskammaren, innan den övre öppningen, inte tidigare eller direkt under den. Skjut in distans och O-ringen nära uppsamlingskammaren.
  16. Klipp en bit cellulosadialysmembran och rehydrera det genom immerging i anod buffert. Täck aperture mellan uppsamlingskammaren och den undre distans med hjälp av dialysmembran.
  17. Montera anoden buffertkammaren efter den andra distans, lägga till och dra åt skruvar och bultar.
  18. Lägg enheten horisontellt över en ishink. Lägg färska anod och katod buffertar för att buffertkamrarna och kontrollera systemet för läckage.
  19. Tillsätt 150 pl av anod-buffert in i uppsamlingskammaren. Anslut strömsladdarna till respektive banankontakter.
  20. Slå på strömförsörjningen på 3 mA konstant ström. Färgfronten bör sedan börja att eluera in i buffert i uppsamlingskammaren.
  21. När hela färgfronten elueras, slå av strömmen och samla den första fraktionen (0 min), överför den till en låg proteinbindnings mikrocentrifugrör.
  22. Fyll uppsamlingskammaren med 150 pl anod buffert. Håll alla de uppsamlade fraktionerna på is.
  23. Samla fraktioner efter följande tidsintervaller från insamling avförsta fraktion: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min och 60 min. Tar inte hänsyn till tid när strömmen är avstängd. Glöm inte att stänga av strömmen innan uppsamling av fraktionerna och för att fylla i uppsamlingskammaren med 150 pl anod buffert mellan prover. Slå strömmen igen efter insamling för att börja eluera nästa fraktion.
  24. Fördela anod- och katod buffertar och lägga nya lösningar till buffertkamrarna efter 60 minuter. Samla fraktioner vid 90 min och 120 min.
  25. Ändra anod och katod buffertar varje timme.
  26. Köra en klar nativt eller en blå naturlig PAGE med fraktionerna och fläcka den som föredras. Följ tillverkarens instruktioner eller föredragna protokoll.
  27. Köra en reducerande SDS-PAGE och fläcka den som föredras. Följ tillverkarens instruktioner eller föredragna protokoll.
  28. Städa upp gelfri fraktionerna och underkasta sig infödda masspektrometri analyser som beskrivs previously 9.

Figur 1
Figur 1:. CN-gelfri enhet (A) gelfri enhetens delar ritningar och (B) Ett fotografi av tillverkade delar; (C) CN-gelfri sammansatta enheten schema: (1) buffertkammaren, (2) distans, (3) O-ring, (4) gel rör, (5) uppsamlingskammaren, och (6) dialysmembran.

Bord 1
Tabell 1: Tabell över lösningar.

tabell 2
Tabell 2: Tabell över gelfri enhetens delar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

200 mikrogram av proteiner extraherade från temperatur malt mus hjärtan fraktioner inbyggt i 14 fraktioner om 150 ul vardera, med hjälp av KN-gelfri metoden i en 1-12% T gel rör. En alikvot av 10 | il av varje fraktion kördes på en CN-PAGE slab gel och silverfärgades. En tydlig avbildning av fraktioneringen och upplösningen som erhålls med CN-gelfri fraktione visas i figur 2A. Fraktioner samlades under två timmar och gelanalys visar ett konsekvent mönster av ökande molekylvikter som sträcker sig från ~ 30 till 500 kDa. Varje fraktion innehåller arter varierar i massa över ~ 100 kDa. Fraktioner uppvisar en låg överlappning av molekylvikt-intervall som alltmer reduceras eftersom fler samlingar hända mellan fraktionerna. CN-PAGE gelplatta som visas här utgör endast 6% av proteinet utvinnas från var 150 | j, l fraktion.

Var och en av fractjoner eluerade inbyggt från CN-gelfri därefter reduceras och denatureras innan du kör dem på en SDS-PAGE gelplatta. I den reducerande SDS-PAGE-gelplatta (figur 2B), är det möjligt att se massförskjutningar i alla fraktioner vid jämförelse med de respektive nativa fraktionerna (Figur 2A), vilket indikerar att intakta proteinkomplex demonterades och disulfidbryggor sänktes.

figur 2
Figur 2:. CN-gelfri separation av mus hjärta kryogenisk målning extrakt (A) Clear Native PAGE av CN-gelfri fraktioner som samlats vid tidsintervall 0 till 120 min. Vänster: nativ molekylvikt stege. (B) Reducerande SDS-PAGE av samma fraktioner som A. Vänster: reducerad och denaturerad molekylvikt stege.

Fraktioner kan sedan rengöras och submitted till infödda masspektrometri analyser 9. Nativ MS-spektrum av det homodimera malatdehydrogenas, som identifierats i några av gelfri fraktioner, visar en laddningsfördelning mellan 16+ och 20+ och en molekylmassa av 72.843 Da (figur 3A). Den 18+ laddningstillstånd isolerades och collisionally aktiverad, vilket resulterar i utstötning av monomert malatdehydrogenas med en molekylmassa på 36,421.7 (figur 3B). Källa aktivering applicerades på intakt komplex för att framkalla monomer utstötning, vilket gör isolering och ytterligare fragmentering av monomerer. Fragmenteringen karta över den 11+ monomeren kan observeras i figur 3C. CN-gelfri bevisades att vara kompatibel med masspektrometri analyser visar inga störningar av icke-kovalenta protein-proteininteraktioner av makromolekylära aggregat.

Figur 3 Figur 3: Masspektra och fragmentering karta över homodimer malatdehydrogenas (A) MS1 spektrum av det intakta komplexet, (B) MS2 spektrum uppvisar monomer matas ut från komplexet, och (C) en fragmentering karta som erhållits genom sönderdelning av monomeren. . Den röda N indikerar att den N-terminala acetyleras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CN-gelfri är härledd från den klara nativa (CN) PAGE-buffertsystemet som använder en blandning av anjoniska och neutrala detergenter som bärarmolekyler 9 för molekyl-viktbaserad proteinfraktionering genom en gelmatris. Tillämpningen av CN-gelfri till en infödd mus hjärta proteinextrakt genererade låga fraktioner komplexitet med diskreta bandbredder bibehållen icke-kovalenta interaktioner av biomolekylära församlingar. Jämförelse av fraktionerna mellan CN-PAGE och reducerande SDS-PAGE-skivgeler visade massförskjutningar som visar förlust av icke-kovalenta interaktioner mellan makromolekyler i fraktionerna och sönderbrytning av disulfidbindningar mellan proteinkedjor. Resultaten bekräftar den nativa karaktären av CN-gelfri separation.

Vissa steg i detta protokoll är kritiska och därmed garanterar mer uppmärksamhet. Först, efter gjutning, gelén röret bör tas loss från anordningen långsamt och den externa polyakrylamid skära noggrant. Underlåtenhet att göraså kan skada gelén, vilket luftbubblor i nätet eller tar bort gelen från glasröret. Dessa skador försämrar separations upplösning och bör noggrant undvikas. För det andra, under elektrofores kommer det elektriska motståndet i systemet ökar övertid, genererar värme, vilket är det mycket viktigt att antingen utföra proceduren i ett kylrum eller för att flytta enheten till en ishink efter det att provet har laddats i gel, för att inte denaturera de laddade proteinerna genom värme. Vidare är det viktigt att tänka på några viktiga begränsningar i tekniken när man utför den beskrivna protokollet. Hög proteinhalt laster kan minska CN-gelfri upplösning. Överbelastning, särskilt av prover där ett fåtal arter är mer rikligt förekommande, kommer att orsaka dessa proteintyper som skall elueras genom ett antal på varandra följande fraktioner. För mus temperatur malt prov erhölls de bästa resultaten ses med mängder mellan 200 och 400 | j, g, men detta beteende är provberoende. Också, hIgH halter av salt i provet kommer att förändra de elektro egenskaper proteiner, ändra bandmönstret och minska fraktione upplösning. Dessa kritiska steg och begränsningar skall redovisas under utförandet av detta protokoll för att uppnå bättre resultat.

Vidare CN-gelfri visat sig ha flera eftertraktad egenskaper infödda kromatografi. Denna enkla separationsmetod uppnår hög upplösning fraktionering av proteinkomplex, acceptera höga mängder protein belastning och fraktione genom ett brett intervall av molekylvikter. CN-gelfri också visat sig vara mycket mångsidig, har förmåga att fraktionera biologiska prover från ett stort antal organismer och olika preparat 9.

Dessutom vätskefraktionen eluering i denna teknik möjliggör hög proteinutvinning som inte observerats i andra gelbaserade infödda separationer. Dessutom, till skillnad från andra metoder som eluta sammansättningar i flytande fas, inte CN-gelfri inte minska provkoncentration. I själva verket, det protokoll som beskrivs häri ökar koncentrationen av varje protein aggregat vid ~ 2-faldigt från prov till fraktioner. Slutligen, vätskeprover Denna metod genererar är lätt kompatibel med olika nedströms biokemiska och biofysiska infödda proteinanalyser, inklusive masspektrometri. Efter en enda städa upp steg kunde vi identifiera och karakterisera genom infödda masspektrometri, okända proteinkomplex i CN-gelfri fraktioner ytterligare visar de infödda mode och kompatibilitet mellan dessa tekniker.

I likhet med denaturering gelfri, är denna roman infödd fraktione teknik också mycket anpassningsbar. Koncentrationerna av gjutning lösningar kan justeras för att skapa olika gradientgeler, i syfte att variera molekylviktsområde som är löst under en körning. i hög Resolut Öka% T av separationsgelé lösningar resultation av lägre mass arter och samtidigt minska den förbättrar separation av hög molekylvikt. Uppsamlings gånger genom vilken experimentet utförs kan även anpassas för att optimera molekylvikt bandbredder uppnås i varje fraktion som behövs. Utökad experiment tid över 120 minuter kommer att generera ännu högre molekylvikt intervall än avbildade i detta protokoll. Dessutom kan minska tiden mellan fraktionsuppsamling minska komplexiteten i varje fraktion. Därför flera parametrar kan lätt finjusteras, optimera användningen av den teknik för att olika studier.

Sammanfattningsvis, CN-gelfri fördelar upptar en lucka när det gäller inhemska separationstekniker uppvisar hög upplösning separation i ett brett spektrum av molekylvikter, hög proteinutvinning, och acceptera stora mängder protein belastning. Slutligen, de resulterande fraktionerna är kompatibel med de flesta nedströms infödda och denatureproteinanalystekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

WM Keck Foundation generöst finansierat detta arbete. Detta material är baserat på arbete som stöds av FAPERJ forskningsanslag 100,039 / 2014 från regeringen i Rio de Janeiro - Brasilien för RDM, vetenskap utan gränser stipendium 88888,075416 / 2013-00 från samordning för förbättring av högre utbildning personal, enligt regeringen Brasilien, för HSS, National Science Foundation Graduate Research Fellowship i gemenskap nummer 2014171659 för OSS, och CNPq forskningsanslag 202.011 / 2012-7 från regeringen i Brasilien för LHFDVPCH är en mottagare av en Northwestern University kemi livsprocesser Institute Forskar Fellowship Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92, (3), 291-294 (1998).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, (8), 645-654 (2007).
  3. Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, (6868), 141-147 (2002).
  4. Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24, (3), 218-229 (2001).
  5. Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7, (7-8), 884-890 (2002).
  6. Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12, (3), 224-234 (1997).
  7. Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815, (1-2), 227-236 (2005).
  8. Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5, (17), 4338-4346 (2005).
  9. Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87, (5), 3032-3038 (2015).
  10. Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26, (4), 327-334 (2002).
  11. Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80, (5), 1568-1573 (2008).
  12. Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, (1), 76-85 (1985).
CN-gelfri - Clear Native Gel-eluerade vätskefraktion Entrapment Elektrofores
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter